抗綿羊包蟲病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及抗綿羊包蟲病感染的基因巧g.myophilin分 子工程疫苗、其制備方法及應(yīng)用技術(shù)
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)粒棘球蝴蟲病，俗稱包蟲病，目前尚沒(méi)有商品化的疫苗。當(dāng)前已有十余種候選分 子，如Eg95、rEgl4-3-3重組疫苗、鐵蛋白重組疫苗、GST重組疫苗等，其中最早證實(shí)EG95是 一種綿羊保護(hù)性細(xì)粒棘球蝴疫苗，其對(duì)綿羊的保護(hù)力為96-98%，其中國(guó)內(nèi)康強(qiáng)等也在綿羊 身上對(duì)EG95進(jìn)行保護(hù)力驗(yàn)證，得到了 90 %的保護(hù)力。遺憾的是Eg95首先由國(guó)外研發(fā)成功 的，即使開(kāi)發(fā)成為真正的商品，其知識(shí)產(chǎn)權(quán)也不屬于我們。而目前絕大部分包蟲病候選疫苗 分子都是通過(guò)小鼠繼發(fā)感染實(shí)驗(yàn)完成，缺乏直接的應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)榘x感染主要通過(guò)其蟲 卵經(jīng)消化道感染而不是繼發(fā)感染；再者，小鼠亦不是細(xì)粒棘球蝴?。òx?。┲饕奶烊贿m 宜宿主。
[0003] 由于細(xì)粒棘球蝴主要寄生于人的肝臟，故該病又稱為肝包蟲病。它呈世界性分布， 是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)近年普查，我國(guó)有25個(gè)省、市和自治區(qū)有該病的病例報(bào)道，其 中W新疆、寧夏、甘肅、青海、西藏、四川、內(nèi)蒙古7個(gè)省（區(qū)）流行最為嚴(yán)重，高發(fā)區(qū)約占全 國(guó)面積的44%，受威脅人口約5千萬(wàn)。該病已被列為我國(guó)重點(diǎn)防治的寄生蟲病之一。
[0004] 包蟲病嚴(yán)重危害人類的健康和農(nóng)牧業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。包蟲病對(duì)人危害主要表現(xiàn)為在 肝臟、肺、腦或腎等器官形成占位性包囊病變，W機(jī)械壓迫與營(yíng)養(yǎng)消耗等形式造成運(yùn)些重 要器官的嚴(yán)重?fù)p害，甚至導(dǎo)致個(gè)體死亡；而對(duì)于家畜而言，包蟲病將會(huì)造成家畜的減產(chǎn)、品 質(zhì)下降等重大經(jīng)濟(jì)問(wèn)題，并且作為寄生蟲感染生活史的重要一個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)人民生命財(cái)產(chǎn)安全 帶來(lái)巨大隱患。
[0005] 目前，人包蟲病的首選治療方法是外科手術(shù)，但由于該病發(fā)病早期可無(wú)自覺(jué)癥狀， 等到入院就診時(shí)，相應(yīng)的臟器已經(jīng)受到嚴(yán)重的損傷并且手術(shù)本身對(duì)機(jī)體也有損傷，從而使 患者在健康和經(jīng)濟(jì)上都蒙受了極大的損害。對(duì)于較早期小棘球蝴或有手術(shù)禁忌的病例可采 用阿苯化挫或甲苯咪挫等藥物進(jìn)行化療，臨床發(fā)現(xiàn)運(yùn)些藥物存在嚴(yán)重的毒副作用，部分患 者不能耐受，同時(shí)某些化療患者可產(chǎn)生耐藥性。因此，無(wú)論是手術(shù)治療，還是藥物治療，對(duì)于 包蟲病治療都有很大的不足。對(duì)于家畜而言，目前很少有相應(yīng)的診療措施。
[0006] 要想從源頭上防控包蟲病，疫苗的研發(fā)將是必然選擇。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技 術(shù)的迅速發(fā)展及在醫(yī)學(xué)科學(xué)中的廣泛應(yīng)用，利用基因工程技術(shù)對(duì)病原體進(jìn)行分子疫苗的預(yù) 防研究引起了人們的廣泛關(guān)注。從目前的研究情況來(lái)看，國(guó)內(nèi)外對(duì)細(xì)胞粒棘球蝴蟲研究較 為成功的重組疫苗有Eg95,它已在人工感染的牛和羊群獲得了較好的免疫保護(hù)水平，免疫 保護(hù)力達(dá)到96-98%。
