和200 mg/kg組。
[0026] (1)開(kāi)場(chǎng)自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn) 給藥后第8天，小鼠被放置于一個(gè)50 cmX25 cmX20 cm的透明自動(dòng)活動(dòng)監(jiān)視器中 (0ptoM3, Columbus Instruments, Columbus, 0H)。紅外線監(jiān)測(cè)每 10 min 記錄 1 次，連續(xù) 記錄小鼠自主活動(dòng)6次，共60 min，實(shí)驗(yàn)完成后，小鼠被送返飼養(yǎng)籠中，并用10%的酒精擦凈 監(jiān)視器。
[0027] 開(kāi)場(chǎng)自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，無(wú)論在前10 min內(nèi)還是在60 min內(nèi)，WGPA-A并未 影響小鼠的自主活動(dòng)時(shí)間，即人參果膠并未影響小鼠行為學(xué)基線的改變。
[0028] 表1 WGPA對(duì)小鼠自主活動(dòng)結(jié)果的影響結(jié)果用:表示
N.S = No significance，沒(méi)有顯著性差異 (2)高架十字迷宮測(cè)試（EPM) 高架十字迷宮是木制的，高于地面60 cm的十字形狀的迷宮，由四條臂組成，其中包含 兩條密閉的臂（24 cm)和兩條敞開(kāi)的臂（1 cm)。每條臂都是由30 cmX5 cm的區(qū)域及5 cmX5 cm的中心區(qū)共同組成。給藥后第9天，小鼠首先被放置于迷宮的中心區(qū)，由迷宮上 方的攝像機(jī)記錄其行為活動(dòng)5 min，然后根據(jù)攝像記錄手動(dòng)計(jì)數(shù)小鼠在敞開(kāi)臂及密閉臂的 時(shí)間及次數(shù)，只有當(dāng)小鼠四肢全部進(jìn)入臂中才被記錄。進(jìn)入臂中的時(shí)間及次數(shù)將用于統(tǒng)計(jì) 學(xué)分析敞開(kāi)臂時(shí)間/(敞開(kāi)臂時(shí)間+密閉臂時(shí)間）；敞開(kāi)臂次數(shù)/(敞開(kāi)臂次數(shù)+密閉臂次 數(shù))。每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后都被送返其飼養(yǎng)籠，并用10%酒精擦凈迷宮裝置。與生理鹽水組 相比，WGPA-A 100 mg/kg及WGPA -A 200 mg/kg顯著增加了小鼠的進(jìn)入敞開(kāi)臂的時(shí)間率 [F(2，27) = 30.2，p〈 0.0001](見(jiàn)圖 1A)和次數(shù)率[F(2，27) = 53.1，p〈 0.0001] (見(jiàn)圖1B)。
[0029] 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)入敞開(kāi)臂的時(shí)間和次數(shù)可以用來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的焦慮樣行 為及藥物抗焦慮的藥理學(xué)活性，人參果膠酸性組分WGPA-A能夠顯著增加小鼠高架十字迷 宮實(shí)驗(yàn)中（敞開(kāi)臂/敞開(kāi)臂+密閉臂)時(shí)間率及次數(shù)率。小鼠進(jìn)入敞開(kāi)臂的時(shí)間和次數(shù)比進(jìn) 入密閉臂的時(shí)間和次數(shù)顯著增加意味著藥物逆轉(zhuǎn)了小鼠焦慮樣癥狀。
[0030] (3)社會(huì)干擾實(shí)驗(yàn) 給藥后第10天，小鼠從其飼養(yǎng)籠中，被配對(duì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入一空的、不熟悉的測(cè)試籠中10 min，配對(duì)的小鼠應(yīng)當(dāng)為同一治療組或生理鹽水組，通過(guò)其上方的攝像機(jī)連續(xù)記錄配對(duì)小鼠 的行為活動(dòng)10 min，然后根據(jù)攝像記錄手動(dòng)計(jì)數(shù)每只小鼠的攻擊時(shí)間及社會(huì)干擾時(shí)間。攻 擊時(shí)間被定義為試圖咬、實(shí)際咬、拳擊、踢等行為。社會(huì)干擾時(shí)間被定義為另一種形式的身 體接觸，包括嗅、舔或身體的接觸。小鼠之間沒(méi)有進(jìn)行相互接觸將不被記錄。入侵比率被定 義為入侵時(shí)間/(入侵時(shí)間+社會(huì)干擾時(shí)間)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠被送返回飼養(yǎng)籠中。
[0031] 結(jié)果WGPA-A 100 mg/kg及WGPA-A 200 mg/kg均顯著影響了社會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié) 果。與生理鹽水組相比，WGPA-A顯著增加了小鼠的社會(huì)干擾時(shí)間[見(jiàn)圖2A，F(xiàn) (2，27) =13.4，p〈 0.0001]和社會(huì)干擾次數(shù)[見(jiàn)圖 2B，F(xiàn) (2，27)= 6.91，p = 0.004]。同時(shí)， WGPA-A顯著降低了小鼠的入侵時(shí)間率和入侵次數(shù)率[見(jiàn)圖3，時(shí)間率：F (2，27) =3. 65， ρ=0· 04;次數(shù)率 F (2,27)=9.8, p〈 0.001]。
