馬尾松聚戊烯醇提取方法及應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬生物技術(shù)領域，具體涉及馬尾松聚戊烯醇提取方法及馬尾松聚戊烯醇在 生產(chǎn)治療雞傳染性支氣管炎藥物中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展和畜禽數(shù)量的增多，各種疾病特別是高致病性禽流感、豬 高致病性藍耳病等病毒性疾病也不斷暴發(fā)流行，已成為制約養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸，它不僅造 成畜禽大量死亡和畜產(chǎn)品質(zhì)量下降，而且還嚴重威脅人類的健康。但目前用于防治動物病 毒性疾病多為化學藥物，而這些藥物長期大量使用，不僅嚴重損害動物機體，而且肉、蛋、奶 等畜產(chǎn)品中的有害殘留嚴重超標，對人類健康造成連帶危害。為此我國在2006年就禁止在 動物生產(chǎn)中使用化學抗病毒獸藥，這就使得諸如高致病性禽流感、豬高致病性藍耳病等動 物烈性病毒病治療藥物成為空白。
[0003] 針葉類植物(馬尾松、黑松、濕地松及雪松）及銀杏葉等植物中含有一種具有抗病 毒作用的有效成分一聚戊稀醇。聚戊稀醇polyprenol亦稱聚異戊稀醇（polyisoprenol)， 是異戊二烯單體（異戊烯基）鏈接成直鏈狀的多聚化合物的總稱，在自然界廣泛存在。聚 戊烯醇是長鏈脂肪醇，結(jié)構(gòu)中含有多個非共輒雙鍵，具有非常強烈的吸收自由基的性能， 對人體無毒、無致突變、無致畸和無致癌作用，是生物體細胞膜中糖蛋白合成過程中的重 要活性成分，參與生物體內(nèi)多種代謝，具有明顯的生理和藥理作用，生物活性十分廣泛。
[0004] 然而，目前國內(nèi)聚戊烯醇的研究處于起步階段，且大多數(shù)研究的主要原料為銀杏 葉，有機溶劑如石油醚、正已烷-丙酮等方法，從銀杏葉中提取得到聚戊烯醇。如大連理工 大學環(huán)境與生命學院進行的"銀杏葉聚戊烯醇類化合物的制備與分析"、"正交設計法在銀 杏葉聚戊烯醇提取工藝中的應用";鎮(zhèn)江醫(yī)學院、江蘇理工大學進行的"銀杏聚戊烯醇提取 技術(shù)研究"；中國林科院林產(chǎn)化學工業(yè)研究所進行的"銀杏葉聚戊烯醇的化學、純化和藥效 研究"、"從植物針葉原料中提取高純度聚戊烯醇的方法"、"銀杏葉聚戊烯醇和銀杏葉提取 物（GBE)的制備方法及其用途"等。由于銀杏葉資源有限，價格高昂，僅適合制備人藥之用， 不適合動物用藥。因此，尋找既能消滅存在于細胞內(nèi)的病毒，又沒有毒副作用的藥物，研究 開發(fā)綠色天然、植物源性抗病毒中獸藥就成為當務之急。
[0005] 另一方面，普通方法得到的聚戊烯醇分子質(zhì)量大，很難通過微血管壁和細胞膜屏 障達到有效的抗病毒濃度，即使有些成分能進入特定器官的細胞，也極易被細胞內(nèi)的酶系 破壞，導致聚戊烯醇在人體和動物體內(nèi)的生物利用度較低，影響其生物活性研究以及相關 制劑開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種馬尾松聚戊烯醇提取方法。
[0007] -種馬尾松聚戊烯醇提取方法，它包括： 1)取馬尾松葉粉末，按每l〇〇g加入450-550ml石油醚，70°C，回流提取，重復提取，合 并提取液，回收溶劑，得到石油醚粗提物； 2) 按每2. 3 -2. 