[0007] 羊作為細(xì)粒棘球緣蟲最主要的天然中間宿主，是細(xì)粒棘球蝴緣蟲感染生活史的重 要環(huán)節(jié)，制備出羊的包蟲病疫苗，預(yù)防家畜羊的感染，阻斷寄生蟲生活史進(jìn)而減少傳染給人 的幾率，具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)目前沒(méi)有羊包蟲病疫苗的現(xiàn)狀，提供一種基因 分子巧g.myophilin在制備抗綿羊包蟲病感染疫苗上的應(yīng)用，同時(shí)提供運(yùn)種疫苗及其制備 方法。 陽(yáng)009] 本發(fā)明技術(shù)方案如下： 陽(yáng)010] 抗綿羊包蟲病感染的基因巧g.myophilin分子工程疫苗，是從細(xì)粒棘球蝴中國(guó)株 提取RNA并通過(guò)RT-PCR獲得Eg.myophilin基因，再通過(guò)克隆、誘導(dǎo)表達(dá)、純化獲得的疫苗， 其保藏號(hào)為：CCTCCM2015426。
[0011] -種抗綿羊包蟲病感染的基因巧g. myophilin分子工程疫苗的制備方法，首先從 細(xì)粒棘球蝴中國(guó)株提取RNA并通過(guò)RT-PCR獲得Eg. myophi 1 in基因，該基因收錄在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)：DQ679473,Eg. myophilin亞克隆于表達(dá)載體祀T-28a，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 化21 0E3) PlysS中誘導(dǎo)表達(dá)，再用含Ni化的His-bind樹脂純化試劑盒純化蛋白；
[0012] 巧g.myophilin基因分子應(yīng)用于制備抗綿羊包蟲病感染的疫苗。
[0013] 本發(fā)明在細(xì)粒棘球蝴重組疫苗myophilin在小鼠身上進(jìn)行免疫保護(hù)驗(yàn)證，免疫保 護(hù)力達(dá)到了 92%。該疫苗有望在肝包蟲防治中發(fā)揮巨大的作用。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1顯示采用ELISA法分別檢測(cè)了血清中巧g.myophilin抗原特異性IgGJgGU IgG2與I姐抗體水平。 陽(yáng)01引圖2顯示ELISA細(xì)胞因子試劑盒檢測(cè)結(jié)果，疫苗組IFN-丫與比-2顯著升高，表明 Thl型介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答顯著激活；而與化2型細(xì)胞因子IL-4亦顯著升高，表明體液免 疫應(yīng)答亦明顯上調(diào)，與抗體升高結(jié)果一致。
【具體實(shí)施方式】 [0016] 疫苗制備： 陽(yáng)017] -種抗綿羊包蟲病感染的基因巧g. myophilin分子工程疫苗的制備方法，首先從 細(xì)粒棘球蝴中國(guó)株提取RNA并通過(guò)RT-PCR獲得Eg. myophi 1 in基因，該基因收錄在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)：DQ679473,Eg. myophilin亞克隆于表達(dá)載體祀T-28a，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 化21 0E3) plysS中誘導(dǎo)表達(dá)，再用Novagen公司的含Ni化的His-bind樹脂純化試劑盒純 化蛋白；
[0018] 為了證實(shí)重組抗原疫苗巧g.myophilin的抗包蟲病感染的免疫保護(hù)力，本發(fā)明W 綿羊天然感染包蟲蟲卵為基礎(chǔ)，通過(guò)初次免疫-加強(qiáng)免疫（prime-boost)進(jìn)行預(yù)防接種 巧g.myophilin,采用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等手段，評(píng)價(jià)該疫苗抗包蟲感染的保 護(hù)力及其免疫保護(hù)機(jī)制。
