用于心力衰竭的預(yù)防或治療的人plgf-2的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及使用胎盤生長(zhǎng)因子2(以下簡(jiǎn)稱為P1GF-2)在哺乳動(dòng)物中治療和/或預(yù) 防心力衰竭或一種或多種個(gè)別的心力衰竭表型。
【背景技術(shù)】
[0002] 雖然在預(yù)防和治療心血管疾病方面有著明顯的進(jìn)展，但是全世界的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明 心力衰竭(HF)的發(fā)病率和盛行率持續(xù)攀高。在工業(yè)化國(guó)家的老齡化社會(huì)，HF的盛行率在50 歲與59歲之間為1 %，而在75歲以上則為10%。此外，在心肌梗塞之后提高的存活率以及用 于預(yù)防心源性猝死的藥理療法和裝置療法的進(jìn)步已經(jīng)明顯擴(kuò)大了處于產(chǎn)生慢性HF的風(fēng)險(xiǎn) 中的患者群體。
[0003] 先前的研究已經(jīng)顯示，施用胎盤生長(zhǎng)因子同種型2(P1GF_2)可在急性心肌梗塞 (AMI)嚙齒動(dòng)物模型中誘導(dǎo)血管生成并且改善心肌區(qū)域和全局功能（Binsalamah等， 2011Int J Nanomed 6,2667;Roncal等，2008J Pathol 216,236;Takeda等，2009Circ J 73,1674)。單次劑量的胎盤生長(zhǎng)因子同種型I(PlGF-I)或規(guī)定的持續(xù)遞送階段是否可在代 表人疾病的大型動(dòng)物模型中增強(qiáng)心臟全局功能仍是不確定的(Kolakowski等，2006J Card Surg 21，559;Iwasaki等，2011PLos One 6，e24872)。最近顯示，全身性rhPIGF-l輸注會(huì)明 顯增強(qiáng)慢性缺血性心肌的區(qū)域血流和收縮功能而無(wú)不利影響。然而，區(qū)域收縮功能的局部 改善不能轉(zhuǎn)為全局LV功能的進(jìn)一步恢復(fù)（Liu等，2013Am J Physiol Heart CircPhysiol304，H885)。目前缺乏關(guān)于P1GF-2的影響的類似知識(shí)。
[0004] 雖然有一些公布描述了PlGFl和P1GF2對(duì)特定模型中HF參數(shù)的特定影響，但是其不 能提供這些蛋白質(zhì)的治療可能的簡(jiǎn)單指示，并且此外不允許在對(duì)PlGFl和P1GF2所得的數(shù)據(jù) 之間進(jìn)行比較。實(shí)際上，盡管大鼠模型為Binsalamah等，2011(Int J Nanomed 6,2667)、 Kolakowski等，2006(J Card Surg 21,559)和Iwasaki等，2011(PLos One 6，e24872)所用， 但是僅Binsalamah等，（2011)和Kolakowski等，（2006)心肌內(nèi)施用了分別含P1GF2蛋白和 PlGFl蛋白的鹽水。Binsalamah等，（2011)也心肌內(nèi)施用了捕獲于納米顆粒中的P1GF2蛋白。 Iwasaki等，（2011)使用了PlGFl的基因治療性心肌內(nèi)施用（通過(guò)PlGF-I編碼質(zhì)粒）。 BinsaIamah等，（2011)應(yīng)用了超聲波心動(dòng)描記術(shù)來(lái)測(cè)定左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF% )，而 Kolakowski等，（2006)使用了使用開胸技術(shù)插入左心室中的電導(dǎo)管。所得結(jié)果因此不允許 測(cè)定在PlGFl和P1GF2之間的治療效果的最終差異。