一種酶法不對(duì)稱(chēng)還原檸檬醛提高(r)?香茅醛光學(xué)純度的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種酶法不對(duì)稱(chēng)還原檸檬醛提高(R)?香茅醛光學(xué)純度的方法，即氨基酸催化的檸檬醛順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)與釀酒酵母烯醇還原酶OYE1催化的檸檬醛不對(duì)稱(chēng)氫化反應(yīng)相偶聯(lián)，提高檸檬醛氫化產(chǎn)物(R)?香茅醛光學(xué)純度的方法。所述釀酒酵母烯醇還原酶OYE1催化檸檬醛順?lè)串悩?gòu)體不對(duì)稱(chēng)氫化合成(R)?香茅醛時(shí)，其(R)?香茅醛源自反式檸檬醛，而(S)?香茅醛源自于順式檸檬醛，并且對(duì)反式檸檬醛的催化速率要遠(yuǎn)高于順式檸檬醛。通過(guò)偶聯(lián)氨基酸催化的檸檬醛順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)，將部分順式檸檬醛轉(zhuǎn)化為反式檸檬醛，顯著地提高了產(chǎn)物(R)?香茅醛的e.e.值；在10mL催化體系中，添加100mg/mL的甘氨酸，50mM檸檬醛經(jīng)4h的催化反應(yīng)后，(R)?香茅醛的e.e.值達(dá)65.4％，與不偶聯(lián)順?lè)串悩?gòu)化反應(yīng)時(shí)(R)?香茅醛的e.e.值(16.7％)相比，提高了48.7％。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種酶法不對(duì)稱(chēng)還原檸檬醛提高(R)-香茅醛光學(xué)純度的方法 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種烯醇還原酶催化檸檬醛的不對(duì)稱(chēng)氫化合成(R)-香茅醛的方法，特 別涉及一種通過(guò)檸檬醛的酶法不對(duì)稱(chēng)氫化與氨基酸催化的檸檬醛順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)相偶聯(lián)從 而提高氫化產(chǎn)物(R)-香茅醛光學(xué)純度的方法。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 檸檬醛屬于萜烯脂肪醛，分子式為C1QH16O,具有濃烈的檸檬香氣，是一種具有廣闊 應(yīng)用前景的香料。目前檸檬醛的工業(yè)生產(chǎn)主要是化學(xué)法，包括脫氫芳樟醇轉(zhuǎn)位法以及異戊 烯醇和異戊烯醛縮合重排合成法。無(wú)論是天然產(chǎn)物中提取的還是化學(xué)合成來(lái)源的檸檬醛均 存在兩種立體異構(gòu)體:順式檸檬醛(橙花醛)和反式檸檬醛(香葉醛）。氨基酸能催化檸檬醛 的順?lè)串悩?gòu)化反應(yīng)，以順式檸檬醛或反式檸檬醛為底物，經(jīng)氨基酸催化后異構(gòu)化產(chǎn)物中順 式朽 1檬醛與反式梓檬醛的比例約為60:40，與商品梓檬醛中的順?lè)幢壤嘟?。梓檬醛是含?兩個(gè)C = C鍵和一個(gè)C = O鍵的α，β-不飽和醛，其順?lè)串悩?gòu)體的C = C鍵和C = O鍵的選擇性加氫 可得到多種具有重要用途的氫化產(chǎn)物。檸檬醛α，Μ立的C = C鍵不對(duì)稱(chēng)氫化可得到(R)-香茅 醛，而(R)-香茅醛是L-薄荷醇的工業(yè)生產(chǎn)中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，其經(jīng)Prins閉環(huán)反應(yīng)形成異胡 薄荷醇，異胡薄荷醇再經(jīng)氫化反應(yīng)得到L-薄荷醇;L-薄荷醇具有新鮮并帶有刺激性甜味，還 有強(qiáng)烈的清涼作用，工業(yè)價(jià)值巨大。
[0003] 從檸檬醛不對(duì)稱(chēng)氫化合成(R)-香茅醛是最直接的合成路徑，然而檸檬醛的結(jié)構(gòu)特 點(diǎn)決定了該反應(yīng)在化學(xué)合成上要兼顧化學(xué)選擇性和立體選擇性。因而，檸檬醛不對(duì)稱(chēng)氫化 合成(R)-香茅醛在化學(xué)合成上仍具有較大的難度，事實(shí)上目前的(R)-香茅醛工業(yè)化生產(chǎn)并 不是以檸檬醛而是以月桂烯為底物從而實(shí)現(xiàn)化學(xué)合成。日本高砂公司通過(guò)以月桂烯為底物 合成(R)-香茅醛，（R)-香茅醛經(jīng)閉環(huán)反應(yīng)成L-胡異薄荷醇，再進(jìn)一步加氫得到高純度的L-薄荷醇。該化學(xué)法工業(yè)化合成L-薄荷醇已應(yīng)用多年，但仍然存在催化劑昂貴、得率不高等問(wèn) 題。鑒于此，開(kāi)發(fā)化學(xué)法的替代工藝具有重要的學(xué)術(shù)意義和較高的應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 與化學(xué)法加氫還原相比，生物酶法不對(duì)稱(chēng)合成具有條件溫和、綠色環(huán)保、立體選擇 性高、工藝簡(jiǎn)單、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，是最被人寄予期望的化學(xué)法的替代者。生物酶法不對(duì)稱(chēng) 氫化檸檬醛合成(R)-香茅醛的關(guān)鍵酶是烯醇還原酶。諸多研究表明，野生型的烯醇還原酶 具有兩個(gè)不足之處。一方面，烯醇還原酶的催化中心較小，適用于催化小分子底物，而合成 的產(chǎn)物往往是大分子;另一方面，與化學(xué)法催化類(lèi)似，同一烯醇還原酶催化順?lè)串悩?gòu)體的加 氫，其產(chǎn)物的手性往往是互補(bǔ)的，因而若底物是順?lè)串悩?gòu)體混合物，其氫化反應(yīng)產(chǎn)物的e. e. 值往往很低。因此，為了實(shí)現(xiàn)酶法不對(duì)稱(chēng)氫化檸檬醛合成(R)-香茅醛，通過(guò)偶聯(lián)氨基酸催化 的檸檬醛順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)進(jìn)而提高氫化產(chǎn)物(R)-香茅醛的光學(xué)純度具有重要的研究意義和 應(yīng)用價(jià)值。