miRNA-489在制備治療矽肺藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】miRNA?489在制備治療矽肺藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種miRNA?489在治療矽肺藥物中的應(yīng)用，所述miRNA?489的序列為：5’?AAUGACACCACAUAUAUGGCAGC?3’。本發(fā)明通過實驗證明：無論在體外細胞水平還是體內(nèi)小鼠矽肺模型水平，上調(diào)miRNA?489的表達對矽塵誘導(dǎo)的肺部炎癥和纖維化均具有明顯的抑制作用，這提示miRNA?489可成為矽肺治療的全新靶點。本發(fā)明將有助于矽肺治療藥物的研究和開發(fā)，并為其他疾病治療藥物的研制提供借鑒。
【專利說明】
m i RN A-489在制備治療巧肺藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于基因工程與生命科學(xué)領(lǐng)域，具體是基因治療領(lǐng)域，設(shè)及一種miRNA-489 在制備治療秒肺藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 秒肺(silicosis)是含游離二氧化娃的粉塵在肺內(nèi)積聚引起的一種進行性、致殘 性、不可治愈的肺組織纖維化疾病。目前秒肺病仍是我國最嚴(yán)重的職業(yè)病之一，來自全國職 業(yè)病報告系統(tǒng)數(shù)據(jù)顯示，2014年全國共報告職業(yè)病29972例，塵肺病新病例26873例，占2014 年職業(yè)病報告總例數(shù)的89.66%，其中煤工塵肺和秒肺分別為13846例和11471例，占塵肺病 例數(shù)的94.21 %。秒肺病一旦發(fā)生，即使不再接觸秒塵，病情仍呈進行性發(fā)展，對健康損害嚴(yán) 重，已成為危害我國相關(guān)職業(yè)勞動者健康和影響社會穩(wěn)定的主要公共衛(wèi)生問題之一。目前 我國在秒肺病藥物研制方面取得一系列的進展，秒肺病治療的新藥也相繼出現(xiàn)。臨床上主 要參照特發(fā)性肺纖維化（IPF)的治療手段，應(yīng)用的藥物集中于抗炎、抗氧化、抗纖維化等方 面，使用的西藥主要有漢防己甲素、化非尼酬、尼達尼布等，但運些藥物也面臨臨床治療效 果不太理想，且存在副作用大、費用昂貴等問題。目前，中醫(yī)藥在防治秒肺肺纖維化方面也 顯示出一定的療效和優(yōu)勢。中藥治療秒肺的方法主要包括單味中藥黃巧、枯梗、姜黃、苦參 素等W及一些中藥湯劑和復(fù)方制劑，但也主要集中于局限的氧化/抗氧化失衡和成纖維細 胞、生長因子(FGF)、TGF-i31、TNF-a、白介素（化-6)等單一細胞因子。此外，大容量肺灌洗術(shù)、 健康教育配合呼吸保健操等方法也可在一定程度上穩(wěn)定或控制秒肺病變的進展，進一步提 高患者的肺功能、減輕癥狀、改善秒肺患者生活質(zhì)量。雖然目前秒肺病已研制出一些藥物進 行積極對癥治療，但是由于至今秒肺肺纖維化發(fā)病機制尚未完全明確，運給秒肺病治療方 法的研發(fā)帶來了一定的困難與局限，故目前尚缺乏秒肺病特效的治療方法。因此，開展秒肺 病治療的藥物篩選研究和臨床新藥研究是亟待解決的重大科學(xué)問題。
[0003] 大量研究證實肺纖維化的發(fā)生發(fā)展設(shè)及到多種細胞因子及其相關(guān)基因的復(fù)雜網(wǎng) 絡(luò)調(diào)控，而11111?^4參與調(diào)控人類約1/^3基因的表達，提示11111?^4可能在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā) 揮重要的調(diào)控作用。MicroRNA(miRNA)是一類由約22個核巧酸組成的非編碼RNA，它們通過 與勒1 基因 mRNA 3'非翻譯區(qū)（3'-UTR)的 miRNA 反應(yīng)元件（microRNA response elements， MREs)通過堿基序列互補特異性結(jié)合，從而抑制祀基因蛋白質(zhì)翻譯或促進其降解，在不同的 細胞和發(fā)育過程中如增殖、分化調(diào)亡和應(yīng)激反應(yīng)等發(fā)揮重要的作用。近年來，越來越多的證 據(jù)表明在肺纖維化疾病中特異性miRNAs可通過調(diào)控不同的祀蛋白，參與多條信號通路影響 肺纖維化進程，如miR-424可通過降低調(diào)控蛋白Smurf2水平而激活TGF-β信號通路，進而促 進肌成纖維細胞分化;let-7d可作用于祀基因 HMGA2和a-SMA使成纖維細胞失去間充質(zhì)細胞 特性，而獲得上皮細胞特性等。秒肺屬于肺纖維化疾病，目前也有報道發(fā)現(xiàn)miRNAs如1111尺- 146a、miR-18化等參與秒肺纖維化進程。
