專利名稱：新的紫杉烷衍生物及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的紫杉烷衍生物及其制備方法，以及含有該化合物的藥物組合物和用于在制備抗惡性腫瘤藥物中應(yīng)用；還涉及在制備治療多藥耐藥腫瘤的藥物和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
癌癥是嚴重危害人類的重大疾病之一。約有半數(shù)的經(jīng)早期診斷的癌癥患者能夠得到手術(shù)或放射治療。而有相當(dāng)數(shù)量的癌癥及轉(zhuǎn)移癌必需進行化學(xué)治療。腫瘤化療近年來有了很大進展，能有效地治療多種癌癥，例如白血病，惡性淋巴瘤，惡性肉瘤等，能有效地延長某些癌癥患者的生存期。臨床常用的化療藥物有長春生物鹼如長春新堿(Vincristine，VCR)，阿霉素類如doxorubicin，順鉑，鬼臼毒素(etoposide)，紫杉醇(taxol)等(Ojima，Bounaud PY，Bernacki RJ.治療多藥耐藥腫瘤紫杉烷類化合物的設(shè)計，現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)雜志，1999，5/645(Designing taxanes to treat multidrug-resistant tumors.Modern Drug Discovery.1999，May/June45))。
目前雖有近50種抗癌藥在供臨床應(yīng)用，但對每一種腫瘤而言，僅有少數(shù)藥對它有效，原因在于腫瘤細胞各自的特性及耐藥性。腫瘤化療最大的問題是，易使癌細胞產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療的失敗。近年的研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生耐藥性的機制有多種；腫瘤細胞對某一化療藥物產(chǎn)生耐藥后，對其它化學(xué)結(jié)構(gòu)及機理不同的化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥，稱“多藥耐藥”(multi-drug-resistance，MDR)。當(dāng)癌細胞產(chǎn)生強耐藥性后，如增加藥量繼續(xù)化療，不僅療效未能改善，且因藥量加大而產(chǎn)生更大的毒副作用。這是許多癌癥患者不能得治的重要原因(Cao LP，Duchrow M，Windhovel U，Kujath P，Bruch HP，Broll R.編碼P-糖蛋白基因MDR1mRNA在福爾馬林固定的、石蠟包埋的膀胱癌組織中的表達，歐洲癌癥雜志，1998，34(10)1612(Expession of MDR1 mRNA and encoding P-glycoprotein inarchival formalin-fixed paraffin-embedded gall bladder cancer tissues.Eur J Cancer，1998，34(10)1612))。
現(xiàn)有研究資料表明，腫瘤細胞產(chǎn)生MDR的原因有多種，其中腫瘤細胞某些膜蛋白的過多表達是產(chǎn)生MDR的主要原因。與MDR有關(guān)的膜蛋白，即多藥耐藥蛋白目前已發(fā)現(xiàn)有3種P-糖蛋白(P-glycoprotein，p-gp，PG-170)、多藥耐藥蛋白(multidrug resistance protein，MRP-190)和肺耐藥蛋白(lung resistanceprotein，LRP)(Ling，Vancouver.P-糖蛋白在耐藥中的作用，美國醫(yī)學(xué)雜志，1995，99(增刊6A)31s(P-GlycoproteinIts role in drug resistance.TheAmerican Journal of Medicine，1995，99(suppl 6A)31s))。DNA拓撲異構(gòu)酶II在質(zhì)和量上的改變也是腫瘤細胞對某些藥物產(chǎn)生MDR的主要原因，DNA拓撲異構(gòu)酶II是一種核酶，是蒽環(huán)類抗生素和表鬼臼毒素等抗癌抗生素的共同作用靶部位(Nooter K，Stoter G.多藥耐藥腫瘤化療的分子機理，應(yīng)用病理學(xué)研究，1996，192(7)798(Molecular mechanisms of muktidrug resistance in cancer chemotherapy.Pathol Res Pract，1996，192(7)768))。谷胱甘肽是體內(nèi)的一個重要活性物質(zhì)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的過多表達及還原型谷胱甘肽(GSH)量的改變也與MDR的產(chǎn)生有關(guān)(O’Brien ML，Tew KD.多藥耐藥過程？中的谷光苷肽及其相關(guān)酶，歐洲癌癥雜志，1996，32A(6)967(Glutahtione and related enzymes in multidrug resistance.Eur J Cancer，1996，32A(6)967))。蛋白激酶(PKC)及其異構(gòu)酶的改變也可引起MDR現(xiàn)象，有研究發(fā)現(xiàn)PKC能夠調(diào)節(jié)MDR，許多PKC抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)MDR現(xiàn)象。另外有報道MDR與一些與凋亡抑制相關(guān)的癌基因(如bcl-2，bcr/abl，NF-kB等)的表達產(chǎn)物可阻斷或阻礙多種因素(如化療藥物、輻射、激素等)誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞的凋亡(apoptosis)(Gleave ME，Miayake H，GoldieJ，Nelson C，Tolcher A.針對bcl-2基因利用反義bcl-2寡脫氧核酸延緩前列腺癌雄性激素依賴性發(fā)展及增加其化學(xué)敏感性，泌尿?qū)W雜志，1999，54(增刊，6A)36(Targeting bcl-2 gene to delay androgen-independenct progression and enhancechemosensitivity in prostate cancer using antisense bcl-2 oligodeoxynucleotides.Urology，1999，54(suppl.6A)36)；Koty PP，Zhang H，Levitt ML.反義bcl-2促進非小細胞肺癌細胞株的程序性死亡，肺癌雜志，1999，23115(Antisense bcl-2treatment increases programmed cell death in non-small cell lung cancer cell lines.Lung Cancer，1999，23115))。
其中，pgp及上述耐藥相關(guān)蛋白的過度表達是引起MDR的主要原因，因而、以它們?yōu)榘悬c，設(shè)計合成耐藥相關(guān)蛋白抑制劑，是研究逆轉(zhuǎn)MDR的藥物的一個重要策略。
目前正在研究中的作用于pgp的MDR逆轉(zhuǎn)劑有(1)鈣通道阻斷劑(calciumchannel blocker)，主要有Verapamil及其衍生物等，在mdrl翻譯水平抑制pgp合成及其活性；(2)鈣調(diào)蛋白拮抗劑(calmodulin antagonists)，包括Chlorpromazine等吩噻嗪類衍生物，已進入臨床試驗(3)環(huán)孢菌素類，環(huán)孢菌素A(Cyclosporine A)及其結(jié)構(gòu)類似物PSC833，SDZ280-466等，阻斷P-glycoprotein，能改變抗癌藥物的藥代動力學(xué)(4)喹啉類Quinidine等，已進入臨床試驗；(5)抗雌激素類化合物。其它MDR逆轉(zhuǎn)劑有(1)反義核酸與核酶針對mdrl的反義核酸或核酶，破壞腫瘤細胞pgp mRNA的表達；(2)細胞因子TNF-α；(3)GSH耗竭劑Vitamin K3，BSO(丁硫氨酸亞砜胺)；(4)蛋白藥物交聯(lián)劑等。
此外，據(jù)報道紫杉烷類化合物Taxinine及其衍生物具有很好的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥癌細胞的活性(Hosoyama H，Shigemori H，Tomida A，Tsuruo T，Kobayashi J.taxinine衍生物對多藥耐藥腫瘤細胞株的調(diào)節(jié)，生物有機與藥物化學(xué)通訊，1999，9389(Modulationof multidrug resistance in tumor cells bv taxinine derivatives.Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，1999，9389))，紫杉醇衍生物ICD5109具有很好的抗多藥耐藥癌的活性(Polizzi D，Praresi G，Tortoreto M，Supino R，RivaR，Bombardelli E，Zunino F.一種對人移植腫瘤有更強耐受性及治療活性的紫杉烷類化合物，癌癥研究，1999，591036(A novel taxane with improved tolerabilityand therapeutic activity in a panel of human tumor xenografts.Cancer Research，1999，591036))，目前還未見到它們臨床試用的報道。
