一種茯苓多糖、其制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種茯苓多糖、其制備方法及用途。具體 地，本發(fā)明還涉及一種藥物組合物以及所述茯苓多糖用于制備疫苗佐劑、疫苗組合物或抗 體的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 獲考:（Poria)為非裙菌目（Aphyllophorales)、多孔菌科（Polyporaceae)、獲茶屬 (Poria)、真菌獲茶（Poria cocos) (Schw. )Wolf.的干燥菌核，具有利水滲濕、健脾、寧心之 功效（中國(guó)藥典，2010版，p224)。近年來(lái)與本發(fā)明領(lǐng)域相關(guān)的研究和報(bào)道歸納如下：
[0003] 余建國(guó)等（余建國(guó)，等.中國(guó)獸醫(yī)科技，2004,34(11) :70-74)給1日齡的雛雞腹 腔注射馬立克氏病病毒（MDV)強(qiáng)毒株（0.2mL/只），并從當(dāng)日開(kāi)始給試驗(yàn)組雛雞以1、2和 3mg/只的劑量連續(xù)肌肉注射茯苓多糖1周。結(jié)果表明3個(gè)劑量茯苓多糖均可顯著提高雛雞 的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、NK細(xì)胞活性及ΜΦ活性。
[0004] 張志軍等（張志軍，等.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2013, 29:1213-1216)將含60%茯苓多 糖混合物（還含有三萜類化合物、乙酰茯苓酸、茯苓酸、膽堿，3β-羥基羊毛留三烯酸，葡萄 糖、腺嘌呤、組氨酸等，未提及制備方法）按〇. 4、0. 8和1. 6mg/鼠的劑量灌胃給予小鼠一 周。發(fā)現(xiàn)小鼠血清中IgA、IgG和IgM水平高于生理鹽水對(duì)照組，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。
[0005] 謝國(guó)秀等（謝國(guó)秀，等.生命科學(xué)研究，2009, 13 (3) :246-248)將不同劑量 (200μg或1000μg)的茯苓多糖分別與低劑量（0. 015μg)或高劑量（1. 5μg)流感病毒 (A/PR/8)滅活疫苗共同免疫小鼠。一次免疫后3周收集血清，檢測(cè)血清中IgG、IgGl和 IgG2a的抗體水平，并用致死量（40XLD50)流感病毒（A/PR/8)攻擊小鼠。結(jié)果表明茯苓多 糖能增加血清抗體水平，提高小鼠抗致死量流感病毒攻擊的能力，其免疫增強(qiáng)效果與氫氧 化鋁相當(dāng)。
[0006] 王青等（王青，等.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(13) :127-130)觀察茯苓多糖 對(duì)卵清白蛋白（0VA)誘導(dǎo)的小鼠腸道黏膜免疫應(yīng)答的影響。茯苓多糖每天按200mg/kg劑 量灌胃給藥小鼠，1周后1次性灌胃抗原〇VA5mg，對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，分別于免疫后1，2,3周， 收集小鼠糞便樣本，ELISA檢測(cè)小鼠糞便0VA特異性分泌型免疫球蛋白A (slgA)。結(jié)果表明 茯苓多糖對(duì)腸道slgA分泌具有促進(jìn)作用，這與其活化淋巴結(jié)B淋巴細(xì)胞有關(guān)。
[0007]Lee等（Lee等.和漢醫(yī)藥學(xué)雜志，1999,16 (526) :175-182)在肺炎球菌gV型多糖 類蛋白質(zhì)結(jié)合抗原接種小鼠前，預(yù)先注射當(dāng)歸多糖和茯苓多糖〇. 2-1.Omg。結(jié)果表明較未 用多糖組gvPSIgG與IgM生成明顯增加。中藥多糖組小鼠用有毒力的19F型肺炎球菌攻擊 后，血中的細(xì)菌迅速清除。用gV型肺炎球菌多糖類蛋白質(zhì)結(jié)合抗原免疫小鼠的脾細(xì)胞與中 藥多糖共育后，TNF-a的生成較對(duì)照組高4. 0-5. 5倍，IL-2高15-39倍，IL-4高4. 6 - 64 倍。茯苓多糖還誘導(dǎo)IFN-γ生成增加。
[0008]Lee等（Lee,etal.InternationalImmunopharmacology, 2004,4:1029-1038)米 用1%碳酸鈉提取茯苓，獲得水提物。水提物經(jīng)過(guò)乙醇沉淀、DEAE-纖維素和S印hadexG-50 柱層析，獲得一個(gè)分子量為8000Da的糖肽（PCSC)，PCSC中糖與肽的百分比為78 :22。糖部 分含有甘露糖（92% )、半乳糖為6. 2%，阿拉伯糖為1. 3%。肽部分主要含有天冬氨酸、絲 氨酸和纈氨酸。PCSC能顯著活化RAW264. 7巨噬細(xì)胞，活化NF-κB/Rel和NO的分泌。
[0009]Chen等（Chen,etal.FoodandChemicalToxicology, 2004, 42:759-769)從獲茶 中分離得到1個(gè)中性多糖組分（PC-PS)，分子量為160000Da。PC-PS能抑制人白血病U937 細(xì)胞和HL-60的增殖和分化，能提高TFN-α和IFN-γ的分泌。