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是利用能耐受高底物濃度的釀酒酵母烯醇還原酶OYEl作為生物催化 劑，直接通過(guò)檸檬醛的不對(duì)稱(chēng)氫化合成(R)-香茅醛，在不對(duì)稱(chēng)氫化體系中同時(shí)偶聯(lián)氨基酸 催化的檸檬醛順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)，從而提高(R)-香茅醛的e.e.值。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一種酶法不對(duì)稱(chēng)還原檸檬醛提高(R)-香茅醛光學(xué)純度的方法，即氨基 酸催化的檸檬醛順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)與釀酒酵母烯醇還原酶OYEl催化的檸檬醛不對(duì)稱(chēng)氫化反應(yīng) 相偶聯(lián)，提高檸檬醛氫化產(chǎn)物(R)-香茅醛光學(xué)純度的方法，具體所述方法為：以含釀酒酵母 烯醇還原酶OYEl編碼基因的工程菌發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體經(jīng)超聲破碎后分離純化獲得的 純酶為催化劑，以含博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶n)HCB編碼基因的工程菌發(fā)酵培養(yǎng)獲得的 濕菌體經(jīng)超聲破碎后分離純化獲得的純酶為偶聯(lián)酶；以檸檬醛為底物，以仲辛醇為溶劑，底 物溶于仲辛醇中；以甲酸鈉為輔底物，以NAD +為輔酶;添加氨基酸，以pH 6.0~9.5的緩沖液 為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，在30°C、200rpm條件下反應(yīng)3.5~10h，反應(yīng)結(jié)束后，獲得(R)-香 茅醛，經(jīng)氣相色譜法分析，測(cè)定反應(yīng)液中產(chǎn)物(R)-香茅醛的得率和e.e.值;所述釀酒酵母烯 醇還原酶OYEl編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示，所述博伊丁假絲酵母甲酸脫氫 酶FDHCB編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.3所示。
[0008] 所述轉(zhuǎn)化體系中，底物用仲辛醇配制為IM底物溶液，所述底物以IM底物溶液的形 式加入，底物終濃度為50mM(即底物溶液的用量以底物物質(zhì)的量計(jì)，底物在轉(zhuǎn)化體系中的終 濃度為50mM)，催化劑用量為0.76U/mL轉(zhuǎn)化體系，偶聯(lián)酶用量為1.25U/mL轉(zhuǎn)化體系，NAD +終 濃度為〇. 625mM，甲酸鈉終濃度為250mM，氨基酸終濃度為100mg/mL轉(zhuǎn)化體系。
[0009] 進(jìn)一步，所述的氨基酸包括D-蛋氨酸、L-蛋氨酸、D/L-纈氨酸、甘氨酸、L-絲氨酸、 L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-賴(lài)氨酸和L-酪氨酸，更優(yōu)選甘 氨酸。
[0010] 進(jìn)一步，所述緩沖液優(yōu)選為pH 7.0、50mM的PIPES緩沖液。
[0011] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述催化劑按如下方法制備：（1)將含釀酒酵母烯醇還原酶OYEl編 碼基因的工程菌(E.coli BL21(DE3)/pEASY-El-〇yel)接種至含100yg/mL氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)12h，獲得種子液，然后按體積濃度1 %接種量接種至150mL含100μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在相同條件下（37 °C )培養(yǎng)至菌液濃度(0D_)約為0.6 ~0.8時(shí)，添加誘導(dǎo)劑IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至終濃度為0.2mM，在25°C和 200rpm下誘導(dǎo)10~12h，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)液，再將誘導(dǎo)培養(yǎng)液于4 °C和1000 Orpm下離心10min， 棄去上清液，收集濕菌體；（2)將步驟（1)濕菌體加入Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中，在500W下 超聲破碎20min，工作2s，間歇6s，破碎液于4°C和12000rpm下離心10min，重復(fù)離心三次后得 到上清粗酶液;所述Tris-HCl緩沖液體積用量以濕菌體重量計(jì)為15mL/g。采用Ni-NTA金屬 螯合親和層析，取上清粗酶液上樣至預(yù)平衡Ni 2+柱中，再依次用含IOmM咪唑、40mM咪唑、 IOOmM咪唑、250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫雜蛋白和目的蛋白，收集含IOOmM咪唑的洗脫緩沖 液的流出液，用50mM、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液通過(guò)超濾濃縮脫鹽，所得的脫鹽酶液，即為 釀酒酵母烯醇還原酶OYEl酶液;所述的超濾指的是流出液加入截留分子量IOkDa的超濾管 中，加入50mM、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液，在5000rpm下離心20分鐘，然后收集截留的酶液， 即為脫鹽酶液;所述洗脫緩沖液為含300mM氯化鈉的pH 8.0、50mM的Tris-HCl緩沖液。