[0019] 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)粒棘球蟲卵的準(zhǔn)備
[0020] 4-6月齡雄性綿羊，利用原頭蝴粗抗原包被檢測(cè)綿羊血清巧LISA)陰性的入組，隨 機(jī)分為3組：疫苗巧g.myophilin接種組、FCA(完全福氏佐劑）組、PBS組，每組10只。細(xì) 粒棘球緣蟲蟲卵由蘭州獸醫(yī)所提供，具體制備過(guò)程如下：從新疆購(gòu)買6月齡±犬3只，于蘭 州獸醫(yī)所試驗(yàn)站隔離飼養(yǎng)，用化哇酬對(duì)實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行驅(qū)蟲，并注射地塞米松W降低其免疫力。 一周后，給實(shí)驗(yàn)犬喂食含有原頭蝴的包囊，感染后45d對(duì)其進(jìn)行糞便檢測(cè)，糞便細(xì)粒棘球緣 蟲蟲卵陽(yáng)性時(shí)，注射烏拉坦安樂(lè)處死（實(shí)驗(yàn)犬于處死之前禁食2地，W減少小腸內(nèi)容物），沿 腹中線剖開(kāi)腹部，自幽口至小腸下段結(jié)扎，剪下小腸，分離腸系膜，將其縱向剪成大小適宜 的片段4-5段，放在含有37°C生理鹽水的小燒杯中稍微晃動(dòng)W洗掉其內(nèi)容物，再次更換新 的生理鹽水，將其放在水浴鍋中37°C解育比，使細(xì)粒棘球緣蟲成蟲從小腸腸壁自行脫落。 用注射器將細(xì)粒棘球緣蟲蟲體吸出，滴數(shù)滴于載玻片上，在顯微鏡下檢測(cè)并判斷其是否成 熟，收集成熟的細(xì)粒棘球緣蟲蟲體于生理鹽水中，用注射器吸取，每管吸取20個(gè)成熟蟲體， 保存?zhèn)溆茫糜趯?shí)驗(yàn)綿羊包蟲病的人工感染。（細(xì)粒棘球緣蟲蟲卵獲取的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中， 操作人員均穿戴一次性防護(hù)服，實(shí)驗(yàn)完后對(duì)隔離的實(shí)驗(yàn)犬舍地面及周圍噴灑堿石灰糊狀 液（1:4)，并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用到的所有實(shí)驗(yàn)器材噴灑10.0%次氯酸鋼溶液W殺滅有可 能殘留的細(xì)粒棘球緣蟲蟲卵，另外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用到的一次性防護(hù)用品全部銷毀，W消除對(duì) 周圍環(huán)境的污染。）
[0021] 2、免疫接種與細(xì)粒棘球蟲卵感染
[0022] 分別在第1周與第4周免疫接種綿羊。疫苗過(guò)濾除菌，用PBS調(diào)節(jié)濃度至50yg/ ml,頸部注射Iml的疫苗。第一次免疫：重組疫苗：完全弗氏佐劑（CFA) = 1:1。第二次免 疫：第一次免疫后四周，重組疫苗：不完全弗氏佐劑（IFA) = 1:1。蟲卵37°C解育40min， 采用膠囊包裝的形式經(jīng)口攻擊感染細(xì)粒棘球蟲卵。每只羊攻入約3000個(gè)左右蟲卵。
[0023] 3、不同時(shí)間點(diǎn)采血
[0024] W第一次免疫作為0周起始點(diǎn)，分別在0、1、2、4、6、9、12w、20、36與44周進(jìn)行采頸 部靜脈血5ml離屯、收集血清-80°C保存，共計(jì)10次（在0、4、8和44周先采血然后相對(duì)應(yīng)的 進(jìn)行兩次免疫、攻蟲感染和剖殺處理）。
[0025] 4、包囊統(tǒng)計(jì)及保護(hù)力的計(jì)算
[00%] 包囊檢測(cè)：把綿羊處死之后取肝，首先仔細(xì)檢查并記錄肝臟表面的包囊個(gè)數(shù)，然后 再用刀把肝切成片，3mm左右/片，仔細(xì)檢查并記錄肝臟內(nèi)部包囊個(gè)數(shù)。纖維化和巧化的包 囊視為不可用包囊。保護(hù)力的計(jì)算，通過(guò)減囊率來(lái)計(jì)算保護(hù)力，保護(hù)力計(jì)算公式：免疫保護(hù) 力（％) = (1-免疫組包囊均數(shù)/對(duì)照組包囊均數(shù)）X100%。經(jīng)包囊統(tǒng)計(jì)與計(jì)算，該疫苗 獲得了 92%的保護(hù)力，具體如下表所示。
