在約40~45 °C進(jìn)行，而用十八烷胺，溫度是大約55 °C_57 °C。通過TLC觀察反 應(yīng)直到觀察到水平不變的剩余的烷基胺，通常在運(yùn)行過夜之后。
[0113]將反應(yīng)混合物酸化至從約3.0至約4.5的pH，并且于室溫攪拌長達(dá)24小時以破壞未 反應(yīng)的EDC，之后用IN NaOH和/或TEMED滴定至7.0的pH。以約800xg將最終的反應(yīng)混合物離 心1至3小時以除去固體污染物和副產(chǎn)物。
[0114]離心后，可將上清液在 GPC 柱（ToyopearlTM、SephadexTM、SephacrylTM、Biogel? 以及 類似產(chǎn)品）上層析。然而Jr聚合物是兩親性物質(zhì)，并且表現(xiàn)出對某些GPC柱填料的親和力，其 使污染物的去除變得復(fù)雜?？蛇x擇地，可將聚合物在大孔的疏水相互作用柱（如， T0Y0PEARL? Phenyl 650C，Toshoh Biosciences，Montgomeryville，PA，U.S.A.)上層析，用 溶于水的梯度的甲醇洗脫。優(yōu)選地，將反應(yīng)混合物對酸性和中性水的數(shù)種變化透析以除去 低分子量的起始材料和反應(yīng)副產(chǎn)物。
[0115] 還可用丁酮、異丙醇、丁醇或其他極性有機(jī)溶劑萃取反應(yīng)混合物以除去有機(jī)雜質(zhì)， 但顯著量的兩親性聚合物損失至萃取溶劑。優(yōu)選地，使用適當(dāng)?shù)哪⒎磻?yīng)混合物進(jìn)行超濾 以將產(chǎn)物分成不同的分子量級別，例如5kDa至10kDa、10kDa至30kDa、30kDa至50kDa等，取決 于所使用的濾膜的截留值?？蓪⒕酆衔锏乃芤哼M(jìn)行死端式過濾以便產(chǎn)生無菌的或無病毒 的溶液(取決于濾膜或過濾介質(zhì)的選擇）。
[0116] 2. Jr-聚合物的合成
[0117] 實施例1: PEG-二(烷基酰胺基琥珀酰)二硫醚的中等分子量聚合物(C16-JI-聚合物 A)
[0118] 將聚乙二醇(PEG-1500，Sigma Chemical Co.)在真空下于80°C干燥直到氣泡停止 形成(8-12小時，取決于PEG的質(zhì)量）。干燥的PEG可在氬氣下無限期的干燥保存。
[0119] 將干燥的PEG在氬氣下于油浴上熔化，并攪拌下逐漸加入馬來酸酐(每摩爾PEG 2 摩爾，針對純度校正）。將混合物在氬氣下于90°C攪拌。由于馬來酸酐容易升華，將頂端空間 最小化并且將整個反應(yīng)容器保持在反應(yīng)溫度。任何冷凝在容器壁上的馬來酸酐將被刮回反 應(yīng)混合物。用UV可視化和碘染色，通過硅膠板上的TLC監(jiān)測反應(yīng)的過程，分別使用乙醇和己 烷作為溶劑。在馬來酸酐消失后將反應(yīng)持續(xù)一小時。
[0120] 將粗制的PEG二馬來酸酯用兩體積的水稀釋。之后攪拌下向反應(yīng)混合物加入溶于 水(每體積TEMED的2體積水）的二硫蘇糖醇(DTT，每當(dāng)量PEG 1 ? 01當(dāng)量)和N，N，MY -四甲 基乙二胺(TEMED，1.02當(dāng)量）的溶液。在氬氣下于70 °C攪拌反應(yīng)2.5小時，置于室溫過夜，并 且之后再次于70°C攪拌2小時。通過TLC監(jiān)測反應(yīng)并通過DTT的完全消失判定反應(yīng)完成。