比較理想的MDR逆轉(zhuǎn)劑一般要求劑量有一定的耐受性，能夠重復(fù)給藥以保持所需的藥物濃度，能完全逆轉(zhuǎn)MDR且副作用較小。上述Verapamil，Cyclosporine A和Quinidine等，由于用為逆轉(zhuǎn)MDR藥物時出現(xiàn)的毒副作用，實際上未能在臨床化療中應(yīng)用；其它報道過的藥物尚處于研究階段。因此開發(fā)新型的治療惡性腫瘤的藥物，尤其是開發(fā)療效好，副作用小的治療多藥耐藥腫瘤的藥物和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥腫瘤的藥物是非常必要的。
本發(fā)明的目的在于提供一種新的化合物及其衍生物，它可以成為治療惡性腫瘤的藥物，尤其是療效優(yōu)良，副作用小的治療多藥耐藥腫瘤的藥物和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥腫瘤的藥物；本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備本發(fā)明所述化合物的方法；
本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有本發(fā)明所述化合物的藥用組合物。
為了完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明人經(jīng)過研究現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)下面通式(I)的新的紫杉烷化合物，其具有殺傷惡性腫瘤細胞的活性，殺傷多藥耐藥腫瘤細胞的活性和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥腫瘤細胞的耐藥性的活性，因而可以開發(fā)作為治療惡性腫瘤的藥物，尤其是開發(fā)治療多藥耐藥腫瘤的藥物和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥腫瘤的耐藥性的逆轉(zhuǎn)藥物。
本發(fā)明第一方面涉及通式(I)的化合物或其立體異構(gòu)體或其藥用鹽。 其中，R1為氫、羥基，R2為氫，R1R2為＝O，R3為氫、羥基、C1-8烷酰氧基，R4為氫，R3R4為＝O，R5為C1-8烷酰氧基，苯甲酰氧基，取代的苯甲酰氧基，取代基可以是羥基，甲氧基或鹵素，可以有1個或2個相同或不同的取代基，R6為氫，R7為羥基、脂環(huán)基C1-8烷基酰氧基、雜環(huán)基C1-8烷基酰氧基、芳環(huán)基C1-8烷基酰氧基，包括苯基C1-8烷基酰氧基，在苯基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是疊氮基，甲氧基或鹵素，在C1-8烷基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是氧＝O、羥基、甲氧基或鹵素，條件是取代基不在同一位置上，R8為氫，
R9為氫、羥基、C1-8烷基酰氧基，R10為氫，R9R10為＝O，R11為羥基、C1-8烷基酰氧基、苯甲酰氧基、芳烴基甲酰氧基，R12為氫，R11R12為＝O，但是不包括 本發(fā)明中的術(shù)語“苯基C1-8烷基酰氧基”中的C1-8烷酰氧基”是指含1-8個碳原子的烷酰氧基，如甲酰氧基，乙酰氧基，丙酰氧基，異丙酰氧基，丁酰氧基，異丁酰氧基等，戊酰氧基，含支鏈的戊酰氧基，己酰氧基，含支鏈的己酰氧基等。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式Ia化合物或其立體異構(gòu)體包括
其中，R1R2為＝O，R3為氫、R4為氫，R5為C1-8烷酰氧基，R6為氫，R7為肉桂酰氧基、脂環(huán)基C1-8烷基酰氧基、雜環(huán)基C1-8烷基酰氧基、芳環(huán)基C1-8烷基酰氧基，包括苯基C1-8烷基酰氧基，在苯基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是疊氮基、甲氧基或鹵素，在C1-8烷基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是氧＝O、羥基、甲氧基或鹵素，條件是取代基不在同一位置上，R8為氫，R9為氫，R10為氫，R11為羥基、C1-8烷基酰氧基、苯甲酰氧基、芳烴基甲酰氧基，R12為氫，n＝0-7，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式Ib化合物或其立體異構(gòu)體包括 其中，R1為氫，R2為氫，R3為C1-8烷酰氧基，R4為氫，R5為C1-8烷酰氧基、苯甲酰氧基、取代的苯甲酰氧基、取代基可以是羥基、甲氧基或鹵素，可以有1個或2個相同或不同的取代基，R6為氫，R7為肉桂酰氧基、脂環(huán)基C1-8烷基酰氧基、雜環(huán)基C1-8烷基酰氧基、芳環(huán)基C1-8烷基酰氧基，包括苯基C1-8烷基酰氧基，在苯基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是疊氮基、甲氧基或鹵素，在C1-8烷基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是氧＝O、羥基、甲氧基或鹵素，條件是取代基不在同一位置上，R8為氫，R9為氫，R10為氫，R11為C1-8烷基酰氧基、苯甲酰氧基、芳烴基甲酰氧基，R12為氫，n＝0-7，但是不包括 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式Ic化合物或其立體異構(gòu)體包括 其中，R1為氫，R2為氫，R3為C1-8烷酰氧基，R4為氫，R5為C1-8烷酰氧基，R6為氫，R7為肉桂酰氧基、脂環(huán)基C1-8烷基酰氧基、雜環(huán)基C1-8烷基酰氧基、芳環(huán)基C1-8烷基酰氧基，包括苯基C1-8烷基酰氧基，在苯基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是疊氮基、甲氧基或鹵素，在C1-8烷基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是氧＝O、羥基、甲氧基或鹵素，條件是取代基不在同一位置上，R8為氫，
R9為羥基，C1-8烷基酰氧基，R10為氫，R11為羥基、C1-8烷基酰氧基、苯甲酰氧基、芳烴基甲酰氧基，R12為氫，n＝0-7，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式Id化合物或其立體異構(gòu)體包括 其中，R1為氫，R2為氫，R3R4為＝O，R5為C1-8烷酰氧基，R6為氫，R7為肉桂酰氧基、脂環(huán)基C1-8烷基酰氧基、雜環(huán)基C1-8烷基酰氧基、芳環(huán)基C1-8烷基酰氧基，包括苯基C1-8烷基酰氧基，在苯基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是疊氮基、甲氧基或鹵素，在C1-8烷基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是氧＝O、羥基、甲氧基或鹵素，條件是取代基不在同一位置上，R8為氫，R9為氫，
R10為氫，R11為羥基、C1-8烷基酰氧基、苯甲酰氧基、芳烴基甲酰氧基，R12為氫，n＝0-7，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選式Ie化合物或其立體異構(gòu)體包括 其中，A環(huán)上雙鍵位于C12與C13，R1為氫，R2不存在，R3R4為＝O，R5為C1-8烷酰氧基，R6為氫，R7為肉桂酰氧基、脂環(huán)基C1-8烷基酰氧基、雜環(huán)基C1-8烷基酰氧基、芳環(huán)基C1-8烷基酰氧基，包括苯基C1-8烷基酰氧基，在苯基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是疊氮基、甲氧基或鹵素，在C1-8烷基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是氧＝O、羥基、甲氧基或鹵素，條件是取代基不在同一位置上，R8為氫，R9為氫，R10為氫，R11為C1-8烷基酰氧基、苯甲酰氧基、芳烴基甲酰氧基，
R12為氫，n＝0-7，應(yīng)當(dāng)明白的是，上述式Ia～Ie化合物或其立體異構(gòu)體是本發(fā)明通式(I)化合物的特例或其亞類，式Ia～Ie化合物均在本發(fā)明通式(I)化合物范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明通式(I)化合物包括更優(yōu)選下面具體的化合物或其立體異構(gòu)體5α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-苯丙酰氧基-新杉素A 5α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-苯丙烯酰氧基-新杉素A 5α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-苯乙酰氧基-新杉素A 5α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-苯甲酰氧基-新杉素A 5α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-(2，5-二甲氧基苯乙酰氧基)-新杉素A 5α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-苯甲酰丙酰氧基-新杉素A 5α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-苯丁酰氧基-新杉素A 5α-去乙酰-5α-苯丙酰氧基-新杉素A 5α-去乙酰-5α-苯丙烯酰氧基-新杉素A 5α-去乙酰-9α-乙酰氧基-5α-苯丙?；?新杉素A 5α-去乙酰-14-脫乙酰氧-13-氧-5-3’-吲哚丙酰氧基-新杉素A 5α，14β-二去乙酰-14-氧-5α-苯丙酰氧基-新杉素A