[0012] 除了篩選基因重組菌的抗性平板中所用的抗生素是Kan外，所述偶聯(lián)酶的表達(dá)和 純化流程與催化劑制備流程一致，具體所述偶聯(lián)酶按如下方法制備：（1)將含博伊丁假絲酵 母甲酸脫氫酶FDHCB編碼基因的工程菌接種于含lOOyg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在 37°C和200rpm條件下培養(yǎng)12h，作為種子液;然后按體積濃度1%接種量接種至含lOOyg/mL 卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C和200rpm條件下培養(yǎng)至OD6qq為0.6~0.8時(shí)，添加誘導(dǎo) 劑IPTG至終濃度為0.2mM，在25°C和200rpm下繼續(xù)培養(yǎng)10~12h，培養(yǎng)液離心，收集濕菌；（2) 將步驟（1)濕菌體用pH 8.(KTris-HCl緩沖液懸浮，在500W下超聲破碎20min，工作2s，間歇 6s，破碎液于4°C和1000 Orpm下離心10min，重復(fù)離心三次后得到上清粗酶液;采用Ni-NTA金 屬螯合親和層析，取上清粗酶液上樣至預(yù)平衡Ni 2+柱中，再依次用含IOmM咪唑、40mM咪唑、 IOOmM咪唑、250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫雜蛋白和目的蛋白，收集含有IOOmM咪唑的洗脫緩 沖液的流出液，用50mM、pH 8.0的Tri s-HCl緩沖液通過(guò)超濾濃縮脫鹽，所得的脫鹽酶液，即 為甲酸脫氫酶I7DHCB純酶;所述洗脫緩沖液為含300mM氯化鈉的pH 8.0、50mM的Tris-HCl緩 沖液;所述的超濾指的是流出液加入截留分子量IOkDa的超濾管中，加入50mM、pH 8.0的 Tris-HCl緩沖液，在5000rpm下離心20分鐘，然后收集截留的酶液，即為脫鹽酶液。
[0013] 本發(fā)明所述釀酒酵母烯醇還原酶OYEl編碼基因源自購(gòu)自釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)CICC 1002,購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。所述博 伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶FDHCB編碼基因源自博伊丁假絲酵母（Candida boidinii) ATCC32195,購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心。
[0014] 本發(fā)明所述含釀酒酵母烯醇還原酶OYEl編碼基因的工程菌是由所述釀酒酵母烯 醇還原酶OYEl編碼基因構(gòu)建的重組載體，重組載體再構(gòu)建重組基因工程菌。優(yōu)選所述的重 組基因工程菌的構(gòu)建包括如下步驟：以來(lái)源于釀酒酵母的基因組DNA為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增 得到釀酒酵母烯醇還原酶OYEl基因，然后克隆至表達(dá)載體pEASY-El上，將所述重組載體轉(zhuǎn) 化至大腸桿菌BL21(DE3)中，即可得到所述含釀酒酵母烯醇還原酶OYEl基因的重組基因工 程菌E.coli BL21(DE3)/pEASY-El-〇yel。類(lèi)似的，我們構(gòu)建了表達(dá)源自博伊丁假絲酵母的 甲酸脫氫酶FDHCB 的基因工程菌E · Co I i BL21 (DE3) /pEASY-E I -f dhcb。
[0015]本發(fā)明所述的方法以釀酒酵母烯醇還原酶OYEl為催化劑，以NAD+為輔酶，催化底 物檸檬醛不對(duì)稱(chēng)還原生成（R)-香茅醛；同時(shí)，以博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶FDHCB為偶聯(lián) 酶，通過(guò)輔底物甲酸鈉的脫氫將氧化型輔酶NAD +還原成NADH，從而實(shí)現(xiàn)輔酶循環(huán)。當(dāng)釀酒酵 母烯醇還原酶OYEl催化檸檬醛順?lè)串悩?gòu)體不對(duì)稱(chēng)氫化合成(R)-香茅醛時(shí)，其(R)-香茅醛源 自反式檸檬醛，而(S)-香茅醛源自于順式檸檬醛。此外，釀酒酵母烯醇還原酶OYEl對(duì)反式檸 檬醛的催化速率要遠(yuǎn)高于順式檸檬醛。當(dāng)釀酒酵母烯醇還原酶OYEl催化檸檬醛不對(duì)稱(chēng)氫化 反應(yīng)時(shí)，反式檸檬醛優(yōu)先被利用從而導(dǎo)致反應(yīng)體系中順?lè)礄幟嗜┑谋壤l(fā)生改變，而氨基 酸催化的順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)將部分順式檸檬醛轉(zhuǎn)化為反式檸檬醛從而維持順?lè)礄幟嗜┑钠胶?比例，因而檸檬醛不對(duì)稱(chēng)氫化反應(yīng)與其順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)相偶聯(lián)可以提高氫化產(chǎn)物(R)-香茅醛 的光學(xué)純度(圖1)。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供了一種氨基酸催化 的檸檬醛順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)與釀酒酵母烯醇還原酶OYEl催化的檸檬醛不對(duì)稱(chēng)氫化反應(yīng)相偶聯(lián)， 提高檸檬醛氫化產(chǎn)物(R)-香茅醛光學(xué)純度的方法;所述方法將部分順式檸檬醛經(jīng)氨基酸催 化的順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為反式檸檬醛，顯著地提高了產(chǎn)物(R)-香茅醛的e.e.值;在IOmL催 化體系中，添加100mg/mL的甘氨酸，50mM朽 1檬醛經(jīng)4h的催化反應(yīng)后，（R)-香茅醛的e. e.值為 65.4%，與不偶聯(lián)順?lè)串悩?gòu)化反應(yīng)時(shí)(R)-香茅醛的e. e.值(16.7 % )相比，提高了48.7 %。 (四）