[0121] 向上文的反應(yīng)混合物加入水以降低粘度直到混合物可被攪拌（以大約25%固體）， 在氬氣下于65°C攪拌混合物，并加入N-羥基琥珀酰亞胺(每mol PEG-二馬來酸酯-DTT聚合 物中的羧酸基團(tuán)O.lmol)，之后是十六烷胺(每mol聚合物中的羧酸基團(tuán)1.05mol)和N-(3-二 甲氨基丙基)-N~乙基碳二亞胺(EDC，每mol聚合物中的羧酸基團(tuán)0.56mol)。將混合物在氬 氣下攪拌1小時并加入第二份EDC(每mo 1聚合物中的羧酸基團(tuán)0.56mo 1)。另一小時后，進(jìn)一 步加入第三份EDC(每mol聚合物中的羧酸基團(tuán)0.28mol，總共每mol羧酸基團(tuán)1.4mol EDC)以 補(bǔ)充EDC水解的損失。當(dāng)所加入的固體使懸浮液難以攪拌時，如保持流動性所必需的加入另 外的水，并如所需要的話，通過加入IN NaOH或IN HC1將pH保持在3.5和7.5之間（優(yōu)選地在 4.5和6.5之間）。在氬氣下于65°C將混合物攪拌過夜，并用TLC(硅膠，以乙醇顯層)監(jiān)測直到 烷基胺顯示出已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定的濃度，并且之后是另外4小時的攪拌。（用十二烷胺，反應(yīng)在約 40-45°C進(jìn)行，而用十八烷胺，溫度優(yōu)選是55°C_57°C)。之后用IN HC1將反應(yīng)混合物酸化至 約4.0-4.5的pH，攪拌24h以破壞未反應(yīng)的EDC，并且通過滴加IN NaOH調(diào)整至pH 7.0。
[0122] 將混合物轉(zhuǎn)移至離心瓶并且在臺式離心機(jī)中于約800xg離心2小時以分離殘留固 體。離心后，將反應(yīng)混合物用異丙醇萃取以除去有機(jī)雜質(zhì)。作為異丙醇萃取的替代方法，超 濾是優(yōu)選的。
[0123] 通過這一方法，下列氨基化合物被輒合至聚合物：
[0124] 實施例la: ^烷胺
[0125] 實施例lb:十八烷胺
[0126] 實施例lc:4-壬基芐胺
[0127]實施例ld:3-[(4_苯氧基)苯基]丙胺
[0128] 實施例1 e: PEG-二(烷基酰胺基琥珀酰)二硫醚(C16-JI-聚合物A，經(jīng)由路線9替代路 線)。
[0129] 在熔化的條件下，如實施例1所描述的將PEG(1.5kD，如上文所描述的脫氣和干燥 的）與過量的馬來酸酐(每摩爾PEG多于2.2摩爾當(dāng)量)反應(yīng)，并且將反應(yīng)產(chǎn)物溶于水并用lkD 截留膜對水透析。將滲余物蒸發(fā)至接近干燥以產(chǎn)生適用于酰胺化的PEG二馬來酸酯。
[0130]在反應(yīng)瓶中，將溶于最小體積的水的PEG二馬來酸酯(每兩份PEG二馬來酸酯約1份 水)在氬氣下加熱至70-80°(：。用1￡1^0將口11調(diào)整至5.0-5.5。于70-80°(：，向這一溶液加入每 摩爾PEG二馬來酸酯重復(fù)單元的2摩爾當(dāng)量十六烷胺。之后緩慢流動加入溶于最小體積的水 中的N-羥基琥珀酰亞胺(每摩爾PEG二馬來酸酯2摩爾當(dāng)量)的溶液，之后是EDC ? HC1的水溶 液(每摩爾PEG二馬來酸酯3摩爾當(dāng)量）。將混合物于70-80°C攪拌直到TLC(硅膠，用EtOH顯 層）顯示反應(yīng)的完成（十六烷胺的點不變化或不存在）。將反應(yīng)混合物冷卻并且通過加入乙 酸破壞過量的碳二亞胺直到pH在2.5和3之間保持穩(wěn)定。將產(chǎn)物通過透析純化，第一次對 EtOH水溶液之后對水，或者可選擇地通過用異丙醇沉淀。
[0131] 將這樣形成的PEG二酰胺溶解于水，用TEMED將反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)至6.5和9之 間，并且將溫度升至60-70°C。加入DTT溶液(每摩爾PEG二酰胺1.2摩爾當(dāng)量），并且將反應(yīng)混 合物攪拌過夜。用化學(xué)計量當(dāng)量的氯乙酰胺和TEMED消耗過量的硫醇，以產(chǎn)生陰性的 Ellmar/s測試。之后將產(chǎn)物通過對水的透析純化，并且通過蒸發(fā)濃縮滲余物。