在本發(fā)明中涉及多種制備本發(fā)明通式(I)化合物的方法，以下為了方便起見，以下將詳細說明之。制備方法(一)的反應(yīng)路線為制備方法(二)的反應(yīng)路線為 SINENXAN A a-1 a-2a-3 a-4a-5 Rb＝Ac or R′COIa SINENXANA Ra＝Ac or Hb-1 Rb＝R′CO or Acb-2制備方法(三)的反應(yīng)路線為 SINENXANA c-1 Ra＝Ac or HRb＝R′CO or Acc-2 Ic
制備方法(四)的反應(yīng)路線為 SINENXANA R＝Ac or Hd-1 Pg為保護基團 R′為各類烴包括芳香烴和脂肪烴d-2d-3 d-4Id方法V R′為各類烴包括芳香烴和脂肪烴d-4Ie
通過以上的的反應(yīng)路線可以明了，本發(fā)明事實上包括五種制備方法，其中，以下涉及一種通式(I)化合物的制備方法，包括以下步驟(1)在水溶性有機溶劑中，用堿性水溶液處理新杉素A進行選擇性水解，得式a-1化合物，即14β-去乙酰-新杉素A；(2)在堿性介質(zhì)存在下，在有機溶劑中，化合物式a-1與二硫化碳，碘甲烷反應(yīng)進行原磺酰酯化生成式-2化合物，即14β-去乙酰-14β-原磺酸酯-新杉素A；(3)經(jīng)步驟2得到的式-2化合物14β-去乙酰-14β-原磺酸酯-新杉素A經(jīng)過脫氧處理，生成式a-3化合物，即14-脫氧-新杉素A；(4)經(jīng)步驟3得到的式a-3化合物14-脫氧-新杉素A，經(jīng)過烯丙位氧化，得式a-4化合物，即14-脫氧-13-氧-新杉素A；(5)經(jīng)步驟4得到的式a-4化合物14-脫氧-13-氧-新杉素A用堿水解，干燥后，于有機溶劑中，經(jīng)有機堿處理，與乙酸酐反應(yīng)進行選擇性酰化得到式a-5化合物，即5α-去乙酰-14-脫氧-13-氧-新杉素A；(6)經(jīng)步驟5得到的式a-5化合物于干燥的有機溶劑中，在DCC和有機堿存在下與R’COOH反應(yīng)成酯得到通式Ia化合物，即5α-去乙酰-14-脫氧-13-氧-5α-R’?；?新杉素A。
換言之，本發(fā)明通式I化合物的制備方法包括以下步驟步驟1新杉素A(Sinenxan A)在有機溶劑中，用KOH或K2CO3水溶液處理，生成式a-1化合物(14β-去乙酰-新杉素A)。該步驟選用水溶性有機溶劑中進行，如甲醇，乙醇，THF，以及一些混合溶劑，如甲醇/二氯甲烷溶液，甲醇/丙酮溶液等，其中優(yōu)選混合溶劑，以甲醇/二氯甲烷溶液為最佳；反應(yīng)是在0℃-40℃下進行，優(yōu)選10℃-15℃；KOH或K2CO3水溶液不宜太濃，優(yōu)選2mol/L-4mol/L。
步驟2式a-1化合物在堿性介質(zhì)存在下，于有機溶劑中，與二硫化碳，碘甲烷反應(yīng)生成式a-2化合物(14β-去乙酰-14β-原磺酸酯-新杉素A)。該反應(yīng)一般在四氫呋喃，乙醚，二氧六環(huán)等不干擾反應(yīng)的無水有機溶劑中進行，以四氫呋喃最佳；使用堿可以是氫氧化鈉，氫鈉，叔丁醇鉀等無水堿，其中以氫鈉最佳。該反應(yīng)分兩個階段，第一個階段，加入堿，二硫化碳一般在室溫-回流溫度下進行，優(yōu)選回流溫度；第二個階段，與碘甲烷形成原磺酸酯，需在較低的溫度20-50℃進行，優(yōu)選40-50℃。
步驟3生成的式a-2化合物在氮氣保護下，于有機溶劑中，與Bu3SnH/AIBN反應(yīng)生成式a-3化合物。該反應(yīng)采用甲苯、苯、二氧六環(huán)等較高溫度的不干擾反應(yīng)有機溶劑，通常這些溶劑需經(jīng)無水，脫氣處理，優(yōu)選的是甲苯；反應(yīng)一般在50-100C進行，優(yōu)選70-80℃。
步驟4得到的式a-3化合物(14-脫氧-新杉素A)經(jīng)PCC、NaOAc，或鉻酐吡啶處理得到式a-4化合物。此步反應(yīng)需在氮氣保護下進行，所用有機溶劑為苯，二氯甲烷等不干擾反應(yīng)的惰性有機溶劑，優(yōu)選為苯；反應(yīng)在室溫-回流溫度下進行，優(yōu)選回流溫度；反應(yīng)時間一般不宜過長，以2-5h最佳。
步驟5得到的式a-4化合物(14-脫氧-13-氧-新杉素A)用堿水解，得到產(chǎn)物，不需純化，干燥后，于有機溶劑中，經(jīng)有機堿處理，與乙酸酐反應(yīng)進行選擇性?；玫绞絘-5(5α-去乙酰-14-脫氧-13-氧-新杉素A)。該反應(yīng)分兩個階段，第一個階段，通常在甲醇或甲醇/四氫呋喃混合溶劑中進行，20-40℃下經(jīng)2-4mol/L KOH或K2CO3水溶液處理，得到全水解產(chǎn)物；第二個階段，一般有機溶劑和堿選用吡啶或二氯甲烷/DMAP等，反應(yīng)在溫度為20-50℃下進行，其中優(yōu)選20-30℃。
步驟6得到式a-5化合物于干燥的有機溶劑中，在DCC和有機堿存在下與R’COOH反應(yīng)成酯得到式Ia(5α-去乙酰-14-脫氧-13-氧-5α-R’?；?新杉素A)。此步反應(yīng)所用有機溶劑優(yōu)選為甲苯、二氯甲烷等不干擾反應(yīng)的惰性有機溶劑，以甲苯最佳；有機堿采用DMAP，4-PP，三乙胺等，優(yōu)選DMAP；反應(yīng)一般在20-50℃條件下進行，優(yōu)選30-35℃。
在本發(fā)明中，步驟5，可以通過控制反應(yīng)條件，進行選擇性水解和選擇性酰化，得到2，5，10不同位置羥基化合物，(如I-5化合物在-10-0℃下用2倍當(dāng)量的1mol/L K2CO3水溶液處理1h得到10β-去乙酰-14-脫氧-13-氧-新杉素A)；隨后與不同酸縮合，得到不同位置的酯化產(chǎn)物。
本發(fā)明還包括一種通式(I)化合物的制備方法，包括(1)新杉素A在有機溶劑中，經(jīng)堿作用，得到全水解產(chǎn)物2α，5α，10β，14β-四去乙酰-新杉素A；干燥后，經(jīng)有機堿處理，與乙酸酐反應(yīng)進行選擇性?；墒絙-1化合物，即5α-去乙酰-新杉素A；(2)經(jīng)步驟2得到的化合物b-1于干燥的有機溶劑中，在DCC和有機堿存在下與R’COOH反應(yīng)成酯得到通式Ib化合物5α-去乙酰-5α-R’酰基-新杉素A。
換言之，本發(fā)明的通式(I)化合物的第二種制備方法包括以下步驟步驟1新杉素A在有機溶劑中，經(jīng)堿作用反應(yīng)水解，得到全水解產(chǎn)物(2α，5α，10β，14β-四去乙酰-新杉素A)，干燥后，經(jīng)有機堿處理，與乙酸酐反應(yīng)進行選擇性酰化生成式b-1化合物(5α-去乙酰-新杉素A)。該反應(yīng)水解所用溶劑為甲醇，乙醇，也可以是混合溶劑如甲醇/二氯甲烷，甲醇/丙酮，甲醇/四氫呋喃等，其中優(yōu)選甲醇，甲醇/四氫呋喃；所用堿一般為K2CO3或KOH，反應(yīng)在10-60℃下進行，優(yōu)選20-40℃；隨后?；话阍谶拎ぶ羞M行，20-40℃下反應(yīng)。
步驟2得到的羥基化合物b-1于干燥的有機溶劑中，在DCC和有機堿存在下與R’COOH反應(yīng)成酯得到式Ib(5α-去乙酰-5α-R’?；?新杉素A)。此步反應(yīng)所用有機溶劑可以是甲苯、二氯甲烷等不干擾反應(yīng)的惰性有機溶劑，有機堿采用DMAP，4-DP，三乙胺等，反應(yīng)一般在20-40℃條件下進行。
另外，在本方法中，經(jīng)過步驟1通過控制反應(yīng)條件，可以對新杉素A進行選擇性水解和選擇性?；玫?，5，10不同位置單羥基或多羥基化合物。
本發(fā)明還涉及一種通式(I)化合物的制備方法，包括以下步驟(1)將新杉素A溶于無水乙醇中，加入培養(yǎng)的銀杏懸浮細胞中，濃度可為10-40mg/L，反應(yīng)2-18天得到式c-1化合物，即9α-羥基-新杉素A；(2)經(jīng)步驟1得到的式c-1化合物9α-羥基-新杉素A在有機溶劑中，經(jīng)堿作用，得到全水解產(chǎn)物(2α，5α，10β，14β-四去乙酰-9α-羥基-新杉素A)，干燥后，經(jīng)有機堿處理，與乙酸酐反應(yīng)進行選擇性?；玫绞絚-2即5α-去乙酰-9α-乙?；?新杉素A；(3)經(jīng)得到羥基化合物于干燥的有機溶劑中，在DCC和有機堿存在下與R’COOH反應(yīng)成酯得到式Ic化合物，即5α-去乙酰-5α-R’?；?9α-乙?；?新杉素A。
換言之，本發(fā)明還涉及第三種通式(I)化合物的制備方法，它包括以下步驟步驟1新杉素A溶于無水乙醇中，取適量在適當(dāng)時期加入培養(yǎng)的銀杏懸浮細胞中，反應(yīng)數(shù)天得到式c-1化合物。按照公知的方法進行銀杏懸浮細胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度18-33℃，優(yōu)選20-30℃，以25±2℃最佳；新杉素A加入濃度可為10-40mg/L，優(yōu)選20-30mg/L，以20mg/L最佳；新杉素A的加入時期為細胞周期的6-18天，優(yōu)選12-18天；反應(yīng)時間可為2-18天，優(yōu)選6-10天。
步驟2式c-1化合物(9α-羥基-新杉素A)在有機溶劑中，經(jīng)堿作用，得到全水解產(chǎn)物(2α，5α，10β，14β-四去乙酰-9α-羥基-新杉素A)，干燥后，經(jīng)有機堿處理，與乙酸酐反應(yīng)進行選擇性?；玫绞絚-2化合物(5α-去乙酰-9α-乙?；?新杉素A)。該反應(yīng)水解所用溶劑為甲醇，乙醇，也可以是混合溶劑如甲醇/二氯甲烷，甲醇/丙酮，甲醇/四氫呋喃等，所用堿一般為K2CO3或KOH，反應(yīng)溫度控制在20-60℃，優(yōu)選20-40℃。隨后?；话阍谶拎ぶ羞M行，室溫-40℃下反應(yīng)。
