人參皂苷Rh2在抑制Treg細(xì)胞中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了人參皂苷Rh2在抑制Treg細(xì)胞中的 應(yīng)用及其制備方法。具體地，本發(fā)明公開了人參皂苷Rh2通過抑制Treg細(xì)胞，從而增強(qiáng)T 細(xì)胞抗腫瘤免疫反應(yīng)并抑制腫瘤生長，以改善機(jī)體免疫功能的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是目前危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，據(jù)WHO統(tǒng)計，腫瘤已成為威脅人類 生命健康的頭號殺手。國內(nèi)外對惡性腫瘤防治的研究投入了大量的人力、物力和財力，但至 今尚未取得根本性的突破。傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療和手術(shù)、放療等結(jié)合，雖然成功提高了多種 惡性腫瘤的治愈率，但是由于較強(qiáng)的副作用以及耐藥性，使得尋找新的治療腫瘤的研究刻 不容緩。
[0003] 中藥是中醫(yī)治病的物質(zhì)基礎(chǔ)，中藥在治療癌癥中具有多方位、多靶點、不易產(chǎn)生耐 藥性等優(yōu)勢，符合腫瘤多因素、多環(huán)節(jié)治病的機(jī)理，但是針對中藥抗腫瘤的有效成分的提取 及作用機(jī)理的研究，較難明確。
[0004] 人參為五加科植物人參的干燥根，《神農(nóng)本草經(jīng)》將人參列為上品，具有主補(bǔ)五臟， 安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目開心益智，久服輕身延年的功效。人參主要化學(xué)成分 為人參皂苷、人參多糖和揮發(fā)油類?，F(xiàn)代藥理與臨床研究表明，人參的活性成分具有誘導(dǎo)腫 瘤細(xì)胞凋亡、阻滯腫瘤細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和血管生長、降 低腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。人參的主要活性成分為人參皂苷，人參皂苷按苷元不同可分為： 原人參二醇型（pro)、原人參三醇型（ppt)和齊墩果烷型（〇A)。人參中二醇型皂苷較三醇 型皂苷含量高。如人參皂苷Rbl、Rb2、Rc、Rd是白參中主要成分，而人參皂苷Rh2是紅參中 特有成分，白參中幾乎沒有。人參皂苷還對腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化作用，但其具體作用機(jī)制 尚不清。
[0005] 因此，本領(lǐng)域迫切需要了解人參皂苷在腫瘤治療領(lǐng)域的作用模式及應(yīng)用價值，以 開發(fā)新的腫瘤治療藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了人參皂苷Rh2通過抑制Treg細(xì)胞從而抑制腫瘤的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明第一方面，提供了一種人參皂苷Rh2的用途，用于（a)制備抑制Treg細(xì)胞 的抑制劑；或（b)制備預(yù)防和/或治療Treg細(xì)胞升高性腫瘤的組合物。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述抑制Treg細(xì)胞包括抑制Treg細(xì)胞的分化、增殖、和/或表 達(dá)。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括藥物組合物、食品組合物和/或保健品組合 物。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括人參皂苷Rh2作為活性成分，和藥學(xué)上/食品 學(xué)上可接受的載體。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述人參皂苷Rh2d在70mg/kg · d的安全劑量內(nèi)施用于哺乳動 物。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物通過選自下組的用藥方式進(jìn)行給藥：口服、靜脈注 射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直腸灌注、鼻腔噴霧、口腔噴霧、皮膚局部或全身經(jīng)皮用 藥；較佳地，所述的組合物通過口服或靜脈注射施藥。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物的制劑選自下組：片劑、膠囊劑、注射劑、顆粒劑、 噴霧劑。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還含有任選的抗腫瘤藥物。