[0004] 由于組織中存在miRNAs,且含量豐富、性質(zhì)穩(wěn)定、易于定量檢測并存在顯著的疾病 特異性，近年來越來越多學(xué)者致力于研究改變miRNAs表達水平在減輕肺纖維化方面的作用 機制，并為臨床祀向治療肺纖維化提供科研數(shù)據(jù)，如上調(diào)小鼠體內(nèi)和A549細胞中miR-26a水 平可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控HMGA2減輕TGF-m和博萊霉素引起的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程化MT)W及纖 維化發(fā)生;抑制miR-21水平可減輕博萊霉素引起的纖維化和肌成纖維細胞分化等過程。此 夕h由Regulus化erapeutics公司開發(fā)的氣代和甲氧基修飾的miR-21抑制劑已用于纖維化 治療的臨床前期試驗。運些研究均表明從發(fā)病機制和基因表達調(diào)控方面出發(fā)，利用miRNAs 作為肺纖維化治療方法具有針對性及效果明顯，運為肺纖維化的治療開拓了新境界。然而， 區(qū)別于特發(fā)性肺纖維化，目前還沒有針對秒肺治療的特異性miRNAs的報道，若能篩選出秒 肺特異或異常表達的組織miRNAs作為治療祀標(biāo)，并研制相應(yīng)的治療藥物，對我國秒肺病的 治療現(xiàn)狀必將是一次有力的推動。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 解決的技術(shù)問題:本發(fā)明提出miRNA-489在制備治療秒肺藥物中的應(yīng)用。
【申請人】通 過前期小鼠秒肺模型肺組織的Affyme tr i X mi RNA表達譜忍片分析初步篩選出秒塵處理組 與對照組比較表達下調(diào)明顯的miRNA-489，并在重建秒肺動物模型肺組織中進行驗證，然后 通過上調(diào)小鼠體內(nèi)miRNA-489水平表明其具有抑制秒塵誘導(dǎo)肺纖維化的作用。最后在人巨 隧細胞和成纖維細胞中進一步驗證上調(diào)miRNA-489可抑制炎性因子、纖維化因子的釋放及 纖維化標(biāo)志物的表達，綜合分析最終明確miRNA-489具有抑制秒肺纖維化的作用，運可為 miRNA-489用于秒肺病的治療提供理論依據(jù)。
[0006] 技術(shù)方案:miRNA-489在制備治療秒肺藥物中的應(yīng)用。
[0007] miRNA-489的序列為5 ' -AAUGACACCACAUAUAUGGCAGC-3 '。
[000引一種治療秒肺的藥物，有效成分為miRNA-489。
[0009] -種治療秒肺的藥物，有效成分為促進miRNA-489表達的化合物。
[0010] -種生物標(biāo)志物作為祀標(biāo)用于篩選治療和預(yù)防秒肺的藥物中的應(yīng)用，所述生物標(biāo) 志物為 miRNA-489。
[0011] 具體來說，（1)建立秒塵致小鼠肺纖維化動物模型：W氣管灌注方法構(gòu)建秒塵致小 鼠肺纖維化動物模型，明確肺組織中miRNA-489水平下調(diào)。（2)建立上調(diào)體內(nèi)miRNA-489水平 的秒塵致小鼠肺纖維化動物模型:采用miRNA-489 agomir上調(diào)小鼠體內(nèi)miRNA-489水平，通 過病理分析、纖維化指標(biāo)檢測，從整體動物水平明確miRNA-489具有抑制秒塵誘導(dǎo)肺纖維化 的作用。（3)建立上調(diào)miRNA-489水平的細胞模型:采用miRNA-489 mimic上調(diào)人源巨隧細胞 和成纖維細胞中miRNA-489水平，通過炎癥和纖維化指標(biāo)檢測，從細胞水平進一步明確 miRNA-489具有抑制秒塵誘導(dǎo)肺纖維化的作用。
[0012] 研究的實驗方法主要包括W下幾個部分：
[0013] 1.重建小鼠秒肺模型中驗證