步驟3得到羥基化合物于干燥的有機溶劑中，在DCC和有機堿存在下與R’COOH反應(yīng)成酯得到式Ic(5α-去乙酰-5α-R’?；?9α-乙?；?新杉素A)。此步反應(yīng)所用有機溶劑可以是甲苯、二氯甲烷等不干擾反應(yīng)的惰性有機溶劑，有機堿采用DMAP，4-PP，三乙胺等，反應(yīng)一般在20-40℃條件下進行。
另外，在步驟1中可通過控制反應(yīng)條件，對新杉素A進行選擇性水解和選擇性?；?，得到2，5，10不同位置的單羥基或多羥基化合物本發(fā)明還涉及一種通式(I)化合物第三種制備方法，它包括以下步驟(1)新杉素A在有機溶劑中，經(jīng)堿作用，得到全水解產(chǎn)物，即2α，5α，10β，14β-四去乙酰-新杉素A，干燥后，經(jīng)有機堿處理，與乙酸酐反應(yīng)進行選擇性?；墒絛-1化合物，即5α，14β-二去乙酰-新杉素A)；(2)經(jīng)步驟1得到式d-1化合物5α，14β-二去乙酰-新杉素A在有機堿存在下，與保護基的作用得到式d-2化合物；(3)經(jīng)步驟2得到式d-2化合物于干燥的有機溶劑中，在DCC和有機堿存在下與R’COOH反應(yīng)成酯得到式d-3化合物，即5α，14β-二去乙酰-14β-Pg-5α-R’?；?新杉素A，所述的式d-3化合物可干燥后直接溶于有機溶劑，在酸性介質(zhì)中脫去保護，得到式d-4化合物；(4)經(jīng)對步驟3得到的式d-4化合物脫保護后，得到的產(chǎn)物濃縮干燥后，溶于有機溶劑，用PCC氧化可得到通式(I)d化合物。
由此可見，在本發(fā)明中，還涉及第四種通式(I)化合物的制備方法，它包括以下步驟步驟1新杉素A在有機溶劑中，經(jīng)堿作用，得到全水解產(chǎn)物(2α，5α，10β，14β-四去乙酰-新杉素A)，干燥后，經(jīng)有機堿處理，與乙酸酐反應(yīng)進行選擇性酰化生成式d-1化合物(5α，14β-二去乙酰-新杉素A)。該反應(yīng)水解所用條件同上述的第二種制備方法。隨后?；话阍谶拎ぶ羞M行，20-60℃下反應(yīng)2-4h，其中優(yōu)選溫度40-60℃。
步驟2得到的d-1化合物，在有機堿存在下，與保護基如TMSCl、TESCl，TBDMSCl等作用得到式d-2化合物。此步反應(yīng)所用溶劑通常是干燥的不干擾反應(yīng)的有機溶劑，如四氫呋喃，二氯甲烷，DMF等，優(yōu)選混合溶劑二氯甲烷/DMF。堿一般用有機弱堿如咪唑、DMAP等。為提高選擇性，反應(yīng)一般在-78--20℃條件下進行，優(yōu)選-50--30℃。
步驟3得到羥基化合物d-2化合物于干燥的有機溶劑中，在DCC和有機堿存在下與R’COOH反應(yīng)成酯得到式d-3化合物(5α，14β-二去乙酰-14β-Pg-5α-R’?；?新杉素A)。該反應(yīng)所用有機溶劑可以是甲苯、二氯甲烷等不干擾反應(yīng)的惰性有機溶劑，有機堿采用DMAP，4-PP，三乙胺等，反應(yīng)一般在20-40℃條件下進行。所得產(chǎn)物可干燥后直接溶于有機溶劑，在酸性介質(zhì)中脫去保護，得到式d-4化合物。通常所用溶劑是甲醇，四氫呋喃等極性較大溶劑。酸性介質(zhì)一般用極稀的鹽酸或其他有機酸稀溶液，以免發(fā)生副反應(yīng)。
步驟4對脫保護的產(chǎn)物濃縮干燥后，將其溶于有機溶劑，用PCC氧化可得到式Id化合物。該步驟中使用的有機溶劑可以是苯，二氯甲烷，氯仿等，以干燥的二氯甲烷為最佳。
最后，本發(fā)明還涉及另一種通式(I)化合物的制備方法，該方法包括將上述式d-4化合物經(jīng)氧化劑氧化，再與酸性介質(zhì)反應(yīng)硅膠發(fā)生雙鍵轉(zhuǎn)移，可得生成通式Ie化合物。
實際上上述的制備方法為本發(fā)明所涉及的第五種制備方法，它包括由方法IV制備化合物d-4經(jīng)氧化劑氧化，再與酸性介質(zhì)反應(yīng)硅膠發(fā)生雙鍵轉(zhuǎn)移，可得生成式Ie化合物。該步驟中使用的有機溶劑可用干燥的氯仿，二氯甲烷，苯，THF等，其中優(yōu)選二氯甲烷或苯，以二氯甲烷最佳；氧化劑可以是TPAP，PCC，PCC/乙酸鈉等，優(yōu)選為PCC或TPAP；酸性介質(zhì)可以是硅膠，三氟乙酸，對甲苯磺酸，較濃的鹽酸，HF等，其中優(yōu)選為硅膠或HF，以硅膠最佳。
本發(fā)明另一方面還涉及一種藥物組合物，它包括至少一種治療有效劑量的通式(I)化合物和/或立體異構(gòu)體或其藥用鹽例如藥用酸鹽和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還涉及上述通式(I)化合物或其立體異構(gòu)體在制備抗惡性腫瘤藥物，尤其是治療多藥耐藥腫瘤的藥物和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥腫瘤的耐藥性藥物中的用途。
本發(fā)明的通式(I)化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等，可以是普通制劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于藥用載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種載體。關(guān)于這類載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級醇、高級醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分通式(I)化合物或其立體異構(gòu)體與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分通式(I)化合物或其立體異構(gòu)體制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
本發(fā)明通式(I)化合物或其立體異構(gòu)體的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重及個體反應(yīng)，所用的具體化合物，給藥途徑及給藥次數(shù)等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥。
為了進一步理解本發(fā)明，下面的實施例以及藥理實驗僅僅用來進一步說明本發(fā)明，但并不是意味對本發(fā)明的任何限制。
實施例實施例15α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-苯丙酰氧基-新杉素A 步驟114β-去乙酰-新杉素A503mg(0.9976mmol)新杉素A于30ml甲醇與4ml二氯甲烷的混合溶液中，0C下加入2mol/L KOH 5.0ml(10.0mmol)，攪拌3.5h，室溫(8℃)繼續(xù)5h。以5％HCl水溶液調(diào)PH至6-7，減壓濃縮，以乙酸乙酯(3×50ml)提取，合并有機相，依次以飽和NaHCO3溶液，brine洗，無水Na2SO4干燥。減壓蒸除溶劑，得到的粗產(chǎn)品，用硅膠柱層析純化，石油醚/二氯甲烷/丙酮(10/10/1，5/20/1)的混合溶劑洗脫，得所需產(chǎn)物200mg，收率43.4％。步驟214β-去乙酰-14β-原磺酸酯-新杉素A1.6g(3.4632mmol)14β-去乙酰-新杉素A于45mL四氫呋喃(經(jīng)無水處理)中，加入831mg(20.78mmol)NaH(60％于礦油中)，4.1ml(0.06926mmol)CS2，回流12h，降至室溫，加入1ml(17.32mmol)碘甲烷，升至40-50℃繼續(xù)攪拌2.5h，降至室溫過濾，濃縮，以200ml乙酸乙酯提取，依次以飽和氯化銨水溶液、brine洗，無水Na2SO4干燥，減壓蒸除溶劑，硅膠柱層析純化，石油醚/乙酸乙酯(6/1，5/1，4/1)得所需產(chǎn)品1.82g，收率95.2％。步驟314-脫乙酰氧基-新杉素A氮氣保護下，1.53g(2.7717mmol)14β-去乙酰-14β-原磺酸酯-新杉素A于100ml甲苯(經(jīng)無水及脫氣處理)升溫至75-85℃，穩(wěn)定后加入7.47ml(27.717mmol)Bu3SnH，46mg(0.27717mmol)AIBN，攪拌7h。濃縮，20ml丙酮稀釋6g粗硅膠拌樣，硅膠柱層析純化，石油醚/乙酸乙酯(8/1，7/1，6/1)得所需產(chǎn)物0.986g，收率79.8％。FABMS447.1(M+1)1HNMR(CDCl3，δ)6.06(dd，1H，J＝5.3Hz，12.3Hz，10-H)，5.38(dd，1H，J＝2Hz，6.3Hz，2-H)，5.266(t，1H，J＝3Hz，5-H)，5.250(s，1H，20-H)，4.891(s，1H，20-H)，3.084(d，1H，J＝6Hz，3-H)，2.45(m，1H，，13-H)，2.375(dd，1H，J＝12Hz，14.5Hz，9-H)，2.12(s，3H，10-OAc-CH3)，2.062(s，3H，2-OAc-CH3)，2.045(s，3H，5-OAc-CH3)，2.033(s，3H，18-CH3)，2.094-1.87(m，3H，1-H，13-H，14-H)，1.80(m，2H，6-H，7-H)，1.68(m，1H，6-H)，1.588(s，3H，16-CH3)，1.588(m，1H，9-H)，1.22(m，7-H)，1.055(s，3H，17-CH3)，0.849(s，3H，19-CH3)步驟414-脫乙酰氧基-13-氧-新杉素A在氮氣保護下，1.26g(20825mmol)14-脫乙酰氧基-新杉素A于160ml苯(無水)中，依次加入6.95g(84.75mmol)無水NaOAc，18.2g Celite，18.2g(84.75mmol)PCC，加熱至95℃回流11h，過濾，殘渣用500ml乙醚洗，合并濾液，減壓濃縮，硅膠柱層析純化，石油醚/丙酮(8/1)得所需產(chǎn)物650mg，回收原料300mg，基于原料75.6％的轉(zhuǎn)化，收率65.7％。