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為檸檬醛不對(duì)稱(chēng)氫化反應(yīng)與其順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)相偶聯(lián)提高(R)-香茅醛光學(xué)純度 的反應(yīng)示意圖。
[0018] 圖2為分離純化后釀酒酵母烯醇還原酶OYEl和博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶FDHCB 的SDS-PAGE圖，M-Protein marker; 1-未誘導(dǎo)菌液；2-純化后0YE2;3-純化后FDHCB。
[0019] 圖3為順式、反式檸檬醛以及(S)-香茅醛、(R)-香茅醛標(biāo)樣氣相色譜圖。
[0020] 圖4甲酸脫氫酶催化的輔酶循環(huán)與烯醇還原酶催化的檸檬醛不對(duì)稱(chēng)氫化反應(yīng)相偶 聯(lián)的反應(yīng)示意圖。
[0021] 圖5不同濃度檸檬醛的氫化反應(yīng)進(jìn)程； : 50mM底物；· ： IOOmM底物；▲ : 150mM底 物;▼dOOmM底物。
[0022]圖6為20mM檸檬醛經(jīng)不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)后的底物與產(chǎn)物氣相色譜圖；A，反應(yīng)3.5h后 底物梓檬醛與產(chǎn)物香茅醛的氣相色譜圖；B，反應(yīng)IOh后底物梓檬醛與產(chǎn)物香茅醛的氣相色 譜圖。
[0023]圖7為偶聯(lián)不同種類(lèi)氨基酸催化的檸檬醛順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)對(duì)(R)-香茅醛光學(xué)純度的 影響；12種氨基酸分別為D-Met、DL-Va I、Gly、L-Asp、L-Glu、L-Met、L-Ser、L-Ly s、L-Pro、L-Thr和L-Tyr。
[0024]圖8為反應(yīng)pH對(duì)甘氨酸催化檸檬醛順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)的影響； :PIPES緩沖液；▲: Tris-HCl緩沖液。
[0025] 圖9為偶聯(lián)甘氨酸催化的順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)與檸檬醛不對(duì)稱(chēng)氫化反應(yīng)生成(R)-香茅醛 氣相色譜圖。
[0026] 圖10在IOmL催化體系中偶聯(lián)甘氨酸催化的順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)對(duì)產(chǎn)物香茅醛得率和 e. e .值的影響；:未加甘氨酸時(shí)香茅醛得率;·：添加甘氨酸時(shí)香茅醛得率；□:未加甘氨 酸時(shí)(R)-香茅醛e. e.值;〇:添加甘氨酸時(shí)(R)-香茅醛e. e.值。 (五)
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0028] 實(shí)施例1:釀酒酵母烯醇還原酶OYEl和源自博伊丁假絲酵母的甲酸脫氫酶FDHCB的 表達(dá)和純化
[0029] (1)釀酒酵母烯醇還原酶OYEl大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)
[0030]釀酒酵母烯醇還原酶OYEl基因 oyel以購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC 1002基因組DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的引物Fl和 Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系見(jiàn)表1所示。
[0031] 表1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
[0033] 引物如下：Fl，5 ' -ATGCCATTTGTTAAGGACTTTA-3 ' ； Rl，5 ' -TTAATTTTTGTCCCAACCGA-3' ICR反應(yīng)進(jìn)程為:94°C預(yù)變性5min;之后，以94°C變性30s，57°C復(fù)性30s，72°C保持Imin為 一個(gè)循環(huán)，重復(fù)這樣循環(huán)35次;最后，72 °C保持I Omin。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 并回收。純化后的PCR產(chǎn)物與載體pEASY-El相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transl-Tl感受態(tài) 細(xì)胞中。利用菌落PCR方法檢測(cè)并確定陽(yáng)性克隆子，從陽(yáng)性克隆子中提取質(zhì)粒。經(jīng)基因測(cè)序 后，將所得基因的序列（氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示） 與GenBank中對(duì)應(yīng)的基因序列(基因號(hào):AJU17243.1)進(jìn)行比對(duì)分析，將含有正確片段的質(zhì)粒 命名為 pEASY-El-oyel。
[0034] 用質(zhì)粒提取試劑盒從Transl-Tl菌體中提取重組質(zhì)粒pEASY-El-oyel，將其轉(zhuǎn)入 IOOyL E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含lOOyg/mL氨芐青霉素的LB抗性平板 上，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。挑取陽(yáng)性克隆子接種于50mL含lOOyg/mL氨芐青霉素的LB液體 培養(yǎng)基中，在37°C和200rpm條件下培養(yǎng)12h，作為種子液。然后按體積濃度1 %接種量擴(kuò)大培 養(yǎng)接種至150mL含lOOyg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)至菌液濃度 (0D_)約為0.6~0.8時(shí)，添加誘導(dǎo)劑IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）至終濃度為 0.2mM，在25°C和200rpm下繼續(xù)培養(yǎng)10~12h過(guò)量表達(dá)目的蛋白，培養(yǎng)液離心，收集濕菌體。 [0035] (2)釀酒酵母烯醇還原酶OYEl分離純化
