一種降糖活性組分的制備方法及醫(yī)療用圖
【技術(shù)領域】
[0001 ] 本發(fā)明是涉及刺五加醇提物降糖活性組分的制備方法。經(jīng)多次體外蛋白酪氨酸磷 酸酯酶IB抑制實驗表明，該活性組分具有明顯的抑制PTPlB活性，可在制備糖尿病、肥胖癥 及并發(fā)癥藥物應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前臨床上常將糖尿病分為胰島素依賴型（IDDM，I型糖尿?。┖头且葝u素依賴型 (NIDDM，II型糖尿病)兩類，其中II型糖尿病在糖尿病中占90%。WHO預計，由于人口老齡化、 肥胖、不健康的飲食以及缺乏運動的生活方式，到2025年，糖尿病患者的數(shù)目將由1995年 的1. 35億上升為3億。
[0003] II型糖尿病的特征是胰島素敏感組織如骨骼肌、肝、脂肪組織對胰島素作用的抵 抗。雖然其具體機制尚不清楚，但胰島素信號在其傳導通路中的減弱甚至阻斷必定是直接 關(guān)系。PTPases在胰島素信號通路中多個環(huán)節(jié)起作用，如將自身磷酸活化的IR去磷酸化，從 而降低受體激酶活性；或?qū)RS_l、IRS-2、Shc等胰島素受體的底物中蛋白酪氨酸殘基至去 磷酸化，從而負調(diào)控胰島素作用受體后通路。特定PTPases和胰島素通路中的酪氨酸激酶 間的酶活性不平衡可能是引起II型糖尿病胰島素抵抗的原因。因此，通過尋找選擇性作用 于該通路中PTPases的抑制劑抑制其活性，加強和延長胰島素信號，成為越來越受重視的 治療II型糖尿病的新途徑。
[0004] PTPlB選擇性抑制劑的研究取得了一定的進展，但大多研究局限于肽類和類 肽化合物，例比如根據(jù)PTPlB去磷酸化的底物序列設計的抑制劑EEDE (F2PMP)M、 Glu-F2PMP-F2PMP，雖然這些肽類化合物具有較高的選擇性和較強的抑制活性，但它們不易 穿透細胞膜和其肽類磷酸結(jié)構(gòu)使其很難成為藥物候選化合物。最近，在非肽類PTPlB抑制 劑的報道中2-羧甲氧基苯甲酸類化合物對PTPlB有很強的抑制作用，更重要的是，其中 (2S) -2- [4?2-芐基-苯并呋喃）-3-聯(lián)苯-4-氧]-3-苯基-丙酸化合物不僅對PTPlB有 很強的選擇抑制性，還對降低〇b/ob小鼠血漿中的葡萄糖和胰島素水平有顯著作用。這是 第一例從藥理學上直接證明PTPlB抑制劑具有抗糖尿病活性的證據(jù)[Malamas，M. S. et al. J. Med. Chem. 2000，43，1293-1310]。
[0005] 本發(fā)明涉及的刺五加（Tfei/ix JcafliAojDiMaci1S 屬于五加科五加屬， 主要生長在山坡林中及路旁灌叢中；藥圃常有栽培。分布于華中、華東、華南和西南。主要 用于抗腫瘤、抗疲勞、降低全血粘度、防止動脈粥樣硬化形成等作用。
[0006] 經(jīng)檢索未見用刺五加醇提物制備降血糖活性組分的相關(guān)文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供以刺五加活性組分為降血糖活性組分，其目的是用于治療糖尿病、高 血糖及并發(fā)癥疾病。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的是提供如上限定的刺五加降血糖活性組分在生產(chǎn)用于抑制 蛋白酪氨酸磷酸酯酶IB (PTPlB)的抑制劑和胰島素增敏劑、治療各種糖尿病、肥胖癥及其 它由此引發(fā)的并發(fā)癥。
[0009] 本發(fā)明公開刺五加降糖活性組分及其制備方法。
[0010] 本發(fā)明所述的刺五加降糖活性組分制備方法，包括以下步驟： (1) 稱取刺五加干燥品300g，加入1-2倍量的75%乙醇浸泡1小時，利用超聲波提取1 至3小時，抽濾并收集濾液； (2) 濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，收集濃縮液，放涼，加入2-3倍量水并攪拌，常溫靜置24小 時，析出沉淀，過濾或離心取沉淀，沉淀物置于表面皿中加熱，除去乙醇和水，直至無醇味， 即得刺五加醇提物； (3) 將刺五加醇提物經(jīng)過150μπι反相色譜，用以甲醇/水（V/V，0:10-10:0)為流動相 進行梯度洗脫，收集的分離組分利用反相薄層層析檢測，成份相同的分離組分合并、濃縮后 得到F 1至F1〇十個分離組分； (4) 將F2組分經(jīng)ΗΡ-20大孔色譜，用以甲醇/水（V/V，0:10-10:0)為流動相進行梯度 洗脫，收集乙醇/水（V/V，3:7)的分離組分、濃縮后得到刺五加降血糖活性組分。