[0132] 實施例2 :PEG_二(烷基酰胺基琥珀酰)二硫醚高分子量聚合物
[0133] 除了使用每mol馬來酸酐0.55mol DTT和0.55mol TEMED之外，遵循實施例1中列出 的步驟。由于粘度快速上升，有力的攪拌是必須的。表明大多數(shù)反應(yīng)在5-10分鐘內(nèi)完成，之 后是當(dāng)溫度升高至55°C至80°C時經(jīng)過4小時緩慢完成。
[0134] 實施例3 :PEG_二(烷基酰胺基琥珀酰)二硫醚聚合物
[0135]除了每mol聚合物中的羧酸基團(tuán)使用1.5mol十二烷胺之外，遵循實施例1中列出的 步驟。加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，每mo 1羧酸基團(tuán)1. Omol)和1，V -羰基二咪唑(CDI，每mo 1 羧酸基團(tuán)3.Omol)，并且將反應(yīng)于80°C攪拌4小時并如上文進(jìn)行后處理。
[0136]通過這一方法，將下列氨基化合物與聚合物輒合：
[0137] 實施例3a: ^烷胺
[0138] 實施例3b:十四烷胺
[0139] 實施例3c:十八烷胺 [0140]實施例3d:脫氫樅胺
[0141] 實施例3e:膽固醇2-氨基乙醚
[0142] 實施例3f: 10-苯氧基癸烷胺
[0143] 實施例3g:癸二酸酰肼
[0144] 實施例3h:油酸酰肼
[0145] 實施例3i:脫氫樅酸酰肼
[0146] 實施例3 j:膽酸酰肼
[0147] 實施例3k:棕櫚酸酰肼
[0148] 實施例4: PEG-共聚_(烷基酰胺基琥珀酸酯)聚合物
[0149] 將溶于無水乙醚中的PEG(6.66mmol)和三乙胺(2.32ml，16.65mmol)的溶液在氬氣 下于0°C冷卻并用甲磺酰氯（1.03 1111，13.32111111〇1)滴加處理。于0°(：持續(xù)攪拌111并且之后于室 溫持續(xù)攪拌2h。將醚蒸發(fā)并向殘留物中加入無水丙酮（15ml)以便沉淀鹽酸三乙胺，將其從 溶液中過濾。將濾出液用溴化鋰(2.31 g，26.64mmo 1)處理并加熱至回流20h。之后用己烷稀 釋混合物并通過由CeliteTM(0.5 Cm)封口的短的二氧化硅柱(3cm)過濾，并用己烷洗脫。將濾 出液干燥、過濾并蒸發(fā)以剩余油狀的a，《_二溴-PEG。
[0150] 通過Godjoian等人，Tetrahedron Letters，37:433_6(1996)的方法將a，二溴-PEG與一當(dāng)量的2,2_二丁基-4,5-雙（甲氧基羰基）-1，3,2_二氧雜錫雜環(huán)戊烷 (dioxastannolane)反應(yīng)。將所得的酒石酸二甲酯-PEG聚醚用溶于甲醇的K0H阜化，并且之 后用如上文實施例1和3中的十二烷胺或十六烷胺對其酰胺化，或用實施例3a-3k中的胺對 其酰胺化。
[0151] 實施例5: PEG與EDTA雙酐共聚
[0152] 通過實施例1中描述的方法將無水PEG與乙二胺四乙酸二酐反應(yīng)，并且之后用如實 施例1中的十二烷胺或用如實施例3中的十六烷胺或用實施例3a-3k中的胺對其酰胺化。
[0153] 以同樣的方法，將下列雙酐與PEG共聚并隨后對其酰胺化：
[0154] 實施例5a:萘四羧酸雙酐
[0155] 實施例5b:茈四羧酸雙酐
[0156] 實施例5c:二苯甲酮四羧酸雙酐
[0157] 實施例5d:4，f-(六氟異亞丙基)二酞酸酐
[0158] 實施例5e: 丁燒四甲酸雙酐
[0159] 實施例5f:雙環(huán)(2，2，2)辛-7-烯-2，3，5，6-四羧酸雙酐
[0160] 實施例5g:二亞乙基四胺五乙酸雙酐