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗腫瘤藥物選自下組的一種或多種：烷化劑、抗代 謝物、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物以及相關(guān)抑制劑、長春花堿類、表鬼白毒素 (epipodopyvllotoxins)、抗生素、L-天冬酞胺酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、干擾素、鉬配位復(fù)合 物、大黃素取代的脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、腎上腺皮質(zhì)類固醇、孕激素、雌激 素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及促性腺激素-釋放激素類似物。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的人參皂苷Rh2包括：
[0017] 2〇(5)-人參皂苷他2:即2〇(5)-原人參二醇-3-〇-0-〇吡喃葡萄糖苷、2〇(1?)-人 參皂苷Rh2 :即20 (R)-原人參二醇-3-0-β -D吡喃葡萄糖苷、或其組合。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述20 (S)-人參皂苷Rh2的結(jié)構(gòu)式如式I所示：
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的20 (R)-人參皂苷Rh2的結(jié)構(gòu)式如式II所示：
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的人參皂苷Rh2通過以下步驟制備：
[0023] 將所述的植物莖葉總皂苷或原人參二醇組皂苷溶入有機(jī)酸或無機(jī)酸的水溶液或 醇溶液中，進(jìn)行酸水解反應(yīng)，然后收集反應(yīng)物。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的Treg細(xì)胞升高性腫瘤包括卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃 癌、肝癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的人參皂苷Rh2還用于制備治療Treg細(xì)胞升高造成的免疫 缺陷性疾病的藥物組合物。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述由于Treg細(xì)胞升高造成的免疫缺陷性疾病包括自身免疫 性胃炎、關(guān)節(jié)炎、腮腺炎、結(jié)腸炎、變態(tài)反應(yīng)性腦炎和糖尿病。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的Treg細(xì)胞升高指的是Treg細(xì)胞的總數(shù)或占 T細(xì)胞總數(shù) 白分比分別比正常人群Treg細(xì)胞的總數(shù)或占 T細(xì)胞總數(shù)百分比高一倍以上。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明還提供了一種Treg細(xì)胞抑制劑組合物，所述的組合物含 有安全有效量的人參皂苷Rh2,和藥學(xué)上和/或食品學(xué)上可接受的載體。
[0029] 本發(fā)明第二方面，提供了一種體外非治療性的抑制Treg細(xì)胞的方法，在人參皂苷 Rh2存在下培養(yǎng)Treg細(xì)胞，或?qū)⑷藚⒃碥誖h2與Treg細(xì)胞接觸，從而抑制Treg細(xì)胞。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述人參皂苷Rh2的濃度為0. 01-1000 μ g/ml，較佳地，為 5-500 μ g/ml，更佳地，為 20-200 μ g/ml。
[0031] 本發(fā)明第三方面，提供了一種體外非治療性的抑制Treg細(xì)胞升高性腫瘤的方法， 在人參皂苷Rh2存在下培養(yǎng)Treg細(xì)胞升高性腫瘤細(xì)胞，或?qū)⑷藚⒃碥誖h2與Treg細(xì)胞接 觸，從而抑制Treg細(xì)胞升高性腫瘤。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞來自以下一種或多種腫瘤：卵巢癌、乳腺癌、結(jié) 直腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤。
[0033] 本發(fā)明第四方面，提供了一種制備Treg細(xì)胞抑制劑的方法，將人參皂苷Rh2與藥 學(xué)上和/或食品學(xué)上可接受的載體混合，從而制備成Treg細(xì)胞抑制劑。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的Treg細(xì)胞抑制劑還能進(jìn)一步抑制Treg細(xì)胞升高性腫瘤。
