具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白及其制備方法，屬于醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域，該具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白全長(zhǎng)132個(gè)氨基酸，其中1～25為NLS序列，26～39為His?FLAG標(biāo)簽序列，42～121為N240序列，122～132為T(mén)AT序列，His?FLAG標(biāo)簽序列與N240序列之間用RS兩個(gè)氨基酸進(jìn)行連接；該具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白克服了現(xiàn)有技術(shù)中的小分子藥物不能阻斷TCF4與除β?catenin外其他癌基因的結(jié)合導(dǎo)致不能有效抑制腫瘤干細(xì)胞的問(wèn)題，從而能夠全方位的阻斷TCF4與原癌基因的結(jié)合，有效抑制腫瘤干細(xì)胞，促進(jìn)化療藥物的敏感性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種具有腫瘤抑制作用的新型真核重組 蛋白及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cells，TSCs)學(xué)說(shuō)越來(lái)越受到關(guān)注。目前已經(jīng)成 功在腦腫瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤中成功分離 出了腫瘤干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)認(rèn)為，經(jīng)藥物治療后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移與腫瘤干細(xì)胞殘存 有密切關(guān)系。腫瘤干細(xì)胞的提出為腫瘤發(fā)生和復(fù)發(fā)機(jī)制提供了合理解釋?zhuān)瑢?duì)于研發(fā)更有效 的抗腫瘤藥物及干細(xì)胞和細(xì)胞生物學(xué)研究均具有重大意義。隨著對(duì)TSCs研究的進(jìn)一步深 入，發(fā)現(xiàn)TSCs和正常干細(xì)胞有很多相似之處，如耐藥、DNA修復(fù)活性和抗調(diào)亡等，TSCs的耐藥 特性幫助TSCs抵抗化療藥物的毒性作用，從而利于腫瘤增殖。
[0003] Wnt信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和分化的關(guān)鍵途徑，Wnt信號(hào)通路在胚胎和器 官發(fā)育以及維持干細(xì)胞的自我更新和防止細(xì)胞分化中起到至關(guān)重要的作用。近年研究表 明，Wnt/P-catenin通路的不恰當(dāng)激活，參與了腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移，與腫瘤干細(xì)胞的關(guān) 系尤為密切。
[0004] 在沒(méi)有Wnt信號(hào)刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)新合成的β-catenin與APC、Axin、GSK-3f3形成復(fù)合 體相互作用，并促進(jìn)β-catenin迅速被蛋白酶體降解，從而使β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)保持低水 平;在Wnt信號(hào)刺激下，Wnt蛋白可與細(xì)胞表面的FZ受體和LRP組成的復(fù)合體結(jié)合，促使細(xì)胞 質(zhì)中的Dsh聚集至細(xì)胞膜下，Dsh誘導(dǎo)GSK-30磷酸化，使其與Axin脫離，阻斷β-catenin的磷 酸化和泛素化降解，使得大量游離的β-catenin在胞質(zhì)聚集并進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF結(jié)合 成復(fù)合體，激活革G基因的轉(zhuǎn)錄，包括原癌基因 c-myc、cyclin Dl、sox2等。
[0005] 正常干細(xì)胞通過(guò)不對(duì)稱(chēng)分裂使其一個(gè)子代細(xì)胞保持干細(xì)胞特性，而另一個(gè)子代細(xì) 胞最終形成分化終末細(xì)胞。Wnt/P-catenin信號(hào)通路在維持干細(xì)胞池和防止細(xì)胞分化中起 到至關(guān)重要的作用，它的這種作用是通過(guò)穩(wěn)定胞質(zhì)中β-catenin的水平來(lái)維持的。在人類(lèi)癌 癥中，越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤起源于干細(xì)胞的非對(duì)稱(chēng)分裂的失調(diào)。腫瘤干細(xì)胞與正常干 細(xì)胞的區(qū)別在于其對(duì)稱(chēng)分裂特性。Wnt/i3-catenin信號(hào)通路的調(diào)控失常是多種類(lèi)型細(xì)胞發(fā) 生癌變的主要原因之一。Wnt/0-catenin信號(hào)通路的異常激活的一個(gè)標(biāo)志是β-catenin在細(xì) 胞核內(nèi)的高表達(dá)，這也被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞保持對(duì)稱(chēng)分裂的重要原因。最近研究顯示，β_ catenin在核內(nèi)的高表達(dá)還賦予TSCs耐藥和耐福射損傷的能力。
