含有突變型h因子結(jié)合蛋白的疫苗組合物的制作方法
【專利說(shuō)明】含有突變型Η因子結(jié)合蛋白的疫苗組合物
[0001 ] 本發(fā)明專利申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/GB2009/051439,國(guó)際申請(qǐng)日為2009年10月 26日,進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)?zhí)枮?00980148000.3,名稱為"含有突變型Η因子結(jié)合蛋白 的疫苗組合物"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及用于引發(fā)對(duì)病原生物的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物,具體的,設(shè)及能 引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的免疫原性組合物。
【背景技術(shù)】
[0003]腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)(腦膜炎球菌)是寄居于人鼻咽中的 一種芙膜革蘭氏陰性雙球菌。普通人群中的攜帶率通常為約10%。復(fù)雜的宿主-病原體關(guān)系 通常是共生性的。但是,攜帶腦膜炎球菌有時(shí)能引起侵入性疾病。運(yùn)一現(xiàn)象通常與屬于少數(shù) 的超毒力克隆譜系的菌株有關(guān)(Caugant,D.A.等(1987)JBacteriol169:2781-2792)。腦 膜炎球菌(N.meningitidis)是全球化脈性腦膜炎的主要原因,并且是唯--種能造成腦膜 炎和敗血癥爆發(fā)的細(xì)菌。根據(jù)疾病在任何一個(gè)地理位置的地方性或流行性的普遍性,發(fā)病 率在每105人群中為1-3之間。因此,需要開(kāi)發(fā)預(yù)防性和治療性方案來(lái)降低侵入性腦膜炎球 菌疾病的發(fā)生率、致死率和發(fā)病率。
[0004]腦膜炎奈瑟球菌對(duì)多種一線抗生素敏感,但是盡管如此,大量被診斷為腦膜炎球 菌感染的患者死于重癥或承受嚴(yán)重的并發(fā)癥。致死率從沒(méi)有并發(fā)癥的腦膜炎病例中的2-3%到發(fā)生感染性休克的病例中的50%或更高(Cartwri曲t,K.A.和D.A.Ala'Aldeen(1997) JInfect34:15-19)。
[0005]當(dāng)前批準(zhǔn)的疫苗是基于包裹住細(xì)菌外膜的多糖芙膜,因此僅提供了針對(duì)表達(dá)相 應(yīng)芙膜的一部分菌株的保護(hù)。此外,還沒(méi)有針對(duì)血清組B腦膜炎奈瑟球菌廣譜有效的疫苗, 而運(yùn)種菌株是發(fā)達(dá)國(guó)家中腦膜炎球菌疾病的最常見(jiàn)病因。運(yùn)是因?yàn)檠褰MB芙膜由唾液酸 的聚合物組成,該聚合物在結(jié)構(gòu)上與嬰兒期和胚胎發(fā)育期表達(dá)的人神經(jīng)細(xì)胞粘著分子的一 種修飾相關(guān)。人們擔(dān)屯、用運(yùn)一抗原進(jìn)行免疫會(huì)造成自身免疫應(yīng)答。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明設(shè)及新型的組合物,具體地,設(shè)及新型的包含修飾的Η因子結(jié)合蛋白的免疫 原性組合物,W及運(yùn)些組合物在引發(fā)針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的免疫應(yīng)答中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的之一是提供一種或多種能用來(lái)引發(fā)針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的保護(hù)性 免疫應(yīng)答的組合物。
[000引本發(fā)明的第一方面提供了包含至少一種修飾的Η因子結(jié)合蛋白的免疫原性組合 物,其中該組合物給予人或非人動(dòng)物時(shí)能引發(fā)免疫應(yīng)答。
[0009]優(yōu)選地,本文所述Η因子結(jié)合蛋白是指來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)或淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)的Η因子結(jié)合蛋白。
[0010] 腦膜炎奈瑟球菌通過(guò)模擬宿主而破壞宿主生物的免疫應(yīng)答。腦膜炎奈瑟球菌使用 Η因子結(jié)合蛋白形式的蛋白質(zhì)替代帶電碳水化合物化學(xué)特性來(lái)征集宿主的補(bǔ)體調(diào)節(jié)子,Η因 子。
[0011] 在健康個(gè)體中,補(bǔ)體的激活通過(guò)包括Η因子(fH)在內(nèi)的膜結(jié)合和水溶性血漿調(diào)節(jié) 蛋白被精確調(diào)控。Η因子是155kDa的蛋白質(zhì),由二十個(gè)域(稱為補(bǔ)體控制蛋白重復(fù),或CCP)組 成。多種病原體已經(jīng)適應(yīng)為通過(guò)在它們的表面馨合Η因子來(lái)避免補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷。