FABMS461.3(M+1)1HNMR(CDCl3，δ)6.06(dd，1H，J＝12Hz，5.5Hz，10-H)，5.46(dd，1H，J＝2Hz，6.5Hz，2-H)，5.266(s，1H，20-H)，5.226(t，J＝3Hz，1H，5-H)，4.816(s，1H，20-H)，3.187(d，1H，J＝6Hz，3-H)，2.87(dd，1H，J＝6.7Hz，19.7Hz，14-H)，2.48(dd，1H，J＝12Hz，15Hz，9-H)，2.328(d，1H，J＝19.5Hz，14-H)，2.196(s，3H，10-OAc-CH3)，2.142(dd，1H，J＝2Hz，6.7Hz，1-H)，2.097(s，3H，2-OAc-CH3)，2.063(s，3H，5-OAc-CH3)，1.990(s，3H，18-CH3)，2.14-1.85(m，1H，7-H)，1.79(m，3H，6-H，9-H)，1.691(s，3H，16-CH3)，1.21(m，7-H)，1.132(s，3H，17-CH3)，0.903(s，3H，19-CH3)步驟55α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-新杉素A32.5mg(0.07065mmol)14-脫乙酰氧基-13-氧-新杉素A于2.5ml甲醇中，加入0.26ml 4mol/L KOH室溫攪拌38.5h，以4mol/L HCl水溶液調(diào)PH值至6-7，濃縮，用乙酸乙酯(3×15ml)提取，合并有機相，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液，brine洗，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，真空干燥。得到25.5mg粗產(chǎn)品，溶于2ml吡啶，加入0.05ml乙酸酐(0.5294mmol)攪拌，0-4℃1.5h，室溫7h，加入0.1ml甲醇，繼續(xù)攪拌10min，減壓濃縮，50ml乙酸乙酯稀釋，1mol/L鹽酸，飽和CuSO4水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液，brine洗，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，TLC純化，石油醚/丙酮(2.5/l)，得所需產(chǎn)物10mg，兩步收率33.9％步驟65α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-苯丙酰氧基-新杉素A27mg(0.0587mmol)5α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-新杉素A于2ml甲苯中，加入26mg(0.1262mmol)DCC，40mg(0.1393mmol)苯丙酸室溫攪拌15min，加入17mg(0.1393mmol)DMAP繼續(xù)反應(yīng)6h，加入甲醇終止反應(yīng)，濃縮，用乙酸乙酯提取，依次用1mol/L鹽酸，飽和碳酸氫鈉水溶液，brine洗，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，TLC純化，石油醚/乙酸乙酯(1.5/1)，得所需產(chǎn)物30mg，收率84.5％。mp.117.2℃FABMS551.3(M+1)1HNMR(CDCl3，δ)7.33-7.21(5H，Ph)，6.06(dd，1H，J＝12.3Hz，6Hz，10-H)，5.48(dd，1H，J＝1.5Hz，6.7Hz，2-H)，5.28(s，1H，20-H)，5.24(br.s，1H，5-H)，4.842(s，1H，20-H)，3.167(d，1H，J＝6Hz，3-H)，2.955(t，2H，J＝8Hz，2’-CH2)，2.81(dd，1H，J＝6.5Hz，20Hz，14-H)，2.63(m，1H，3’-CH2)，2.53(m，1H，3’-CH2)，2.50(dd，1H，J＝12Hz，15Hz，9-H)，2.32(d，1H，J＝20Hz，14-H)，2.179(s，3H，10-OAc-CH3)，2.16(dd，1H，J＝1.5Hz，6.5Hz，1-H)，2.117(s，3H，2-OAc-CH3)，2.088(s，3H，18-CH3)，1.91(m，1H，7-H)，1.78(m，3H，6-H，9-H)，1.711(s，3H，16-CH3)，1.28(m，7-H)，1.154(s，3H，17-CH3)，0.919(s，3H，19-CH3)實施例25α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-苯丙烯酰氧基-新杉素A
按照實施例1描述的方法，步驟6中，用肉桂酸代替苯丙酸制備期待產(chǎn)物。白色固體，mp146.8-148℃FABMS1HNMR(CDCl3，δ)7.795(d，2H，J＝6.5Hz，Ph-2，6-H)，7.68(d，1H，J＝16Hz，3’H)，7.44(m，3H，Ph-3，4，5-H)，6.48(d，1H，J＝16.5Hz，2’H)，6.10(dd，1H，J＝6Hz，12.3Hz，10-H)，5.517(dd，1H，J＝2Hz，6.5Hz，2-H)，5.317(s，1H，20-H)，5.361(br.s，1H，5-H)，4.836(s，1H，20-H)，3.38(d，1H，J＝7Hz，3-H)，2.86(dd，1H，J＝7Hz，20Hz，14-H)，2.525(dd，1H，J＝12Hz，15Hz，9-H)，2.477(d，1H，J＝20Hz，14-H)，2.26(s，3H，10-OAc-CH3)，2.10(dd，1H，J＝1.5Hz，6.7Hz，1-H)，2.123(s，3H，2-OAc-CH3)，2.096(s，3H，18-CH3)，1.97(m，2H，6-H，7-H)，1.83(m，2H，6-H，9-H)，1.735(s，3H，16-CH3)，1.344(m，7-H)，1.185(s，3H，17-CH3)，0.959(s，3H，19-CH3)實施例35α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-苯乙酰氧基-新杉素A按照實施例1描述的方法，步驟6中，用苯乙酸代替苯丙酸制備期待產(chǎn)物。 白色固體，mp51.1-51.9℃FABMS571.5(M+K+1)，537.5(M+1)1HNMR(CDCl3，δ)7.35-7.24(5H，Ph)，6.08(dd，1H，J＝12Hz，5.5Hz，10-H)，5.48(dd，1H，J＝2Hz，6.5Hz，2-H)，5.267(s，1H，20-H)，5.238(t，1H，J＝2Hz，5-H)，4.834(s，1H，20-H)，3.55(q，2H，J＝17Hz，2’CH2)3.105(d，1H，J＝6.5Hz，3-H)，2.835(dd，1H，J＝7Hz，19.7Hz，14-H)，2.50(dd，1H，J＝11.7Hz，15Hz，9-H)，2.37(d，1H，J＝19.5Hz，14-H)，2.24(s，3H，10-OAc-CH3)，2.62(dd，1H，J＝2Hz，7Hz，1-H)，2.101(s，3H，2-OAc-CH3)，2.064(s，3H，18-CH3)，1.95(m，1H，7-H)，1.80(m，3H，6-H， 9-H)，1.703(s，3H，16-CH3)，1.29(m，1H7-H)，1.154(s，3H，17-CH3)，0.894(s，3H，19-CH3)實施例45α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-苯甲酰氧基-新杉素A按照實施例1描述的方法，步驟6中，不用DCC，用苯甲酰氯代替苯丙酸，制備期待產(chǎn)物。白色固體，mp137-138.5℃FABMS523.4(M+1)1HNMR(CDCl3，δ)7.82(d，2H，J＝7.5Hz，Ph-2，6-H)，7.607(t，1H，J＝7.3Hz，3-H)，7.538(t，2H，J＝7.5Hz，Ph-4，5-H)6.02(dd，1H，J＝12Hz，5.5Hz，10-H)，5.524(d，1H，J＝7Hz，2-H)，5.404(s，1H，5-H)，5.375(s，1H，20-H)，4.815(s，1H，20-H)，3.243(d，1H，J＝7Hz，3-H)，2.836(dd，1H，J＝7Hz，19.5Hz，14-H)，2.41(dd，1H，J＝12.5Hz，14.5Hz，9-H)，2.472(d，1H，J＝20Hz，14-H)，2.21(d，1H，J＝7.5Hz，1-H)，2.077(s，3H，10-OAc-CH3)，2.002(s，3H，2-OAc-CH3)，1.951(s，3H，18-CH3)，2.07-1.915(m，3H，2×6-H，7-H)，1.78(dd，1H，J＝14.7Hz，6.7Hz，9-H)，1.713(s，3H，16-CH3)，1.35(m，1H，7-H)，1.120(s，3H，17-CH3)，0.966(s，3H，19-CH3)實施例55α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-(2，5-二甲氧基苯乙酰氧基)-新杉素A 按照實施例1描述的方法，步驟6中，用2，5-二甲氧基苯乙酸代替苯丙酸，制備期待產(chǎn)物。