[0006] 腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性是臨床腫瘤治療中的主要障礙，TSCs是造成腫瘤耐 藥的重要原因，因此針對(duì)T S C s的治療將比針對(duì)整個(gè)腫瘤的治療更為有效。針對(duì)W n t / β -catenin信號(hào)通路中的重要信號(hào)分子的靶向治療是一類(lèi)具有發(fā)展前景的策略。細(xì)胞核中的 β-catenin并不能獨(dú)立發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，必須與轉(zhuǎn)錄因子TCF4結(jié)合才能發(fā)揮對(duì)革E1基因的 轉(zhuǎn)錄。近年的研究證實(shí)腫瘤干細(xì)胞的存活和維持依賴(lài)于細(xì)胞核中0-catenin/TCF4的轉(zhuǎn)錄因 子復(fù)合體的異常高表達(dá)。一種有效干預(yù)腫瘤干細(xì)胞的途徑是破壞兩者之間的相互結(jié)合。
[0007] 目前，已篩選出多個(gè)小分子化合物或多肽可阻斷β-catenin與TCF4的相互結(jié)合，對(duì) 腫瘤干細(xì)胞致瘤性有明顯的抑制作用。目前，已知TCF4蛋白的N端80個(gè)氨基酸是β-catenin 結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，同時(shí)該結(jié)構(gòu)域還能結(jié)合多個(gè)致癌基因如ATF2、GRi3等。上述的小分子藥 物并不能阻斷TCF4與除β-catenin的其他癌基因的結(jié)合。因此，如果單獨(dú)表達(dá)TCF4的N端結(jié) 構(gòu)域多肽，使之作為內(nèi)源性TCF4的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑將更為有效阻止i3-catenin/TCF4復(fù)合體的 形成并抑制TCF/LEF轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，從而抑制腫瘤干細(xì)胞并促進(jìn)化療藥物的敏感性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)上述存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白及 其制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的小分子藥物不能阻斷TCF4與除β-catenin的其他癌基因 的結(jié)合導(dǎo)致不能有效抑制腫瘤干細(xì)胞的問(wèn)題，從而能夠全方位的阻斷TCF4與原癌基因的結(jié) 合，有效的抑制腫瘤干細(xì)胞，促進(jìn)化療藥物的敏感性。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0010] -種具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白，其中，將能與β-catenin結(jié)合的轉(zhuǎn)錄 因子TCF4的氨基端(N端）的80個(gè)氨基酸序列命名為N240,在N240的N端連接核定位肽NLS，在 N240的C端連接穿膜信號(hào)肽TAT，在NLS和N240之間加入His-FLAG標(biāo)簽，所述具有腫瘤抑制作 用的新型真核重組蛋白功能區(qū)代號(hào)為:NLS-His-FLAG-N240-TAT;
[0011] 所述具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白全長(zhǎng)132個(gè)氨基酸，其中1~25為NLS 序列，26~39為His-FLAG標(biāo)簽序列，42~121為N240序列，122~132為T(mén)AT序列，所述His-FLAG 標(biāo)簽序列 與所述 N240序列之間用RS 兩個(gè)氨基酸進(jìn)行連接；
[0012] 所述具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的氨基酸序列為：
[0013]
[0014] 上述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白，其中，所述具有腫瘤抑制作用的 新型真核重組蛋白對(duì)應(yīng)的堿基序列為：
[0015]
[0016]
[0017] -種如上述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其中，包括：
[0018] (1) NLS-Hi S-FLAG-N240-TAT基因的克隆
[0019]以pcDNA/Myc-TCF4載體為模板用高保真PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增含TCF4前80個(gè)氨基酸 的N240序列，在上下游引物中分別引入His-Flag序列和TAT序列，在N端引入NLS序列，得到 初級(jí)PCR產(chǎn)物，以所述初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板擴(kuò)增最終的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列，而后在 最終的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列兩端分別引入內(nèi)切酶Hind III和Κρη I酶切位點(diǎn)，得到 PCR產(chǎn)物，
[0020]用所述內(nèi)切酶Hind III和Κρη I酶切所述PCR產(chǎn)物，再用膠回收試劑盒回收，得到 PCR酶切產(chǎn)物；
[0021]用所述內(nèi)切酶Hind III和Κρη I酶切所述PCR產(chǎn)物，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后用質(zhì) 粒抽提試劑盒回收，得到質(zhì)粒酶切產(chǎn)物pcDNA3.1質(zhì)粒；
[0022] 在溫度為3~5°C的環(huán)境下采用T4DNA連接酶將所述PCR酶切產(chǎn)物和所述質(zhì)粒酶切 產(chǎn)物pcDNA3.1質(zhì)粒連接過(guò)夜，而后轉(zhuǎn)化至E. coli Dh5a感受態(tài)細(xì)胞后涂布到含50μg/ml氨芐 青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，在溫度為36~38°C的環(huán)境下培養(yǎng)過(guò)夜；