[0012] 如上所述,腦膜炎奈瑟球菌作為造成細(xì)菌性腦膜炎和感染性休克的主要原因,是 一種具有全球重要性的適應(yīng)人體的病原體(St邱hens等(2007)Lancet369,2196-210)。由 于奈瑟球菌菌株的差異,現(xiàn)有的腦膜炎球菌疾病疫苗不提供廣譜基礎(chǔ)的保護(hù),因此其應(yīng)用 很有限。一種方法是使用Η因子結(jié)合蛋白(稱為甜bp、GNA1870、或R2086)作為疫苗組合物中 的抗原。Η因子結(jié)合蛋白是27kDa的表面脂蛋白,普遍存在于腦膜炎奈瑟球菌的表面,能引 發(fā)保護(hù)性的殺菌抗體(Fletcher等(2004)InfectImmun72,2088-100 ;Masi即ani等(2003) JExpMed197,789-99)邊因子結(jié)合蛋白起到把補(bǔ)體的負(fù)調(diào)節(jié)物,Η因子征集到細(xì)菌表面的 作用,并通過(guò)抑制人血漿中補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解而對(duì)腦膜炎球菌避免先天免疫應(yīng)答的能力有貢 獻(xiàn)(Madico等(2006)JImmunol177,501-10;Schneider等(2006)JImmunol176,7566-75)。
[0013]在本發(fā)明中,使用了至少一種修飾的Η因子結(jié)合蛋白作為抗原。該蛋白質(zhì)被修飾W 避免、或減少Η因子與蛋白質(zhì)的結(jié)合。在疫苗制劑中的Η因子結(jié)合蛋白被給予到對(duì)象后,Η因 子與Η因子結(jié)合蛋白的結(jié)合被認(rèn)為會(huì)降低疫苗的成功。首先,Η因子結(jié)合蛋白上Η因子的存在 可能限制宿主免疫系統(tǒng)對(duì)Η因子結(jié)合蛋白上關(guān)鍵表位的識(shí)別。所產(chǎn)生的針對(duì)運(yùn)些表位的抗 體可W是殺菌的,并且抑制Η因子與細(xì)菌結(jié)合使得細(xì)菌對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解敏感。其次,針對(duì)Η 因子結(jié)合蛋白的免疫應(yīng)答還能W和半抗原類似的方式引發(fā)針對(duì)已結(jié)合的Η因子的應(yīng)答。運(yùn) 可能引起潛在的不希望發(fā)生的自身免疫應(yīng)答。最后,由于補(bǔ)體蛋白質(zhì)具有佐劑活性,免疫應(yīng) 答中設(shè)及補(bǔ)體激活。通過(guò)征集Η因子來(lái)降低免疫位點(diǎn)的補(bǔ)體激活會(huì)降低疫苗接種后得到的 免疫水平。
[0014]優(yōu)選地,本發(fā)明中使用的修飾的Η因子結(jié)合蛋白在蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上被 改變。
[0015] 優(yōu)選地,與野生型蛋白質(zhì)的氨基酸相比,修飾的Η因子結(jié)合蛋白至少有一個(gè)氨基酸 被改動(dòng)。
[0016]優(yōu)選地,所述一個(gè)或多個(gè)被改變的氨基酸殘基使Η因子結(jié)合蛋白在和Η因子形成復(fù) 合物時(shí)與分離的Η因子結(jié)合蛋白相比表面暴露減少。Η因子結(jié)合蛋白中所述一個(gè)或多個(gè)被改 變的氨基酸可W是圖6(SEQIDΝ0:1)所示序列中選自下列位置編號(hào)的氨基酸:103、106、 107、108、109、145、147、149、150、154、156、157、180、181、182、183、184、185、191、193、194、 195、196、199、262、264、266、267、268、272、274、283、285、286、288、289、302、304、306、311和 313。
[0017]在Η因子結(jié)合蛋白中被改變的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可W是在野生型蛋白質(zhì)中與Η因 子形成氨鍵結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
[0018]在Η因子結(jié)合蛋白中被改變的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可W是圖6(SEQIDNO: 1)所示序 列中選自下列位置編號(hào)的氨基酸:103、106、107、108、180、181、183、184、185、191、193、195、 262、264、266、272、274、283、286、304和306。
[0019]本發(fā)明中使用的修飾的Η因子結(jié)合蛋白中,上述氨基酸中的兩個(gè)或更多個(gè)、Ξ個(gè)或 更多個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)、或者五個(gè)或更多個(gè)可W被改變。優(yōu)選通過(guò)改變?chǔ)б蜃咏Y(jié)合蛋白中的 一個(gè)或多個(gè)氨基酸,防止或顯著降低與Η因子的結(jié)合。
