2] 參照文獻(xiàn)（汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實(shí)驗(yàn)研 究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008 ;24(1) :25~27)的方法，將樣品按稀釋順序M)橫向 接種于96板孔中的單層細(xì)胞上，每孔IOOuL每稀釋度縱向重復(fù)4孔，微孔板的A、B、C行 加含100個TCI^。的病毒IOOuL作為試驗(yàn)組，D行補(bǔ)充等容量細(xì)胞維持液為不同濃度藥物 對照，平行設(shè)F行作為病毒對照，E行的1~12作為細(xì)胞對照。37°C、5%C〇2培養(yǎng)，每日觀 察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出現(xiàn)90%W上C陽時，加1%中性紅染色，用酶標(biāo)儀在波長 540皿波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗(yàn)組與細(xì)胞對照組A值相比，獲 得細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度（ICJ，最終將TDw和IC5。相比獲得 抑毒指數(shù)燈I)。 陽0創(chuàng) 妨結(jié)果：
[0044] ①樣品TDs。的測定：對照組細(xì)胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、 化合物III和化合物IV的TDs廟肥K293分別為2 1'39、2 2'is、2 2'38。
[0045] ②抑毒實(shí)驗(yàn)：對照組細(xì)胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，服V-1、服V-2病毒 對照組分別在第3d、3d出現(xiàn)90%W上的CPE，服V1和服V2在肥K293C陽則W腫脹、多細(xì) 胞融合化SV1致多個細(xì)胞融和成大泡，而HSV2致融合為小泡）、變圓、脫落為主要特征。
[0046] 而組合物抑毒試驗(yàn)各組細(xì)胞，按照組合物樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPEWSV 1-HEK293在第10稀釋度之前、HSV2-HEK293組在第9稀釋度之前細(xì)胞完全被保護(hù)，之后出 現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
[0047] 而化合物HI和化合物IV處理組在2 6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應(yīng)。 W48] 將上述實(shí)驗(yàn)板用1 %中性紅染色、用酶標(biāo)儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照 組A值后，各實(shí)驗(yàn)組A值與細(xì)胞對照組A值相比獲得ICw,ICw與TDW相比獲得組合物的TI:抑制服V-1、服V-2在肥K293細(xì)胞發(fā)生CPE，ICsd分別為2 11'35、2TI分別為996. 0、 1686. 7?；衔颕II的TI:對應(yīng)的ICsc分別為2 4'73、2s'ls，TI分別為5. 9、8. 1。化合物IV 的TI:對應(yīng)的ICw分別為2 "8、2 4'?，TI分別為3. 5、5. 3。
[0049] 結(jié)論：組合物具有顯著的抗瘤疹科病毒（包括服V-I、肥V-2)的作用，而且安全性 高，因此組合物在治療瘤疹病毒感染疾病中具有廣泛的應(yīng)用背景。化合物III和化合物IV 不具有顯著的抗瘤疹科病毒（包括服V-1、肥V-2)的作用，而且安全性極低，因此化合物III 和化合物IV在治療瘤疹病毒感染疾病中沒有應(yīng)用背景。
[0050](二）實(shí)驗(yàn)例：組合物對呼吸道合胞病毒巧SV)的作用研究
[0051] (1)組合物、化合物HI和化合物IV的配置：將藥物溶于細(xì)胞維持液（含2%新生 牛血清的MEM，GIBICO公司產(chǎn)品）中備用。
[0052] (2)細(xì)胞株與病毒株：
[0053] 人胚腎細(xì)胞（肥K293，RSV病毒敏感細(xì)胞）購自美國Clontech公司；呼吸道合胞病 毒巧SV)Long株引自中國CDC病毒病研究所。
[0054] (3)細(xì)胞毒性測定：
[00對參照文獻(xiàn)（汪受傳，王霖，陳超等，清肺日服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作 用的實(shí)驗(yàn)研究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008 ;24(1) :25~27)的方法，將樣品W2倍比做系 列稀釋（2°一 5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的肥K293上，每孔100祉，每稀釋度 縱向重復(fù)3孔（A、B、C行），平行設(shè)微孔板D的1~6孔為細(xì)胞對照，7~12孔不接種細(xì)胞 為空白對照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7山中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將 實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞對照組OD值相比計算細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細(xì)胞中 毒濃度燈05。）。
