利用takara的SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系如下，
[0072]
[0073] 利用Rotor Gene 3000A儀器進(jìn)行兩步法擴(kuò)增，95°C預(yù)變性2min，進(jìn)行40個(gè)PCR循 環(huán)，95°C 5 秒，60°C 30 秒。
[0074] 3、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
[0075] 采用CCK-8方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染SiRNA后對(duì)細(xì)胞增殖的影響，具體步驟如下：
[0076] 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔3000個(gè)的密度接種于96孔板。待細(xì)胞過(guò)夜貼壁 后，轉(zhuǎn)染各siRNA，培養(yǎng)48小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。棄去原有培養(yǎng)基，每孔加入含10 μ L CCK-8的新鮮培養(yǎng)基110 μ L，培養(yǎng)3h后用多功能酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值。 實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)算平均值。
[0077] 4、EV71病毒感染Caco-2細(xì)胞
[0078] 4. lCaco-2細(xì)胞的EV71病毒感染實(shí)驗(yàn)
[0079] Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染RNA后60小時(shí)，進(jìn)行EV71病毒感染實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)上清吸出，用預(yù) 溫PBS潤(rùn)洗2次，以MOI = 0. 1的病毒量接種EV71，37°C孵育2h后棄去病毒液，并用預(yù)溫 PBS潤(rùn)洗3次，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0080] 4. 2免疫熒光染色檢測(cè)EV71抗原表達(dá)
[0081] Caco-2細(xì)胞感染病毒后繼續(xù)培養(yǎng)48h，采用免疫熒光法檢測(cè)病毒抗原的表達(dá)，具 體步驟如下：
[0082] 1)細(xì)胞固定：將96孔板中的培養(yǎng)液移去，加入PBS清洗細(xì)胞2次，每孔加入100 μ 1 預(yù)冷甲醇，于-20°C條件下固定20min，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次。
[0083] 2)透膜：固定后的細(xì)胞每孔加入100 μ 1 0. 1% TritonX-100,室溫孵育15min，用 預(yù)冷PBS洗滌3次。
[0084] 3)封閉：每孔加入100 μ I 3% BSA，于室溫下孵育lh。
[0085] 4) 一抗孵育：每孔加入EV71特異性鼠源單抗I(M) (1:2000稀釋?zhuān)?00 μ 1，室溫孵 育Ih，用預(yù)冷的PBS洗滌3次。
[0086] 5)二抗孵育：每孔加入AF 488熒光標(biāo)記抗鼠 IgG(l: 1000稀釋?zhuān)?00 μ 1，室溫避光 孵育lh，用預(yù)冷的PBS避光洗滌2次。
[0087] 6)標(biāo)記細(xì)胞核：每孔加入細(xì)胞核熒光染料DAPI (1:5000, PBS稀釋?zhuān)?，室溫避光孵?15min，用預(yù)冷的PBS避光洗滌3次。
[0088] 7)熒光顯微鏡下檢測(cè)并計(jì)算綠色AF 488陽(yáng)性細(xì)胞克隆數(shù)。
[0089] 4. 3qRT_PCR檢測(cè)細(xì)胞中EV71病毒量
[0090] Caco-2細(xì)胞感染病毒后繼續(xù)培養(yǎng)48h，采用TRIzoI提取對(duì)照組與干擾組細(xì)胞的總 RNA，并逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)EV71病毒量。具體步驟同2. 2所示。
[0091] 5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0092] 1、設(shè)計(jì)、合成并篩選有效的siRNA
[0093] 針對(duì)各個(gè)目的基因序列，我們?cè)O(shè)計(jì)了多個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列，并利用設(shè)計(jì)軟件進(jìn) 行預(yù)評(píng)估測(cè)定，選擇3個(gè)最佳的動(dòng)力學(xué)參數(shù)靶點(diǎn)進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)流程，每一基因共合成3條干 擾序列，如表1所示。
[0094] 采用體外轉(zhuǎn)染的方法，將各個(gè)基因的干擾RNA轉(zhuǎn)染到Caco-2細(xì)胞中去，48h后通 過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)各干擾RNA的干擾效率，最終篩選到干擾效果最佳的siRNA序列進(jìn)行后 續(xù)實(shí)驗(yàn)，其干擾效率如表2所示。
[0095] 表2qRT_PCR法檢測(cè)siRNA干擾序列對(duì)相關(guān)宿主基因的下調(diào)效率

[0098] 注：CTRL :不轉(zhuǎn)染任何siRNA的Caco-2細(xì)胞組（空細(xì)胞組）
[0099] NT :轉(zhuǎn)染 non-targeting siRNA 的 Caco-2 細(xì)胞組（陰性對(duì)照組）
[0100] SiRNA :轉(zhuǎn)染針對(duì)各目的基因的SiRNA的Caco-2細(xì)胞組（實(shí)驗(yàn)組）。
[0101] 2、SiRNA干擾后的干擾效率以及細(xì)胞毒性檢測(cè)
[0102] 挑選出的針對(duì)各宿主分子的有效SiRNA轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h通過(guò) qRT-PCR法檢測(cè)各干擾RNA的干擾效率，同時(shí)采用CCK8檢測(cè)轉(zhuǎn)染后對(duì)Caco-2細(xì)胞毒性的影 響。
[0103] 結(jié)果如圖1所示，轉(zhuǎn)染有效siRNA組與CTRL組相比，轉(zhuǎn)染各siRNA后能夠明顯抑 制相應(yīng)基因的表達(dá)水平（P<〇. 01)。轉(zhuǎn)染 VPS4A siRNA(SEQ ID N0:35)和 HRS siRNA(SEQ ID NO:39)的抑制效率分別高達(dá)72. 17%和78. 88%。
[0104] 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，各siRNA轉(zhuǎn)染后并沒(méi)有產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性（P > 0. 05)，對(duì)細(xì) 胞正常的生理功能未產(chǎn)生影響，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0105] 3、siRNA干擾后對(duì)EV71病毒感染的影響