[0036] 將上述濕菌體按Ig濕菌體加15mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.0)的比例加入適量 Tris-HCKpH 8.0)緩沖液，在500W下超聲破碎20min(工作2s，間歇6s)后，破碎液于4°C和 1000 Orpm下離心10min，重復(fù)離心三次后得到上清粗酶液。
[0037]按照Ni-NTA金屬螯合親和層析使用說(shuō)明，取上清粗酶液上樣至預(yù)平衡Ni2+柱中，再 依次用含I OmM咪唑、40mM咪唑、10 OmM咪唑、2 5 OmM咪唑的洗脫緩沖液（相應(yīng)濃度的咪唑和 300mM的氯化鈉溶解在50mM的Tris-HCl緩沖液中，pH 8.0)洗脫雜蛋白和目的蛋白。目的蛋 白經(jīng)含有IOOmM咪唑的洗脫緩沖液洗脫后，用50mM、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液通過(guò)超濾濃縮 脫鹽，所得的脫鹽酶液，即為釀酒酵母烯醇還原酶OYEl純酶，酶活為0.72U/mg(采用實(shí)施例2 方法測(cè)量），用作酶法催化的催化劑;所述的超濾條件指的是酶液加入截留分子量IOkDa的 超濾管中，在5000rpm下離心20分鐘，然后收集截留的酶液。
[0038]博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶roHCB純酶的制備除了篩選基因重組菌的抗性平板中 所用的抗生素是卡納霉素外，用作輔酶的博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶FDHCB的表達(dá)和純化 流程與上述流程一致，以購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心的博伊丁假絲酵母（Candida boidinii)ATCC32195為基因來(lái)源，制備獲得博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶roHCB純酶(氨基酸 序列為SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列為SEQ ID NO.3所示），酶活為2.2U/mg。
[0039] 粗酶液經(jīng)Ni-NTA親和層析分離純化分別獲得了純度較高的目的釀酒酵母烯醇還 原酶OYEl和博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶roHCB，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)檢 測(cè)均為單一條帶。重組OYEl與FDHCB均為可溶性蛋白，其分子量大小表觀分別為40.5和 39. OkD，與理論相符，如圖2所示。
[0040] 實(shí)施例2:釀酒酵母烯醇還原酶OYEl的酶活力測(cè)定
[0041 ] 標(biāo)準(zhǔn)酶活力測(cè)定體系（2mL)分別含0 · 4mM NADH、10Oyg/mL釀酒酵母稀醇還原酶 OYEI、20mM梓檬醛(檸檬醛仲用辛醇配制為IM底物溶液的形式加入，底物溶液加入量以檸檬 醛的量計(jì)，反應(yīng)體系中終濃度為20mM)，以50mM PIPES緩沖液(pH 7.0)為反應(yīng)介質(zhì);所述濃 度均指在測(cè)定體系中的終濃度。反應(yīng)在30 °C下進(jìn)行，NADH最后加入，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系在 340nm處每分鐘的吸光值變化來(lái)確定酶活(NADH的摩爾系數(shù)e34() = 6.3mM-1CnT4。活力單位 (U)定義為每分鐘消耗Ιμπιο? NADH所需的酶量。
[0042]實(shí)施例3:釀酒酵母烯醇還原酶OYEl的催化性質(zhì)表征
[0043]標(biāo)準(zhǔn)的催化體系總體積10mL，分別包括20mM檸檬醛(檸檬醛仲用辛醇配制為IM底 物溶液的形式加入，底物溶液加入量以檸檬醛的量計(jì)，反應(yīng)體系中終濃度為20mM)、0.25mM NAD+UOOmM甲酸鈉、0.3U/mL 0YEl、0.5U/mL FDHCB，以50mM PIPES緩沖液（pH 7.0)為反應(yīng) 介質(zhì)。不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的條件優(yōu)化在轉(zhuǎn)速為200rpm水浴搖床上進(jìn)行。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃 取，所獲得的有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，利用氣相色譜法定量測(cè)定底物檸檬醛和產(chǎn)物 (R)-香茅醛。
[0044]底物檸檬醛和產(chǎn)物(R)-香茅醛的氣相色譜(Agilent 6890N)檢測(cè)條件如下：手性 柱868-174,30111\25(^111\0.254111;檢測(cè)器：卩10,250°(： ;載氣：吣，3311117111丨11;空氣流量： 300mL/min;氫氣流量，30mL/min;分流比：1:30;進(jìn)樣量：IyL;進(jìn)樣口溫度:250 °C。柱溫條件： 40°C保持lmin，4°C/min升溫至 120°C，保持lmin，20°C/min升溫至180°C，保持3min。如圖3所 示，在上述色譜條件下，（Z)-檸檬醛、（E)-檸檬醛、（S)-香茅醛、（R)-香茅醛出峰時(shí)間分別為 24.90min、25·49min、22·55min和22·61min〇
