一種茯苓多糖聚乳酸納米乳及其制備方法與應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種茯苓多糖聚乳酸納米乳，它是以丙酮、聚乳酸、茯苓多糖和丙二醇嵌段聚醚F68為原料，以復(fù)乳法制備得到的。本發(fā)明還公開(kāi)了茯苓多糖聚乳酸納米乳的制備方法和在制備免疫增強(qiáng)藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用復(fù)乳法將茯苓多糖制備成茯苓多糖聚乳酸納米乳，所得納米乳懸液包封率高，而且便于藥物的吸收，可以使藥物緩慢地的釋放，有效地延長(zhǎng)藥效，具免疫增強(qiáng)作用，對(duì)抵抗疫病有重要意義。本發(fā)明作為一種新型中獸藥，沒(méi)有副作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種茯苓多糖聚乳酸納米乳及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，具體涉及一種茯苓多糖聚乳酸納米乳及其制備方法與應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 茯苓屬于食藥同用真菌，其有效成分主要有：多糖、生物堿、皂苷、萜類(lèi)、多酚類(lèi)等 物質(zhì)。真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體及其發(fā)酵液中分離出的代謝產(chǎn)物，是一類(lèi)由10個(gè)以 上的單糖以糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，具有特異的生物活性。茯苓多糖主要由 i3-(l-3)-D-葡聚糖組成，主要分布于茯苓的子實(shí)體、菌絲及其發(fā)酵液中。現(xiàn)代藥理研究表 明，茯苓多糖具有增強(qiáng)免疫功能的作用，可作為免疫增強(qiáng)劑，用于提高機(jī)體免疫力，主要表 現(xiàn)在免疫增強(qiáng)或免疫刺激，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分泌抗體，與多種多糖比較，茯苓多糖增強(qiáng)B細(xì)胞 產(chǎn)生抗體的能力最強(qiáng)。對(duì)茯苓多糖增強(qiáng)免疫的機(jī)制表明，茯苓多糖通過(guò)產(chǎn)生毒因子、釋放溶 酶體酶、與淋巴細(xì)胞協(xié)同破壞抗原和癌細(xì)胞、合成和釋放干擾素、消除組織變態(tài)等反應(yīng)完 成。然而，茯苓多糖分子量較大，藥物釋放太快，會(huì)導(dǎo)致藥量過(guò)大，副作用增強(qiáng)，不適用于臨 床。因此，解決這一問(wèn)題成為必要。
[0003] 聚乳酸是從上世紀(jì)90年代迅速發(fā)展起來(lái)的一種新的可生物降解高分子材料，通常 采用乳酸縮聚或丙交酯的開(kāi)環(huán)聚合來(lái)制備得到。聚乳酸具有良好的生物相容性，無(wú)毒、無(wú)刺 激性，在人體內(nèi)經(jīng)水解可生成乳酸單體，然后在乳酸脫氫酶的氧化下生成丙酮酸，并參與體 內(nèi)三羧酸循環(huán)，最終生成水和二氧化碳從人體排出。肽類(lèi)、蛋白類(lèi)、酶類(lèi)、疫苗等藥物，易被 胃腸道酸堿物質(zhì)和各種消化酶分解，臨床應(yīng)用只能采取腸道外給藥途徑。制成聚乳酸納米 乳可保護(hù)被包裹藥物不被破壞，加之適當(dāng)?shù)陌?，可有效控制納米粒的體內(nèi)降解。
[0004] 本發(fā)明首次利用復(fù)乳法制備茯苓多糖聚乳酸納米乳膠體懸液，對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu) 化，并體外刺激小鼠淋巴細(xì)胞增值，建立了茯苓多糖聚乳酸納米乳的制備方法，優(yōu)化了制備 條件，發(fā)現(xiàn)茯苓多糖聚乳酸納米乳能顯著提高茯苓多糖的免疫增強(qiáng)作用，提高其生物利用 度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種茯苓多糖聚乳酸納米乳，以解決現(xiàn)有技術(shù)存 在的臨床應(yīng)用中的各種限制問(wèn)題。
[0006] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述茯苓多糖聚乳酸納米乳的制備方法。
[0007] 本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述茯苓多糖聚乳酸納米乳的應(yīng)用。
[0008] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0009] -種制備茯苓多糖聚乳酸納米乳的方法，它包括如下步驟：
[0010] (1)將丙酮和聚乳酸混合后使用磁力攪拌器攪拌至完全溶解，得到油相;將茯苓多 糖溶于水后得到水相;一邊攪拌油相，一邊將水相逐滴滴加到油相中，直至形成穩(wěn)定的W/0 型初乳；