[0023] 挑取單菌落，LB固體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后通過(guò)PCR初篩陽(yáng)性克隆、質(zhì)粒抽提試劑盒抽 提，得到陽(yáng)性質(zhì)粒:pcDNA3 · 1-NLS-His-FLAG-N240-TAT;
[0024] (2)HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與表達(dá)
[0025] 將pcDNA3 · 1-NLS-His-FLAG-N240-TAT通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小 時(shí)后，加入新霉素進(jìn)行加壓篩選，構(gòu)建表達(dá)NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞 株；
[0026] (3)NLS-His-FLAG-N240-TAT 重組蛋白的分離純化
[0027]對(duì)所述HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，而后收集細(xì)胞并抽提細(xì)胞總蛋白，蛋白 抽提液用0.45μπι的濾器過(guò)濾，使用Ni柱純化帶有His標(biāo)簽的重組蛋白；
[0028] 具體過(guò)程如下:轉(zhuǎn)移樹(shù)脂到Ni柱，待完全沉淀后，用雙蒸水洗滌鎳親和層析柱，并 防止下一步Ni 2+沉淀；用ddH20洗滌，除盡基質(zhì)中的空氣；10X柱體積的Binding buffer平 衡;上樣；10 X柱體積的Binding buffer洗滌，收集流出液;Elution buffer洗脫，進(jìn)一步超 濾濃縮后得到所述具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白。
[0029] 上述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其中，所述內(nèi)切酶 Hind IΠ 酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的堿基序列為:AAGCTT。
[0030] 上述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其中，所述內(nèi)切酶Κρη 頂每切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的堿基序列為:GGTACC。
[0031] 上述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其中，步驟（1)中，在 溫度為4°C的環(huán)境下采用T4DNA連接酶將所述PCR酶切產(chǎn)物和所述質(zhì)粒酶切產(chǎn)物pcDNA3.1質(zhì) 粒連接過(guò)夜。
[0032] 上述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其中，步驟（1)中，在 溫度為37°C的環(huán)境下培養(yǎng)過(guò)夜。
[0033] 上述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其中，步驟（1)中，在 得到陽(yáng)性質(zhì)粒:pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT后，對(duì)所述陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證基 因克隆的正確性。
[0034] 上述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其中，步驟(2)中，在 構(gòu)建表達(dá)NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后，還通過(guò)Western blot檢測(cè) NLS-His-FLAG-N240-TAT 蛋白的表達(dá)。
[0035] 上述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其中，還包括:將所述 具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，通過(guò)His單抗對(duì)所述具有 腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白進(jìn)行鑒定。
[0036] 上述技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)或者有益效果：
[0037] 本發(fā)明提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白全長(zhǎng)132個(gè)氨基酸，其中1~ 25為NLS序列，26~39為His-FLAG標(biāo)簽序列，42~121為N240序列，122~132為T(mén)AT序列，His-FLAG標(biāo)簽序列與N240序列之間用RS兩個(gè)氨基酸進(jìn)行連接;該具有腫瘤抑制作用的新型真核 重組蛋白克服了現(xiàn)有技術(shù)中的小分子藥物不能阻斷TCF4與除β-catenin外的其他癌基因的 結(jié)合導(dǎo)致不能有效抑制腫瘤干細(xì)胞的問(wèn)題，從而能夠全方位的阻斷TCF4與原癌基因的結(jié) 合，有效的抑制腫瘤干細(xì)胞，促進(jìn)化療藥物的敏感性。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明及其特征、外 形和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更加明顯。