白色固體，mp69.5-70.5℃FABMS596.3(M+)1HNMR(CDCl3，δ)6.825-6.75(m，3H，Ph)，6.09(dd，1H，J＝5.5Hz，12Hz，10-H)，5.484(dd，1H，J＝1.5Hz，6.5Hz，2-H)，5.272(s，1H，20-H)，5.252(br.s，1H，5-H)，4.825(s，1H，20-H)，3.769(s，3H，5-OCH3)，3.759(s，3H，2-0CH3)，3.596(d，1H，J＝17Hz，2’-H)，3.407(d，1H，J＝17Hz，2’-H)，3.232(d，1H，J＝6.5Hz，3-H)，2.812(dd，1H，J＝7Hz，20Hz，14-H)，2.498(dd，1H，J＝12.3Hz，14.7Hz，9-H)，2.387(d，1H，J＝20Hz，14-H)，2.243(s，3H，10-OAc-CH3)，2.155(d，1H，J＝5.5Hz，1-H)，2.096(s，3H，2-OAc-CH3)，2.066(s，3H，18-CH3)，2.17-1.96(m，1H，7-H)，1.834(m，2H，6-H)，1.768(dd，1H，J＝14.7Hz，5.7Hz，9-H)，1.701(s，3H，16-CH3)，1.28(m，1H，7-H)，1.140(s，3H，17-CH3)，0.914(s，3H，19-CH3)實施例65α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-苯甲酰丙酰氧基-新杉素A 按照實施例1描述的方法，步驟6中，用4-羰基-苯丁酸代替苯丙酸，制備期待產(chǎn)物。白色固體。FABMS579.3(M+1)1HNMR(CDCl3，δ)7.993(d，2H，J＝7.5Hz，Ph-2，6-H)，7.556-7.444(m，3H，Ph-3，4，5-H)，6.092(dd，1H，J＝12Hz，5.5Hz，10-H)，5.475(dd，1H，J＝1.5Hz，6.3Hz，2-H)，5.265(s，1H，20-H)，5.246(br.s，1H，5-H)，4.827(s，1H，20-H)，3.396(m，1H，3’-CH2)，3.193(m，2H，3-H，3’-CH2)，2.79(dd，1H，J＝7Hz，20Hz，14-H)，2.755(m，1H，J＝8Hz，2’-CH2)，2.56(m，1H，2’-CH2)2.49(dd，1H，J＝12.3Hz，14.7Hz，9-H)，2.369(d，1H，J＝20Hz，14-H)，2.254(s，3H，10-OAc-CH3)，2.145(dd，1H，J＝1.7Hz，6.7Hz，1-H)，2.09(s，3H，2-OAc-CH3)，2.064(s，3H，18-CH3)，2.01(m，1H，7-H)，1.86(m，2H，6-H)，1.772(dd，1H，J＝5.7Hz，14.7Hz，9-H)，1.696(s，3H，16-CH3)，1.563(s，3H，17-CH3)，1.308(m，1H，7-H)，1.133(s，3H，19-CH3)實施例75α-去乙酰-14-脫乙酰氧基-13-氧-5α-苯丁酰氧基-新杉素A 按照實施例1描述的方法，步驟6中，用苯丁酸代替苯丙酸，制備期待產(chǎn)物。白色固體。FABMS565.2(M+1)1HNMR(CDCl3，δ)7.306-7.172(m，5H，Ph)，6.049(dd，1H，J＝11.7Hz，5.7Hz，10-H)，5.461(dd，1H，J＝1.5Hz，6.5Hz，2-H)，5.265(s，1H，20-H)，5.232(t，J＝2.7Hz，1H，5-H)，4.817(s，1H，20-H)，3.396(m，1H，3’-CH2)，3.162(d，1H，J＝6Hz，3-H)，2.780(dd，1H，J＝6.7Hz，19.7Hz，14-H)，2.696(m，2H，2’-CH2)，2.481(dd，1H，J＝12Hz，15Hz，9-H)，2.309(d，1H，J＝20Hz，14-H)，2.241(m，2H，3’-CH2)2.155(s，3H，10-OAc-CH3)，2.137(dd，1H，J＝1.7Hz，7.3Hz，1-H)，2.094(s，3H，2-OAc-CH3)，2.060(s，3H，18-CH3)，1.906(m，3H，7-H，4’-CH2)，1.76(m，3H，6-H，9-H)，1.726(s，3H，16-CH3)，1.283(t，1H，J＝3.3Hz，7-H)，1.131(s，3H，17-CH3)，0.900(s，3H，19-CH3)實施例85α-去乙酰-5α-苯丙酰氧基-新杉素A 步驟A2α，5α，10β，14β-四去乙酰-新杉素A50mg(0.099mmol)新杉素A于2ml甲醇中，加入0.4ml 2mol/L KOH(0.8mmol)升溫至40℃攪拌8h，減壓濃縮至干，用乙酸乙酯溶解，濾去不溶物，減壓蒸去溶劑，真空干燥，得到32mg所需產(chǎn)品，收率96％。步驟B5α-去乙酰-新杉素A60mg(0.1786mmol)2α，5α，10β，14β--四去乙酰-新杉素A溶于3ml吡啶，加入0.1ml乙酸酐(0.5294mmol)室溫攪拌49h，加入0.2ml甲醇，繼續(xù)攪拌10min，減壓濃縮，20ml乙酸乙酯稀釋，1mol/L鹽酸，飽和CuSO4水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液，brine洗，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，硅膠柱純化，石油醚/乙酸乙酯(4/1-2/1)，得所需產(chǎn)物31mg，收率37.8％。步驟C5α-去乙酰-5α-苯丙酰氧基-新杉素A78mg(0.52mmol)苯丙酸于2ml甲苯中，加入40mg(0.1948mmol)DCC，室溫攪拌15min，加入30mg(0.06494mmol)2α，10β，14β-三乙酰氧基-5α-羥基-新杉素A，79mg(0.6475mmol)DMAP繼續(xù)反應(yīng)4h，加入甲醇終止反應(yīng)，濃縮，用乙酸乙酯提取，依次用1mol/L鹽酸，飽和碳酸氫鈉水溶液，brine洗，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，硅膠柱純化，石油醚/乙酸乙酯(6/1)，得所需產(chǎn)物25mg，收率65％。淡黃色油狀物。FABMS587.2(M+Na)，565.2(M+1)1HNMR(CDCl3，δ)7.308-7.192(m，5H，Ph-H)，6.03(dd，1H，J＝12Hz，5.5Hz，10-H)，5.34(dd，1H，J＝2.5Hz，6.5Hz，2-H)，5.273(s，1H，20-H)，5.299(t，J＝3Hz，1H，5-H)4.985(dd，J＝4.5，9.5Hz，14-H)，4.879(s，1H，20-H)，2.99(m，2H，2’-CH2)，2.81(d，1H，J＝6.5Hz，3-H)，2.71(m，3H，3’-CH2，13-H)，2.41(dd，1H，J＝4.3，18.7Hz，13-H)，2.367(dd，1H，J＝12.3Hz，14.7Hz，9-H)，2.056(s，3H，10-OAc-CH3)，2.05(s，3H，2-OAc-CH3)2.023(s，3H，14-OAc-CH3，)2.009(s，3H，18-CH3)，1.91(m，1H，7-H)，1.877(d，1H，J＝2.29Hz，1-H)，1.75(m，2H，6-H)，1.65(s，3H，16-CH3)，1.61(dd，J＝6，15Hz，9-H)，1.106(s，3H，17-CH3)，0.832(s，3H，19-CH3)實施例95α-去乙酰-5α-苯丙烯酰氧基-新杉素A 按照實施例8描述的方法，步驟C中，用肉桂酸代替苯丙酸，制備期待產(chǎn)物。白色固體，mp75-78℃FABMS593(M+1)1HNMR(CDCl3，δ)7.76(d，1H，J＝6.02Hz，3’-H)7.39-7.57(m，5H，Ph)，6.53(d，1H，J＝6.02Hz，2’-H)6.07(dd，1H，J＝12.2Hz，5.7Hz，10-H)，5.36(dd，1H，J＝2.29Hz，6.49Hz，2-H)，5.34(s，1H，20-H)，5.33(br.s，1H，5-H)，5.04(dd，1H，J＝4.58，9.54Hz，14-H)4.93(s，1H，20-H)，2.99(d，J＝6.48Hz，3-H)2.82(dd，1H，J＝9.53Hz，19.45Hz，13-H)，2.47(dd，1H，J＝3.05，19.07Hz，13-H)，2.40(dd，1H，J＝12.21Hz，14.88Hz，9-H)，2.12，(s，3H，10-OAc-CH3)，2.08(s，3H，2-OAc-CH3)2.06(s，3H，14-OAc-CH3，)1.99(s，3H，18-CH3)，1.90(d，1H，J＝2.29Hz，1-H)，1.67(s，3H，16-CH3)，1.62(dd，J＝5.34，14.88Hz，9-H)，1.11(s，3H，17-CH3)，0.87(s，3H，19-CH3)實施例105α-去乙酰-9α-乙酰氧基-5α-苯丙酰基-新杉素A 步驟A9α-羥基-新杉素A的制備1)銀杏懸浮細胞的培養(yǎng)銀杏愈傷組織的誘導(dǎo)、培養(yǎng)及細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立參見文獻[1]。培養(yǎng)基為MS[]+0.5mg/L NAA(α-萘乙酸)+0.5mg/L 6-BA(6-芐基腺嘌呤)+0.2mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，蔗糖用量為30g/L，消毒前pH調(diào)為5.8。所用搖瓶為500mL和1000mL的三角瓶，500mL三角瓶中盛裝150mL培養(yǎng)基，1000mL中盛裝330mL培養(yǎng)基，細胞接種量為5g/L培養(yǎng)物(干重)搖床振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為110轉(zhuǎn)/分鐘，黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃。