、硬膏劑、霜 劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。本發(fā)明的制劑，優(yōu)選的是口服劑型，如：膠囊劑、片劑、口服液、顆粒 劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等，更優(yōu)選為膠囊劑、顆粒劑、片劑和口服液。
[0074] 本發(fā)明所述的載體為藥學(xué)上常用的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸 氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素 C、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價(jià) 堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化 鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、 硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、 碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、β -環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂 酸鈣、硬脂酸鎂等。
[0075] 本發(fā)明的上述組成中均是按照重量份作為配比，在生產(chǎn)中可按照相應(yīng)比例增大或 減少，如大規(guī)模生產(chǎn)可以以公斤或噸為單位，小規(guī)模生產(chǎn)可以以mg為單位計(jì)。重量可以增 加或減少，但各組成之間的生藥材重量配比比例不能改變。
[0076] 本發(fā)明的以上重量比例是經(jīng)過(guò)科學(xué)篩選出的，對(duì)于特殊病人如重癥或輕癥可以相 應(yīng)增加或減少調(diào)整相應(yīng)的比例，但是增減或減少不超過(guò)300%，功效不變。
[0077] 為了更好的闡述本發(fā)明的有益效果，通過(guò)下述試驗(yàn)例來(lái)說(shuō)明。
[0078] 試驗(yàn)例一寡糖測(cè)定方法苯酚-硫酸法測(cè)巴戟天寡糖含量
[0079] 原理：植物體內(nèi)的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的單糖和寡糖。苯酚-硫酸 法測(cè)定可溶性糖的原理是：糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚反 應(yīng)，產(chǎn)生一種橙紅色化合物，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485nm波長(zhǎng) 下有最大吸收峰，故可用可見光分光光度法在485nm下測(cè)定。
[0080] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：
[0083] 按上表5加樣，然后順序加入7 %苯酚水溶液lmL，再加入5mL濃硫酸，室溫下放置 30min，然后以空白為參比在485nm處用可見光分光光度法測(cè)定。
[0084] 樣品溶液的制備：
[0085] 精密稱取實(shí)施例1制備得到的巴戟天寡糖0. 01541g于IOOmL量瓶中，加蒸餾水溶 解至刻度，搖勻，精密量取0. 3mL巴戟天寡糖溶液，精密加入I. 7mL水，然后順序加入7%苯 酸水溶液lmL，再加入5mL濃硫酸，室溫下放置30min，制得樣品溶液在485nm處用可見光分 光光度法測(cè)定。
[0086] 結(jié)果：巴戟天寡糖樣品中寡糖含量為：（0.218/0. 231)*100%= 94.4%。
[0087] 試驗(yàn)例二藥效學(xué)試驗(yàn)
[0088] 藥物：實(shí)施例一制備
[0089] 精密稱取巴戟天寡糖固體I. 00g，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基溶解，使 成濃度為lOOmg/mL的藥液。在超凈工作臺(tái)中過(guò)0. 22um微孔濾膜以去除雜菌，存放于15mL 離心管中備用。
[0090] 1J774巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)
[0091] I. I. I J774巨噬細(xì)胞的復(fù)蘇
[0092] 根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)，從_80°C冰箱中取出細(xì)胞盒，取出 所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。迅速將凍存管放入37°C的恒溫水浴鍋中解凍，并不斷搖 動(dòng)，使管內(nèi)的固體迅速融化，在2min內(nèi)完全融化完畢。外周經(jīng)消毒后迅速轉(zhuǎn)移進(jìn)已含有適 量10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基的中號(hào)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕輕水平搖動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞均 勻散開。放置于37°C、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。
[0093] I. I. 2J774巨噬細(xì)胞的傳代
[0094] 倒置細(xì)胞顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)觀察到細(xì)胞數(shù)量占整個(gè)視野40~50%時(shí)，需要傳 代培養(yǎng)。在超凈工作臺(tái)下，用巴氏吸管吸取培養(yǎng)瓶中原有的培養(yǎng)基輕輕吹打培養(yǎng)瓶有細(xì)胞 的一面，把J774巨噬細(xì)胞吹打下來(lái)。注意力度以免損傷J774導(dǎo)致其激活分化。1000轉(zhuǎn)/ min低速離心5min，棄去上清，加入新的培養(yǎng)基輕輕吹打均勾細(xì)胞，重新接種于新的培養(yǎng)瓶 中。傳代比例為1:2。
[0095] I. I. 3 J774巨噬細(xì)胞的日常培養(yǎng)
[0096] J774巨噬細(xì)胞經(jīng)過(guò)37°C、5% 0)2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h后需要 換液一次，否則由于生存環(huán)境惡化，細(xì)胞會(huì)被激活，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，變現(xiàn)為伸出偽足，分 泌物增多，以及增殖速度下降等等。超凈工作臺(tái)下，用巴氏吸管小心吸去原培養(yǎng)基，加入適 量的PBS輕輕清洗培養(yǎng)瓶有細(xì)胞一面，清洗2次。最后加入適量新的培養(yǎng)基，放置于37°C、 5 % CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0097] I. I. 4 J774巨噬細(xì)胞的凍存