[0045]實(shí)施例4:偶聯(lián)輔酶循環(huán)系統(tǒng)的檸檬醛氫化合成香茅醛的反應(yīng)進(jìn)程 [0046]以源自釀酒酵母的重組烯醇還原酶OYEl作為催化劑，以源自博伊丁假絲酵母的重 組甲酸脫氫酶roHCB作為輔酶循環(huán)驅(qū)動(dòng)力，構(gòu)建酶法不對(duì)稱(chēng)還原檸檬醛生成香茅醛的催化 體系（圖4)。
[0047] 標(biāo)準(zhǔn)催化體系（ImL)如下：0.3U/mL 0YEl、0.1U/mL FDHCB、20mM檸檬醛（檸檬醛仲 用辛醇配制為IM底物溶液的形式加入，底物溶液加入量以檸檬醛的量計(jì)，反應(yīng)體系中檸檬 醛終濃度為20mM)、0.5mM NAD+、IOOmM甲酸鈉，以50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)為反應(yīng)介 質(zhì)。維持體系當(dāng)中的純酶OYE1的加入量(0.3U/mL)不變，通過(guò)改變其他各組分的添加量以及 反應(yīng)的條件，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)體系進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最優(yōu)的催化體系。優(yōu)化過(guò)程中考察的因素包 括:反應(yīng)溫度(25~50°C )、反應(yīng)pH(6 · 0~9 · 0)、FDHCB添加量(0 · 05~0 · 5U/mL)、甲酸鈉濃度 (10~200mM)、NAD+濃度(0.05~I .OmM)、檸檬醛濃度（20~50mM)。優(yōu)化后的催化體系（ImL) 為:20mM檸檬醛(檸檬醛仲用辛醇配制為IM底物溶液的形式加入，底物溶液加入量以檸檬醛 的量計(jì)，反應(yīng)體系中檸檬醛終濃度為20mM)、0.3U/mL OYEl純酶（實(shí)施例1制備）、0.5U/mL FDHCB純酶（實(shí)施例1制備）、0.25mM NAD+、100mM甲酸鈉，以50mM PIPES緩沖液(pH 7.0)反應(yīng) 介質(zhì);反應(yīng)溫度為30°C，不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)在200rpm的水浴搖床中進(jìn)行。反應(yīng)過(guò)程中未檢測(cè)到 作為副產(chǎn)物的醇或酯，有效地避免了副產(chǎn)物的產(chǎn)生。烯醇還原酶催化的不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)往 往適用底物濃度較低（〈10mM)。當(dāng)適用底物濃度提高至50mM和IOOmM時(shí)，催化體系的其它組 分濃度同比例增加(緩沖液濃度不變），成功地提高了檸檬醛不對(duì)稱(chēng)氫化反應(yīng)中的適用底物 濃度。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0mM時(shí)，優(yōu)選的催化體系（IOmL)如下：0.76U/mL OYEl、1.25U/mL H)HCB、50mM檸檬醛(檸檬醛用仲辛醇配制為IM底物溶液的形式加入，底物溶液加入量以檸 檬醛的量計(jì)，反應(yīng)體系中檸檬醛終濃度為50mM)、0.625mM NAD+、250mM甲酸鈉，以50mM PIPES緩沖液(pH 7.0)反應(yīng)介質(zhì)。在30 °C和200rpm反應(yīng)條件下反應(yīng)3h后，香茅醛的得率達(dá) 94% ;反應(yīng)延長(zhǎng)至8h，得率為98.3 %。當(dāng)適用底物濃度提高至IOOmM，優(yōu)選的催化體系（IOmL) 如下：1.5U/mL OYEl、2.5U/mL FDHCB、IOOmM檸檬醛(檸檬醛用仲辛醇配制為IM底物溶液的 形式加入，底物溶液加入量以檸檬醛的量計(jì)，反應(yīng)體系中檸檬醛終濃度為IOOmM)、1.25mM NAD +、500mM甲酸鈉、以50mM PIPES緩沖液(pH 7.0)為反應(yīng)介質(zhì)。在30°C和200rpm反應(yīng)條件 下反應(yīng)8h后，香茅醛得率為97.8 %，如圖5所示。
[0048]實(shí)施例5:順?lè)礄幟嗜┡c(R/S)-香茅醛的對(duì)應(yīng)關(guān)系
[0049]在ImL反應(yīng)體系中，分別含20mM梓檬醛(檸檬醛用仲辛醇配制為IM底物溶液的形式 加入，底物溶液加入量以檸檬醛的量計(jì)，反應(yīng)體系中檸檬醛終濃度為20mM)、0.3U/mL OYEl 純酶（實(shí)施例1制備）、0 · 5U/mL FDHCB純酶（實(shí)施例1制備）、0 · 2 5mM NAD+、10OmM甲酸鈉，以 50mM PIPES緩沖液（pH 7.0)反應(yīng)介質(zhì)。在30°C、200rpm下反應(yīng)1.5h后，反應(yīng)的得率為 51.2 %，產(chǎn)物（R)-香茅醛的e . e .值為48.5 %，如圖6中A所示。當(dāng)反應(yīng)4h后，反應(yīng)的得率為 91.5%，產(chǎn)物(R)-香茅醛的e.e.值降低為16.1%，如圖6中B所示。
[0050] 經(jīng)觀察反應(yīng)過(guò)程，（1)釀酒酵母烯醇還原酶OYEl對(duì)反式檸檬醛的催化速率要高于 對(duì)順式檸檬醛的催化速率；（2)生成的（S)-香茅醛和剩余順式檸檬醛的摩爾數(shù)之和約等于 起始順式檸檬醛的摩爾數(shù)，與此類(lèi)似的，生成的（R)-香茅醛和剩余反式檸檬醛的摩爾數(shù)之 和約等于起始反式檸檬醛的摩爾數(shù);上百次不同條件的催化反應(yīng)均驗(yàn)證了這一事實(shí)，因而 推斷(R)-香茅醛是源自反式檸檬醛的不對(duì)稱(chēng)氫化，而(S)-香茅醛是源自順式檸檬醛的不對(duì) 稱(chēng)氫化，并且順?lè)礄幟嗜┡c(S/R)-香茅醛的對(duì)應(yīng)關(guān)系是嚴(yán)格存在的。