[0011] (2)將丙二醇嵌段聚醚F68溶于水后，從液面下緩慢加入步驟（1)中得到的W/0型初 乳，磁力攪拌形成穩(wěn)定的W/0/W型復(fù)乳;W/0/W型復(fù)乳經(jīng)減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑和離心去除 較大沉淀后，收集上清液，即得茯苓多糖聚乳酸納米乳。
[0012] 步驟⑴中，油相中，聚乳酸的濃度為10~lOOmg/mL，優(yōu)選30mg/mL。
[0013] 步驟⑴中，水相中，茯苓多糖的濃度為5~25mg/mL，優(yōu)選15mg/mL。
[0014]步驟(1)中，油相和內(nèi)水相的體積比為3~13:1，優(yōu)選10:1。
[0015] 步驟(2)中，丙二醇嵌段聚醚F68和溶解丙二醇嵌段聚醚F68所用水的固液比為1~ llmg：lmL〇
[0016]步驟(2)中，溶解丙二醇嵌段聚醚F68所用水和溶解聚乳酸所用丙酮的體積比為4 ~12:1〇
[0017]步驟(2)中，減壓蒸發(fā)的方法為:在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以55°C和lOOrpm的條件進(jìn)行減壓 蒸發(fā)。
[0018] 步驟(2)中，離心的方法為3500rpm離心8min。
[0019] 上述制備方法中的任意一項(xiàng)制備得到的茯苓多糖聚乳酸納米乳也在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。
[0020] 上述茯苓多糖聚乳酸納米乳在制備免疫增強(qiáng)藥物中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
[0021] 按此方法制備的茯苓多糖聚乳酸納米乳，包封率高達(dá)59.09%。得到茯苓多糖聚乳 酸納米乳后，利用馬爾文粒度分析儀對(duì)茯苓多糖聚乳酸納米乳的粒徑、多分散系數(shù)(PDI)及 表面電勢(shì)進(jìn)行了分析，并通過(guò)透射電鏡對(duì)茯苓多糖聚乳酸納米乳的表面形態(tài)進(jìn)行了研究， 發(fā)現(xiàn)茯苓多糖聚乳酸納米乳呈現(xiàn)均一的納米分散體系。
[0022] 體外將茯苓多糖以及茯苓多糖聚乳酸納米乳以一定濃度重懸，用透析袋模擬體內(nèi) 半透膜，探究?jī)烧叩尼尫乓?guī)律。發(fā)現(xiàn)茯苓多糖被聚乳酸包裹后，明顯減緩了藥物的釋放。說(shuō) 明聚乳酸有緩釋效果。
[0023]體外探究茯苓多糖聚乳酸納米乳對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的最大安全濃度，在安全濃度下 刺激淋巴細(xì)胞增值。發(fā)現(xiàn)與其他空白組相比，載藥納米乳組在不同濃度下均能顯著刺激淋 巴細(xì)胞增值。表明了其具有較好的免疫增強(qiáng)功能，對(duì)提高動(dòng)物機(jī)體的免疫功能，防治疾病具 有重要應(yīng)用價(jià)值。
[0024] 有益效果
[0025] 動(dòng)物疫病主要靠疫苗來(lái)預(yù)防，但是很多疫苗存在免疫原性較弱等缺點(diǎn)，需要免疫 增強(qiáng)劑輔助才能產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫應(yīng)答。現(xiàn)有的常用免疫增強(qiáng)劑如油佐劑、鋁膠佐劑等常存 在刺激性強(qiáng)、有殘留等缺點(diǎn)。由于中藥具有綠色安全的特點(diǎn)，從中藥中開(kāi)發(fā)免疫增強(qiáng)劑已成 為熱點(diǎn)。
[0026] 茯苓多糖是茯苓中所含的主要有效成分之一，具有抗腫瘤，增強(qiáng)巨嗜細(xì)胞和T淋巴 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，增強(qiáng)細(xì)胞的免疫反應(yīng)等廣泛的生物學(xué)功能和藥理學(xué)作用。然而，茯苓多 糖作為一種免疫增強(qiáng)劑直接用于獸醫(yī)臨床，存在著分子量較大、藥物釋放太快，藥量過(guò)大， 副作用增強(qiáng)、生物利用度低等問(wèn)題，免疫增強(qiáng)作用相對(duì)較弱，從而限制了臨床應(yīng)用。利用聚 乳酸包封茯苓多糖，不僅可以防止茯苓多糖不穩(wěn)定，解決用藥量大等問(wèn)題，而且可以有效維 持茯苓多糖在機(jī)體內(nèi)的有效濃度，提高其生物利用度。
[0027] 本發(fā)明采用復(fù)乳法將茯苓多糖制備成茯苓多糖聚乳酸納米乳，所得納米乳懸液包 封率高，而且便于藥物的吸收，可以使藥物緩慢地的釋放，有效地延長(zhǎng)藥效，具免疫增強(qiáng)作 用，對(duì)抵抗疫病有重要意義。本發(fā)明作為一種新型中獸藥，沒(méi)有副作用。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)如下：
