含有奎尼酸類及糖苷類化合物的檵木提取物及其醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥、化學(xué)藥物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及富含奎尼酸衍生物和糖苷類 成分的白花檻木提取物、其制備方法及其在治療出血性疾病和制備止血藥物方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 出血是許多疾病的臨床表現(xiàn)，也是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一。臨床上的出血 性疾病是由于先天性或獲得性止血機制（包括血管、血小板數(shù)量和質(zhì)量、凝血因子）異常引 起的自發(fā)性或創(chuàng)傷造成的出血不止的一類疾病，該類疾病嚴重威脅著患者的生命和健康。 止血藥可通過收縮小動脈及毛細血管、增強血小板功能、加速血液凝固過程、抑制血塊溶解 過程而產(chǎn)生止血作用。目前國內(nèi)臨床常用的止血藥約有20多種，根據(jù)其凝血作用機制可分 為四大類：促凝血因子活性藥如血凝酶、去氨加壓素、維生素 K類止血藥等；降低毛細血管 通透性藥如卡巴克洛、卡絡(luò)磺鈉；抗纖維蛋白溶解藥如氨基己酸、氨甲苯酸、止血環(huán)酸、抑肽 酶等；外用止血藥如纖維蛋白膠、膠原蛋白、殼聚糖、可吸收性明膠海綿、氧化纖維素、微纖 維膠原等?，F(xiàn)有的止血藥物在應(yīng)用中都存在一定的局限性，如容易導(dǎo)致血栓、不適用于創(chuàng)面 及大手術(shù)出血、止血速度慢等。由于上述局限性的存在，新止血藥的研發(fā)一直受到較多關(guān) 注。
[0003] 繼木（Loropetalum chinense)也稱為白花繼木，為金縷梅科（Hamamelidaceae) 檻木屬（Loropetalum)植物，其味苦、潘，以花、葉和根入藥，具有清熱解毒、收斂止血的作 用，廣泛用于治療各種出血、燒燙傷、皮膚感染、痢疾腹瀉等。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)白花檻木具 有止血、抑菌、抗炎、促愈合和抗氧化等作用。白花檻木中主要含有揮發(fā)油、鞣質(zhì)、黃酮、木脂 素等成分。迄今為止，國內(nèi)外學(xué)者從白花檻木中分離得到了約50余個化合物，主要為鞣質(zhì) 和黃酮類化合物。
[0004] 在現(xiàn)有的有關(guān)檻木的專利中，公開號為CN101153303A的專利為檻木總黃酮 的提取工藝專利，不涉及用途，該專利中的總黃酮定量方法存在較大誤差；公開號為 CN101485701A和CN102579524A的專利所涉及的醫(yī)藥用途分別為檻木治療燒燙傷和促進傷 口愈合，其有效成分并不明確。公開號為CN102134187B的專利公開了一種由檻木中分離得 到的化合物及其抗炎、抗菌的醫(yī)藥用途。公開號為CN102716157A的專利公布了一種檻木總 酚的制備方法及其止血作用，采用乙醇回流提取和大孔樹脂分離得到總酚類化合物，但總 酚中的主要成分沒食子酸、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚等化合物的止血作用未經(jīng)過實驗 確證，因而上述化合物不能代表檻木止血作用的有效成分。
[0005] 本發(fā)明采用丙酮室溫浸泡的方法對檻木進行提取，采用與中國專利CN102716157A 中所用的型號不同的大孔樹脂分離得到具有明確止血活性的部位，通過對活性部位中的 各類化學(xué)成分進行系統(tǒng)分離和活性篩選研究，首次公開了此前并未在檻木中發(fā)現(xiàn)的綠原 酸甲酯、綠原酸乙酯、5-0-p-香豆?？崴峒柞サ瓤崴嵫苌锖图t景天苷、（Z)-3-己 烯基-Ο-α-L-吡喃鼠李糖-(1 - 6)-i3_D-批喃葡萄糖苷、芐基-Ο-α-L-吡喃鼠李 糖-(1 - 6) - β -D-批喃葡萄糖苷、槲皮素-3-0- (6 " -0-沒食子酰基）-β -葡萄糖苷等糖 苷類化合物，并且通過動物實驗證實了這些化合物的止血作用。國內(nèi)外相關(guān)研究中未見有 從白花檻木中獲得止血活性良好的奎尼酸衍生物和糖苷類成分復(fù)合物的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個方面涉及一種白花檻木提取物，其富含有奎尼酸衍生物類成分 和糖苷類成分。其中，奎尼酸衍生物類成分為綠原酸甲酯、綠原酸乙酯、5-0-p-香豆酰 奎尼酸甲酯的一種或多種；糖苷類成分為紅景天苷、（Z)-3_己烯基-Ο-α-L-吡喃鼠李 糖-(1 - 6) - β -D-批喃葡萄糖苷、芐基-0- a -L-吡喃鼠李糖-(1 - 6) - β -D-批喃葡萄糖 苷、楊梅苷、槲皮素-3-0-(6 " -0-沒食子?；?β -葡萄糖苷的一種或多種。