2)銀杏細胞懸浮培養(yǎng)物對新杉素A的生物轉(zhuǎn)化i)底物底物為新杉素A由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所生物合成室提供，是從云南紅豆杉(Taxus yunnensis)愈傷組織培養(yǎng)物中分離得到，純度經(jīng)HPLC檢查達到95％以上。準確稱取Sinenxan A一定量，用無水乙醇溶解，配成濃度為20mg/mL的溶液，待用。ii)生物轉(zhuǎn)化預(yù)試驗 取上述新杉素A溶液0.5mL加入裝有生長15天的銀杏懸浮細胞的500mL三角瓶中，同時向另一三角瓶中加入0.5mL無水乙醇作為空白對照。再培養(yǎng)6天后將培養(yǎng)物減壓濾去，并用蒸餾水將培養(yǎng)物清洗3次，每次蒸餾水用量為20mL，濾液合并，用等量乙酸乙酯萃取3次，萃取液減壓濃縮至干，用少量丙酮溶出。培養(yǎng)物在50℃烘箱中烘干至恒重，用乙酸乙酯浸泡并超聲提取0.5小時，濾去培養(yǎng)物后的溶液減壓濃縮至干，用少量丙酮溶出。通過上述方法制得的樣品與底物一起進行TLC檢查。展開劑為丙酮-石油醚(1∶2.5)，噴10％硫酸乙醇溶液，加熱至紫杉烷類化合物特有的棕褐色斑點出現(xiàn)為止。重復(fù)2次。iii)生物轉(zhuǎn)化放大試驗 經(jīng)2次預(yù)試驗確定銀杏培養(yǎng)細胞對新杉素A有轉(zhuǎn)化作用后，即進行放大試驗。所用三角瓶容積為1000mL，共15瓶。待培養(yǎng)至15天后，于每瓶加上述底物新杉素A溶液1mL，在21天收獲。濾去培養(yǎng)物并用適量蒸餾水清洗3次，合并濾液后用等量乙酸乙酯萃取5次，減壓濃縮后用丙酮溶出。iv)生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離及鑒定 3)中丙酮溶出物減壓濾去不溶物，濃縮后稱重，得450mg殘渣。硅膠柱層析進行分離，所用硅膠為薄層層析硅膠H(青島海洋化工廠)，洗脫劑為丙酮-石油醚(1∶5-1∶1)，得一個產(chǎn)物，經(jīng)1H-NMR，13C-NMR，1H-1H COSY，13C-1H COSY，F(xiàn)ABMS，紅外等光譜技術(shù)鑒定為2α，5α，10β，14β-四乙酰氧基-9α-羥基-新杉素A。v)9α-羥基-新杉素A制備的反應(yīng)式、結(jié)構(gòu)式、得率、分子量及比旋光度為 Sinenxan A 9-hydroxyl-sinenxan A1(60％)C28H40O9Exact Mass520.27Mol.Wt.520.61C，64.60；H，7.74；O，27.66[α]D20+44.6°(C＝0.0083，CH3OH)步驟B2α，5α，10β，14β-四去乙酰-9α-羥基-新杉素A135mg(0.260mmol)2α，5α，10β，14β-四乙酰氧基-9α-羥基-新杉素A于10ml甲醇和1ml丙酮中，加入1.2ml 4mol/L KOH(4.8mmol)室溫攪拌34h，以6N HCl水溶液調(diào)PH值至6-7，濃縮，用乙酸乙酯(15ml)提取，有機相，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液，brine洗，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，真空干燥，得到85mg粗產(chǎn)品。將粗產(chǎn)品溶于3ml吡啶，加入0.23ml乙酸酐(2.4mmol)室溫攪拌48h，加入0.2ml甲醇，繼續(xù)攪拌10min，減壓濃縮，20ml乙酸乙酯稀釋，1mol/L鹽酸，飽和CuSO4水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液，brine洗，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，硅膠柱純化，石油醚/乙酸乙酯(3/1-1/1)，得所需產(chǎn)物35mg，收率28％。步驟C5α-去乙酰-9α-乙酰氧基-5α-苯丙酰基-新杉素A20mg(0.03846mmol)2α，9α，10β，14β-四乙酰氧基-5α-羥基-新杉素A于3ml二氯甲烷中，加入12mg(0.05769mmol)DCC，17mg(0.1154mmol)苯丙酸室溫攪拌15min，加入14mg(0.1154mmol)DMAP繼續(xù)反應(yīng)10h，30-40℃繼續(xù)4h，加入甲醇終止反應(yīng)，濃縮，用二氯甲烷(12ml)提取，依次用1mol/L鹽酸，飽和碳酸氫鈉水溶液，brine洗，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，硅膠柱層析純化，石油醚/乙酸乙酯(6/1，5/1)，得所需產(chǎn)物18mg，收率97.8％。FABMS675.2(M+Na)1HNMR(CDCl3，δ)7.31-7.199(m，5H，Ph)，5.987(d，1H，J＝10Hz，10-H)，5.793(d，1H，J＝10.5Hz，9-H)，5.404(dd，1H，J＝2.5Hz，7Hz，2-H)，5.34(s，1H，20-H)，5.318(br.s，1H，5-H)，4.962(dd，1H，J＝5，9Hz，14-H)4.898(s，1H，20-H)，3.021(t，1H，J＝7.7Hz，2’-CH2)，2.92(d，1H，J＝6Hz，3-H)，2.79(m，2H，3’-CH2，13-H)，2.66(m，1H，3’-CH2)，2.42(dd，1H，J＝5，18.5Hz，13-H)，2.15(d，1H，J＝21.5Hz，2’-CH2)，2.073-2.009(3×s+br.s，12H，9-OAc-CH3，10-OAc-CH3，2-OAc-CH3，14-OAc-CH3，18-CH3)，1.93(d，1H，J＝2Hz，1-H)，1.79-1.64(m，4H，6-H，7-H)，1.672(s，3H，16-CH3)，1.110(s，3H，17-CH3)，0.844(s，3H，19-CH3)實施例115α，14β-二去乙酰-14-氧-5α-苯丙酰氧基-新杉素A 步驟A2α，5α，10β，14β--四去乙酰-新杉素A50mg(0.099mmol)2α，5α，10β，14β-四乙酰氧基-新杉素A于2ml甲醇中，加入0.4ml 2mol/L KOH(0.8mmol)升溫至40℃攪拌8h，減壓濃縮至干，用乙酸乙酯溶解，濾去不溶物，減壓蒸去溶劑，真空干燥，得到32mg所需產(chǎn)品，收率96％。步驟B5α，14β-二去乙酰-新杉素A1.6g(4.8mmol)2α，5α，10β，14β--四去乙酰-新杉素A于11ml吡啶加入醋酐1.8ml(19.2mmol)中，40-60℃攪拌3h45min，加入甲醇終止反應(yīng).乙酸乙酯稀釋，1mol/L鹽酸，飽和CuSO4水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液，brine洗，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，硅膠柱純化，石油醚/乙酸乙酯(1.5/1-1/1)，得所需產(chǎn)物0.46g。收率23％。步驟C5α，14β-二去乙酰-14β-TES-新杉素A85mg(0.2021mmol)5α，14β-二去乙酰-新杉素A和138mg(2.021mmol)咪唑于8ml二氯甲烷和DMF混合溶液中，-12--14℃反應(yīng)20min。以6ml冰水終止反應(yīng)。用3×6ml二氯甲烷提取，合并有機相，brine洗，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，硅膠柱純化，石油醚/乙酸乙酯(10/1-8/1)，得所需產(chǎn)物36mg。收率33.3％。步驟D5α，14β-二去乙酰-14-氧-5α-苯丙酰氧基-新杉素A50mg(0.09349mmol)5α，14β-二去乙酰-14β-TES-新杉素A于2ml二氯甲烷中，加入56mg(0.374mmol)苯甲酸，38mg(0.187mmol)DCC，室溫攪拌15min，加入46mg(0.374mmol)DMAP繼續(xù)2小時，升至30-40℃繼續(xù)6小時，用3ml甲醇終止反應(yīng)，以1mol/L HCl調(diào)PH值至6-7，再用0.5％HCl溶液調(diào)PH至3左右室溫攪拌1小時，以飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)PH到7，濃縮，20ml乙酸乙酯提取，有機相用brine洗，無水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑，得14β-羥基-2α，10β-二乙酰氧基-5α-苯丙酰氧基-新杉素A粗產(chǎn)品43mg。將該粗產(chǎn)品溶于3ml二氯甲烷，加入40mg(0.1873mmol)PCC，室溫攪拌2小時，過短硅膠柱，以50ml乙醚沖洗，濃縮，薄層硅膠板分離純化，得目標物28mg。收率71.8％。1HNMR(CDCl3，δ)7.31-7.18(5H，Ar)，5.875(dd，1H，J＝12.5Hz，6Hz，10-H)，5.552(dd，1H，J＝2.5Hz，6.5Hz，2-H)，5.202(s，1H，20-H)，5.183(br.s，1H，5-H)4.854(s，1H，20-H)，2.95(m，4H，13-H，9-H，2’-CH2)，2.71(d，1H，J＝6Hz，3-H)，2.50(m，3H，13-H，3’-CH2)，2.099(s，3H，10-OAc-CH3)，2.053(s，3H，2-OAc-CH3)，2.027(s，3H，18-CH3)，1.97(m，2H，1-H，9-H)，1.89-1.73(m，3H，7-H，2×6-H)，1.644(s，3H，16-CH3)，1.275(s，3H，17-CH3)，1.126(m，1H，7-H)，0.993(s，3H，19-CH3)實施例125α-去乙酰-14-脫乙酰氧-13-氧-5-3’-吲哚丙酰氧基-新杉素A 按照實施例1描述的方法，步驟6中，用3”-吲哚丙酸代替苯丙酸制備期待產(chǎn)物。