[0014] 首先在秒肺模型中進行忍片結(jié)果驗證:氣管灌注法建立小鼠秒肺模型，病理切片 顯示建模成功。根據(jù)病理切片選取秒塵組每個時間點（7、14和28d)和28d生理鹽水組各5只 小鼠肺組織，采用Trizol裂解-氯仿抽提-異丙醇沉淀的方法提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得 到cDNA樣品，加入巧光探針進行PCR反應(yīng)，檢測并比較纖維化肺組織與對照肺組織中miRNA- 489水平的變化。
[001引 2.上調(diào)miRNA-489水平的秒塵致小鼠肺纖維化動物模型：氣管灌注法建立小鼠秒 肺模型，采用經(jīng)化學(xué)修飾的miRNA-489激動劑(agomir)于造模Od首次氣管注入，隨后在7、14 和21d分別再經(jīng)尾靜脈注射的方法上調(diào)小鼠體內(nèi)miRNA-489水平，28d收集肺組織進行病理 切片皿染色、纖維化程度評分，提取肺組織總蛋白通過Western blot方法進行纖維化指標(biāo) 檢測，從整體動物水平明確miRNA-489具有抑制秒塵誘導(dǎo)肺纖維化的作用。
[0016] 3.上調(diào)miRNA-489水平的細胞模型：采用化學(xué)合成miRNA-489模擬物(mimic)轉(zhuǎn)染 的方法，上調(diào)人源巨隧細胞和成纖維細胞中miRNA-489水平，轉(zhuǎn)染2地后分別采用Si化處理 巨隧細胞，TGF-βΙ處理成纖維細胞。提取細胞總蛋白后通過Western blot方法進行炎癥和 纖維化指標(biāo)檢測，從細胞水平進一步明確miRNA-489具有抑制秒塵誘導(dǎo)炎癥和肺纖維化的 作用。
[0017] 4.統(tǒng)計分析方法
[0018] 運用方差分析(Dunnett's t test)比較纖維化動物模型組與對照組間miRNA-489 表達水平分布差異。統(tǒng)計學(xué)分析均通過?？诘慕y(tǒng)計學(xué)分析軟件完成(SAS，v.9.1)。統(tǒng)計學(xué)顯 著性水平P值設(shè)為0.05，所有統(tǒng)計學(xué)檢驗均為雙側(cè)檢驗。
[0019] miRNA的差異表達水平:在肺組織中WU6作為內(nèi)參，計算比較miRNA-489差異表達 情況。用2-AAGT表示相比于對照組變化的倍數(shù)，其中Λ CT = CT姻-CTV慘，Δ Δ CT= Δ CT姻-Δ CT礎(chǔ),?，此后W2為底數(shù)、-Δ Δ CT為指數(shù)計算處理組及對照組間miRNA-489的改變倍數(shù)。
[0020] W下是本發(fā)明進一步說明：
[0021 ] 本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)miRNA-489在秒塵誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中顯著下調(diào)。采 用miRNA-489 agomir體內(nèi)注射和miRNA-489 mimic細胞轉(zhuǎn)染上調(diào)miRNA-489表達，通過病理 觀察、炎癥指標(biāo)和纖維化指標(biāo)的檢測，發(fā)現(xiàn)miRNA-489過表達無論在整體動物水平還是細胞 水平均可明顯抑制秒塵誘導(dǎo)的炎癥和肺纖維化的發(fā)生，運意味著miRNA-489可成為一種治 療秒肺的藥物。具體的，可W合成miRNA-489的核巧酸，并與適當(dāng)載體如納米顆粒、脂質(zhì)體等 連接形成藥物，通過口服、靜脈或肌肉注射的方式對秒肺病進行治療。
[0022] 有益效果:本發(fā)明提供的miRNA-489用于秒肺病治療藥物的優(yōu)越性在于:作為基因 表達調(diào)控的新工具，miRNAs是一種新型祀向分子治療藥物，區(qū)別于傳統(tǒng)的治療藥物，具有易 于合成，易于檢測，定量精確，經(jīng)化學(xué)修飾后能増加其穩(wěn)定性并提高親和力，可通過特殊藥 物遞送系統(tǒng)有效定位到祀器官等優(yōu)點，將大大提高秒肺病治療的特異性和祀向性，該種 miRNA藥物的成功開發(fā)將為秒肺病的治療開創(chuàng)新局面，為其他疾病治療藥物的研制提供借 鑒。
[0023] 本發(fā)明在整體動物和細胞水平均上調(diào)miRNA-489水平，研究miRNA-489對秒肺肺纖 維化的影響及抑制效果，掲示其作為治療藥物的潛在價值。因此，本發(fā)明可為研發(fā)具有潛在 治療價值的新型小分子藥物祀標(biāo)提供幫助。
【附圖說明】