[0029] 1.茯苓多糖聚乳酸納米乳的制備國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道，本發(fā)明提供了一種茯苓多糖聚 乳酸納米乳的制備方法及其優(yōu)化的條件，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外研究的空白。
[0030] 2.茯苓多糖聚乳酸納米乳的免疫增強(qiáng)活性未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)本發(fā)明的實(shí)施，證明茯 苓多糖通過(guò)制備成茯苓多糖聚乳酸納米乳后能夠顯著提高其免疫增強(qiáng)活性，表現(xiàn)為體外刺 激小鼠淋巴細(xì)胞增值，與茯苓多糖相比，具有較強(qiáng)的緩釋作用，從而長(zhǎng)時(shí)間增強(qiáng)動(dòng)物免疫功 能。因此，茯苓多糖聚乳酸納米乳可以作為研制新型免疫增強(qiáng)劑的材料，為研制新型免疫 增強(qiáng)劑提供了材料和示范。
【附圖說(shuō)明】
[0031 ]圖1A為空白聚乳酸納米乳的透射電鏡圖；
[0032] 圖1B為茯苓多糖聚乳酸納米乳的透射電鏡圖；
[0033] 圖2為茯苓多糖聚乳酸納米乳和空白聚乳酸納米乳的體外藥物釋放對(duì)比圖。
[0034]圖3為藥物單獨(dú)刺激淋巴細(xì)胞增殖的條件下，淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)比圖；
[0035]圖4為藥物協(xié)同LPS作用對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的條件下，淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)比圖；
[0036]圖5為藥物協(xié)同PHA作用對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的條件下，淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0038]實(shí)施例1茯苓多糖聚乳酸納米乳的制備
[0039] 精確稱(chēng)取10ml丙酮和300mg聚乳酸于10ml EP管中，使用磁力攪拌器形成油相;精 確稱(chēng)取15mg的茯苓多糖，溶于lml去離子水，形成水相。一邊攪拌油相，一邊將水相逐滴滴加 到油相中，直至形成穩(wěn)定的W/0型初乳；另精確稱(chēng)取360mgF68溶于110ml去離子水中，一邊攪 拌F68溶液，一邊將初乳用移液槍緩慢打入液面下，磁力攪拌1.5h，形成穩(wěn)定的W/0/W型復(fù) 乳;于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上55 °C lOOrpm減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑;使用3500轉(zhuǎn)8min離心去除較大沉 淀，收集上清，即得包裹茯苓多糖的聚乳酸納米乳。
[0040] 制備空白聚乳酸納米乳的方法同上，所不同的是，內(nèi)水相中不添加茯苓多糖。
[0041] 在單一因素考察的基礎(chǔ)上，確定影響茯苓多糖聚乳酸納米乳包封率的3個(gè)主要影 響因素，即F68濃度(mg/ml)、聚乳酸濃度(mg/ml)和聚乳酸和茯苓多糖比值(o/wl)3個(gè)因素， 以此3個(gè)因素為自變量，每個(gè)因素又選擇3個(gè)水平，以包封率為響應(yīng)值，做3因素3水平共17個(gè) 試驗(yàn)點(diǎn)（5個(gè)中心點(diǎn)）二次回歸正交組合試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。
[0042] 對(duì)表1中試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，經(jīng)過(guò)二次回歸擬合后，得到茯苓多糖聚乳酸納 米乳的包封率對(duì)F68濃度(mg/ml)、聚乳酸濃度(mg/ml)和聚乳酸和茯苳多糖比值(o/wi)的 二次多項(xiàng)回歸方程為：Y = +53 · 62+5 · 45Xi-2 · 47X2+1 · 47X3+4 · 70ΧιΧ2+2 · 40ΧιΧ3-3 · 45X2X3- 7.69Xi2+1.42X22-4.24X3 2
[0043] 表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果
[0044]