[0039] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法 中陽(yáng)性質(zhì)粒pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT的構(gòu)建原理示意圖；
[0040] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法 中對(duì)步驟(3)得到的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)的 結(jié)果示意圖；
[0041] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法 中利用His單克隆抗體通過(guò)Western blot鑒定步驟(3)得到的具有腫瘤抑制作用的新型真 核重組蛋白的結(jié)果示意圖；
[0042] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例2提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白免疫熒光雙 染顯示細(xì)胞定位情況示意圖；
[0043] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例3提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白抑制膠質(zhì)瘤 干細(xì)胞標(biāo)志物⑶133表達(dá)的示意圖；
[0044] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例3提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白抑制膠質(zhì)瘤 干細(xì)胞中c-Myc表達(dá)的示意圖；
[0045] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例4提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白促進(jìn)膠質(zhì)瘤 干細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性的示意圖；
[0046] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例5提供的采用具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白時(shí)裸鼠 皮下荷瘤生存期分析的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但是不作為本發(fā)明的限 定。
[0048] 實(shí)施例1:
[0049] 本發(fā)明實(shí)施例1提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白，將能與β-catenin 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子TCF4的氨基端(N端）的80個(gè)氨基酸序列命名為N240,在N240的N端連接核定 位肽NLS，在N240的C端連接穿膜信號(hào)肽TAT，在NLS和N240之間加入His-FLAG標(biāo)簽，具有腫瘤 抑制作用的新型真核重組蛋白功能區(qū)代號(hào)為:NLS-His-FLAG-N240-TAT;具有腫瘤抑制作用 的新型真核重組蛋白全長(zhǎng)132個(gè)氨基酸，其中1~25為NLS序列，26~39為His-FLAG標(biāo)簽序 列，42~121為N240序列，122~132為T(mén)AT序列，His-FLAG標(biāo)簽序列與N240序列之間用RS兩個(gè) 氨基酸進(jìn)行連接;該具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的氨基酸序列為：
[0050]
[0052] 本發(fā)明實(shí)施例1提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白對(duì)應(yīng)的堿基序列 為：
[0053]
[0054] 本發(fā)明實(shí)施例1提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白中，對(duì)照具有腫瘤 抑制作用的新型真核重組蛋白，以TCF4蛋白N端前8-27位氨基酸亂序?qū)φ招蛄?(SKIDLGDGFGLEGNEDQDEA)取代N240序列，其他鏈接方案不變，由于序列較小不便于通過(guò)質(zhì) 粒表達(dá)，故采用多肽合成方法直接合成融合蛋白，命名為NLS-N240sc。
[0055] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法 中陽(yáng)性質(zhì)粒pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT的構(gòu)建原理示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1提 供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法中對(duì)步驟(3)得到的具有腫瘤抑制 作用的新型真核重組蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)的結(jié)果示意圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例1 提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法中利用His單克隆抗體通過(guò) Western blot鑒定步驟(3)得到的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的結(jié)果示意圖； 如圖所示，一種具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，包括：