[0024] 圖1.顯示重建秒塵致小鼠肺纖維化模型后，肺組織病理改變化E染色），包括炎細 胞滲出、肺泡結(jié)構(gòu)破壞、秒結(jié)節(jié)形成等變化。
[0025] 圖2.顯示重建秒塵致小鼠肺纖維化模型后，肺組織中纖維化指標(biāo)上皮細胞標(biāo)志物 化-ca化erin)、間質(zhì)細胞標(biāo)志物(a-SMA、Vimentin)的蛋白表達變化。*沖<0.01，與生理鹽水 對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0026] 圖3.顯示前期miRNA忍片結(jié)果，在不同時間點秒塵誘導(dǎo)小鼠肺纖維化動物模型的 肺組織中，與生理鹽水對照組比較，miRNA-489差異表達的柱狀圖。
[0027] 圖4.顯示在后期重建的秒塵誘導(dǎo)小鼠肺纖維化動物模型肺組織中，進一步驗證 miRNA-489差異表達的柱狀圖，與前期忍片結(jié)果相一致。*沖<0.01，與生理鹽水組比較差異 有統(tǒng)計學(xué)意義。
[002引圖5.顯示上調(diào)小鼠體內(nèi)miRNA-489水平后，秒塵誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型肺組織中 miRNA-489表達水平比較的柱狀圖；表明采用miRNA-489 agomir成功上調(diào)小鼠體內(nèi)miRNA- 489水平。*沖<0.01，與miR-NC+秒塵組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義;*沖<0.01，與生理鹽水組比 較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0029] 圖6.顯示上調(diào)小鼠體內(nèi)miRNA-489水平后，肺組織病理改變化E染色），包括肺泡結(jié) 構(gòu)的完整性、肺泡壁增厚、炎細胞滲出、秒結(jié)節(jié)形成等變化。
[0030] 圖7 .顯示上調(diào)小鼠體內(nèi)miRNA-489水平后，肺組織中纖維化指標(biāo)上皮細胞標(biāo)志物 化-ca化erin)、間質(zhì)細胞標(biāo)志物(a-SMA、Vimentin)的蛋白表達變化。*沖<0.01，與miR-NC+ 秒塵組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0031] 圖8.顯示采用miRNA mimic轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)人巨隧細胞中miRNA-489水平后，再用 培養(yǎng)基配制的Si化粉塵懸液處理細胞。提取細胞總蛋白，采用western blot實驗檢測炎性 因子IL-Ιβ和纖維化因子TGF-m蛋白水平變化。*沖<0.01，與mimic-NC+秒塵組比較差異有 統(tǒng)計學(xué)意義。
[0032] 圖9.顯示采用miRNA mimic轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)人成纖維細胞中miRNA-489水平后，再 用培養(yǎng)基配制的TGF-βΙ溶液處理細胞。提取細胞總蛋白，采用western blot實驗檢測纖維 化指標(biāo)日-SMA和Vimentin蛋白水平變化。*沖<0.01，與mimic-NC+TGF-化組比較差異有統(tǒng)計 學(xué)意義。
【具體實施方式】
[0033] W下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細說明：本實施例在W本發(fā)明技術(shù)方案為 前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的包含范圍不限于下述的實施 例。下述的實施例中未注明的條件和方法等均按照常規(guī)進行。
[0034] W下實施例中所使用的試劑均為分析純級試劑，且可從正規(guī)渠道商購獲得。
[0035] W下實施例中體內(nèi)動物實驗所使用的miRNA-489 agomir，體外細胞實驗轉(zhuǎn)染用的 轉(zhuǎn)染試劑及miRNA-489 mimic均購自廣州銳博生物科技公司，均為商業(yè)化產(chǎn)品。
[0036] 實施例1:重建小鼠秒肺模型