[0056] (4)抑毒試驗(yàn)：
[0057] 參照文獻(xiàn)（汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作 用的實(shí)驗(yàn)研究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008 ;24(1) :25~27)的方法，將樣品按稀釋順序 (2 2^ 橫向接種于96板孔中的單層細(xì)胞上，每孔IOOuL每稀釋度縱向重復(fù)4孔，微孔板 的A、B、C行加含100個TCIDw的病毒IOOuL作為試驗(yàn)組，D行補(bǔ)充等容量細(xì)胞維持液為不 同濃度藥物對照，平行設(shè)F行作為病毒對照，E行的1~12作為細(xì)胞對照。37°C、5%C〇2培 養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出現(xiàn)90%W上C陽時，加1%中性紅染色，用酶標(biāo) 儀在波長540皿波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗(yàn)組與細(xì)胞對照組A 值相比，獲得細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度（ICJ，最終將TDw和IC5。 相比獲得抑毒指數(shù)（TI)。 陽05引 妨結(jié)果：
[0059] ①樣品TDs。的測定：對照組細(xì)胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、 化合物III和化合物IV對肥K293的TDsn分別為2 2'°7、22'3I、2 2'28。
[0060] ②抑毒實(shí)驗(yàn)：對照組細(xì)胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，RSV病毒對照組在 第2d出現(xiàn)90%W上的CPE，RSV在肥K293CPEW折光性增強(qiáng)、變圓、脫落、破碎為主要特征。
[0061] 而組合物抑毒試驗(yàn)各組細(xì)胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE:
[0062]RSV-HEK293試驗(yàn)組細(xì)胞在第9稀釋度之前，細(xì)胞完全被保護(hù)，之后出現(xiàn)CPE，C陽隨 樣品濃度減少逐漸加重。
[0063] 而化合物HI和化合物IV處理組在2 6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應(yīng)。
[0064] 將上述實(shí)驗(yàn)板用1 %中性紅染色、用酶標(biāo)儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照 組A值后，各實(shí)驗(yàn)組A值與細(xì)胞對照組A值相比獲得ICw,ICw與TDW相比獲得TI:組合物 抑制RSV在肥K293細(xì)胞發(fā)生CPE，ICs。為2 11'"，TI為548. 7;化合物III的ICs。為2 4'32， TI為4. 0 ;化合物IV的ICw為2 5'11，TI為7. 1。結(jié)論：組合物具有顯著的抗副粘科病毒呼 吸道合胞病毒RSV的作用，可W用來制備抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物?；衔?III和化合物IV無顯著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，不可W用來制備抗副 粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物。 W65] (S)實(shí)驗(yàn)例：組合物對甲型流感病毒的作用研究：
[0066] (1)細(xì)胞株與病毒株：狗腎細(xì)胞（MDCK，流感病毒敏感細(xì)胞）引自中國CDC病毒病 研究所；流感病毒甲型（FluA) 1995.AII:32094地方株引自中國CDC病毒病研究所。
[0067] 似細(xì)胞毒性測定： W側(cè)參照文獻(xiàn)（汪受傳，王霖，陳超等，清肺日服液含藥血清對病毒抑制作用的實(shí)驗(yàn)研 究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008 ;24(1) :25~27)的方法，將各樣品W2倍比做系列稀釋 (2 1 一 5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的MDCK上，每孔100祉，每稀釋度縱向重復(fù) 3孔（A、B、C行），平行設(shè)微孔板D的1~6孔為細(xì)胞對照，7~12孔不接種細(xì)胞為空白對 照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7山中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實(shí)驗(yàn)組 與細(xì)胞對照組OD值相比計算細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細(xì)胞中毒濃度 (TDso)O W例 做抑毒試驗(yàn)：