[0056] (1 )NLS-His-FLAG-N240-TAT 基因的克隆
[0057]以pcDNA/Myc-TCF4載體為模板用高保真PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增含TCF4前80個(gè)氨基酸 的N240序列，在上下游引物中分別引入His-Flag序列和TAT序列，在N端引入NLS序列，得到 初級(jí)PCR產(chǎn)物，以初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板擴(kuò)增最終的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列，而后在最終 的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列兩端分別引入內(nèi)切酶Hind III和Κρη頂每切位點(diǎn)（參見(jiàn)圖 1)，得到PCR產(chǎn)物；
[0058]用內(nèi)切酶Hind III和Κρη I酶切PCR產(chǎn)物，再用膠回收試劑盒回收，得到PCR酶切產(chǎn) 物；
[0059]用內(nèi)切酶Hind III和Κρη I酶切PCR產(chǎn)物，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后用質(zhì)粒抽提試 劑盒回收，得到質(zhì)粒酶切產(chǎn)物pcDNA3.1質(zhì)粒；
[0060] 在溫度為4°C的環(huán)境下采用T4DNA連接酶將PCR酶切產(chǎn)物和質(zhì)粒酶切產(chǎn)物PCDNA3.1 質(zhì)粒連接過(guò)夜，而后轉(zhuǎn)化至E.coli Dh5a感受態(tài)細(xì)胞后涂布到含50μg/ml氨節(jié)青霉素的LB固 體培養(yǎng)基上，在溫度為37 °C的環(huán)境下培養(yǎng)過(guò)夜；
[0061] 挑取單菌落，LB固體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后通過(guò)PCR初篩陽(yáng)性克隆、質(zhì)粒抽提試劑盒抽 提，得到陽(yáng)性質(zhì)粒:pcDNA3 · 1-NLS-His-FLAG-N240-TAT;
[0062] 對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果 經(jīng)軟件比對(duì)，驗(yàn)證基因克隆的正確性；
[0063] (2)HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與表達(dá)
[0064] 將pCDNA3 · 1-NLS-His-FLAG-N240-TAT通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小 時(shí)后，加入新霉素進(jìn)行加壓篩選，構(gòu)建表達(dá)NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞 株，通過(guò)Western blot檢測(cè)NLS-His-FLAG-N240-TAT蛋白的表達(dá)；
[0065] (3)NLS-His-FLAG-N240-TAT 重組蛋白的分離純化
[0066]對(duì)HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，而后收集細(xì)胞并抽提細(xì)胞總蛋白，蛋白抽提 液用0.45μπι的濾器過(guò)濾，使用Ni柱純化帶有His標(biāo)簽的重組蛋白；
[0067] 具體過(guò)程如下:轉(zhuǎn)移樹(shù)脂到Ni柱，待完全沉淀后，用雙蒸水洗滌鎳親和層析柱，并 防止下一步Ni 2+沉淀；用ddH20洗滌，除盡基質(zhì)中的空氣；10X柱體積的Binding buffer平 衡;上樣；10 X柱體積的Binding buffer洗滌，收集流出液;Elution buffer洗脫，進(jìn)一步超 濾濃縮后得到具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白，命名為NLS-N240(參見(jiàn)圖2);
[0068] (4)NLS_N240的Western blot鑒定
[0069] 將具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，通過(guò)His單抗 對(duì)具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果參見(jiàn)圖3。
[0070]在本發(fā)明實(shí)施例1提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法中， 內(nèi)切酶Hind III酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的堿基序列為:AAGCTT;內(nèi)切酶Κρη I酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的堿基序 列為:GGTACC。
[0071] 實(shí)施例2:
[0072]培養(yǎng)的C0S-7細(xì)胞加入500μΜ的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白NLS-N240， 隨機(jī)亂序多肽NLS-N24〇SC，和無(wú) NLS序列的Ν240真核重組蛋白，6h后用4 %多聚甲醛固定以 備后續(xù)免疫熒光染色，其中，NLS-N240SC是對(duì)照具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白，以 TCF4蛋白N端前8-27位氨基酸亂序?qū)φ招蛄校⊿KIDLGDGFGLEGNEDQDEA)取代N240序列，其他 鏈接方案不變，由于序列較小不便于通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)，故采用多肽合成方法直接合成融合蛋 白；