[0007] 在本發(fā)明的一個實施方案中，以提取物的總重量計算，上述奎尼酸衍生物和糖苷 類成分以重量比合計為30% -90%，30-90%，優(yōu)選為60% -80%。
[0008] 在本發(fā)明的一個實施方案中，以提取物的總重量計算，綠原酸甲酯、綠原酸乙酯、 紅景天苷、楊梅苷四種成分的含量以重量百分比記分別為：1-5%、0. 6-3%、0. 3-1. 5%、 5-20% ;優(yōu)選為 1-3. 5%、1-2%、0· 5-1%、5-15%。
[0009] 本發(fā)明的另一方面涉及上述的白花檻木提取物的制備方法，包括如下步驟：
[0010] 1)將白花檻木藥材以丙酮室溫浸泡提取，濃縮后得到粗提物；
[0011] 2)將藥材粗提物在水中分散均勻，用低級性溶劑萃取除去低級性成分，得到水溶 性部分；
[0012] 3)水溶性部分濃縮后，過大孔樹脂柱，以10%、20%、30%、40%、50%、70%、95% 乙醇-水梯度洗脫，將20%、30%、40%洗脫液減壓蒸干，得到不同極性部位。
[0013] 4)將3)所得30%乙醇洗脫物加水溶解，用反相C1S硅膠柱層析，以不同濃度的甲 醇水溶液（1〇%，20%，30%，40%，50%，70%，95% )梯度洗脫，劃分成 F1-F46 段。
[0014] F19-20段合并記為組分B，再用反相C1S硅膠柱層析，以不同濃度的甲醇水溶 液（5%，10%，15%，20%，25%，30%，40%，50%，100% )梯度洗脫，劃分成 B1-B58。其 中B8-B10合并，用LH-20柱層析，甲醇洗脫，劃分成B-8-1至B-8-58,其中組分B-8-16至 B-8-26合并，用硅膠柱層析，以二氯甲烷：甲醇：水=9 : 1 : 0.1-8 : 2 : 0.2洗脫，得 到單體化合物紅景天苷；組分B-8-27用硅膠柱層析，以二氯甲烷：甲醇：水=8 : 2 : 0.2 洗脫，得到單體化合物5-0-p-香豆酰奎尼酸甲酯；組分B-8-29至B-8-33合并，用硅膠柱層 析，以二氯甲烷：甲醇：水=8 : 2 : 0.2洗脫，得到單體化合物綠原酸甲酯；組分B48-B51 合并，用硅膠柱層析，以二氯甲烷：甲醇=95 : 5洗脫，得到單體化合物綠原酸乙酯。
[0015] F39-41段合并記為組分I，用硅膠柱層析，以二氯甲烷：甲醇：水= 9 : 1 : 0.1-8 : 2 : 0.2洗脫，劃分成11-152。其中120-121合并，用LH-20柱層析，甲 醇：水=2 : 1洗脫，得到單體化合物芐基-0- a -L-吡喃鼠李糖-(1 - 6) - β -D-批喃葡 萄糖苷；124-125合并，用LH-20柱層析，甲醇：水=2 : 1洗脫，得到單體化合物（Ζ)-3-己 烯基-0- a -L-吡喃鼠李糖-(1 - 6) - β -D-吡喃葡萄糖苷；129-132合并，用LH-20柱層析， 甲醇洗脫，得到單體化合物槲皮素-3-0-(6 " -0-沒食子酰基）-β -葡萄糖苷。
[0016] F42-44段合并記為組分J，用聚酰胺柱層析，以甲醇：水=1 : 1-9 : 1梯度洗 脫，劃分成J1-J71，其中組分J14-J40合并，用LH-20柱層析，甲醇：水=2 : 1洗脫，得到 單體化合物楊梅苷。
[0017] 采用室溫冷浸提取時，包括以下步驟：取適量白花檻木藥材切為2-3cm小段，加入 固液比為1 : 8-1 : 10的丙酮，室溫浸泡提取，然后合并提取液，減壓濃縮至干。
[0018] 采用溶劑萃取法除去低級性成分時，包括以下步驟：取藥材的粗提物在水中分散， 然后加入體積比為1 : 1-1 : 4的低級性的酯類、烷烴類或醚類溶劑萃取3-5次，以除去其 中的色素等。其中優(yōu)選的溶劑為石油醚、環(huán)己烷、乙酸乙酯。萃取后水層揮干有機溶劑得到 水溶性成分。
[0019] 采用大孔吸附樹脂法時，包括以下步驟：將萃取除雜后的水溶性成分減壓濃縮至 濃度為200-300g/L的提取液，上大孔樹脂柱，樹脂柱徑高比為1 : 6-1 : 10,上樣后用2-4 倍BV的10%、20%、30%、40%、50%、70%、95%乙醇-水梯度洗脫，洗脫流速為3-98￥/11， 收集20%、30%、40%洗脫液減壓濃縮至干，得到富含有奎尼酸衍生物類成分和糖苷類成分 的白花檻木提取物。
[0020] 大孔樹脂包括非極性、弱極性、中等極性、弱堿性或弱酸性等任意一種類型的樹 月旨，如 HP20、D4020、S-8、HZ-806、D4006、X-5、NKA-II、NKA-9 等，其中優(yōu)選的為弱極性或中 等極性的樹脂HP20、I-IHMOO、D4006、X-5等，更優(yōu)選為HP20型樹脂。
[0021] 本發(fā)明的又一方面涉及該提取物制備的藥物組合物，該提取