[0161] 實施例511:3,4,3/，4/-二苯基砜四羧酸雙酐
[0162] 實施例5i: 3，4,3人V-二苯基醚四羧酸雙酐
[0163] 實施例5 j:苯均四酸二酐
[0164] 實施例6A:具有懸垂的硫醚的PEG-二胺共聚物
[0165] 用與實施例1中用于DTT的同樣的步驟將如實施例1中制備的PEG二馬來酸酯與十 二烷硫醇(每當(dāng)量PEG二馬來酸酯二當(dāng)量)反應(yīng)。沒有聚合發(fā)生時，則不必稀釋，并且在熔化 的PEG-二馬來酸酯中進(jìn)行反應(yīng)。加入TEMED催化劑并且之后加入硫醇。使用TLC通過起始材 料的消失來觀察反應(yīng)?？墒褂弥钡接捎谡舭l(fā)損失的烷基硫醇變得顯著的點的溫度(直到約 100°C)。使用稍微過量的烷基硫醇以充分飽和馬來酸基團(tuán)。在反應(yīng)最后，將過量的烷基硫醇 通過用氮氣或氬氣噴射和/或在真空中加熱來去除，直到通過氣味或通過TLC檢測不到烷基 硫醇。
[0166] 以此方法，將下列硫醇與PEG二馬來酸酯輒合：
[0167] 實施例6Aa:巰基琥珀酸二叔丁酯
[0168] 實施例6Ab:十四烷硫醇
[0169] 實施例6Ac:十六烷硫醇 [0170] 實施例6Ad: 2-巰基乙磺酸
[0171] 實施例6Ae: 3-巰基丙磺酸
[0172] 實施例6Af: 6-巰基己酸叔丁酯 [0173]實施例6Ag: 4-疏基苯甲酸叔丁酯
[0174] 實施例6Ah:巰基乙酸叔丁酯
[0175] 實施例6Ai:4_(叔丁氧基羰基氨基)丁烷硫醇
[0176] 實施例6Aj:3_(叔丁氧基羰基氨基)芐硫醇
[0177] 實施例6Ak: 4-癸基芐硫醇
[0178] 具有反應(yīng)性官能團(tuán)的硫醇是適用于連接C鏈的，和/或反應(yīng)性官能團(tuán)可用作靶向部 分的連接點(X)。
[0179] 實施例6B:具有懸垂的硫醚的PEG-二胺共聚物
[0180]
[0181 ]使用與實施例1中用于十二烷胺的同樣的步驟將在實施例6A中得到的硫醇加合物 用1，4_二氨基丁烷(每兩C00H基團(tuán)一當(dāng)量的二胺)酰胺化，同時當(dāng)對于維持反應(yīng)混合物的流 動性來說必需時用水稀釋。當(dāng)對于確保完成聚合來說必需時加入另外等份的H)C。通過這一 方法，實施例6A和6Aa到6Ak的硫醇加合物被轉(zhuǎn)化為PEG-二氨基丁烷聚酰胺。
[0182] 通過此方法，可將下列二胺轉(zhuǎn)化為PEG聚酰胺(B0C =叔丁氧基羰基）：
[0183] 實施例6Ba: 2-(0-B0C)_l，3-二氨基-2-丙醇
[0184] 實施例eBbW，N〃_二(B0C)六亞乙基四胺
[0185] 實施例eBc:^，N〃_二(B0C)精胺
[0186] 實施例eBcUN'-BOC亞精胺
[0187] 實施例eBe:^，?/〃-三(B0C)五亞乙基六胺
[0188] 實施例6Bf:胍基丁胺 [0189]實施例6Bg:賴氨酸叔丁酯 [0190] 實施例6Bh:l，6_二氨基己烷
[0191] 實施例6Bi:l，4_苯二胺
[0192] 實施例6Bj:l，3_苯二胺
[0193] 實施例6Bk: 1，4-二氨基丁烷-2，3-二醇丙酮化合物
[0194] 實施例7: PEG-二（烷基琥珀酸酯）二硫醚
[0195]
[0196] 通過S ? Sasaki等人，Chem. Pharm? Bui 1 ? 33( 10): 4247-4266(1985)的步驟的變體制 備DTT的2,3_雙-0-十六烷基醚（內(nèi)消旋_2,3_雙(十六烷氧基)丁烷_1，4_二硫醇）。通過實施 例1的方法將其加至PEG-二馬來酸酯。
[0197]通過這一方法，將下列醚二硫醇偶聯(lián)至PEG聚合物：
[0198] 實施例7a:內(nèi)消