一種巴戟天寡糖及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是涉及一種巴戟天寡糖及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巴戟天，為雙子葉植物茜草科藥用植物，入藥的部位為地下的干燥根。藥材根扁 圓柱形式圓柱形，略彎曲，長度不等，直徑l-2cm，表面灰黃色或灰黃棕色，有的微帶紫色， 具縱皺及深陷的橫紋，有的呈縊縮狀或皮部橫向斷離而露出木部，形如雞腸。質(zhì)堅韌，折 斷面不平，皮部厚5-7mm，淡紫色，木部直徑2-4_。氣微，味苦，略澀。傳統(tǒng)功效有補腎壯 陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕。經(jīng)研究，其主要成分為14種蒽醌化合物、環(huán)烯醚萜、低聚糖、多糖類， 有機(jī)酸類，氨基酸，揮發(fā)性成分以及微量元素等等。糖類是巴戟天的主要成分之一，含量占 50%以上。從巴戟天中分得了葡萄糖、甘露糖，巴戟素、耐斯糖（nystose)，IF-果呋喃糖基 耐斯糖（lF-fructofuranosyl nystose)、菊淀粉[即（2-1)果咲喃糖基鹿糖]型六聚糖 (hexasaccharide)和七聚糖（heptasaccharide)等多種低聚糖。有研究表明5~7年生 巴戟天總糖的含量可超過50%。對巴戟天水溶性部分的研究發(fā)現(xiàn)其中含有低聚糖類成分。 崔承彬等從巴戟天根中分離鑒定出4個水溶性低聚糖類單體：耐斯糖、IF-果呋喃糖基耐 斯糖、菊淀粉系列的六聚糖和七聚糖，均為菊淀粉型低聚糖（亦稱寡糖），具有抗抑郁活性。 馮峰等從巴戟天活性部分提取出6個寡糖化合物，分別為蔗糖（I )、耐斯糖（II )、菊粉 六糖（III )、β -D-果吡喃糖-(2 - 1) - β -D-果呋喃糖-(2 - 1) - β -D-果呋喃糖（IV )、 0-〇-果吡喃糖-(2-1)-0-〇-果呋喃糖-(2-1)-0-〇-果呋喃糖-(2-1)-0-〇-果 呋喃糖（V )、β -D-果吡喃糖-(2 - 1)-β -D-果呋喃糖-(2 - 1)-β -D-果呋喃 糖-(2 - l)-i3-D-果呋喃糖-(2 - l)-i3-D-果呋喃糖（VI)。
[0003] 巴戟天的主要藥理作用
[0004] 1壯陽作用
[0005] 丁平等通過巴戟天水提液、巴戟天體積分?jǐn)?shù)80%乙醇提取物、巴戟天寡糖結(jié)晶對 環(huán)磷酰胺（CTX)引起的精子減少模型雄性小鼠的生精子作用及對性器官的影響進(jìn)行了研 究。結(jié)果與CTX組小鼠相比，巴戟天水溶液組、巴戟天體積分?jǐn)?shù)80%乙醇提取物及巴戟天總 寡糖結(jié)晶組小鼠平均精子數(shù)分別升高。實驗顯示，3種巴戟大提取物促進(jìn)精子生成作用的 強(qiáng)弱順序為巴戟天寡糖結(jié)晶、巴戟天80%乙醇提取物、巴戟天水提液。其中巴戟天總寡糖 結(jié)晶作用最強(qiáng)，由此推斷巴戟天促進(jìn)小鼠生精作用的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是巴戟天總寡糖的提取 物，且這一藥理作用與巴戟天傳統(tǒng)的補腎作用較吻合，值得進(jìn)一步深入研究。
[0006] 2抗抑郁作用
[0007] 張中啟等通過大鼠，小鼠強(qiáng)迫性游泳和大鼠獲得性無助抑郁模型，觀察了不同批 次的巴戟天寡糖（MOs)對其的影響，發(fā)現(xiàn)MOs能逆轉(zhuǎn)大鼠的逃避行為缺欠，表明其具有一定 的抗抑郁作用。亦有研究表明，巴戟天寡糖能夠增加原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元樹突及分支數(shù) 目，巴戟天寡糖對海馬神經(jīng)可塑性具有調(diào)節(jié)作用，該作用可能是其抗抑郁作用機(jī)制之一。
[0008] 3抗腫瘤作用
[0009] 祝海燕表明，從海巴戟中得到的citrifolinoside和citrifolininA，對紫外線 (UVB)誘導(dǎo)的、在腫瘤誘發(fā)和生長中起重要作用的蛋白活化劑AP-I有顯著抑制作用，也是 目前為止發(fā)現(xiàn)的惟一兩種具有此活性的環(huán)烯醚萜類化合物。付嘉等用S180瘤株制備荷瘤 動物模型，以紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率（RBC-C3bRR)，紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率（RBC-ICR)，外 周血T淋巴細(xì)胞亞群，血清IL-2含量測定為指標(biāo)，對巴戟天水提液的抗腫瘤作用進(jìn)行觀察 發(fā)現(xiàn)，巴戟天水提液對荷瘤小鼠的上述4項指標(biāo)均有明顯作用，由此表明巴戟天水提液能 夠提高荷瘤機(jī)體的抗腫瘤功能。