[0045] 利用Design expert 7.0軟件對(duì)表1的結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸擬合，對(duì)模型進(jìn)行方 差分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，模型P<0.0001，表示模型極顯著;說(shuō)明該模型成立，本實(shí)驗(yàn) 方法可靠。失擬項(xiàng)P = 0.0845>0.05,不顯著，表明回歸方程無(wú)失擬因素存在，回歸式擬合的 較好。進(jìn)一步說(shuō)明在試驗(yàn)范圍內(nèi)可以用來(lái)解釋和預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。模型中的A、B、C、AB、AC、BC 的"P"值均小于0.05,說(shuō)明其對(duì)茯苓多糖聚乳酸納米乳包封率有顯著影響；相關(guān)性R2 = 0.9862，校正決定系數(shù)RAdj2 = 0.9685，僅有約2%的茯苓多糖聚乳酸納米乳包封率總變異 不能由此模型進(jìn)行解釋。綜上表明，此模型擬合度好。
[0046] 表2響應(yīng)面模型方差分析表
[0047]
[0048] 通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化得到制備茯苓多糖聚乳酸納米乳的最佳制備條件為:F68 濃度為3.3mg/ml，聚乳酸濃度為30mg/ml，聚乳酸與茯苓多糖比值為10.25:1，所得茯苓多糖 聚乳酸納米乳的包封率高達(dá)59.09%。
[0049] 實(shí)施例2茯苓多糖聚乳酸納米乳的表征
[0050] (1)粒徑電位檢測(cè)及透射電鏡觀察
[0051]分別取實(shí)施例1中制備得到的茯苓多糖聚乳酸納米乳和空白聚乳酸納米乳，使用 馬爾文粒徑分析儀分析兩種納米粒的粒徑和電勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)表3。
[0052] 表面形態(tài)使用透射電鏡分析，結(jié)果見(jiàn)圖1A和圖1B。
[0053] 表 3
[0054]
[0056]由表格可以看出，茯苓多糖聚乳酸納米乳和空白聚乳酸納米乳大小相差不大，在 245nm左右，PDI值較小，表明粒徑分散較集中，電勢(shì)均為負(fù)值。
[0057]由透射電鏡圖可以看出，茯苓多糖聚乳酸納米乳和空白聚乳酸納米乳均呈現(xiàn)較均 勻分布，粒子呈現(xiàn)圓形，表面光滑。電鏡及粒徑、電勢(shì)分析表明茯苓多糖聚乳酸納米乳具有 優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)。
[0058] (2)體外藥物釋放
[0059]選擇PBS(PH= 7.4)作為釋放介質(zhì)，其中包含0.1 %吐溫80，其作用是增加納米乳在 PBS中的溶解度。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，凍干后的粒子分別稱(chēng)重后在lml釋放介質(zhì)中重懸，加入透析袋 中。然后將透析袋兩頭封緊，放進(jìn)裝有30ml釋放介質(zhì)的錐形瓶中。將錐形瓶放入搖床中，37 °C，lOOrpm，模擬體液環(huán)境。選擇特定時(shí)間間隔（2，4，6，8，10，12，24，48，72，96h)，取0 · 5ml釋 放介質(zhì)于1.5mlEP管中，并加入等量新的釋放介質(zhì)于錐形瓶中。EP管中樣品茯苓多糖的含量 使用紫外分光光度計(jì)定量分析。
[0060]如圖2所示，茯苓多糖聚乳酸納米乳在前12小時(shí)出現(xiàn)突釋現(xiàn)象，然后以一個(gè)較平 緩、持續(xù)的速率釋放，最后96小時(shí)，藥物釋放達(dá)到頂峰;茯苓多糖在前10個(gè)小時(shí)基本釋放完 畢。這個(gè)現(xiàn)象表明包裹在聚乳酸中的茯苓多糖體外釋放藥物要比多糖本身單獨(dú)釋放緩慢的 多，這是茯苓多糖聚乳酸納米乳的緩釋作用，由于納米粒最外層穩(wěn)定劑具有保護(hù)作用。
[0061 ]實(shí)施例3茯苓多糖聚乳酸納米乳體外免疫增強(qiáng)活性比較 [0062]以實(shí)施例1中制備得到的茯苓多糖聚乳酸納米乳(PHYP)為研究對(duì)象，以茯苓多糖 (PHY)和實(shí)施例1中制備得到的空白聚乳酸納米乳(PLA)作為對(duì)照，探索其體外對(duì)小鼠淋巴 細(xì)胞的增值影響。
[0063] (1)脾臟淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備
[0064]用頸椎脫臼法處死小鼠，75%乙醇浸泡3-5min。在超凈臺(tái)內(nèi)，將小鼠置于一平皿 中，左側(cè)面朝上，在最后一根肋骨處打開(kāi)皮膚和腹腔，小心取出脾臟，將脾移入200目鋼篩。 用剪刀和鑷子將脾臟破碎，加入少許，用玻璃注射器套心輕輕研磨脾臟，邊研邊加 PBS (加5mL左右即可），使細(xì)胞懸液流入平皿中。將細(xì)胞懸液混勻后加入10mL離心管中，以 1500r · min-1離心8min，棄上清，加入適量紅細(xì)胞裂解液，靜置3min，以1500r · min-1離心 8min，沉淀經(jīng)PBS反復(fù)洗滌2次。用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至5.ΟΧΙΟ 6個(gè)· ml/1。
[0065] (2)最大安全濃度的測(cè)定