[0035] 本發(fā)明第五方面，提供了一種抑制Treg細(xì)胞和/或抑制Treg細(xì)胞升高性腫瘤和 /或抑制Treg細(xì)胞升高引起的免疫缺陷性疾病的方法，包括步驟：（i)測定患有腫瘤和/或 自身免疫缺陷疾病的對象樣本中Treg細(xì)胞占 T細(xì)胞總數(shù)的比例VI ;和（ii)當(dāng)VI > 2倍 正常值或?qū)φ罩礦0時，向所述的對象施用安全有效量的人參皂苷Rh2。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的樣本為血液樣本，較佳地，為全血樣本。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的對照值或正常值V0為正常無患病人群的Treg細(xì)胞占 T 細(xì)胞總數(shù)的比。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述需要的對象為哺乳動物，較佳地為小鼠、大鼠和人。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述安全有效量的人參皂苷Rh2的劑量為70mg/kg · d。
[0040] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0041] 圖1顯示TIDA建模方式。實驗組1、2的BALB/c小鼠，分別灌胃給予生理鹽水、 4. 5mg/Kg Rh2單體。在第4天分別在皮下注入LLC細(xì)胞（lOOuL，106細(xì)胞/只）建立腫瘤 小鼠模型。
[0042] 圖2顯示小鼠全血中Treg含量分析圖。圖2A顯示小鼠全血中Treg流式細(xì)胞檢 測結(jié)果圖。正常代表正常小鼠，植入LCC細(xì)胞Omg/kg代表腫瘤小鼠，植入LCC細(xì)胞4. 5mg/ kg代表給予Rh2的給藥組小鼠。圖2B顯示小鼠全血中Treg含量統(tǒng)計結(jié)果柱狀圖。正常代 表正常小鼠，〇mg/kg代表腫瘤小鼠，4. 5mg/kg代表給予Rh2的給藥組小鼠。
[0043] 圖3顯示小鼠脾臟中Treg流式結(jié)果及Treg含量分析圖。圖3A顯示小鼠脾臟中 Treg流式細(xì)胞檢測結(jié)果圖。正常代表正常小鼠，植入LCC細(xì)胞Omg/kg代表腫瘤小鼠，植入 LCC細(xì)胞4. 5mg/kg代表給予Rh2的給藥組小鼠。圖3B顯示小鼠脾臟中Treg流式統(tǒng)計結(jié)果 柱狀圖。正常代表正常小鼠，〇mg/kg代表腫瘤小鼠，4. 5mg/kg代表給予Rh2的給藥組小鼠。
[0044] 圖4顯示各個腫瘤模型小鼠 Treg細(xì)胞在不同濃度Rh2下的比例。正常代表正常 小鼠，LLC肺癌荷瘤小鼠 Oug/mL代表肺癌腫瘤小鼠，腎癌荷瘤小鼠 Oug/mL代表腎癌腫瘤小 鼠；5、10、20、40代表不同濃度的Rh2給藥處理。
[0045] 圖5顯示小鼠原代Treg細(xì)胞在不同Rh2濃度下比例變化圖。正常mice代表正常 小鼠，LLC肺癌荷瘤小鼠 Oug/mL代表肺癌腫瘤小鼠，腎癌荷瘤小鼠 Oug/mL代表腎癌腫瘤小 鼠；5、10、20、40代表不同濃度的Rh2給藥處理。
[0046] 圖6顯示小鼠的建模方式。分別為：正常小鼠組、LLC小鼠肺癌細(xì)胞植瘤-TIAA (給 藥后植瘤）建模小鼠組、LLC小鼠肺癌細(xì)胞植瘤-TIDA(給藥期間植瘤）建模小鼠組、Renca 小鼠肺癌細(xì)胞植瘤-TIAA (給藥后植瘤）建模小鼠組、Renca小鼠肺癌細(xì)胞植瘤-TIDA (給 藥期間植瘤）建模小鼠組。
[0047] 圖7顯示小鼠全血中Treg細(xì)胞的表達(dá)變化。圖7為正常小鼠、兩種建模方式下 LLC、Renca植瘤的四種模型小鼠，及建立在此基礎(chǔ)上的給藥組小鼠實驗結(jié)果，圖片標(biāo)明這幾 組小鼠全血中Treg的變化。圖7A顯示小鼠全血中Treg細(xì)胞流式細(xì)胞檢測結(jié)果圖。正常 代表正常小鼠，植入LCC細(xì)胞Omg/kg代表肺癌腫瘤小鼠 ，Renca cell implantedOmg/kg代 表腎癌腫瘤小鼠；TIAA代表給藥后植瘤建模小鼠組，TIDA代表給藥期間植瘤建模小鼠組； 1. 5mg/kg、4. 5mg/kg代表Rh2給藥濃度。圖7B為小鼠全血中Treg細(xì)胞統(tǒng)計結(jié)果柱狀圖。 正常代表正常小鼠，植入LCC細(xì)胞Omg/kg代表肺癌腫瘤小鼠，植入腎癌細(xì)胞Omg/kg代表腎 癌腫瘤小鼠；TIAA代表給藥后植瘤建模小鼠組，TIDA代表給藥期間植瘤建模小鼠組；1. 5、 4. 5代表Rh2給藥濃度。
[0048] 圖8顯示正常小鼠、兩種建模方式下肺癌、腎癌植瘤的四種模型小鼠，及建立在此 基礎(chǔ)上的給藥組小鼠脾臟中Treg細(xì)胞的變化趨勢。圖8A顯示小鼠脾臟中Treg細(xì)胞流式細(xì) 胞檢測