[0010] 4對免疫系統(tǒng)作用
[0011] 吳巖斌等通過LPS刺激RAW264. 7小鼠巨噬細(xì)胞系建立炎癥細(xì)胞模型以篩選巴戟 天體外抗炎的有效部位，發(fā)現(xiàn)以正丁醇所萃取的成分有明顯的量效關(guān)系。
[0012] 趙輝等用體外細(xì)胞培養(yǎng)法觀察巴戟天對絲裂原誘導(dǎo)的健康老人淋巴細(xì)胞增殖及 對絲裂原誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響，以及小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子（TNF)的 影響，結(jié)果表明巴戟天可促進(jìn)刀豆蛋白A (ConA)活化的人體淋巴細(xì)胞增殖，可促進(jìn)ConA和 細(xì)菌多糖（LPS)活化的小鼠淋巴細(xì)胞的增殖，并能提高小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF的水平。陳 小娟等認(rèn)為巴戟天的多糖提取物能夠增加幼鼠的胸腺重量，提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力， 并可提高小鼠免疫特異玫瑰花結(jié)形成細(xì)胞（RFC)的形成。陳忠等通過對巴戟天水提取物的 研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天水提液對小鼠具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫的功能，可增加小鼠的單核吞噬細(xì)胞系 統(tǒng)的廓清率，并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞的能力。馮昭明通過對巴戟天低聚糖的研究發(fā)現(xiàn)，其 對小鼠胸腺T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)有明顯的促進(jìn)作用，表明巴戟天中低聚糖類成分有促進(jìn)細(xì) 胞免疫的作用。而陳小娟等巴戟天多糖能夠提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力。
[0013] 陳嵐等通過完全Freund's佐劑誘導(dǎo)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和0. 6%冰醋酸致小鼠 疼痛扭體模型，分別以大鼠足踝關(guān)節(jié)周徑、炎癥介質(zhì)PGE :含量，小鼠扭體次數(shù)為指標(biāo)，觀察 巴戟天提取物對實驗性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用。巴戟天提取物具有一定的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎作用。在臨床上可能通過抑制滑膜內(nèi)襯巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞惡性增殖及TNF. d合成而對RA 滑膜炎的發(fā)展進(jìn)程具有一定程度的阻斷作用。
[0014] 徐超斗等通過LACA純系小鼠的脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外增殖培養(yǎng)以及綿羊紅細(xì)胞應(yīng) 激小鼠免疫作用，以溶血空斑試驗。結(jié)果均為增強(qiáng)作用，認(rèn)為巴戟天寡糖具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng) 作用。
[0015] 上述藥理試驗證明，巴戟天除具有補腎壯陽、袪風(fēng)濕等作用外，還具有抗抑郁、提 高細(xì)胞免疫功能、防治冠心病、降低膽固醇、抗癌、補腎健腦和抗炎鎮(zhèn)痛等多種生理作用。因 此，巴戟天這種傳統(tǒng)的中藥具有比較廣泛的應(yīng)用前景和開發(fā)利用價值。但對巴戟天的化學(xué) 成分以及藥理作用方面的研究還不夠透徹和全面，很多工作仍有待進(jìn)一步深入研究，以便 為巴戟天的臨床應(yīng)用及開發(fā)提供理論依據(jù)。