Roncal等，2008(J Pathol 216,236)和 Takeda等，2009(Circ J 73,1674)都依賴于小鼠 HF模型。而Roncal等，（2008)應(yīng)用了基因療 法(腺病毒載體）以施用PlGF2，Takeda等，（2009)施用了重組型PlGFl蛋白。此外，這種差異 阻礙了對(duì)所得結(jié)果的可靠比較并且不允許獲得一種PlGF同種型相對(duì)于另一 PlGF同種型的 最終更好的治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] -方面，本發(fā)明涉及一種組合物，其包含用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物心力衰竭表型 (的方法）的胎盤生長(zhǎng)因子2蛋白（P1GF-2)。
[0006] 心力衰竭表型可以定義為以下任一個(gè)或者其組合：心室功能障礙、收縮末期容量 增大、射血分?jǐn)?shù)減小、心室重構(gòu)或者舒張末期容量增大。具體來(lái)說(shuō)，心室功能障礙可以由收 縮末期容量增大和/或射血分?jǐn)?shù)減小來(lái)定義?；蛘撸氖夜δ苷系K可以由舒張受損、心室填 充壓力增大和射血分?jǐn)?shù)保持來(lái)定義。具體來(lái)說(shuō)，心室重構(gòu)可以由舒張末期容量增大來(lái)定義。
[0007] 待治療或預(yù)防的心力衰竭表型可以呈現(xiàn)于左心室和/或右心室中。在一個(gè)具體實(shí) 施方案中，其呈現(xiàn)于左心室中。
[0008] 上文所述的組合物進(jìn)一步用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物心力衰竭表型（的方法）中，其 中所述哺乳動(dòng)物有動(dòng)脈粥樣硬化。
[0009] 如上文所述的組合物中的P1GF-2蛋白可為重組型P1GF-2蛋白，如獲自哺乳動(dòng)物細(xì) 胞培養(yǎng)物。這種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的實(shí)例是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)培養(yǎng)物或等效的細(xì)胞培 養(yǎng)物。這種細(xì)胞培養(yǎng)物可以能夠以短暫或組成方式表達(dá)P1GF-2蛋白。如上文所述的組合物 中的P1GF-2蛋白在一個(gè)實(shí)施方案中是如由SEQ ID N0:1所定義的人P1GF-2蛋白，或其多態(tài) 變體(多形體）。
[0010] 構(gòu)成如上文所述的組合物的P1GF-2蛋白中的任一種具體來(lái)說(shuō)都通過(guò)全身性施用 來(lái)使用。這種全身性施用可為血管內(nèi)（例如靜脈內(nèi)）或皮下施用。
【附圖說(shuō)明】
[0011 ] 圖I. RhPLGF2治療會(huì)改善區(qū)域心肌功能。在缺血區(qū)域中，在以rhPLGF2治療的豬中， 在靜止時(shí)以及以多巴酚丁胺誘導(dǎo)應(yīng)激期間，作為區(qū)域心肌功能指標(biāo)的磁共振成像源性區(qū)域 壁增厚性比對(duì)照組保持得更好。圖標(biāo)記:實(shí)心方塊（)=缺血、對(duì)照組(磷酸鹽緩沖鹽水），n = 12;實(shí)心三角形（▲)=缺血、以rhPLGF2治療，11=12;實(shí)心菱形（令）：假組的前壁，11 = 3。統(tǒng) 計(jì)標(biāo)記:*相對(duì)于遠(yuǎn)程和假組p〈〇. 05; 1*相對(duì)于靜止p〈0.05; $相對(duì)于低劑量應(yīng)激p〈0.05; #相 對(duì)于對(duì)照組P〈〇.〇5。