[0073] 使用抗His小鼠單抗和抗tubulin兔多抗進(jìn)行免疫熒光雙染，參見(jiàn)圖4,圖4是本發(fā) 明實(shí)施例2提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白免疫熒光雙染顯示細(xì)胞定位情況 示意圖，結(jié)果顯示所有重組蛋白均能進(jìn)入細(xì)胞，但僅帶有NLS序列的重組蛋白能定位于細(xì)胞 核，表明我們的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白不僅能進(jìn)入細(xì)胞，而且能順利定位 于細(xì)胞核并發(fā)揮作用。
[0074] 實(shí)施例3:
[0075] 用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液(D/F12+EGF+bFGF+N2)培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和A172,同時(shí) 加入NLS-N240具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白和對(duì)照蛋白NLS-N24〇SC，濃度為500μ Μ，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組，培養(yǎng)至5d溶劑對(duì)照組形成直徑約100μπι的干細(xì)胞球時(shí)收集培養(yǎng)液中 懸浮的細(xì)胞球，部分細(xì)胞用來(lái)抽提RNA后進(jìn)行PCR檢測(cè)，部分細(xì)胞抽提蛋白用來(lái)進(jìn)行Western blot檢測(cè)靶基因 c-Myc的表達(dá)量，其中，NLS-N240sc是對(duì)照具有腫瘤抑制作用的新型真核重 組蛋白，以TCF4蛋白N端前8-27位氨基酸亂序?qū)φ招蛄校⊿KIDLGDGFGLEGNEDQDEA)取代N240 序列，其他鏈接方案不變，由于序列較小不便于通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)，故采用多肽合成方法直接合 成融合蛋白。
[0076]通過(guò)CD133特異性引物對(duì)收集到的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞RNA進(jìn)行PCR檢測(cè)并相對(duì)定量，以 GAPDH為內(nèi)參，參見(jiàn)圖5,圖5是本發(fā)明實(shí)施例3提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋 白抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)志物⑶133表達(dá)的示意圖，結(jié)果表明NLS-N240可顯著抑制腫瘤干細(xì) 胞標(biāo)志物⑶133的表達(dá)。
[0077] 通過(guò)Western blot對(duì)收集到的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中TCF/LEF革E1蛋白c-Myc進(jìn)行檢測(cè)，以 actin為內(nèi)參，參見(jiàn)圖6,圖6是本發(fā)明實(shí)施例3提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋 白抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中c-Myc表達(dá)的示意圖，結(jié)果表明NLS-N240可顯著抑制腫瘤干細(xì)胞中 促癌基因 c-Myc的表達(dá)。
[0078] 實(shí)施例4:
[0079]采用貼壁培養(yǎng)方式培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSC)，加入不同濃度的膠質(zhì)瘤化療藥物替 莫唑胺（TMZ，50、125、250、500、ΙΟΟΟμΜ)聯(lián)合NLS-N240(500μΜ)，分組：（1)TMZ; (2)TMZ+NLS-N240sc;(3)TMZ+NLS-N240;連續(xù)培養(yǎng)5d，其中，NLS-N240sc是對(duì)照具有腫瘤抑制作用的新型 真核重組蛋白，以TCF4蛋白N端前8-27位氨基酸亂序?qū)φ招蛄校⊿KIDLGDGFGLEGNEDQDEA)取 代N240序列，其他鏈接方案不變，由于序列較小不便于通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)，故采用多肽合成方法 直接合成融合蛋白。
[0080]用Promega公司生產(chǎn)的LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞毒性，參見(jiàn)圖7，圖7是本發(fā)明實(shí)施 例4提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性 的示意圖，結(jié)果顯示加入NLS-N240真核重組蛋白后顯著促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感性。 [0081 ] 實(shí)施例5:
[0082]用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87形成膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球，用Accutase消 化成單細(xì)胞，繼續(xù)用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)使之再次形成干細(xì)胞球，用Accutase消化呈單 細(xì)胞，用D/F12培養(yǎng)液與Matr i ge 1 (BD公司產(chǎn)品）按1:1重懸用于裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)。