[0037] 秒塵致小鼠肺纖維動物模型建立:選擇6-8周，體重為20-25g的雄性巧7BL/6小鼠， 麻醉狀態(tài)下經(jīng)支氣管灌注50化生理鹽水配制的50mg/mL Si化粉塵懸液，對照組給予生理鹽 水，在第7、14、28加寸處理小鼠，留存肺組織。右下肺葉經(jīng)甲醒固定后石蠟包埋、切片進行皿 染色。其余肺組織經(jīng)液氮速凍后存于-80°C冰箱，備用。采用western blot方法測定肺組織 中上皮細胞標(biāo)志物化-cadher in)、間質(zhì)細胞標(biāo)志物(a-SMA、Viment in)的蛋白水平。小鼠肺 組織病理切片和纖維化指標(biāo)的結(jié)果相結(jié)合評價秒塵致小鼠肺纖維化模型構(gòu)建是否成功。 [003引 （1)肥染色
[0039]小鼠肺組織經(jīng)甲醒固定一脫水一淋蠟一包埋一切片等一系列步驟后，制成空白切 片進行皿染色。組織切片放入60°C電熱恒溫培養(yǎng)箱中烘烤化W防止脫片。經(jīng)梯度脫蠟至水 后蘇木素染色15min，水洗玻片上多余染液；1%鹽酸酒精分化，鏡下控制直至細胞核染色清 晰為止；自來水沖洗lOmin左右;伊紅染色Imin左右至鏡下觀察控制，待細胞質(zhì)染成紅色即 可;經(jīng)梯度脫水-透明-用中性樹膠進行封片，顯微鏡下觀察。蘇木素為堿性染料，將細胞核 染成藍色。伊紅為酸性染料，將細胞質(zhì)染成紅色。結(jié)果如圖1所示，與生理鹽水組比較，秒塵 組出現(xiàn)了炎細胞滲出、肺泡結(jié)構(gòu)破壞，14加寸開始出現(xiàn)纖維化改變，28d出現(xiàn)典型秒結(jié)節(jié)。
[0040] (2)纖維化指標(biāo)的western blot實驗
[0041] 1)提取肺組織總蛋白
[0042] 取約1 OOmg的肺組織樣本置于ImL消毒的研磨器中，加入組織蛋白提取液(T-PER Tissue Protein Extraction Reagent,thermo scientific)500yL，將研磨充分的含組織 蛋白液的研磨器放置于冰上30min后于4°C，12,00化9111，離屯、151]1；[]1后取上清，此為提取的肺 組織總蛋白質(zhì)。
[0043] 2)BCA法測定肺組織蛋白濃度
[0044] 首先按50體積BCA試劑A與1體積BCA試劑B( 50:1)配制適量的BCA工作液，進行充分 混勻；將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品提取溶解，取10化蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用生理鹽水稀釋至l(K)yL，使應(yīng)用終濃度 為0.5mg/mL將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20化加入96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，然后用生 理鹽水補足至20化;將19化生理鹽水加到96孔板的樣品孔中，然后加入化L待測樣品；對待 測各孔加入臨用前配制好的20化L BCA工作液，于37°C解箱放置30min;酶標(biāo)儀測定波長為 570nm檢測吸光度值，然后用Excel根據(jù)蛋白濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 曲線計算待測樣本的蛋白質(zhì)總濃度。
[0045] 3)weste;rn blot實驗
[0046] 采用12.5%濃度分離膠（下層膠)和5%濃度的濃縮膠(上層膠），10孔梳子所做泳 道每孔加蛋白質(zhì)樣品的總體積為40化，需保證每個泳道樣品蛋白上樣量相等。在電泳槽內(nèi) 加適量電泳緩沖液，W電壓60V進行電泳。電泳結(jié)束將甲醇預(yù)浸泡后的適當(dāng)大小的PVDF膜與 3mm濾紙經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖液4°C冰箱平衡30min，然后從下向上依次按順序?qū)V紙、PVDF膜、凝膠、 濾紙放好，去除各層內(nèi)氣泡，150mA恒流電轉(zhuǎn)膜90min;轉(zhuǎn)膜結(jié)束將PVDF膜置于5 %的脫脂牛 奶中，室溫?fù)u床低速封閉1小時。根據(jù)待測目的蛋白配制抗體稀釋液，一般情況下第一抗體 為1:1000稀釋，4°C冰箱與PVD刊莫解育過夜，經(jīng)1 X TBST洗膜15min，第二抗體羊抗兔IgG-HRP 或羊抗小鼠 IgG-皿P(稀釋比為1:1000)，室溫解育化；1 XTBST洗膜45min。