結(jié)果顯示，隨著薦糖醋加量的增加，載 體系統(tǒng)的細(xì)胞毒性逐漸減小。在最佳轉(zhuǎn)染效率條件下，脂質(zhì)體對化Ia細(xì)胞和A549細(xì)胞的毒 性都不大，細(xì)胞存活率在80%~100%之間。
[0049] (4)細(xì)胞攝入研究 將A549細(xì)胞種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加細(xì)胞培養(yǎng)液(含雙抗和血清）1 mL，濃度約 為4.OX IO6個/孔，解育24 h，使在轉(zhuǎn)染日細(xì)胞密度達(dá)70~80 %。
[0050] 將脂質(zhì)體與SiRNAW質(zhì)量比為3:1復(fù)合，總體積200化加到每孔中，培養(yǎng)30 h。用 DPBS洗一次，每孔加入0.3 mL膜酶消化細(xì)胞，1-2 min后，加入0.8 mL培養(yǎng)基。離屯、后，將細(xì) 胞用0.4 ml DPBS稀釋，用流式細(xì)胞儀分析。
[0051] 圖8為細(xì)胞攝入檢測結(jié)果，薦糖醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體與SiRNA質(zhì)量比為3:1。6種 脂質(zhì)體均能進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞攝入率在30~80%之間。其中，脂質(zhì)體CD014S(CD014與S070質(zhì)量比 為1:1)細(xì)胞攝入量達(dá)到76 %。
[0052] 實施例17體內(nèi)生物學(xué)評價實驗 (1)小鼠模型的建立 取對數(shù)生長期LUC-A549細(xì)胞，用DPBS洗一次，加3 ml膜蛋白酶消化，加5 mL有血清和 雙抗的PRMI1640,輕輕吹打，轉(zhuǎn)移到15血離屯、管中，在1200 rpm下離屯、5 min。移除上清液， 稀釋于1.5 ml PBS中，使?jié)舛冗_(dá)到2X107cells/mL。降裸鼠消毒后，植于裸鼠前肢蔽下皮 下，每只約200化，腫瘤長到100-200 mm3時，可W使用。
[0053] (2)運載SiRNA沉默Luciferase基因 將12只荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組，每組3只，分別為空白對照組、CD014S脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組、陽 性對照組化ipofectamine2000轉(zhuǎn)染組）。將脂質(zhì)體/siRNAW質(zhì)量比3:1復(fù)合，用量為SiRNA 8 yg/20g，脂質(zhì)體2化g/20g。復(fù)合物經(jīng)尾靜脈注射于荷瘤小鼠，于轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后24h、4她、 72h測量并記錄裸鼠體重，測瘤大小，并計算瘤體積。活體成像檢測體內(nèi)巧光素酶的表達(dá)，裸 鼠腹腔注射巧光素3mg/20g，自由活動15min后用氣燒麻醉，再進(jìn)入活體成像系統(tǒng)拍照。W轉(zhuǎn) 染前后小鼠瘤內(nèi)的凈光密度比表示體內(nèi)RNAi的效果。
[0054] 陽離子脂質(zhì)體RisORRR運載SiRNA，在小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)沉默Iucif erase基因的結(jié)果 如附圖9所示，注射脂質(zhì)體CD014S后24h，小鼠腫瘤體積逐漸變大，但小鼠腫瘤細(xì)胞中 Iuciferase巧光強度降低50%。說明薦糖醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體CD014S可特異性地、高效地 下調(diào)Iucif erase基因的過量表達(dá)。
[005引（3)體內(nèi)細(xì)胞毒性研究 將脂質(zhì)體/siRNAW質(zhì)量比3:1復(fù)合，經(jīng)尾靜脈注射于荷瘤小鼠，隔兩天注射一次，共注 射5次。每天給藥前測量小鼠體重，觀察各組小鼠每天體重增長的變化。同時測定小鼠血清 生化指標(biāo)，考察薦糖醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體對小鼠肝臟和腎臟的毒性。
[0056] 小鼠的體重變化如圖10所示，在注射復(fù)合物前，小鼠的體重為21-23g，注射復(fù)合物 后9天內(nèi)小鼠體重呈整體上升趨勢，第9天小鼠的平均體重達(dá)到25-28 g，表明小鼠對一定劑 量的脂質(zhì)體CD014S的適應(yīng)，脂質(zhì)體不會影響小鼠的正常生長。表1為轉(zhuǎn)染后小鼠血清生化指 標(biāo)，轉(zhuǎn)染后小鼠的肌酢、尿素氮、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量變化不大，均在正常值范圍， 說明本發(fā)明的薦糖醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體對小鼠的肝臟和腎臟不產(chǎn)生毒性。
[0057] 表1是薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體CD014S與基因復(fù)合物對小鼠肝臟和腎臟 的毒性。
【主權(quán)項】