[0051] 實(shí)施例6:偶聯(lián)不同氨基酸催化的檸檬醛順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)對(duì)(R)-香茅醛光學(xué)純度的 影響
[0052] 氨基酸可以催化順式和反式檸檬醛之間的異構(gòu)化反應(yīng)，當(dāng)順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)達(dá)到平衡 時(shí)順式梓檬醛與反式梓檬醛的比例約為60:40?？疾炝?12種氨基酸對(duì)梓檬醛不對(duì)稱(chēng)氫化反 應(yīng)中（R)-香茅醛光學(xué)純度的影響。在ImL反應(yīng)體系中，分別含50mM檸檬醛(檸檬醛用仲辛醇 配制為IM底物溶液的形式加入，底物溶液加入量以檸檬醛的量計(jì)，反應(yīng)體系中檸檬醛終濃 度為50mM)、0.76U/mL OYEl純酶(實(shí)施例1方法制備）、1.25U/mL FDHCB純酶(實(shí)施例1方法制 備）、0.625mM NAD+、250mM甲酸鈉、100mg/mL氨基酸（分別為D-蛋氨酸、L-蛋氨酸、D/L-繳氨 酸、甘氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-賴(lài)氨酸 和L-酪氨酸），以50mM PIPES緩沖液(pH 7.0)為反應(yīng)介質(zhì)。在30°C和200rpm反應(yīng)條件下反應(yīng) 4h，結(jié)果如圖7所示。L-天冬氨酸、L-谷氨酸以及L-賴(lài)氨酸等3種氨基酸催化順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)時(shí) 幾乎沒(méi)有香茅醛生成，而當(dāng)酪氨酸催化順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)時(shí)（R)-香茅醛的e.e.值只有17%左 右，與未添加氨基酸的對(duì)照組的結(jié)果(e.e.值為16.7%)相近。其余的氨基酸催化順?lè)串悩?gòu) 反應(yīng)均能有效提高(R)-香茅醛的e.e.值，其e.e.值均在50%以上。在所考察的12種氨基酸 中，以甘氨酸為催化劑催化順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)時(shí)（R)-香茅醛的光學(xué)純度最高，其e.e.值達(dá) 57.6%。因此，選擇甘氨酸作為催化劑催化檸檬醛的順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)，并進(jìn)一步考察了pH值對(duì) 甘氨酸催化檸檬醛順?lè)串悩?gòu)的影響，最終的結(jié)果如圖8所示。在所考察的pH范圍（6.0~9.5) 內(nèi)，（R)-香茅醛的e.e.值均維持在較高水平?？紤]到pH對(duì)不對(duì)稱(chēng)氫化反應(yīng)的影響，選擇反應(yīng) 介質(zhì)為pH 7·0、（50mM、PIPES緩沖液。
[0053]實(shí)施例7:通過(guò)偶聯(lián)甘氨酸催化的順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)提高不對(duì)稱(chēng)氫化合成(R)-香茅醛 光學(xué)純度
[0054]與甘氨酸催化的順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)相偶聯(lián)，在不對(duì)稱(chēng)氫化的同時(shí)使順式檸檬醛異構(gòu)化 為反式檸檬醛。在IOmL反應(yīng)體系，分別含50mM檸檬醛(檸檬醛用仲辛醇配制為IM底物溶液的 形式加入，底物溶液加入量以檸檬醛的量計(jì)，反應(yīng)體系中檸檬醛終濃度為50mM)、0.76U/mL OYE1純酶（實(shí)施例1方法制備）、1 · 25U/mL FDHCB純酶（實(shí)施例1方法制備）、0 · 625mM NAD+、 250mM甲酸鈉、lOOmg/mL甘氨酸以50mM PIPES緩沖液(pH 7.0)為反應(yīng)介質(zhì)。在30°C、200rpm 下反應(yīng)3h后，反應(yīng)的得率為83.9%，產(chǎn)物(R)-香茅醛的e. e.值為67.7%，該反應(yīng)的底物與產(chǎn) 物的氣相色譜圖如圖9所示。與沒(méi)有偶聯(lián)順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)的體系（圖6中B)相比，在高產(chǎn)物得率 的情況下，偶聯(lián)順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)顯著地提高了產(chǎn)物(R)-香茅醛的e.e.值，該結(jié)果表明一部分 順式檸檬醛經(jīng)順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)成為反式檸檬醛，進(jìn)而不對(duì)稱(chēng)氫化為(R)-香茅醛。甘氨酸催化 的順?lè)串悩?gòu)反應(yīng)偶聯(lián)檸檬醛不對(duì)稱(chēng)氫化反應(yīng)的反應(yīng)進(jìn)程如圖10所示，在反應(yīng)4h后，反應(yīng)體 系中香茅醛得率幾乎達(dá)到100 %，（R)-香茅醛e. e.值為65.4%，比不偶聯(lián)甘氨酸催化的順?lè)?異構(gòu)反應(yīng)時(shí)(R)-香茅醛e. e.