根據(jù)試劑盒說明 書進行操作，將化學(xué)發(fā)光液ECL A液與B液按1:1配制適量的顯色液，采用全自動圖像分析系 統(tǒng)對目的蛋白條帶進行掃描曝光，依據(jù)條帶灰度來判定蛋白量表達變化。結(jié)果如圖2所示， 小鼠支氣管灌注秒塵后7、14、28d，肺組織中上皮細胞標(biāo)志物E-ca化er in蛋白表達水平逐漸 降低，而間質(zhì)細胞標(biāo)志物a-SMA和Vimentin表達水平逐漸升高。結(jié)合圖1病理切片結(jié)果綜合 評價表明重建秒塵致小鼠肺纖維化模型構(gòu)建成功。
[0047] 實施例2:重建小鼠秒肺模型中miRNA-489水平的qRT-PCR實驗
[004引確定模型建立成功后，根據(jù)肺組織病理切片選第7、14、28加夕塵處理組和28d生理 鹽水組各5只小鼠肺組織提取RNA進行qRT-PCR檢測。在整個研究過程中均實施嚴(yán)格的質(zhì)控， 每個樣本連續(xù)檢測Ξ次，所有樣本均采用盲法，即在不清楚樣本背景的情況下完成從而避 免偏倚。
[0049] (1)制備3酷樣品
[(Κ)加]將消毒后的組織勻漿器置于冰上，放入lOOmg小鼠肺組織后再加入1 .OmL化izol (Life Technologies/ambion，Carlsbad，CA)研磨至勻漿狀態(tài);②將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5mL無 RNA酶EP管中，加入氯仿(立氯甲燒)200化，夾在兩板間輕柔的上下顛倒混勻，室溫放置2~ 3min dRNA被氯仿萃取到上層水相，蛋白質(zhì)和DNA在下層有機相；③4°C、12，00化pm，離屯、 15min;④吸取上清液至新EP管中，加入-20°C預(yù)冷的異丙醇50化L，-20°C放置lOmin，W防降 解;⑤4°C、12，00化pm，離屯、lOmin;⑥棄上清液并吸干殘留的少量上清;-20°C預(yù)冷75%乙醇 后，取ImL加入到EP管中，混勻;⑦4°C、7，500g，離屯、5min;⑧棄上清，觀察RNA量，倒置于干凈 濾紙上片刻；⑨常溫7,5(K)rpm離屯、3min;用槍頭吸去多余乙醇，置于通風(fēng)楓內(nèi)揮發(fā)至無乙 醇;⑩根據(jù)RNA的量，加入適量消毒的DEPC水，混勻后4°C溶解1~2h，得到RNA樣品。
[00引](2)使用Takara試劑盒進行qRT-PCR實驗
[0化2] 1)通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總體積10化，包括化L 5X PrimeScript Buffer(for Real Time)、0.5yL PrimeScript RT Enzyme MixI、0.5yL Specific Primer(2yM)、化L總RNA(500ng/yL)及化L RNase Free 地2〇。反應(yīng)步驟為42°C反 應(yīng)15min，85°C反應(yīng)5sec，4°C存放；反應(yīng)結(jié)束后加入20化腳ase Free地2〇,補足終體積至 3化L。使用儀器為BI0-RAD T100 Thermal切cler。逆轉(zhuǎn)錄引物由廣州銳博生物科技公司設(shè) 計和合成。
[0053] 2)qRT-PCR擴增反應(yīng)：反應(yīng)體系總體積化L，包括：2.5化2xSYBR"'Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus),Ο.ΙμΙ 50XR0X Reference Dye,0.化L PCR Forward PrimerQOy M)、0.化L PCR Reverse Primed 10μΜ)、1.化L RNase Free 地2〇及化L逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。 使用ABI Prism 7900巧光定量PCR儀，PCR反應(yīng)條件是：95°C、30sec進行一個循環(huán)一95°C、 0.05sec，60°C、lmin進行40個循環(huán)。擴增反應(yīng)正向引物和反向引物均由廣州銳博生物科技 公司設(shè)計和合成。