[0011] 將本發(fā)明刺五加降糖活性組分中加入一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑 混合，根據(jù)給藥途徑制成多種藥物劑型。
[0012] 藥理學研究表明，本發(fā)明的刺五加活性組分具有明顯地抑制PTPlB活性和降血糖 作用。因此，本發(fā)明刺五加降糖活性組分的PTPlB抑制活性及降血糖作用顯著優(yōu)于刺五加 醇粗提取物的降血糖效果。
【附圖說明】
[0013] 圖1 :為本發(fā)明刺五加降糖活性組分分別對STZ致高血糖大鼠胰島素敏感性的影 響。
[0014] 以下試驗例表明本發(fā)明刺五加活性組分的藥理活性： 試驗例1 本發(fā)明刺五加降糖活性組分抑制PTPIB，VHR和PPl活性試驗 實驗方法：用于篩選的蛋白酪氨酸磷酸酯酶ΡΤΡ1Β，是從大腸桿菌中表達并純化的GST 融合蛋白。采用紫外底物ΡΝΡΡ，觀察不同濃度對重組酶的活性抑制，以初步評價化合物的 藥用效果。PTPlB水解底物^NPP的磷脂得到的產(chǎn)物在410nm處有很強的光吸收。因此可以 直接檢測410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化以及刺五加活性組分對其的抑制情 況。陽性對照正釩酸鈉的IC 5。為2. 0 uM。刺五加降糖活性組分抑制VHR和PPl活性實驗 原理同PTP1B。實驗結(jié)果如下：
實驗結(jié)果顯示，當本發(fā)明活性組分的濃度為15. 3 μ g/ml時，對PTPlB活性有50%抑制 作用（IC5。），并且實驗數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明活性組分對PTPlB有高選擇性。
[0015] 試驗例2 本發(fā)明刺五加活性組分對STZ致高血糖大鼠降血糖實驗 以昆明大鼠60只（雄性)，隨機分組成空白組、模型組（Diabetic control)、實驗組、消 渴丸對照組（XKW)。除空白組外，各組禁食不禁水I d，以STZ (在4°C冰浴中用0. 05 mol/ ml梓檬酸pH4. 5溶液配制，立即使用）腹腔注射60 mg/kg，造糖尿病模型。注射后72 h斷 尾取血測定血糖(測前禁食12 h)，血糖值高于11. I mmol/L用于實驗。
[0016] 實驗組分別以本發(fā)明刺五加活性組分灌胃（100、200、300 mg/kg);XKW組以消渴丸 灌胃（250 mg/kg);空白組、模型組灌胃等體積生理鹽水。給藥30 d，每天給藥一次并稱重。 末次給藥后，斷尾取血測宙口服血糖倌（測前禁食12 h)。實膾結(jié)果如下：
實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明活性組分的低、中、高劑量組與模型組比較，均有顯著的降糖效 果，其中活性組分300mg/kg組的降糖效果與消渴丸對照組相當。因此，通過以上數(shù)據(jù)得到 本發(fā)明活性組分有效降血糖劑量為300mg/kg。
[0017] 試驗例3 : 本發(fā)明活性組分別對STZ致高血糖大鼠胰島素敏感性的影響 實驗組分別以本發(fā)明活性組分灌胃（200 mg/kg);模型組灌胃等體積生理鹽水。給藥 30 d，每天稱重、給藥一次。以上各組在給藥30 d內(nèi)，每天腹腔注射長效人胰島素 I IU/kg。 30 d后，各組大鼠四天內(nèi)每天分別腹腔注射速效人胰島素0.05、0.5、1.0、2.5 IU/kg，測定 給速效人胰島素前后的血糖，計算比值。實驗結(jié)果如圖1。
[0018] 實驗結(jié)果顯