值(16.7 % )提高了48.7 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種酶法不對(duì)稱(chēng)還原檸檬醛提高(R)-香茅醛光學(xué)純度的方法，其特征在于所述方法 為：以含釀酒酵母烯醇還原酶0YE1編碼基因的工程菌發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體經(jīng)超聲破碎、 分離純化獲得的純酶為催化劑，以含博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶FDHCB編碼基因的工程菌 發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體經(jīng)超聲破碎、分離純化獲得的純酶為偶聯(lián)酶，以檸檬醛為底物，以仲 辛醇為溶劑，以甲酸鈉為輔底物，以NAD+為輔酶，添加氨基酸，以pH 6.0~9.5的緩沖液為反 應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，在30 °C、200rpm條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)完全后，獲得(R)-香茅醛； 所述釀酒酵母烯醇還原酶OYE1編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示，所述博伊丁假 絲酵母甲酸脫氫酶FDHCB編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.3所示。2. 如權(quán)利要求1所述酶法不對(duì)稱(chēng)還原檸檬醛提高(R)_香茅醛光學(xué)純度的方法，其特征 在于所述轉(zhuǎn)化體系中，底物以1M底物仲辛醇溶液的形式加入，底物終濃度為50mM，催化劑用 量為0.76U/mL，偶聯(lián)酶用量為1.25U/mL，NAD+終濃度為0.625mM，甲酸鈉終濃度為250mM，氨 基酸終濃度為100mg/mL。3. 如權(quán)利要求1所述酶法不對(duì)稱(chēng)還原檸檬醛提高(R)_香茅醛光學(xué)純度的方法，其特征 在于所述氨基酸為下列之一:D-蛋氨酸、L-蛋氨酸、D/L-纈氨酸、甘氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨 酸、L-蘇氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-賴(lài)氨酸和L-酪氨酸。4. 如權(quán)利要求1所述酶法不對(duì)稱(chēng)還原檸檬醛提高(R)_香茅醛光學(xué)純度的方法，其特征 在于所述氨基酸為甘氨酸。5. 如權(quán)利要求1所述酶法不對(duì)稱(chēng)還原檸檬醛提高(R)_香茅醛光學(xué)純度的方法，其特征 在于所述緩沖液為pH 7.0、50mM的PIPES緩沖液。6. 如權(quán)利要求1所述酶法不對(duì)稱(chēng)還原檸檬醛提高(R)_香茅醛光學(xué)純度的方法，其特征 在于所述催化劑按如下方法制備：（1)將含釀酒酵母烯醇還原酶0YE1編碼基因的工程菌接 種于含100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C和200rpm條件下培養(yǎng)12h，作為種子 液;然后按體積濃度1 %接種量接種至含l〇〇yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C和 200rpm條件下培養(yǎng)至0D6qq為0.6~0.8時(shí)，添加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.2mM，在25 °C和 200rpm下繼續(xù)培養(yǎng)10~12h，培養(yǎng)液離心，收集濕菌體； (2)將步驟（1)濕菌體用pH 8.0、Tris-HCl緩沖液懸浮，在500W下超聲破碎20min，工作 2s，間歇6s，破碎液于4°C和lOOOOrpm下離心10min，重復(fù)離心三次后得到上清粗酶液;采用 Ni-NTA金屬螯合親和層析，取上清粗酶液上樣至預(yù)平衡Ni2+柱中，再依次用含10mM咪唑、 40mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫雜蛋白和目的蛋白，收集含有100mM咪 唑的洗脫緩沖液的流出液，用50mM、pH 8.0的Tri s-HCl緩沖液通過(guò)超濾濃縮脫鹽，所得的脫 鹽酶液，即為釀酒酵母烯醇還原酶0YE1純酶;所述洗脫緩沖液為含300mM氯化鈉的pH 8.0、 50mM 的 Tris-HCl 緩沖液。7. 如權(quán)利要求1所述酶法不對(duì)稱(chēng)還原檸檬醛提高(R)_香茅醛光學(xué)純度的方法，其特征 在于所述偶聯(lián)酶按如下方法制備：（1)將含博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶FDHCB編碼基因的工 程菌接種于含l〇〇yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C和200rpm條件下培養(yǎng)12h，作為 種子液;然后按體積濃度1 %接種量接種至含l〇〇yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C 和200rpm條件下培養(yǎng)至0D6qq為0.6~0.8時(shí)，添加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.2mM，在25 °C和 200rpm下繼續(xù)培養(yǎng)10~12h，培養(yǎng)液離心，收集濕菌體； (2)將步驟（1)濕菌體用pH 8.0、Tris-HCl緩沖液懸浮，在500W下超聲破碎20min，工作 2s，間歇6s，破碎液于4°C和lOOOOrpm下離心10min，重復(fù)離心三次后得到上清粗酶液;采用 Ni-NTA金屬螯合親和層析，取上清粗酶液上樣至預(yù)平衡Ni2+柱中，再依次用含10mM咪唑、 40mM咪唑、100mM咪唑、250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫雜蛋白和目的蛋白，收集含有100mM咪 唑的洗脫緩沖液的流出液，用50mM、pH 8.0的Tri s-HCl緩沖液通過(guò)超濾濃縮脫鹽，所得的脫 鹽酶液，即為甲酸脫氫酶H)HCB純酶;所述洗脫緩沖液為含300mM氯化鈉的pH 8.0、50mM的 Tris-HCl緩沖液。
【文檔編號(hào)】C12P7/24GK106086089SQ201610438016
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月17日
【發(fā)明人】應(yīng)向賢, 汪釗, 孟淑敏, 胡寶軍, 程峰
【申請(qǐng)人】浙江工業(yè)大學(xué)