[0032] 證明了人參果膠酸性組分WGPA-A能夠明顯降低小鼠社會(huì)互動(dòng)實(shí)驗(yàn)的入侵時(shí)間 率、入侵次數(shù)率(入侵行為/非入侵行為)，顯著增加小鼠社會(huì)互動(dòng)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間及次數(shù)，即人 參果膠酸性組分顯著增加了社會(huì)互動(dòng)能力，同時(shí)減少了社會(huì)攻擊行為。
[0033] (4)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程按（Porsolt R.D·，Bertin A·, Jalfre M·，et al (1978). ''Behavioural despair" in rats and mice: strain differences and the effects of imipramine. Eur J Pharmacol 51(3): 291-294.)進(jìn)行。BS 小鼠于給藥后第 11 天，被分 別放入盛有水的塑料圓柱體25 cm (高）X10 cm (直徑）中，圓柱體盛有23~25°C，10 cm 高的水，小鼠被迫在塑料圓柱體中6 min，當(dāng)小鼠在塑料圓柱體中停止掙扎，保持漂浮的狀 態(tài)(僅有微小的動(dòng)作以保持頭部露出水面)被認(rèn)為是固定不動(dòng)?？倻y(cè)試時(shí)間持續(xù)6 min，前2 min作為適應(yīng)期，后4 min通過(guò)Enthovision 8. 5自動(dòng)分析軟件記錄下其游泳時(shí)間及固定不 動(dòng)時(shí)間。每只小鼠游泳完，都需要更換圓柱體中的水。結(jié)果WGPA-A 100 mg/kg和200 mg/ kg均顯著減少了強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的固定時(shí)間[F2，27=8. 64，p〈0. 002](見(jiàn)圖4)。
[0034] 試驗(yàn)證明，人參果膠酸性組分WGPA-A能夠降低小鼠強(qiáng)迫游泳的固定時(shí)間，增加其 游泳時(shí)間，提示人參果膠的酸性組分能夠明顯逆轉(zhuǎn)雙向情感性精神障礙的抑郁癥狀。
[0035] 實(shí)施例3:機(jī)制研究 腦組織的準(zhǔn)備：給藥第12天，小鼠于給藥后1 h通過(guò)C02麻醉過(guò)量處死，取其海馬置 于液氮中，轉(zhuǎn)移至_80°C冰箱中。勻漿：腦組織樣本加入9X體積的50 mM KP04緩沖液， 0. 5% pH7. 2的Triton-X-100和IX不含EDTA的蛋白酶抑制劑中，使用Barnant勻漿器勻 漿，腦勻漿物于4°C，13,000 g離心15 min，取上清儲(chǔ)存在-80°C冰箱中，其蛋白濃度使用 BCA蛋白分析試劑盒檢測(cè)。
[0036] β -鏈蛋白 Western Blotting 分析：Beta-catenin 上樣量為 1 μ g / 孔，上樣 至8%凝膠中，SDS-PAGE電泳（100 V，1 h)，分離出的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜中，5%脫脂奶粉 封閉 lh，兔源 Anti-beta catenin 多克隆一抗孵育（1:5000，Abeam, Inc, Cambridge, ab32572)2h，Anti_rabbit IgG二抗（1: 1000，Beyotime Biotechnology, A0208)孵育 lh， 凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)。鼠源 Beta-tubulin -抗（1: 1000，Beyotime Biotechnology, AT819)孵育 1 h，Anti-mouse IgG 二抗（1: 1000，Beyotime Biotechnology, A0216)孵 育1 h，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。蛋白表達(dá)量使用Bio-Rad Quality One分析軟件 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。樣本檢測(cè)結(jié)果通過(guò)對(duì)照樣本糾正(每個(gè)膠中都跑了同一對(duì)照樣本)，最后通過(guò) Beta-tubulin糾正，保證上樣量的一致。
[0037] 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Western Blotting分析：BDNF上樣量為5 μ g /孔，上樣 至10%凝膠中，SDS-PAGE電泳（100 V，1 h)，分離出的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜中，5%脫脂奶粉 封閉 lh，兔源 Anti-BDNF 多克隆一抗孵育（1:1000，Abeam, Inc, Cambridge, ab6201)2h， Anti-rabbit IgG 二抗（1: 1000，Beyotime Biotechnology, A0208)孵育 lh，凝膠成像分 析系統(tǒng)檢測(cè)。鼠源 Beta-tubulin -抗（1: 1000，Beyotime Biotechnology, AT819)孵育 1 h，Anti_mouse IgG 二抗（1: 1000，Beyotime Biotechnology, A0216)孵育 1 h，凝膠成 像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。蛋白表達(dá)量使用Bio-Rad Quality One分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。樣本檢 測(cè)結(jié)果通過(guò)對(duì)照樣本糾正(每個(gè)膠中都跑了同一對(duì)照樣本)，最后通過(guò)Beta-tubulin糾正， 保證上樣量的一致。