[0066] 用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液分別將PHYP和PHY自lmg · mL-1倍比稀釋至11個(gè)濃度。在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入各濃度的PHYP和PHY，每孔100yL，每個(gè)濃度重復(fù)4孔，同時(shí)加入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液設(shè)細(xì)胞對(duì)照組，按2.1.1所制得的淋巴細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)板除空白調(diào) 零孔外其余孔中，每孔1 〇〇yL。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 °C、5 %C02條件下連續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔 加入30yL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入DMS0 100yL裂解細(xì)胞，微量震蕩器震蕩5min，待沉淀完全 溶解，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀中測(cè)定570nm波長(zhǎng)處的吸光值(A57〇值hPHYP和PHY組的A 57〇值顯著高 于細(xì)胞對(duì)照組時(shí)，表示PHYP和PHY促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)顯著。選擇A57〇值不顯著低于細(xì)胞對(duì)照組時(shí) 的PHYP和PHY的最大濃度作為它們的最大安全濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。
[0067] 表 4
[0068]
[0069] 由表可見(jiàn)，PHYP濃度在1000-125yg · mL-1時(shí)的A57〇值顯著小于細(xì)胞對(duì)照(P〈〇.〇5)， 濃度62.5yg · mL-1至0.977yg · mL-1與細(xì)胞對(duì)照差異均不顯著（Ρ>0·05)，且濃度為3·906μ g · ml/11時(shí)A57Q值高于對(duì)照組，說(shuō)明在此濃度，ΡΗΥΡ促進(jìn)淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)。PHY在lOOOyg · ml/1 至250yg · mL-1的A57〇值顯著小于細(xì)胞對(duì)照(P〈0.05)，在濃度125yg · mL-1至1.953yg · mL-1與 細(xì)胞對(duì)照差異均不顯著(P>〇.〇5)，且濃度為125yg · mL-1到1.953yg · mL-1時(shí)A57Q值均高于對(duì) 照組，說(shuō)明在此濃度范圍內(nèi)，PHY促進(jìn)淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)。PHYP在62.5yg · mL-1時(shí)的A57Q值不顯 著小于細(xì)胞對(duì)照組（P>〇.〇5)，PHY在125yg · ml/1時(shí)的A57〇值不顯著小于細(xì)胞對(duì)照組（P> 0.05)。因此，將62.5yg · ml/1和125yg · ml/1分別定為PHYP和PHY的最大安全濃度。
[0070] (3)淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定
[0071]淋巴細(xì)胞制備同上，將細(xì)胞懸液加到96孔細(xì)胞板中，每孔80yL，每個(gè)樣品重復(fù)12個(gè) 孔，每孔l〇〇yL，其中4個(gè)孔每孔加 PHA(20yg · mL-iUOuL，另外4個(gè)孔每孔加 LPS(10yg · mL-1) 20uL，剩余4個(gè)孔每孔加 RPMI-1640(不含小牛血清)20yL。用PHA刺激T淋巴細(xì)胞增殖，LPS刺 激B淋巴細(xì)胞增殖。37 °C、5 % C〇2條件下培養(yǎng)44h后，每孔加入30yL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h。將每孔 中的上清棄去，加入l〇〇yL DMS0，在微量振蕩器上振蕩5min左右使沉淀完全溶解。用酶聯(lián)免 疫儀檢測(cè)570nm波長(zhǎng)處的吸光值(A57〇) 〇
[0072] 在藥物單獨(dú)刺激淋巴細(xì)胞增殖的情況下，由圖3可知，PHYP組在3.906-62.5yg · mL-1濃度的A57〇值均顯著高于PHY、PLA以及BL組(P〈0.05) ;PHY組在3.906-62.5yg · mL-1濃度 的A57Q值均顯著高于PLA組和BL組(P〈0.05);表明這些濃度下刺激淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)。PLA組與對(duì) 照組的差異不明顯。