[0083] 按每只balb/c裸鼠2xl06/100ul濃度皮下注射建立膠質(zhì)瘤干細(xì)胞裸鼠皮下模型。1 周后皮下形成明顯腫瘤包塊后，隨機(jī)分組"DDMSOiOTMZdS^LS-m^dOTMZ+NLS-mdO, 每組 10 只 ，分別給予腹腔注射 DMS0-PBS 緩沖液、替莫唑胺 （50mg/kg/d，dl-5)、NLS-N240(10yg/只，2天一次，持續(xù)14天）、TMZ(方案同前)+NLS-N240(方案同前），給藥停止后繼 續(xù)正常飲食飼養(yǎng)，持續(xù)觀察裸鼠生存期，通過(guò)log-rank法比較各組動(dòng)物的生存期，參見(jiàn)圖8， 圖8是本發(fā)明實(shí)施例5提供的采用具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白時(shí)裸鼠皮下荷瘤 生存期分析的示意圖，結(jié)果顯示，NLS-N240單獨(dú)治療對(duì)裸鼠荷瘤后生存期無(wú)明顯影響，而 TMZ單獨(dú)治療有利于裸鼠荷瘤后的生存期，而兩者聯(lián)合治療則較TMZ單獨(dú)治療有更明顯的延 長(zhǎng)生存期的效果。
[0084] 綜上所述，本發(fā)明實(shí)施例提供的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白全長(zhǎng)132 個(gè)氨基酸，其中1~25為NLS序列，26~39為His-FLAG標(biāo)簽序列，42~121為N240序列，122~ 132為T(mén)AT序列，His-FLAG標(biāo)簽序列與N240序列之間用RS兩個(gè)氨基酸進(jìn)行連接;該具有腫瘤 抑制作用的新型真核重組蛋白克服了現(xiàn)有技術(shù)中的小分子藥物不能阻斷TCF4與除β-catenin的其他癌基因的結(jié)合導(dǎo)致不能有效抑制腫瘤干細(xì)胞的問(wèn)題，從而能夠全方位的阻 斷TCF4與原癌基因的結(jié)合，有效的抑制腫瘤干細(xì)胞，促進(jìn)化療藥物的敏感性。
[0085] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)以及上述實(shí)施例可以實(shí) 現(xiàn)所述變化例，在此不予贅述。這樣的變化例并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，在此不予贅述。
[0086] 以上對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實(shí)施方式;任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案作出許多可能的變 動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。因此，凡是未 脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改、 等同變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白，其特征在于，將能與β-catenin結(jié)合的 轉(zhuǎn)錄因子TCF4的氨基端(N端）的80個(gè)氨基酸序列命名為N240,在N240的N端連接核定位膚 化S，在N240的C端連接穿膜信號(hào)膚TAT，在化S和N240之間加入化S-化AG標(biāo)簽，所述具有腫瘤 抑制作用的新型真核重組蛋白功能區(qū)代號(hào)為:化S-His-化AG-N240-TAT; 所述具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白全長(zhǎng)132個(gè)氨基酸，其中1~25為化S序列， 26~39為化S-FLAG標(biāo)簽序列，42~121為N240序列，122~132為T(mén)AT序列，所述化S-FLAG標(biāo)簽 序列與所述N240序列之間用RS兩個(gè)氨基酸進(jìn)行連接； 所述具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的氨基酸序列為：2. 如權(quán)利要求1所述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白，其特征在于，所述具有 腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白對(duì)應(yīng)的堿基序列為：3. -種如權(quán)利要求1所述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其特 征在于，包括： (1)化S-His-化AG-N240-TAT基因的克隆 WpcDNA/Myc-TCF4載體為模板用高保真PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增含TCF4前80個(gè)氨基酸的 N240序列，在上下游引物中分別引入化s-Flag序列和TAT序列，在N端引入化S序列，得到初 級(jí)PCR產(chǎn)物，W所述初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板擴(kuò)增最終的化S-His-FLAG-N240-TAT序列，而后在最 終的化S-化S-化AG-N240-TAT序列兩端分別引入內(nèi)切酶化nd III和Κρη I酶切位點(diǎn)，得到 PCR產(chǎn)物， 用所述內(nèi)切酶化nd III和Κρη I酶切所述PCR產(chǎn)物，再用膠回收試劑盒回收，得到PC賄每 切產(chǎn)物； 用所述內(nèi)切酶化nd III和Κρη I酶切所述PCR產(chǎn)物，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后用質(zhì)粒抽 