[0054] 結(jié)果如圖4所示，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在各組時間點5例肺組織樣本中，與對照生理鹽 水組比較，miRNA-489在7、14、28加夕塵組顯著降低，與圖3所示前期11111?^43忍片結(jié)果一致。
[0055] 實施例3:上調(diào)miRNA-489水平的秒塵致小鼠肺纖維化動物實驗
[0056] (1)動物模型建立
[0化7] 采用經(jīng)化學(xué)修飾的miRNA-489激動劑(agomir)上調(diào)小鼠體內(nèi)miRNA-489水平。選擇 6-8周，體重為20-25g的雄性巧7BL/6小鼠，將小鼠分為對照組(生理鹽水）、秒塵組（Si〇2懸 液）、miR-NC+秒塵組(miR-NC+Si〇2懸液）、miRNA-489高表達+秒塵組(miRNA-489 agomir+ Si化懸液），麻醉狀態(tài)下經(jīng)支氣管灌注50化生理鹽水配制的50mg/mL Si化粉塵懸液，其中 miRNA-489高表達組在支氣管灌注Si〇2粉塵懸液后，伴隨首次氣管注射5nmol miRNA-489 agomir，隨后在7、14和21d分別再經(jīng)尾靜脈注射2.5nmol miRNA-489 agomir，28d收集肺組 織、血清。
[0化引（2)qRT_PCR及western blot實驗
[0059] qRT-PCR方法檢測miRNA-489表達水平(方法同實施例2)評價上調(diào)小鼠體內(nèi)miRNA- 489水平的效果。結(jié)果如圖5所示，與miR-NC+秒塵組比較，miR-489 agomir+秒塵組miR-489 水平出現(xiàn)顯著增加，表明成功上調(diào)小鼠體內(nèi)miRNA-489水平。將小鼠右下肺組織經(jīng)甲醒固定 后，制作病理切片進行皿染色(方法同實施例1)。結(jié)果如圖6所示，在miR-NC+秒塵組出現(xiàn)了 典型的炎癥反應(yīng)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞和纖維化結(jié)節(jié)，而上調(diào)miR-489表達后運些改變均出現(xiàn)明顯 減輕。根據(jù)肺組織病理切片，各組選擇5只小鼠肺組織提取總蛋白，western blot方法測定 肺組織中上皮細胞標(biāo)志物化-ca化erin)、間質(zhì)細胞標(biāo)志物(a-SMA、Vimentin)的蛋白水平 (方法同實施例1)。結(jié)果如圖7所示，與miR-NC+秒塵組比較，miR-489 agomir+秒塵組間質(zhì)細 胞標(biāo)志物(a-SMA，Vimentin)的蛋白水平降低，而上皮細胞標(biāo)志物E-ca化erin的蛋白水平得 到一定程度恢復(fù)。
[0060] (3)小鼠肺組織纖維化病理評分
[0061] 根據(jù)小鼠肺組織病理切片，W肺泡壁增厚、細胞増殖情況、炎性損傷、膠原沉積及 纖維化損傷為評判纖維化程度的基礎(chǔ)依據(jù)，對每只小鼠的病理切片都進行評分，具體的評 分系統(tǒng)參照文獻進行，嚴(yán)重程度判定等級為:0表示無異常，1表示邊緣的，2表示輕微，3表示 中度，4表示嚴(yán)重，5表示非常嚴(yán)重;損傷分布判定等級為:0表示無損傷，1表示少見或者機會 性出現(xiàn)化肺部面積的10% )，2表示稀少的/有限的化肺部面積的10%-25% ); 3表示中度 (占肺部面積的25 % -50 % ); 4表示擴増性或者廣泛分布（占肺部面積的50 %-75 % ); 5表示 非常廣泛或者非常明顯(分布面積超過肺部面積的75%)。結(jié)果如表1所示，miR-489 agomir +秒塵組肺損傷的嚴(yán)重程度和分布范圍均低于miR-NC+秒塵組。結(jié)合圖5、6、7綜合評價表明 miR-489具有明顯抑制肺纖維化的作用。
[0062] 實施例4:上調(diào)人源巨隧細胞和成纖維細胞中miRNA-489水平的實驗 [00創(chuàng) （1)細胞分組
[0064]將人源巨隧細胞(PMA誘導(dǎo)的THP-1細胞)和成纖維細胞(MRC細胞)分別提前一天傳 代于六孔板中，根據(jù)要求實驗分組設(shè)對照組(不做任何處理正常細胞）；處理組（巨隧細胞用 培養(yǎng)基配制的Si化粉塵處理2地，成纖維細胞用TGF-化處理細胞4她）；miR-NC+處理組(細胞 轉(zhuǎn)染25nM陰性對照miR-NC后經(jīng)Si〇2或TGF-βΙ分別處理兩種細胞）；miRNA-489 mimic+處理 組(細胞轉(zhuǎn)染25nM miRNA-489 mimic后經(jīng)Si化或TGF-化分別處理兩種細胞)共四組。