[0098] 待細(xì)胞長(zhǎng)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶40~50%時(shí)，用巴氏吸管吸取培養(yǎng)瓶中原有的培養(yǎng)基輕 輕吹打培養(yǎng)瓶有細(xì)胞的一面，把J774巨噬細(xì)胞吹打下來(lái)。1000轉(zhuǎn)/min低速離心5min，棄 去上清，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，用適量的含20% FBS培養(yǎng)基，10% DMSO的凍存液凍存細(xì)胞。分裝于 凍存管中，每管I. 5mL。先置于4°C的冰箱放置30min，在轉(zhuǎn)移到-20攝氏度的冰箱中放置 2h，最后轉(zhuǎn)移到-80°C超低溫冰箱中保存。
[0099] I. 2J774巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線
[0100] 1.2.1細(xì)胞分組
[0101] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，于倒置細(xì)胞顯微鏡下血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為 2 X IO3個(gè) /mL、5 X 10 3個(gè) /mL、IX 10 4個(gè) /mL、2 X 10 4個(gè) /mL、3 X 10 4個(gè) /mL、4 X 10 4個(gè) /mL、 5 X IO4個(gè)/mL、6 X 10 4個(gè)/mL、7 X 10 4個(gè)/mL, 100 μ L/孔接種到96孔培養(yǎng)板中，并增加一組 調(diào)零空白對(duì)比，每組6個(gè)復(fù)孔，并每孔加入100 μ L的高糖DMEM培養(yǎng)基使每孔培養(yǎng)基容量為 200 μ L。放置于37°C、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為24h、48h、 72h。除去第一塊培養(yǎng)24h不需要作換液處理外，其余培養(yǎng)48h、72h的96孔板分別每24h 換培養(yǎng)基一次。
[0102] 1. 2. 2 MTT比色法檢測(cè)J774巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線
[0103] 待細(xì)胞培養(yǎng)到所需時(shí)間后，加入MTT (5mg/mL)溶液20 μ L/孔，繼續(xù)放置于37°C、 5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，小心棄去上清，每孔加入100 μ L DMS0,置于搖 床上低速震蕩IOmin使生成的甲臜結(jié)晶充分溶解，于OD57。處測(cè)量每孔的吸光值。將每組6 孔的OD值取平均值。繪制生長(zhǎng)曲線，從中選擇適合實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞接種密度。
[0104] 1.3巴戟天寡糖活性濃度的篩選
[0105] 1.3.1梯級(jí)濃度設(shè)計(jì)
[0106] 把巴戟天寡糖溶液由lOOmg/mL用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，梯級(jí)稀釋 至 0· 3906、0· 7812、1· 5625、3· 125、6· 25、12· 5、25、50、10〇11^/11^濃度用于活性濃度篩選。
[0107] 1.3.2細(xì)胞分組
[0108] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照1. 2. 3. 2檢測(cè)出最適合實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞接種密度（3X104個(gè)/ 1^，100以17孔）接種于96孔板中，約61 1后，待1774巨噬細(xì)胞完全貼壁，實(shí)驗(yàn)分組按空白 對(duì)照組和巴戟天寡糖給藥組（終濃度分別為0. 1953、0. 3906、0. 7812、I. 5625、3. 125、6. 25、 12. 5、25、50mg/mL)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。
[0109] 1. 3. 3 MTT比色法檢測(cè)巴戟天寡糖對(duì)J774巨噬細(xì)胞增殖的影響
[0110] 待細(xì)胞貼壁后，吸棄上清，按上述分組給藥，每孔終體積為200 yL。37°C、5% CO2 及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中24h后，加入MTT (5mg/mL)溶液20 μ L/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上 清，每孔加入150 μ L DMS0,置搖床上低速震蕩IOmin使結(jié)晶物充分溶解，于OD57。處測(cè)量每 孔吸光值。
[0111] L 4 MTT 的制備
[0112] 取一只Sigma 0· 25g分裝的噻唑藍(lán)MTT，加入裝有50mL的PBS的離心管中，超聲處 理約IOmin至完全溶解后，表面用70%乙醇棉球消毒后置于超凈工作臺(tái)中用0. 22 μ m微孔 濾膜濾過(guò)，分裝于2. 5mL PB管中，放4°C冰箱中避光保存。在配置以及保存過(guò)程中，容器采 取鋁箱包裹避光處理。
[0113] 1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0114] 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（X土s)表示，應(yīng)用SPSS 18. 0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P < 0. 05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0115] 2數(shù)據(jù)分析與結(jié)果
[0116] 2. I J774巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線
[0117] 通過(guò)MTT比色法測(cè)定，以2X IO2個(gè)/孔、5X10 2個(gè)/孔、IX IO3個(gè)/孔、2X10 3個(gè)/ 孔、3X IO3個(gè)/孔、4X 10 3個(gè)/孔、5X 10 3個(gè)/孔、6X 10 3個(gè)/孔、7X 10 3個(gè)/孔密度接種的 J774巨噬細(xì)胞的72小時(shí)生長(zhǎng)曲線圖如圖1所示。
[0118] 表6、7、8為J774巨噬細(xì)胞MTT測(cè)量OD值。