[0012] 圖2.在靜止時(shí)以及在腺苷誘導(dǎo)應(yīng)激期間，在以rhPLGF2治療的心臟的缺血區(qū)域中 的心肌血流量(MBF)高于對(duì)照組或假組（左圖）。在應(yīng)激條件下的MBF高于靜止時(shí)，表明有灌 注儲(chǔ)備。在遠(yuǎn)程區(qū)域中，治療組之間沒有明顯差異（右圖）。缺血區(qū)域的圖標(biāo)記（左圖）：實(shí)心 方塊（)=對(duì)照組(磷酸鹽緩沖鹽水），n = 11;實(shí)心三角形（▲) = P1GF-2治療，n = 11;實(shí)心 菱形（（?) =假組，ri = 2。遠(yuǎn)程區(qū)域的圖標(biāo)記(右圖）：方塊（□) =對(duì)照組(磷酸鹽緩沖鹽水）， n = 11;空心三角形（Λ) =P1GF_2治療，n = 11;空心菱形(?)=假組，η = 2。計(jì)標(biāo)記:*相對(duì)于 遠(yuǎn)程和假組Ρ〈〇. 05; t相對(duì)于靜止Ρ〈〇. 〇5; f相對(duì)于對(duì)照組ρ〈0.05。
[0013] 圖3.描繪了應(yīng)用于在動(dòng)脈粥樣硬化背景下用再灌注的心肌梗塞鼠模型的實(shí)驗(yàn)設(shè) 計(jì)的流程圖。LAD =左前降支冠狀動(dòng)脈;PBS =磷酸鹽緩沖鹽水;PlGF =重組型人P1GF-2。
[0014] 圖4.描繪了應(yīng)用于在動(dòng)脈粥樣硬化背景下用再灌注的心肌梗塞鼠模型的研究方 案的流程圖。LAD =左前降支冠狀動(dòng)脈;PBS =磷酸鹽緩沖鹽水;PlGF =重組型人PlGF-2;xW =x周;ECHO =超聲波心動(dòng)描記術(shù);IHC =免疫組織化學(xué)。
[0015] 圖5.在對(duì)照組-(PBS)中以及在以rhPLGF2治療的組中，在時(shí)間0周=基線(BL)、在8 周時(shí)(對(duì)應(yīng)于在誘導(dǎo)心肌梗塞之后4周以及治療開始）以及在12周和20周時(shí)的左心室(LV)收 縮末期和舒張末期容量。針對(duì)體表面積指數(shù)化的LV舒張末期容量(A圖）和針對(duì)體表面積指 數(shù)化的LV收縮末期容量(B圖）在MI之后在對(duì)照組中明顯增大，但在rhPLGF2治療之后并沒有 明顯增大。*相對(duì)于基線p〈〇. 05。
[0016 ] 圖6.在對(duì)照組O3BS)中以及在以rhPLGF2治療的組中，在時(shí)間0 =基線(BL)、在8周 時(shí)(在誘導(dǎo)心肌梗塞后4周并且對(duì)應(yīng)于治療開始）以及在12周和20周時(shí)的左心室(LV)全局功 能。在12周和20周之后，射血分?jǐn)?shù)（EF)明顯高于后來(lái)的rhPLGF2治療。*相對(duì)于基線p〈 0.05;#相對(duì)于8周時(shí)的MI ρ〈0·05。
[0017] 圖7.通過(guò)測(cè)量遠(yuǎn)程心臟區(qū)域(Α圖）和缺血區(qū)域(Β圖）中的MAC3陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目來(lái) 評(píng)價(jià)對(duì)照小鼠（PBS)和以rhPLGF2治療的小鼠的心臟炎癥。在兩個(gè)治療組中，在20周之后的 MAC3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目都大于12周。*相對(duì)于12周p〈0.05。
[0018] 圖8.使用多普勒脈波超聲波測(cè)量的主動(dòng)脈血液峰速。A圖：在5個(gè)測(cè)量位置的主動(dòng) 脈掃描圖像：1 =主動(dòng)脈根;2 =升主動(dòng)脈;3 =在無(wú)名動(dòng)脈旁邊的主動(dòng)脈弓；4 =在頸動(dòng)脈旁 邊的主動(dòng)脈弓；5 =在鎖骨下動(dòng)脈旁邊的主動(dòng)脈弓。