提試劑盒回收，得到質(zhì)粒酶切產(chǎn)物pcDNA3.1質(zhì)粒； 在溫度為3~5°C的環(huán)境下采用T4DNA連接酶將所述PCR酶切產(chǎn)物和所述質(zhì)粒酶切產(chǎn)物 PCDNA3.1質(zhì)粒連接過(guò)夜，而后轉(zhuǎn)化至E. coli化5α感受態(tài)細(xì)胞后涂布到含50μg/ml氨節(jié)青霉 素的LB固體培養(yǎng)基上，在溫度為36~38°C的環(huán)境下培養(yǎng)過(guò)夜； 挑取單菌落，LB固體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后通過(guò)PCR初篩陽(yáng)性克隆、質(zhì)粒抽提試劑盒抽提， 得到陽(yáng)性質(zhì)粒:PCDNA3.1-NLS-His-化 AG-N240-TAT; (2化EK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與表達(dá) 將PCDNA3.1-化S-His-FLAG-N240-TAT通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染肥K293細(xì)胞48小時(shí)后， 加入新霉素進(jìn)行加壓篩選，構(gòu)建表達(dá)化S-His-化AG-N240-TAT基因的肥K293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株； (3)化S-Hi S-化AG-N240-TAT重組蛋白的分離純化 對(duì)所述皿K293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，而后收集細(xì)胞并抽提細(xì)胞總蛋白，蛋白抽提 液用0.45WI1的濾器過(guò)濾，使用Ni柱純化帶有化S標(biāo)簽的重組蛋白； 具體過(guò)程如下:轉(zhuǎn)移樹(shù)脂到Μ柱，待完全沉淀后，用雙蒸水洗涂?jī)x親和層析柱，并防止 下一步Ni化沉淀；用dd肥0洗涂，除盡基質(zhì)中的空氣；10 X柱體積的Binding buffer平衡;上 樣；10 X柱體積的Binding buffer洗涂，收集流出液;Elution buffer洗脫，進(jìn)一步超濾濃 縮后得到所述具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白。4. 如權(quán)利要求3所述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其特征在 于，所述內(nèi)切酶化nd III酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的堿基序列為:AAGCTT。5. 如權(quán)利要求3所述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其特征在 于，所述內(nèi)切酶Κρη I酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的堿基序列為:GGTACC。6. 如權(quán)利要求3所述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其特征在 于，步驟（1)中，在溫度為4°C的環(huán)境下采用T4DNA連接酶將所述PCR酶切產(chǎn)物和所述質(zhì)粒酶 切產(chǎn)物PCDNA3.1質(zhì)粒連接過(guò)夜。7. 如權(quán)利要求3所述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其特征在 于，步驟(1)中，在溫度為37°C的環(huán)境下培養(yǎng)過(guò)夜。8. 如權(quán)利要求3所述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其特征在 于，步驟（1)中，在得到陽(yáng)性質(zhì)粒:PCDNA3.1-NLS-Hi S-化AG-N240-TAT后，對(duì)所述陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn) 行測(cè)序，W驗(yàn)證基因克隆的正確性。9. 如權(quán)利要求3所述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其特征在 于，步驟（2)中，在構(gòu)建表達(dá)化S-化S-FLAG-N240-TAT基因的皿K293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后，還通過(guò) Western blot檢測(cè)化S-His-化AG-N240-TAT蛋白的表達(dá)。10. 如權(quán)利要求3所述的具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白的制備方法，其特征在 于，還包括:將所述具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，通過(guò) His單抗對(duì)所述具有腫瘤抑制作用的新型真核重組蛋白進(jìn)行鑒定。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK106084067SQ201610416328
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月15日 公開(kāi)號(hào)201610416328.0, CN 106084067 A, CN 106084067A, CN 201610416328, CN-A-106084067, CN106084067 A, CN106084067A, CN201610416328, CN201610416328.0
【發(fā)明人】鄒健, 殷瑩, 平鋒鋒, 蔣孟軍, 陳越新
【申請(qǐng)人】無(wú)錫市人民醫(yī)院