抗體組合物和用于其的緩沖體系的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于綴合反應(yīng)中的抗體組合物、抗體分離試劑盒、用于將分離的抗體 與標(biāo)記物綴合的方法以及用于此類組合物、試劑盒或方法的緩沖體系。
【背景技術(shù)】
[0002] 所有抗體最初均被制成粗制品形式(例如，免疫血清、腹水、雜交瘤組織培養(yǎng)物上 清液）。在用于許多基礎(chǔ)研究和診斷應(yīng)用中之前，必須將抗體純化以除去許多(或全部)污染 性非抗體蛋白和小分子(例如，氨基酸）。
[0003] 如果要將抗體共價連接至"標(biāo)記物（label)"（例如，酶、有機染料、熒光蛋白或有色 顆粒）以產(chǎn)生雜交試劑(通常稱作"標(biāo)記抗體"或"抗體綴合物"）或者連接至衍生化試劑以引 入新的官能團，則純化特別重要。綴合物的抗體部分賦予針對特定抗原(例如，蛋白、藥物、 肽或生物標(biāo)志物)的特異性，而標(biāo)記物則賦予可測量性，以使該綴合物能用于對例如蛋白印 跡物、組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞、血樣和尿液等中的抗原進(jìn)行檢測和定量。
[0004] 抗體純化中的關(guān)鍵步驟是抗體與抗原親和柱或者與帶有固定化的蛋白A、蛋白G或 蛋白L的柱的結(jié)合，所述柱與不直接參與抗原結(jié)合的抗體區(qū)相互作用。抗原親和柱上的抗體 純化是有利的，因為粗制樣品中的具有不相關(guān)抗原特異性的抗體不會保留在柱上。這種親 和純化方法穩(wěn)健可靠，且廣泛用于從諸如血清、腹水和雜交瘤組織培養(yǎng)物上清液等粗制樣 品中純化抗體。
[0005] 無論使用何種純化方式，柱結(jié)合的抗體通常用低pH緩沖液(通常包含甘氨酸或檸 檬酸)洗脫，然后用例如Tris緩沖液(pH 8.0至9.0)快速中和，以使低pH對抗體造成的損害 最小化（例如，Thermo Scientific Protein Purification Technical Handbook,ref 1601617 07/08)。用低pH甘氨酸或檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫被廣為采用，因為其成本低且其 在破壞抗體-抗原相互作用所需的pH值處具有良好的緩沖能力。
[0006] 在儲存之前，通常（但并非總是)在roS或某些其它近中性的pH緩沖液中透析中和 的純化抗體。出于穩(wěn)定化或避免微生物生長的目的，往往會將其它物質(zhì)（例如，BSA、疊氮化 鈉、洗滌劑)添加至經(jīng)透析的抗體。
[0007] 在從商業(yè)來源購買抗體時，極少情況會得到關(guān)于純化過程中所用的透析步驟的信 息。因此，可能不清楚來自純化過程的緩沖劑成分是否留在了最終的抗體制備物中。如果要 將抗體標(biāo)記，則這樣的考慮至關(guān)重要，因為用于洗脫親和柱的緩沖劑常常會在標(biāo)記反應(yīng)中 造成嚴(yán)重干擾。
[0008] 所有類型的標(biāo)記物都最通常地與抗體分子上的賴氨酸殘基連接。例如，有機熒光 染料的NHS酯和流行的熒光素異硫氰酸酯衍生物(FITC)與賴氨酸殘基反應(yīng)。雖然其他綴合 化學(xué)(例如，巰基-馬來酰亞胺)可能并未明顯涉及賴氨酸殘基，但其幾乎總是依賴于在綴合 過程早期步驟中的賴氨酸修飾。例如，賴氨酸導(dǎo)向型異雙官能NHS酯衍生化試劑常用于將馬 來酰亞胺和各種其它官能團（例如，受保護(hù)的巰基、疊氮基、碘代乙?；┮氲鞍追肿?。碳 二亞胺用于將抗體綴合至羧基化微米顆?；蚣{米顆粒，其涉及表面羧基與抗體中的賴氨酸 殘基的反應(yīng)，從而形成酰胺鍵。
[0009] 為人熟知的是，涉及賴氨酸殘基的衍生化或綴合反應(yīng)不能在含伯氨基的物質(zhì)（例 如，游離氨基酸）的存在下進(jìn)行。這是因為這類物質(zhì)會與蛋白中的賴氨酸殘基競爭。在碳二 亞胺介導(dǎo)的反應(yīng)(其涉及羧基與氨基的偶合)的情形中，現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)因競爭問題而強烈 反對使用具有羧基或伯氨基官能團的添加劑。