[0070] 參照文獻(xiàn)（汪受傳，王霖，陳超等，清肺日服液含藥血清對病毒抑制作用的實(shí)驗(yàn)研 究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008:24(1) :25~27)的方法，將樣品按稀釋順序橫向接種于96 板孔中的單層細(xì)胞上，每孔IOOuL每稀釋度縱向重復(fù)4孔，微孔板的A、B、C行加含100個 TCIDw的病毒IOOuL作為試驗(yàn)組，D行補(bǔ)充等容量細(xì)胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設(shè) F行作為病毒對照，E行的1~12作為細(xì)胞對照。37°C、5%C〇2培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀 察4d。病毒對照出現(xiàn)90%W上C陽時，加1 %中性紅染色，用酶標(biāo)儀在波長540皿波長讀取 A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗(yàn)組與細(xì)胞對照組A值相比，獲得細(xì)胞存活率， 用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度（ICJ，最終將TDw和IC5。相比獲得抑毒指數(shù)燈I)。 陽〇7U (4)結(jié)果：
[0072] ①樣品TDs。的測定：對照組細(xì)胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、 化合物III和化合物IV對的TDs廟MDCK分別為2 2'Si、2 2'27、2 2'96。
[0073] ②抑毒實(shí)驗(yàn)：對照組細(xì)胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)luA在MDCKCPE W折光性增強(qiáng)、壞死、破碎為主要特征。
[0074] 而組合物抑毒試驗(yàn)各組細(xì)胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE=FIuA-MDCK 組細(xì)胞在第8稀釋度之前細(xì)胞完全被保護(hù)，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。 陽07引而化合物m和化合物IV處理組在2 4~6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應(yīng)。
[0076] 將上述實(shí)驗(yàn)板用1 %中性紅染色、用酶標(biāo)儀測450nm的A值，各組A值減掉病毒對 照組A值后，各實(shí)驗(yàn)組A值與細(xì)胞對照組A值相比獲得ICw,ICw與TDW相比獲得TI:組合 物抑制FluA在MDCK細(xì)胞發(fā)生CPE，IC5。為2ll'll，TI為 362.0;化合物III的IC5。為24'35， TI為 4. 2 ;化合物IV的ICs。為 2 3'28,TI為 1. 2。
[0077] 結(jié)論：組合物對甲型流感病毒具有很強(qiáng)的抑制作用，而且安全，因此組合物在治療 甲型流感病毒感染疾病中具有廣泛的應(yīng)用背景?；衔颕II和化合物IV對甲型流感病毒 沒有顯著的抑制作用，而且安全性極低，因此化合物III和化合物IV在治療甲型流感病毒 感染疾病中沒有應(yīng)用背景。
[007引實(shí)施例6本發(fā)明所設(shè)及組合物片劑的制備
[0079] 取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
[0080] 實(shí)施例7本發(fā)明所設(shè)及組合物膠囊的制備
[0081] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100 粒。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為45%和55%，2. 如權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為：將化合物III的粉末和化合物 IV的粉末按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為45 %和55 %充分混合。3. -種如權(quán)利要求1所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述病毒為甲型 流感病毒。5. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述病毒為單純 皰疹病毒。6. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述病毒為呼吸 道合胞病毒。7. 如權(quán)利要求5所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述單純皰疹病 毒為單純皰疹病毒1型或者單純皰癥病毒2型。8. 如權(quán)利要求7所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述單純皰疹病 毒1型為單純痕疼病毒1型的Sm44株。9. 如權(quán)利要求7所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述單純皰疹病 毒2型為單純皰癥病毒2型333株。
【專利摘要】本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物及其在制備抗病毒藥物上的用途。公開了一種組合物及其制備方法。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的組合物具有抗病毒作用，具有開發(fā)抗病毒藥物的價值。
【IPC分類】A61P31/22, A61K31/4025, C07D313/06, A61P31/16, A61K31/5377
【公開號】CN105343106
【申請?zhí)枴緾N201510752212
【發(fā)明人】朱磊磊
【申請人】蘇州賀澳德生物醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年11月6日