[0010] 歸納以上研究結(jié)果，可以看出茯苓多糖能提高受藥動(dòng)物的體液免疫和細(xì)胞免疫能 力，但未明確闡明使用的茯苓多糖的具體制備方法和理化性質(zhì)。
[0011] 不同的制備方法所獲得的茯苓多糖具有本質(zhì)差別，理化性質(zhì)往往存在截然不同的 區(qū)別，生物學(xué)活性亦不相同。
[0012] 目前，尚需要制備新的茯苓多糖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，得到了一種茯苓多糖。本發(fā)明人驚奇 地發(fā)現(xiàn)，所述茯苓多糖具有良好的疫苗佐劑作用。由此提供了下述發(fā)明：
[0014] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種茯苓多糖，其中，組成該茯苓多糖的單糖包括巖藻糖、 甘露糖、葡萄糖和半乳糖。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組成該茯苓多糖的單糖為巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和 半乳糖。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的茯苓多糖，其中，巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖之間 的摩爾比依次為 1 : (1 - 2) : (0· 3 - 4) : (2 - 3. 5);具體地，為 1 : (1 -L5) : (0· 5 - 3. 5): (2 - 3. 5);更具體地，為 1 : (1. 3 - 1. 5) : (0· 5 - 1. 8) : (2. 6 - 3)。
[0017] 在本發(fā)明的具體的實(shí)施方式中，藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖之間的摩爾比依次 分別如表2中的摩爾比所示。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的茯苓多糖，其中，按照葡萄糖計(jì)算，其含糖量為20% - 80%、20% - 60%、20% - 40%、40% - 80%、40% - 60%、20%、40%、60% 或 80%。
[0019] 在本發(fā)明的具體的實(shí)施方式中，按照葡萄糖計(jì)算，茯苓多糖的含糖量分別如表1 所示。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的獲茶多糖，其分子量在IXl〇4Da- 8X105Da之間。具體 地，該分子量范圍是不連續(xù)的。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的茯苓多糖，其包含如下兩個(gè)多糖組分：
[0022] 組分 1 (PCP-1):分子量范圍為 1X104Da- 8X104Da;
[0023]組分 2 (PCP-2):分子量范圍 2X105Da- 8X105Da;
[0024] 具體地，組分1的峰商分子量為2. 71X104Da;組分2的峰商分子量為 6. 47X105Da。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)附圖1和附圖2。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的茯苓多糖，其大分子成分僅由組分1和組分2組成。具 體地，所述大分子成分為分子量3IXl〇4Da的成分。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的茯苓多糖，其僅由組分1和組分2組成。
[0027] 上述任一項(xiàng)所述的茯苓多糖，其亦可稱為茯苓總多糖或者茯苓提取物；其可由下 面任一項(xiàng)所述的制備方法制得。
[0028] 本發(fā)明的另一方面涉及一種制備茯苓多糖的方法，包括下述步驟：
[0029] 1)將茯苓藥材用水進(jìn)行浸提，得到水提液；
[0030] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提取溫度為50 - 60°C，浸提時(shí)間為5小時(shí)，提取2 次。
[0031] 2)將步驟1)中得到的水提液在50°C-60°C下減壓濃縮，濃縮液加入乙醇進(jìn)行沉 淀，得到沉淀物；
[0032] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，茯苓水提濃縮液加入3倍體積的乙醇，醇沉?xí)r間為 72小時(shí)。
[0033] 3)將步驟2)中得到的沉淀物加水溶解，溶解液進(jìn)行透析或超濾；
[0034] 4)將步驟3)中透析所得的袋內(nèi)透析液或者超濾截留液在50°C- 60°C下減壓濃 縮，得到濃縮液；
[0035] 5)將步驟4)中得到的濃縮液進(jìn)行冷凍干燥或噴霧干燥，得到茯苓多糖。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于如下的（1) 一（14)項(xiàng)中的任意一