[0073]在藥物協(xié)同LPS作用對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的情況下，如圖4所示，在濃度為3.906-62.5μ g · ml/1時(shí)，ΡΗΥΡ組的A57Q值均為最高，并且均顯著高于PHY、PLA、LPS對(duì)照組以及BL對(duì)照組(Ρ〈 Ο · 05); PHY組在3 · 906-62 · 5yg · mL-1 時(shí)的A57Q值均顯著高于LPS組（P>0 · 05)，且在3 · 906、 7.813以及62.5yg · ml/1均顯著高于PLA組。表明它們?cè)谶@些濃度均能協(xié)同LPS促進(jìn)淋巴細(xì)胞 增殖，并且PHYP協(xié)同LPS作用促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的效果在適合濃度下強(qiáng)于PHY。
[0074]在藥物協(xié)同PHA刺激時(shí)淋巴細(xì)胞增殖的情況下，如圖5所示，濃度范圍在3.906_ 62.5yg · mL-1時(shí)，PHYP組的A57〇值均為最高，并且均顯著高于PHA對(duì)照組及細(xì)胞對(duì)照組(P〈 0 · 05)，且在3 · 906、7 · 813和62 · 5yg · mL-1 時(shí)顯著高于PHY組(P〈0 · 05) ;PHY組在3 ·906-31 · 25μ g · mL-1時(shí)的A57Q值均顯著高于PLA組(Ρ〈0·05)，在3.906_62.5yg · mL-1時(shí)的A57Q值均顯著高 于PHA組(P〈0.05) ;PLA在濃度范圍15.625-62.5yg · mL-1時(shí)的A57Q值均顯著高于PHA組;而PHA 組均顯著高于BL空白對(duì)照組(P〈0.05)。表明PHYP、PHY和PLA在這些濃度時(shí)，能協(xié)同PHA促進(jìn) 淋巴細(xì)胞的增殖，并且PHYP協(xié)同PHA作用促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的效果強(qiáng)于PHY和PLA，且顯效范 圍大。
[0075]根據(jù)上述體外刺激淋巴細(xì)胞增值試驗(yàn)結(jié)果可以得出茯苓多糖聚乳酸納米乳能夠 單獨(dú)和協(xié)同PHA、LPS分別刺激T、B淋巴細(xì)胞增值，結(jié)果顯示所有濃度組均顯著比對(duì)照組高。 說(shuō)明本發(fā)明涉及的茯苓多糖聚乳酸納米乳能夠提高機(jī)體免疫功能，可用于提高動(dòng)物機(jī)體免 疫功能以達(dá)到抵抗疾病的目的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備茯苓多糖聚乳酸納米乳的方法，其特征在于，它包括如下步驟： (1) 將丙酮和聚乳酸混合后攪拌，得到油相;將茯苓多糖溶于水后得到水相;將水相加 入油相中，攪拌形成穩(wěn)定的W/0型初乳； (2) 將丙二醇嵌段聚醚F68溶于水后，加入步驟（1)中得到的W/0型初乳，攪拌形成穩(wěn)定 的W/0/W型復(fù)乳;W/0/W型復(fù)乳經(jīng)減壓蒸發(fā)和離心后收集上清液，即得茯苓多糖聚乳酸納米 乳。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，油相中，聚乳酸的濃度為 10~100mg/mL。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，水相中，茯苓多糖的濃度 為5~25mg/mL〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，油相和內(nèi)水相的體積比為 3 ~13:1〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，丙二醇嵌段聚醚F68和溶 解丙二醇嵌段聚醚F68所用水的固液比為1~1 lmg: lmL。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，溶解丙二醇嵌段聚醚F68所用水和溶 解聚乳酸所用丙酮的體積比為4~12:1。7. 權(quán)利要求1~6中任意一項(xiàng)制備得到的茯苓多糖聚乳酸納米乳。8. 權(quán)利要求7所述的茯苓多糖聚乳酸納米乳在制備免疫增強(qiáng)藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/715GK105997870SQ201610473811
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】王德云, 鄭思思, 伯若楠, 羅莉, 胡元亮, 劉家國(guó)
【申請(qǐng)人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)