[00化](2)細胞轉(zhuǎn)染miRNA-489 mimic
[0066] 待細胞生長密度達40%時進行轉(zhuǎn)染處理，提前將5nM干粉狀miRNA-489 mimic試劑 用消毒后的25化L DEPC水溶解，存儲終濃度為20μΜ，分裝保存。使用PBS稀釋riboEFCT?CP Buffer(lOX)緩沖液為riboEFCT?CP Buffer(lX)。用 120μΙ riboEFCT?CP Buffer(lX) 稀釋扣L 20μΜ miRNA-489 mimic,混勻室溫解育5min。加入 12化 riboEFCT?CP Reagent,混 勻室溫解育20min。將W上混合液加入到1863化細胞培養(yǎng)基中混勻后加入六孔板的一個孔 中。根據(jù)細胞所需轉(zhuǎn)染孔的數(shù)量配制上述混合液。
[0067] (3)細胞Si〇2或TGF-化處理
[006引待人源巨隧細胞和成纖維細胞轉(zhuǎn)染miRNA-489 mimic 24h后，更換新鮮培養(yǎng)液，分 別加入所需一定濃度的Si化或TGF-化(本實驗Si化處理的濃度為100yg/mL，TGF-化處理的濃 度為Ing/mL)，空白對照組正常更換培養(yǎng)基，37Γ培養(yǎng)箱巨隧細胞培養(yǎng)2地，成纖維細胞培養(yǎng) 4化。
[0069] (4)細胞總蛋白提取及western blot實驗
[0070] 配制細胞裂解液（ImL RIPA裂解液，臨用前加入ΙΟμΙ PMSF，使終濃度為ImM)，六孔 板每孔棄培養(yǎng)液后用ImL PBS清洗1次，每孔加入上述配好的裂解液80化，4°C搖床裂解 30miη。4 °C，12，00化pm，離屯、15min，取上清，如實施例1，使用BCA法測定總蛋白濃度，在巨隧 細胞中采用western blot實驗檢測炎性因子IL-Ιβ和纖維化因子TGF-m蛋白水平變化，在 成纖維細胞中采用western blot實驗檢測纖維化指標(biāo)a-SMA和Vimentin改變。結(jié)果如圖8、 圖9所示，與mimic-NC組比較，采用miR-489 mimic轉(zhuǎn)染巨隧細胞上調(diào)細胞中miR-489水平可 抑制IL-Ιβ和TGF-m的表達;采用miR-489 mimic轉(zhuǎn)染成纖維細胞發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-489可降低 a-SMA和Vimentin水平。綜合分析表明在人源巨隧細胞和成纖維細胞中上調(diào)miRNA-489水平 可抑制炎癥和纖維化反應(yīng)。
[0071] 結(jié)論:上調(diào)小鼠體內(nèi)、人源巨隧細胞和成纖維細胞中miR-489的表達水平對秒塵誘 導(dǎo)的肺部炎癥和纖維化均具有明顯的抑制作用。因此，將其應(yīng)用于秒肺藥物的研發(fā)，具有較 好的應(yīng)用前景。
[0072] 表1 miRNA-489對肺組織纖維化嚴(yán)重程度和分布范圍的影響
[0073]
[0074] 表1.顯示上調(diào)小鼠體內(nèi)miRNA-489水平后，對小鼠肺組織病理切片進行纖維化嚴(yán) 重程度和分布范圍評分。*沖<0.01，與miR-NC+秒塵組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
【主權(quán)項】
1. miRNA-489在制備治療矽肺藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于miRNA-4 8 9的序列為5 ' -AAUGACACCACAUAUAUGGCAGC-3,。3. -種治療矽肺的藥物，其特征在于有效成分為miRNA-489。4. 一種治療矽肺的藥物，其特征在于有效成分為促進miRNA-489表達的化合物。5. -種生物標(biāo)志物作為靶標(biāo)用于篩選治療和預(yù)防矽肺的藥物中的應(yīng)用，所述生物標(biāo)志 物為 miRNA-489 〇
【文檔編號】A61P11/00GK105878265SQ201610353625
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月25日
【發(fā)明人】倪春輝, 吳秋云, 韓磊, 嚴(yán)瑋文, 吉曉明, 劉易
【申請人】南京醫(yī)科大學(xué)