5 g上述的石油粗提物中加入濃度為20% wt的氫氧化鈉溶液9-llml， 在70°C溫度下攪拌反應1小時，用石油醚萃取，合并石油醚萃取液，水洗至溶液呈中性為 止，減壓濃縮回收溶劑，得到馬尾松葉不皂化物； 3) 馬尾松葉不皂化物中加入丙酮，加熱攪拌溶解后，在0°C條件下靜置4小時，過濾除 去析出物，濾液濃縮回收溶劑后，得聚戊烯醇粗提物； 4) 向上述的聚戊烯醇粗提物中加入濃度為92% wt的乙醇溶液，加熱攪拌溶解后，冷卻 至室溫，靜置分層，吸取上清液，沉淀物加入乙醇溶液，重復處理5次，得到乙醇不溶物； 5) 向上述的乙醇不溶物中加入丙酮，攪拌溶解后，在_22°C溫度下冷凍，過濾除去濾 液，濾餅加入丙酮，重復上述操作5次，濾餅濃縮干燥后，得到馬尾松聚戊烯醇； 上述的馬尾松聚戊稀醇，按每l〇g馬尾松聚戊稀醇，加入Tween-80和Span-80混合 物15-20g，邊加入邊攪拌，得到油相；向上述的油相中緩慢加入去離子水，體系短暫渾濁后 變澄清，待體系穩(wěn)定后，在40°C下，邊攪拌邊繼續(xù)加入去離子水轉(zhuǎn)相，體系將由澄清變?yōu)闇?池，隨后提高溫度至60°C，用均質(zhì)乳化機以15000r/min的攪拌速度攪拌15 min，體系變 為澄清，即可得到聚戊稀醇納米乳液，所述的Tween-80和Span-80混合物，其Tween-80和 Span-80的重量比為0.9-1 : 1〇
[0008] 本發(fā)明第二個目的是提供馬尾松聚戊烯醇在生產(chǎn)治療雞傳染性支氣管炎藥物中 的用途。
[0009] 本發(fā)明提供了一種馬尾松聚戊烯醇提取方法，包括石油醚提取，氫氧化鈉水解， 丙酮、乙醇多次處理，得到馬尾松聚戊烯醇。按每l〇g馬尾松聚戊烯醇，加入Tween-80和 Span-80混合物15-20g，經(jīng)過攪拌、去離子水轉(zhuǎn)相的步驟，得到聚戊烯醇納米乳液。本發(fā)明 也提供了一種馬尾松聚戊烯醇在生產(chǎn)治療雞傳染性支氣管炎藥物中的應用，試驗結(jié)果表 明，納米聚戊烯醇和普通聚戊烯醇的有效率分別為98. 67%、97. 33% ;治/自愈率分別為98%、 97. 33%，可見納米聚戊烯醇療效優(yōu)于普通聚戊烯醇，并且兩者的療效均明顯優(yōu)于陰性對照 組。從劑量與療效相關性來看，隨著計量增加，療效有上升趨勢，確定推廣臨床用藥劑量為 〇. 4毫升/只。并且納米聚戊烯醇無慢性和急性毒性，臨床使用安全。
[0010]
【具體實施方式】
[0011] 實施例1聚戊烯醇的提取 馬尾松葉采摘后洗凈、烘干、碾碎，制成含水率10%wt的粉末。取上述的馬尾松葉粉末 l〇〇g置于lOOOrnl的圓底燒瓶中，加入500ml石油醚加熱至70°C，回流提取2小時，過濾，濾 渣再加入500ml石油醚，重復提取。合并兩次提取液，減壓濃縮回收溶劑，得到石油醚粗提 物5. 7g。向上述的石油醚粗提物中加入10ml濃度為20% wt的氫氧化鈉溶液，在70°C溫 度下攪拌反應1小時，用20ml石油醚萃取5次，合并石油醚萃取液，水洗至溶液呈中性為 止，減壓濃縮回收溶劑，得到馬尾松葉不皂化物2. 9g。向上述的馬尾松葉不皂化物中加入 30ml丙酮，加熱攪拌溶解后，在0°C條件下靜置4小時，過濾除去析出物，濾液濃縮回收溶劑 后，得到2. 4g聚戊烯醇粗提物。向上述的聚戊烯醇粗提物中加入濃度為92% wt的乙醇溶 液l〇ml，加熱攪拌溶解后，冷卻至室溫，靜置分層，吸取上清液，沉淀物加入乙醇溶液，重復 處理5次，得到1.3g乙醇不溶物。向上述的乙醇不溶物中加入20ml丙酮，攪拌溶解后， 在_22°C溫度下冷凍6小時，過濾除去濾液，濾餅加入20ml丙酮，重復上述操作5次，濾餅 濃縮干燥后，得到〇.7g淺黃色油狀物，聚戊烯醇含量為96% wt。
[0012] 本發(fā)明聚戊稀醇的純度測定使用高效液相色譜法，色譜柱為分析柱Kromasil C18 0051(15〇1111]1\4.61111]1，5以1]1)，柱溫為室溫，紫外檢測波長為206111]1，流動相為異丙醇：甲醇： 正己烷：水=50 : 25 : 10 : 4(v/v)，流量為 lml/min。