1. 一種蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，其特征在于:所述的蔗糖脂 肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)由蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體與基因物 質(zhì)組成，所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體由陽離子類脂和蔗糖脂肪酸酯構(gòu)成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，其特征在 于:所述蔗糖脂肪酸酯為單酯或雙酯，其中單酯結(jié)構(gòu)如下：其中，R選自硬脂酸或月桂酸或油酸或棕櫚酸或肉蔻酸或芥酸； 所述的蔗糖脂肪酸酯的親水親油平衡值為:HLB〈1或I SHLBS 16。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，其特征 在于:所述陽離子類脂為肽型陽離子類脂，結(jié)構(gòu)式為：或雙子型陽離子類脂，結(jié)構(gòu)式為：或季銨鹽型陽離子類脂，結(jié)構(gòu)式為：其中：X選自1~6; y選自1~8; R選自C8-2Q烷基，該烷基包括直鏈烷基和支鏈烷基;AA選 自精氨酸或組氨酸或天冬氨酸或丙氨酸或甘氨酸或鳥氨酸或賴氨酸;B選自O(shè)rn或Lys。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，其特征在 于:所述的陽離子類脂與蔗糖脂肪酸酯的質(zhì)量比為1:8~8:1;所述蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽 離子脂質(zhì)體與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為〇. 5:1~32:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或4所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，其 特征在于:所述的基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或小干擾RNA。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，其特征在 于:所述的基因物質(zhì)為質(zhì)粒DNA或小干擾RNA。7. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)的制備 方法，其特征在于:步驟如下： 蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體的制備： (1) 將陽離子類脂和蔗糖脂肪酸酯按照質(zhì)量比1:8~8:1比例溶解于氯仿或甲醇中得溶 液； (2) 將(1)步驟得到的溶液在氮氣下吹成均勻薄膜，真空干燥2~12h; (3) 用乙醇或水或生理鹽水或磷酸作為緩沖液或以乙醇、水、生理鹽水、磷酸中的任意 兩種等質(zhì)量的混合液進(jìn)行水化，水化溫度為10~80°C;水化時間為1~10h，超聲震蕩至澄 清，得到蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體，濃度為0.5~3.Omg/mL;該蔗糖脂肪酸酯嵌入 式陽離子脂質(zhì)體為分散在水相中形成的粒徑大小為150~250nm的均一穩(wěn)定的表面帶有正 電荷的陽離子脂質(zhì)體； 利用蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體與基因物質(zhì)制備蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子 脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)： 將蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA或小干擾RNA，通過靜電相互作用形成 分散在水相中均一穩(wěn)定的納米顆粒，具體步驟如下： (1) 取蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體分散在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM或RPMI1640中，混勻， 使?jié)舛葹椹?· O1μg/μL~0 · 64yg/yL; (2) 將0.5~1.0 lIg質(zhì)粒DNA或小干擾RNA稀釋在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM或RPMI1640中，混勻， 使質(zhì)粒濃度為〇. (^lIgAiL; (3) 按照蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體與基因物質(zhì)質(zhì)量比0.5:1~32:1比例，將 (1)和（2)兩稀釋液混勻，室溫放置10~40min，即可得到蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體 基因載體系統(tǒng)。8. -種如權(quán)利要求7所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)的制備方 法制備的蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用及在體內(nèi) 轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。
【專利摘要】一種蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用，該基因載體系統(tǒng)是由陽離子類脂和助類脂蔗糖酯制備的脂質(zhì)體與基因物質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合物。其中陽離子類脂包括肽型陽離子類脂、雙子型陽離子類脂和季銨鹽型陽離子類脂；蔗糖酯包括蔗糖硬脂酸酯、蔗糖棕櫚酸酯、蔗糖月桂酸酯、蔗糖油酸酯和蔗糖芥酸酯。該載體能有效壓縮質(zhì)粒DNA和siRNA，在體外體內(nèi)都能高效轉(zhuǎn)染，并對細(xì)胞和小鼠幾乎不產(chǎn)生毒性。本發(fā)明所述的蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)在基因治療中具有很好的研究和應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61K9/127, A61K48/00, A61K47/26, A61K47/34, A61K31/7088, A61P35/00
【公開號】CN105521497
【申請?zhí)枴緾N201511011257
【發(fā)明人】張樹彪, 趙軼男, 崔詩慧, 赫澤坤, 徐宇虹
【申請人】大連民族大學(xué)
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2015年12月30日