[0106] 轉(zhuǎn)染各宿主分子的有效siRNA來(lái)下調(diào)宿主細(xì)胞相關(guān)分子的表達(dá)后，感染相同劑量 的EV71病毒，感染48h后，采用免疫熒光法檢測(cè)各宿主分子下調(diào)后對(duì)EV71感染的影響，發(fā) 現(xiàn)與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 VPS4A siRNA(SEQ ID NO: 35)和 HRS siRNA(SEQ ID NO: 39)分別使 VPS4A基因和HRS基因下調(diào)后，明顯降低了 EV71對(duì)Caco-2細(xì)胞的感染（圖2A)。通過(guò)計(jì)算 病毒量發(fā)現(xiàn)，VPS4A和HRS基因下調(diào)后對(duì)病毒的抑制率分別達(dá)到59. 44%和68. 57%，而其 余分子的下調(diào)并沒(méi)有明顯抑制EV71對(duì)Caco-2細(xì)胞的感染（P > 0. 05)(圖2B)。
[0107] 為明確VPS4A和HRS對(duì)EV71感染的抑制作用，分別轉(zhuǎn)染三條VPS4A和HRS分子的 siRNA觀(guān)察對(duì)病毒感染性的影響。結(jié)果表明不同的siRNA對(duì)VPS4A和HRS分子的下調(diào)效率 不同（圖 3A、3B)，其中 VPS4A siRNA(SEQ ID N0:35)和 HRS siRNA(SEQ ID N0:39)的干擾 效率最高，與前面的結(jié)果相一致。檢測(cè)干擾后對(duì)EV71感染性的影響發(fā)現(xiàn)，三條VPS4A和三 條HRS分子的siRNA對(duì)病毒感染的抑制率均可達(dá)到50%以上，而且隨著對(duì)VPS4A和HRS分 子的下調(diào)效率的增高，對(duì)EV71感染的抑制率也在升高（圖3C、3D)，提示VPS4A和HRS分子 在EV71感染Caco-2中發(fā)揮著重要作用。因此，VPS4A和HRS可作為抑制EV71對(duì)Caco-2細(xì) 胞感染的新的宿主靶點(diǎn)。
[0108] 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：本發(fā)明篩選到能夠抑制EV71感染Caco-2細(xì)胞的兩個(gè)新 的宿主細(xì)胞分子VPS4A和HRS。VPS4A和HRS基因下調(diào)以后，不影響細(xì)胞正常的生理功能， 但明顯抑制了 EV71對(duì)Caco-2細(xì)胞的感染。因此本發(fā)明為臨床預(yù)防和治療EV71感染提供 了新的靶點(diǎn)。
[0109] 以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說(shuō)明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述 實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的 變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物在制備預(yù)防或治療腸道病毒71型感染藥物 中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物在制備預(yù)防或治療 腸道病毒71型感染藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的腸道病毒71型感染導(dǎo)致的疾病為手 足口病。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物在制備預(yù)防或治 療腸道病毒71型感染藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物是指能夠抑制或下調(diào)肝細(xì)胞 生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物的表達(dá)量的試劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物在制備預(yù)防或治療 腸道病毒71型感染藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的能夠抑制或下調(diào)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào) 節(jié)的酪氨酸激酶底物的表達(dá)量的試劑是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物的siRNA、 shRNA或包含siRNA、shRNA的重組載體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物在制備預(yù)防或治療 腸道病毒71型感染藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶 底物的siRNA的序列選自以下任一： GGUAUCUCAACCGGAACUACU(SEQIDN0:37)、 CGGAGUAACACUACAUACAGU(SEQIDN0:38)、 CAGAAUGGUACAGCGAUAAUA(SEQIDN0:39)〇
【專(zhuān)利摘要】肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物在制備防治腸道病毒71型感染藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是一種抗腸道病毒71型感染的新靶點(diǎn)及應(yīng)用。本發(fā)明以人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)作為靶細(xì)胞，采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)靶細(xì)胞宿主蛋白的表達(dá)，來(lái)尋找可有效抑制EV71感染人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)的宿主因子，達(dá)到從源頭(腸道)有效切斷EV71感染的目的。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物(hepatocyte？growthfactor-regulated？tyrosine？kinasesubstrate，HRS)在EV71感染Caco-2中發(fā)揮著重要的作用，下調(diào)HRS的表達(dá)，能明顯抑制EV71的感染。本發(fā)明提供了HRS在制備預(yù)防或治療腸道病毒71型感染藥物中的應(yīng)用。
【IPC分類(lèi)】A61K38/17, A61P31/14
【公開(kāi)號(hào)】CN105267948
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510287409
【發(fā)明人】朱勇喆, 任浩, 戚中田, 陳生林, 趙平, 徐慶強(qiáng)
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2015年5月29日