[0013] 實施例2納米聚戊烯醇的制備 稱取上述的淺黃色油狀物l〇g于250ml錐形瓶中，邊攪拌邊加入由8. 5gTween-80和 9. 0gSpan-80預先混合均勻的混合物，充分攪拌后，得到油相。向上述的油相中緩慢加入 5ml去離子水，體系短暫渾濁后變澄清，待體系穩(wěn)定后，在40°C下，邊攪拌邊繼續(xù)加入100ml 去離子水轉(zhuǎn)相，體系將由澄清變?yōu)闇啙?，隨后提高溫度至60°C，用均質(zhì)乳化機以15000r / min的攪拌速度攪拌15 min，體系變?yōu)槌吻?，即可得到聚戊烯醇納米乳液。對上述的聚戊烯 醇納米乳液進行粒徑分布及顯微分析，結(jié)果顯示乳液平均粒徑可達到97nm。
[0014] 實施例3納米聚戊烯醇對人工感染雞傳染性支氣管炎模型的防治試驗 納米聚戊烯醇，項目組研制提供，純度96% ;普通聚戊烯醇，項目組研制提供，純度96% ; IBV標準株M41，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；IBV抗體檢測試劑盒，北京愛德士元亨生物科技 有限公司生產(chǎn)，批號：09261-ADI660 ;318MC酶標儀，上海三科儀器有限公司生產(chǎn)；SPF種 蛋，購于山東斯帕斯種蛋有限公司；孵化器其他試驗用品，課題組提供；非免疫海蘭公雞， 太原市小店區(qū)種雞場提供。
[0015] 所有操作均須嚴格無菌。實驗室及超凈臺都需要先用紫外線消毒20~30分鐘， 實驗用具高壓消毒滅菌，接種操作在超凈工作臺進行。
[0016] (1) IBV種毒傳代和EID50測定： 接種前處理：先用檢卵燈在暗室檢查雞胚活力，用鉛筆畫出氣室和胚胎的位置，并在氣 室下沿無血管處的接種部位做一個記號。雞胚發(fā)育正常時，可見清晰的血管、活的雞胚血管 及其主要分支均明顯，呈現(xiàn)鮮紅色，雞胚可以活動。未受精和死胚胚體固定在一端不動，看 不到血管者，應予以剔除。
[0017] 尿囊腔接種：取出雞胚，在雞胚氣室下沿的接種部位(打孔位置）用碘酒消毒、酒精 棉脫碘，打孔器用酒精燈火焰消毒后，在接種部位打一小孔。IBV標準株M41種毒按1 :10稀 釋，加雙抗（2000IU/ml)，后4°C作用4~6小時，用注射器吸取病毒稀釋液，隨后將注射器 針頭從接種部位垂直插入至〇. 5~1厘米處，注入0. 2毫升接種物，緊接著用石蠟封口，并 置于孵化箱中直立孵育。孵育36~40小時后收獲尿囊液，取出，4°C冰箱過夜(大約10小 時）或-20°C冰箱中1. 5小時凍死雞胚，以免收獲時出血。從冰箱取出雞胚，用碘酒或75% 酒精消毒氣室部蛋殼，在超凈臺用鑷子剝開氣室部位的蛋殼，撕去內(nèi)層殼膜和絨毛尿囊膜， 用鑷子輕輕按住胚腔，以無菌吸管或消毒注射器避開血管收集尿囊液，以3000r/min的速 度離心30分鐘，取出上清液，將收集的雞胚尿囊液合并均勻分裝，存于-20°C冰箱，以備下 次傳代用。以上方法盲傳5代，試驗所用種毒是IBV第5代病毒。
[0018] EID50的測定：將含IBV-M41的尿囊液做10 3~10 8稀釋，每個稀釋度接種10日 齡IB-SPF雞胚5枚（0. 1毫升/胚)，同時設有對照組，接種生理鹽水至20日齡后，記錄侏 儒胚及死亡情況，最終測定病毒含量EID50為10 6·5°/0. lml。
[0019] (2)預試驗： 選擇健康無病，體格、體重差異不大，試驗期間不做任何疫苗免疫的400只18日齡海蘭 褐公雛雞作為試驗動物，其中預試驗50只，正式試驗350只。
[0020] 攻毒劑量篩選試驗：將上述的50只試驗動物，按隨機區(qū)組設計分為A、B、C、D和E 共五個攻毒劑量組，每組10只。五個攻毒劑量組依次按照〇. 2毫升/只、0. 3毫升/只、0. 5 毫升/只、〇. 7毫升/只和1. 0毫升/只五個攻毒劑量進行滴鼻上述的IBV第5代病毒。
結(jié)果表明，A、B、C劑量組攻毒后第3天有18只發(fā)病，發(fā)病率60%，而D和E劑量組的雛 雞發(fā)病均達到90%