[0020] 在一種實(shí)施方式中,氨基酸編號(hào)283和204中的至少一個(gè)被突變/改變成丙氨酸,而 不是谷氨酸。優(yōu)選地,運(yùn)一突變導(dǎo)致Η因子的結(jié)合幾乎完全消除。
[0021] 和Η因子與野生型Η因子結(jié)合蛋白間的結(jié)合相比,Η因子與修飾的Η因子結(jié)合蛋白間 的結(jié)合優(yōu)選至少降低5倍,優(yōu)選至少降低10倍,優(yōu)選至少降低2個(gè)數(shù)量級(jí)。結(jié)合力的降低優(yōu)選 在分析物濃度為約50ηΜ下測(cè)得。運(yùn)樣的結(jié)合力降低幅度被認(rèn)為是顯著的降低。
[0022] 除了對(duì)Η因子結(jié)合蛋白進(jìn)行修改來(lái)避免或抑制與Η因子的結(jié)合之外,該蛋白質(zhì)還可 W包括對(duì)蛋白質(zhì)作為針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌感染的免疫原的能力沒(méi)有影響的其它突變。例 如,可W對(duì)蛋白質(zhì)做出其它保守性氨基酸改變。類似地,可W對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行不改變蛋白質(zhì)免 疫原性的插入或缺失操作。
[0023] 優(yōu)選地,修飾的Η因子結(jié)合蛋白與圖6所示序列具有至少60 %、70 %、80 %、85 %、 90%、95%或更高的序列相同性,但是經(jīng)過(guò)修飾,優(yōu)選至少在一個(gè)位置上有一個(gè)不同的氨基 酸,運(yùn)一修飾導(dǎo)致Η因子的結(jié)合力喪失或者顯著降低。
[0024] 序列相同性的百分值被定義為:經(jīng)過(guò)序列比對(duì)和在必要時(shí)引入缺口W最大程度提 高序列相同性百分?jǐn)?shù)后,序列中與所提供的氨基酸序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分 數(shù)。為確定序列相同性百分?jǐn)?shù)進(jìn)行的比對(duì)可W通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方式實(shí)現(xiàn), 例如包括:利用化AST(國(guó)家生物技術(shù)信息中屯、基礎(chǔ)本地比對(duì)捜索工具,化tionalCenter forBiotechnologyInformationBasicLocalAlignmentSearchTool)。
[0025]例如,相同性百分?jǐn)?shù)的變化可能是由于氨基酸的取代、插入或缺失。氨基酸取代可 W是保守性的,其中所取代的氨基酸具有相似的結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性,例如用異亮氨酸取代 亮氨酸就是保守性取代。
[0026] 免疫原性組合物是一種當(dāng)被給予對(duì)象后能引發(fā)針對(duì)至少一種修飾的Η因子結(jié)合蛋 白的免疫應(yīng)答的組合物。優(yōu)選地,對(duì)象是人或者非人動(dòng)物,更優(yōu)選是人或者非人哺乳動(dòng)物。
[0027] 優(yōu)選地,本發(fā)明的組合物引發(fā)的免疫應(yīng)答影響到腦膜炎奈瑟球菌感染已免疫的人 的能力。優(yōu)選地,腦膜炎奈瑟球菌對(duì)經(jīng)本發(fā)明組合物免疫的人的感染能力被阻止或預(yù)防。運(yùn) 可W通過(guò)多種方式實(shí)現(xiàn)。被引發(fā)的免疫應(yīng)答可W識(shí)別并破壞腦膜炎奈瑟球菌?;蛘呋虼送猓?被引發(fā)的免疫應(yīng)答可W阻止或預(yù)防腦膜炎奈瑟球菌的復(fù)制?;蛘呋虼送?,被引發(fā)的免疫應(yīng) 答可W阻止或預(yù)防腦膜炎奈瑟球菌在人或非人動(dòng)物內(nèi)引起疾病。
[0028] 修飾的Η因子結(jié)合蛋白可W是重組生產(chǎn)的(例如從基因工程表達(dá)系統(tǒng)中),或者是 合成產(chǎn)物,例如通過(guò)體外膚合成或體外翻譯制得。
[0029]除了一個(gè)或多個(gè)修飾的Η因子結(jié)合蛋白W外,本發(fā)明的組合物還可W進(jìn)一步的包 含一個(gè)或多個(gè)抗原。進(jìn)一步包含的抗原也可W來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌,并且可能引發(fā)針對(duì)腦 膜炎奈瑟球菌的免疫應(yīng)答。
[0030] 在被給予對(duì)象時(shí),組合物可W用來(lái)引發(fā)/引起保護(hù)性的免疫應(yīng)答。保護(hù)性的免疫應(yīng) 答可W造成腦膜炎奈瑟球菌在感染對(duì)象時(shí)被殺傷,或者可W預(yù)防或抑制腦膜炎奈瑟球菌復(fù) 制和/或引起疾病。
[0031 ]組合物可被用作針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的預(yù)防性或治療性疫苗。
[0032]本發(fā)明的另一方面提供了一種包含至少一種修飾的Η因子結(jié)合蛋白和藥學(xué)上可接 受的載體或賦形劑的藥物組合物。
[0033]優(yōu)選地,該藥物組合物包含按本發(fā)明的第一