[0028] 5、檢測(cè)血清抗體
[0029] 采用ELISA法分別檢測(cè)了血清中！"Eg.myophilin抗原特異性IgG、IgGl、IgG2與 I姐抗體水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)免疫接種后，疫苗組運(yùn)四種特異性抗體顯著升高。如圖I所示。
[0030] 6、檢測(cè)血清細(xì)胞因子 陽(yáng)03UELISA細(xì)胞因子試劑盒檢測(cè)表明，經(jīng)免疫接種后，疫苗組IFN-丫與比-2顯著升高， 表明Thl型介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答顯著激活；而與化2型細(xì)胞因子IL-4亦顯著升高，表明體 液免疫應(yīng)答亦明顯上調(diào)，與抗體升高結(jié)果一致。如2圖所示。 本申請(qǐng)所設(shè)及的生物保藏單位名稱：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、地址：中國(guó)湖北省武漢 市武漢大學(xué)；保藏日前：2015年7月3日；保藏編號(hào)：CCTCCNO:M2015426 ;分類命名：大腸 桿菌BL21/pET-28曰/Eg.MyophilinEscherichiscoliBL21/pET-28曰/Eg.Myophilin。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 抗綿羊包蟲病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗，是從細(xì)粒棘球蝴中國(guó)株提 取RNA并通過(guò)RT-PCR獲得Eg.myophi1in基因，再通過(guò)克隆、誘導(dǎo)表達(dá)、純化獲得的疫苗，其 保藏號(hào)為：CCTCCM2015426。2. -種抗綿羊包蟲病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗的制備方法，首先從細(xì) 粒棘球蝴中國(guó)株提取RNA并通過(guò)RT-PCR獲得Eg.myophi1in基因，該基因收錄在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)：DQ679473,Eg.myophilin亞克隆于表達(dá)載體pET-28a，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21 (DE3)plysS中誘導(dǎo)表達(dá)，再用含Ni2+的His-bind樹脂純化試劑盒純化蛋白。 3. rEg.myophilin基因分子應(yīng)用于制備抗綿羊包蟲病感染的疫苗。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗綿羊包蟲病感染的基因rEg.myophilin分子工程疫苗，是從細(xì)粒棘球蚴中國(guó)株提取RNA并通過(guò)RT-PCR獲得Eg.myophilin基因，再通過(guò)克隆、誘導(dǎo)表達(dá)、純化獲得的疫苗，其保藏號(hào)為：CCTCC？M2015426。本發(fā)明還涉及rEg.myophilin基因分子應(yīng)用于制備抗綿羊包蟲病感染的疫苗。本發(fā)明在細(xì)粒棘球蚴重組疫苗myophilin在綿羊身上進(jìn)行免疫保護(hù)驗(yàn)證，免疫保護(hù)力達(dá)到了92％。該疫苗有望在肝包蟲防治中發(fā)揮巨大的作用。CCTCC NO：M201542620150703
【IPC分類】C12N15/12, C07K14/435, A61K48/00, C12N15/70, A61K39/00, A61P33/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105343872
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510703525
【發(fā)明人】趙巍
【申請(qǐng)人】寧夏醫(yī)科大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2015年10月27日