[0038] 圖5為給藥后小鼠的BDNF及Beta-catenin的Western Blotting印記結(jié) 果，A為BDNF的印記結(jié)果，B為Beta-catenin的蛋白印記結(jié)果；圖6為給藥后小鼠的 BDNF及Beta-catenin的蛋白表達(dá)百分比結(jié)果，A為BDNF的蛋白表達(dá)百分比結(jié)果，B為 Beta-catenin的蛋白表達(dá)百分比結(jié)果；*表示與生理鹽水對(duì)照組相比差別有顯著性意義 (p〈0. 05)。結(jié)果顯示，WGPA-A顯著增加了小鼠海馬區(qū)的BDNF及Beta-catenin的蛋白表達(dá) 百分比。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 人參果膠在制備抗抑郁樣行為藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參果膠在制備抗抑郁樣行為藥物中的應(yīng)用，其特征在于， 所述人參果膠活性組分為人參果膠酸性組分WGPA-A。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的人參果膠在制備抗抑郁樣行為藥物中的應(yīng)用，其特征在于， 所述人參果膠酸性組分WGPA-A能誘導(dǎo)小鼠海馬Beta-catenin及BDNF的蛋白表達(dá)上調(diào)，增 強(qiáng)突觸間遞質(zhì)的釋放，影響神經(jīng)元的可塑性和促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的人參果膠在制備抗抑郁樣行為藥物中 的應(yīng)用，其特征在于，所述抗抑郁樣行為為雙向情感性精神障礙、社會(huì)攻擊行為或焦慮等。5. -種抗抑郁樣行為的藥物，其特征在于，所述藥物包含人參果膠酸性組分WGPA-A。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗抑郁樣行為的藥物，其特征在于，所述藥物為以人參 果膠酸性組分WGPA-A單一成分為有效藥物成分。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種抗抑郁樣行為的藥物，其特征在于，所述藥物為人參果 膠酸性組分WGPA-A和其他具有同類功效的藥物成分組成的復(fù)方形式。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人參果膠在抗抑郁樣行為中的應(yīng)用，屬于中藥應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)人參果膠強(qiáng)飼給予小鼠12天，通過(guò)開(kāi)場(chǎng)自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)，高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)，社會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其抗抑郁樣行為的活性，結(jié)果表明人參果膠顯著增加了小鼠社會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)中的干擾時(shí)間、次數(shù)，降低了小鼠入侵時(shí)間、次數(shù)；增加了小鼠進(jìn)入高架十字迷宮中敞開(kāi)臂的時(shí)間率和次數(shù)率；降低了小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的固定不動(dòng)時(shí)間，上述行為學(xué)的改變伴隨著小鼠海馬腦區(qū)β-鏈蛋白Beta-catenin及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF的蛋白表達(dá)增加；即人參果膠通過(guò)誘導(dǎo)小鼠海馬Beta-catenin及BDNF的蛋白表達(dá)，增強(qiáng)突觸間遞質(zhì)的釋放及突觸間聯(lián)系進(jìn)而影響神經(jīng)元的可塑性和促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育，發(fā)揮抗抑郁樣行為的活性。
【IPC分類】A61P25/22, A61K31/732, A61P25/24, A61K36/258
【公開(kāi)號(hào)】CN105287671
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510724008
【發(fā)明人】王佳, 張維寧, 王玉聰, 陳嘉欣, 魯京欣, 査利晨, 宗慧敏, 王文欣, 彭顥, 陳宇璇, 周露, 周甜甜, 侯卓然
【申請(qǐng)人】江蘇大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年10月30日