[0010] 因此，流行的抗體洗脫緩沖劑在幾乎所有類型的抗體標(biāo)記方法中都是禁忌的。甘 氨酸或檸檬酸都不能出現(xiàn)在抗體與標(biāo)記物的受碳二亞胺介導(dǎo)的反應(yīng)中，因為該反應(yīng)涉及氨 基與羧基的縮合。
[0011] 例如，在 Biocon jugate Techniques，Hermanson GT，1995，ISBN 0-12-342336-8， 第102頁（和更新的第2版中第117頁，2008ISBN 9780123705013)中給出了以下建議："避免 含羧基或含氨基的緩沖劑，例如檸檬酸鹽、乙酸鹽、甘氨酸或Tris"。
[0012] Bangs Labs技術(shù)筆記205提及碳二亞胺偶聯(lián)時陳述到："應(yīng)該避免含有游離氨基的 緩沖劑，例如Tris或甘氨酸"。
[0013] 在《Immobilization of Enzymes and Cells》，2006，Guisan JM編，第223頁， ISBN1-58829-290-8)中討論了使用含羧基微球的反應(yīng)，且給出了以下警告注釋："應(yīng)該避免 含有游離氨基的緩沖劑，例如Tris或甘氨酸"。
[0014] 來自ThermoFisher的碳二亞胺依賴性生物素化試劑盒（EZ-Lin丨<j?Amine-PEGn-Biotin，產(chǎn)品編碼26136)注明："避免含有伯氨基的緩沖劑(Tris、甘氨酸等)或含有羧基的 緩沖劑(乙酸鹽、檸檬酸鹽等），因為它們會終止反應(yīng)"。
[0015] G Biosciences的羧基偶聯(lián)樹脂的程序給出警告："注意：對于使用EDC的偶聯(lián)反 應(yīng)，避免使用含有游離氨基的緩沖劑或磷酸鹽，因為它們會干擾偶聯(lián)效率。Tris、乙酸鹽和 甘氨酸緩沖劑均易與H)C或偶聯(lián)中間體反應(yīng)"。
[0016] 最后，用于羧基化金綴合試劑盒的規(guī)程注明："蛋白溶液中的任何其它含氨基或羧 基的分子(包括蛋白穩(wěn)定劑)會與綴合反應(yīng)競爭"（OceanNanotech,產(chǎn)品編碼GCK)。
[0017] 在并未同時涉及羧基修飾的針對賴氨酸的修飾反應(yīng)的情形中，可以容許檸檬酸， 但甘氨酸總是禁用的，例如DyLight?Amine-Reactive Dyes規(guī)程（Thermo Scientif ic，No 2032.11)稱："含有伯氨基的緩沖劑(例如，Tris或甘氨酸)將會產(chǎn)生干擾，因為其與NHS-酯 部分發(fā)生反應(yīng)"。
[0018] 抗體樣品中的潛在干擾性小分子(例如甘氨酸和檸檬酸)可以通過透析或脫鹽而 除去，而后將抗體用于綴合反應(yīng)中。透析去除這類分子的效率與抗體樣品相對于透析緩沖 液的體積、透析緩沖液的更換次數(shù)以及在下一次緩沖液更換之前是否達(dá)到動態(tài)平衡有關(guān)。 這些信息對于商購抗體而言幾乎總是未知的。
[0019] 不幸的是，在不顯著損失材料的情況下很難將商購抗體透析/脫鹽，因為所述抗體 通常以少量購入(例如，1〇〇μ1，濃度約Img抗體/ml)。而且，在透析期間可能發(fā)生樣品的稀 釋，這可能需要后續(xù)的抗體濃縮步驟(導(dǎo)致進(jìn)一步的材料損失)來實現(xiàn)用于抗體標(biāo)記反應(yīng)所 需的最小濃度(通常為lmg/ml)。毫克量的抗體的透析相對容易，但過程必然較慢，且如果需 要更換緩沖液數(shù)次則可能需要1至2天。高毫克級別所需的透析膜和大體積的透析緩沖液也 會增加生產(chǎn)成本。
[0020] 本發(fā)明的目的在于提供克服現(xiàn)有技術(shù)的不足的純化和/或綴合抗體的方法、用于 此類方法的試劑盒和抗體組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 抗體標(biāo)記技術(shù)在此前數(shù)年間得到了顯著進(jìn)展，特別是在工藝簡化方面。多步綴合 方法正被簡單的一步工藝所取代，后者對操作者而言無需特定的化學(xué)知識。
[0022] 為避免緩慢、增加成本且導(dǎo)致抗體損失的干涉性透析步驟，需要更好地整合抗體 純化程序和標(biāo)記反應(yīng)。對于"綴合友好型洗脫緩沖劑"（CFEB)存在明顯的需求，因為最初被 抗體純化科學(xué)家采用的緩沖劑與大多數(shù)綴合化學(xué)都不相容。本發(fā)明人在這里將CFEB限定為 pKa為1至4的緩沖劑，其不會對流行的綴合方法（即，最低限度地為抗體與碳二亞胺、NHS酯、 異硫氰酸酯、馬來酰亞胺和硫醇化試劑的反應(yīng))造成干擾。