[0016] MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞 線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan) 并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免 疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)， MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。在細(xì)胞學(xué)實驗中，MTT法常用于細(xì)胞毒性、細(xì)胞活性和 細(xì)胞增殖的檢測。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物 篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。李紅艷等 在不同細(xì)胞增殖檢測方法對比研究中指出，檢測細(xì)胞存活與增殖的方法很多，主要包括觀 察DNA合成含量和直接檢測細(xì)胞代謝活性兩種，而前者由于摻入同位素操作復(fù)雜并存在放 射性污染等缺點，難以得到廣泛的應(yīng)用。而自1983年Mosmann建立MTT法以來，由于其簡 單、經(jīng)濟(jì)、快速、無放射性污染等特點，已成為細(xì)胞生物學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域一種分析細(xì)胞活性、生 長增殖的常用方法。本研究測定巴戟天寡糖對J774巨噬細(xì)胞增殖的影響，擬采用MTT法。
[0017] 寡糖，通常指的是2-9個單糖通過糖苷鍵連接起來而形成直鏈或支鏈的一類糖。 研究表明，在小鼠體內(nèi)實驗中，巴戟天寡糖能促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖加速。而巨噬細(xì)胞，在機(jī) 體免疫反應(yīng)的各個環(huán)節(jié)，都起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。本研究以與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)的J774巨 噬細(xì)胞為載體，觀察巴戟天寡糖對J774巨噬細(xì)胞增殖的影響，探討其免疫調(diào)節(jié)作用。
[0018] 由于寡糖單體并未有明顯活性的報道，且分離過程會增加工業(yè)化生產(chǎn)的成本，所 以以巴戟天的寡糖部位入藥較為合理。廣州中醫(yī)藥大學(xué)對巴戟天總寡糖的純化作了研究， 但是制備過程較為復(fù)雜，至少需要7個具體步驟，且得率不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種巴戟天寡糖，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能 作用。
[0020] 本發(fā)明提供了上述巴戟天寡糖的制備方法，該方法操作簡單，寡糖收率高，純度 高，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
[0021] 本發(fā)明還提供了該寡糖在制備治療調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的藥物中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0023] -種巴戟天寡糖，所述的寡糖含量50-99% (優(yōu)選巴戟天寡糖含量為80-99% )，所 含寡糖成分的高效液相指紋圖譜中含有單峰面積占總峰面積的百分比超過3%的共有峰為 8個峰，以峰3為參照峰，其它峰相對保留時間和相對峰面積為表1、附圖3-1。
[0024] 表1共有峰的相對保留時間就相對峰面積
[0026] 優(yōu)選為表2
[0027] 表2共有峰的相對保留時間就相對峰面積
[0029] 上述巴戟天寡糖的液相指紋圖譜是通過下述高效液相色譜條件測定得到：蒸發(fā)光 檢測器、蒸發(fā)室溫度50-90°C、霧化器溫度50-90°C、氮氣流速1. 0-1. 8SLM。
[0030] 色譜柱：兩性離子鍵合硅膠為填充劑，50 X 2. I