[0019] B圖：在基線(BL; 0周=0W)、在心肌梗塞之后4周（對(duì)應(yīng)于開始施用PBS或rhPlGF-2) (MI，8周）以及在12周和20周時(shí)的主動(dòng)脈弓血液峰速(測(cè)量點(diǎn)3)。在兩組中，血液峰速的暫時(shí) 且類似的提高都出現(xiàn)在12周。*相對(duì)于基線p〈0.05。
[0020]圖9.測(cè)量對(duì)照動(dòng)物(PBS)和以rhPLGF2治療的動(dòng)物的主動(dòng)脈斑塊中的血管形成，且 將其表示為關(guān)于斑塊面積的毛細(xì)管面積(A圖）以及關(guān)于斑塊面積(B圖）的小動(dòng)脈面積。在不 同時(shí)點(diǎn)，斑塊中的毛細(xì)管和小動(dòng)脈密度在治療組間類似。
[0021 ]圖10.評(píng)價(jià)為關(guān)于斑塊面積的MAC3陽(yáng)性細(xì)胞面積的動(dòng)脈粥樣硬化病變中的炎癥反 應(yīng)在以rhPLGF2治療的組和對(duì)照組(PBS)之間是相當(dāng)?shù)摹?br>【具體實(shí)施方式】
[0022] 由永久性結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈所引起的急性心肌梗塞的先前嚙齒動(dòng)物模型誘 導(dǎo)了大規(guī)模心臟局部缺血和大面積的梗塞尺寸（Binsalamah等，2011Int J Nanomed 6， 2667;Roncal等，2008J Pathol 216,236;Takeda等，2009Circ J 73,1674)。奠定本發(fā)明基 礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的豬模型使用減流支架技術(shù)以模擬晚期冠狀動(dòng)脈疾病患者的變窄的冠 狀動(dòng)脈模式，并且與適度心肌梗塞關(guān)聯(lián)但是誘導(dǎo)左心室功能發(fā)生明顯變化（由局部缺血誘 導(dǎo)的可收縮功能障礙），包括由收縮末期容量(EDV)增大和射血分?jǐn)?shù)(EF)減小所示的左心室 全局功能障礙(Liu等，2013Am J Physiol Heart CircPhysiol 304,H885)。舒張末期容量 (H)V)不增大或者僅略微增大，這個(gè)模型因此僅代表了適度的心室擴(kuò)張。豬(porcine)(即野 豬(Sus scrofa)、豬(pig))冠狀動(dòng)脈減流模型更好地代表了具有適度心力衰竭(HF)的臨床 上相關(guān)的缺血性心臟病病理生理學(xué)。本文所用的以動(dòng)脈粥樣硬化為背景的局部缺血-再灌 注(具有晚期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊沉積的再灌注心肌梗塞)小鼠模型允許研究化合物對(duì)心臟 和血管重構(gòu)，包括可收縮功能障礙(局部缺血誘導(dǎo);HF表型：收縮末期容量增大和射血分?jǐn)?shù) 減小）、心室重構(gòu)(梗塞誘導(dǎo);HF表型:舒張末期容量增大)和病理學(xué)血管流型(主動(dòng)脈中的動(dòng) 脈粥樣硬化斑塊沉積)的臨床影響。
[0023] 心室功能障礙、心室重構(gòu)、ESV增大、EDV增大和EF減小在本文中進(jìn)一步稱為心力衰 竭(HF)表型（中的一些）。當(dāng)與在健康受試者群體中測(cè)量并且來(lái)源于健康受試者群體的正常 相應(yīng)容積相比時(shí)，ESV增大和EDV增大被測(cè)定為容積增大。因?yàn)檫@些容積取決于體重，所以針 對(duì)體表面積(BSA)進(jìn)行校正是適用的并且經(jīng)常使用指數(shù)化的值(EDVi、ESVi)。與在健康受試 者群體中測(cè)量并且來(lái)源于健康受試者群體的正常相應(yīng)EF相比來(lái)確定EF減小。EF是心搏量 (測(cè)定為HW-ESV的容積)除以EDV。
[0024] 例如，在由Jdrgensen等，200