[0023] 在第一方面，本發(fā)明提供了用于綴合反應(yīng)中的抗體組合物。所述組合物包含處于 緩沖體系中的分離的抗體，其中所述緩沖體系包含除甘氨酸以外的一元羧酸緩沖化合物， 該一元羧酸緩沖化合物帶有處于α位或β位的氨基取代基。
[0024] 在另一方面，本發(fā)明提供了包含除甘氨酸外的一元羧酸緩沖化合物的緩沖劑在從 固相中洗脫出抗體中的應(yīng)用，所述一元羧酸緩沖化合物帶有處于α位或β位的氨基取代基。
[0025] 在另一方面，本發(fā)明提供了一種抗體分離試劑盒，其包含用于結(jié)合抗體的固相親 和基質(zhì)和用于洗脫結(jié)合至該親和基質(zhì)的抗體的緩沖劑，其中所述緩沖劑包含除甘氨酸外的 一元羧酸緩沖化合物，該一元羧酸緩沖化合物帶有處于α位或β位的氨基取代基。
[0026] 在另一方面，本發(fā)明提供了一種將分離的抗體綴合至標(biāo)記物的方法。所述方法包 括:在緩沖體系中，使抗體與活化的標(biāo)記物接觸或在抗體綴合試劑的存在下與標(biāo)記物接觸， 所述緩沖體系包括除甘氨酸外的一元羧酸緩沖化合物，該一元羧酸緩沖化合物帶有處于α 位或m立的氨基取代基。
[0027] 令人意外地發(fā)現(xiàn)，可以在抗體綴合反應(yīng)中使用包含帶有處于α位或Μ立的氨基取代 基的一元羧酸緩沖化合物的緩沖體系。這類緩沖體系既可用在抗體純化程序中也可用在綴 合反應(yīng)中，由此避免對不希望的透析步驟的需要。
[0028] 為了確定可能存在于商購抗體中的分子(例如，甘氨酸、檸檬酸、疊氮化物)在碳二 亞胺反應(yīng)中的干擾程度，發(fā)明人對抗體與商購羧基化納米顆粒之間的反應(yīng)進(jìn)行了研究。發(fā) 明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，甘氨酸即使在高濃度下也不會導(dǎo)致干擾。甘氨酸既有氨基也有羧基官能 團，且在現(xiàn)有技術(shù)中是明確禁用的。發(fā)明人利用該出人意料的發(fā)現(xiàn)開發(fā)了新的純化試劑盒， 其抗體產(chǎn)品不僅可以用于碳二亞胺反應(yīng)，而且可以與其他流行的綴合化學(xué)一同使用而無需 綴合前的抗體透析步驟。下文對本發(fā)明進(jìn)行更為全面的說明。
[0029] 所述一元羧酸緩沖化合物帶有處于α位或Μ立的氨基取代基，并且可以進(jìn)而包含一 個或多個其它取代基，條件是其他取代基不能干擾綴合反應(yīng)。通常，如果存在其它取代基， 則這些取代基是一個或多個非氨基取代基。優(yōu)選的是，緩沖化合物上不存在其它取代基。
[0030] 仲氨基或叔氨基通常優(yōu)選作為所述氨基取代基，因為它們與伯氨基相比在綴合反 應(yīng)中反應(yīng)性更低。氨基取代基優(yōu)選為季銨取代基。特別適合作為所述一元羧酸緩沖化合物 的一類優(yōu)選的化合物是甜菜堿。甜菜堿含有季銨取代基。優(yōu)選的甜菜堿是N，N，N_三甲基甘 氨酸，其也稱作甘氨酸甜菜堿。
[0031] 然而，一元羧酸緩沖化合物的氨基取代基可以是伯氨基。當(dāng)一元羧酸是伯氨基酸 (primary amino acid)時，其可以為丙氨酸、β-丙氨酸或2-氨基丁酸。常見的仲胺或叔胺包 括脯氨酸、三(羥甲基）甲基甘氨酸、Ν-甲基甘氨酸、Ν，Ν-二甲基甘氨酸或2-吡啶甲酸。
[0032] -元羧酸緩沖化合物中的氨基取代基的存在通過吸電子效應(yīng)使羧基陰離子穩(wěn)定 化，從而抑制了羧基的pKa。通常，一元羧酸緩沖化合物的羧基的pKa為1至4,優(yōu)選為1.5至 3.5。一元羧酸緩沖化合物的氨基的pKa通常大于8,優(yōu)選大于9。在pH 5的綴合反應(yīng)中，氨基 基本為質(zhì)子化形式，因此其在綴合反應(yīng)中不具有反應(yīng)性。
[0033] -元羧酸緩沖化合物在抗體組合物中以小于200mM、優(yōu)選小于100mM、更優(yōu)選小于 50mM的濃度存在。
[0034] 在一種設(shè)定下，緩沖體系還包括pKa大于5.5的中和緩沖化合物。根據(jù)抗體是如何 分離的，在緩沖體系中可以存在所述中和緩沖化合物。這將在下文進(jìn)行更詳