1HNMR(CDCl3，δ)8.011(br.s 1H，NH)7.678-7.10(5H，Ar)，6.033(dd，1H，J＝12Hz，5.5Hz，10-H)，5.46(d，1H，J＝6.5Hz，2-H)，5.264(s，1H，20-H)，5.238(br.s，1H，5-H)，4.813(s，1H，20-H)，3.173(d，1H，J＝6.5Hz，3-H)，3.072(m，2H，2’-CH2)，2.781(dd，1H，J＝7.3Hz，20Hz，14-H)，2.636(m，2H，3’-CH2)，2.472(dd，1H，J＝11.7Hz，14.7Hz，9-H)，2.325(d，1H，J＝20Hz，14-H)，2.149(s，3H，10-OAc-CH3)，2.13(1H，1-H)，2.087(s，3H，2-OAc-CH3)，2.061(s，3H，18-CH3)，1.89-1.7(m，4H，7-H，2×6-H，9-H)，1.686(s，3H，16-CH3)，1.24(m，7-H)，1.125(s，3H，17-CH3)，0.895(s，3H，19-CH3)實驗例1材料和方法藥品及試劑經(jīng)上述實施例2，5或10得到的本發(fā)明新的紫杉烷類化合物，用DMSO溶解。DMSO為北京化工廠產(chǎn)品。長春新堿(VCR)為北京醫(yī)科大學(xué)實驗藥廠產(chǎn)品。RPMI1640為GIBCO產(chǎn)品。小牛血清為北京軍區(qū)獸醫(yī)防治中心產(chǎn)品。
細胞株KB/V200(人口腔上皮癌耐藥細胞株)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所建立，培養(yǎng)傳代。
儀器B10-RAD 550型酶標儀。
MTT法測定收集生長良好的腫瘤耐藥細胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配制成1×104/ml細胞懸液，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接種100μl(含1000個腫瘤細胞)，置37℃，5％CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時后加藥。實驗設(shè)空白對照及溶劑對照，單獨VCR組及VCR+受試樣品組，每組4個劑量，每劑量3個平行孔。置37℃，5％CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)4天。棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(0.4mg/ml，RPMI1640配制)100μl，37℃孵育4小時。棄去上清液，每孔加入DMSO150μl，溶解Fomazan顆粒，輕度振蕩后，用B10-RAD 550型酶標儀，在波長540nm條件下測定OD值。
結(jié)果計算以藥物的不同濃度及對細胞的抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線，從中求出半數(shù)抑制濃度(IC50)。
MTT法人癌細胞殺傷結(jié)果(KB/V200*)樣品 IC50(μmol/L)實施例2化合物 8.624實施例5化合物 3.952實施例10化合物55.243Verapamil 61.700
樣品 IC50(μmol/L)VCR+實施例2化合物 0.023VCR+實施例5化合物 ＜0.01VCR+實施例10化合物 0.038VCR+Verapamil 0.066注*以mdr-1基因表達增加，P-gp表達升高為主要耐藥機制，對長春新堿(VCR)耐藥100倍以上，對阿霉素，紫杉醇，秋水仙堿等交叉耐藥。
**對照藥實驗結(jié)果紫杉烷類化合物的衍生物對多藥耐藥的人口腔上皮癌細胞，能夠顯著逆轉(zhuǎn)耐藥性，增強抗癌藥的活性。實施例2化合物，實施例5化合物及實施例10化合物的活性，強于已知對照藥Verapamil。
權(quán)利要求
1.一種通式(1)化合物及其立體異構(gòu)體， 其中，R1為氫、羥基，R2為氫，R1R2為＝O，R3為氫、羥基、C1-8烷酰氧基，R4為氫，R3R4為＝O，R5為C1-8烷酰氧基，苯甲酰氧基，取代的苯甲酰氧基，取代基可以是羥基，甲氧基或鹵素，可以有1個或2個相同或不同的取代基，R6為氫，R7為羥基、脂環(huán)基C1-8烷基酰氧基、雜環(huán)基C1-8烷基酰氧基、芳環(huán)基C1-8烷基酰氧基，包括苯基C1-8烷基酰氧基，在苯基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是疊氮基，甲氧基或鹵素，在C1-8烷基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是氧＝O、羥基、甲氧基或鹵素，條件是取代基不在同一位置上，R8為氫，R9為氫、羥基、C1-8烷基酰氧基，R10為氫，R9R10為＝O，R11為羥基、C1-8烷基酰氧基、苯甲酰氧基、芳烴基甲酰氧基，R12為氫，R11R12為＝O但是不包括以下通式
2.如權(quán)利要求1所述的化合物及其立體異構(gòu)體，其特征在于所述的化合物選自以下通式Ia、Ib、Ic、Id和Ie；其中，式Ia化合物或其立體異構(gòu)體是 其中，R1R2為＝O，R3為氫、R4為氫，R5為C1-8烷酰氧基，R6為氫，R7為脂環(huán)基C1-8烷基酰氧基、雜環(huán)基C1-8烷基酰氧基、芳環(huán)基C1-8烷基酰氧基，包括苯基C1-8烷基酰氧基，在苯基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是疊氮基、甲氧基或鹵素，在C1-8烷基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是氧＝O、羥基、甲氧基或鹵素，條件是取代基不在同一位置上，R8為氫，R9為氫，R10為氫，R11為羥基、C1-8烷基酰氧基、苯甲酰氧基、芳烴基甲酰氧基，R12為氫，n＝0-7，Ib化合物或其立體異構(gòu)體是 其中，R1為氫，R2為氫，R3為C1-8烷酰氧基，R4為氫，R5為C1-8烷酰氧基、苯甲酰氧基、取代的苯甲酰氧基、取代基可以是羥基、甲氧基或鹵素，可以有1個或2個相同或不同的取代基，R6為氫，R7為脂環(huán)基C1-8烷基酰氧基、雜環(huán)基C1-8烷基酰氧基、芳環(huán)基C1-8烷基酰氧基，包括苯基C1-8烷基酰氧基，在苯基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是疊氮基、甲氧基或鹵素，在C1-8烷基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是氧＝O、羥基、甲氧基或鹵素，條件是取代基不在同一位置上，R8為氫，R9為氫，R10為氫，R11為C1-8烷基酰氧基、苯甲酰氧基、芳烴基甲酰氧基，R12為氫，n＝0-7，Ic化合物或其立體異構(gòu)體是 其中，R1為氫，R2為氫，R3為C1-8烷酰氧基，R4為氫，R5為C1-8烷酰氧基，R6為氫，R7為脂環(huán)基C1-8烷基酰氧基、雜環(huán)基C1-8烷基酰氧基、芳環(huán)基C1-8烷基酰氧基，包括苯基C1-8烷基酰氧基，在苯基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是疊氮基、甲氧基或鹵素，在C1-8烷基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是氧＝O、羥基、甲氧基或鹵素，條件是取代基不在同一位置上，R8為氫，R9為羥基，C1-8烷基酰氧基，R10為氫，R11為羥基、C1-8烷基酰氧基、苯甲酰氧基、芳烴基甲酰氧基，R12為氫，n＝0-7， 式Id化合物或其立體異構(gòu)體是 其中，R1為氫，R2為氫，R3R4為＝O，R5為C1-8烷酰氧基，R6為氫，R7脂環(huán)基C1-8烷基酰氧基、雜環(huán)基C1-8烷基酰氧基、芳環(huán)基C1-8烷基酰氧基，包括苯基C1-8烷基酰氧基，在苯基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是疊氮基、甲氧基或鹵素，在C1-8烷基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是氧＝O、羥基、甲氧基或鹵素，條件是取代基不在同一位置上，R8為氫，R9為氫，R10為氫，R11為羥基、C1-8烷基酰氧基、苯甲酰氧基、芳烴基甲酰氧基，R12為氫，n＝0-7，式Ie化合物或其立體異構(gòu)體是 其中，A環(huán)上雙鍵位于C12與C13.R1為氫，R2不存在，R3R4為＝O，R5為C1-8烷酰氧基，R6為氫，R7為脂環(huán)基C1-8烷基酰氧基、雜環(huán)基C1-8烷基酰氧基、芳環(huán)基C1-8烷基酰氧基，包括苯基C1-8烷基酰氧基，在苯基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是疊氮基、甲氧基或鹵素，在C1-8烷基上可以有1個或2個相同或不同的取代基，取代基可以是氧＝O、羥基、甲氧基或鹵素，條件是取代基不在同一位置上，R8為氫，R9為氫，R10為氫，R11為C1-8烷基酰氧基、苯甲酰氧基、芳烴基甲酰氧基，R12為氫，n＝0-7，
3.如權(quán)利要求1或2所述的化合物及其立體異構(gòu)體，其特征在于所述的化合物包括14-脫氧-13-羰基-5-苯丙?；?紫杉烷A，14-脫氧-13-羰基-5-苯丙烯?；?紫杉烷A，14-脫氧-13-羰基-5-苯乙酰基-紫杉烷A，14-脫氧-13-羰基-5-苯甲?；?紫杉烷A，14-脫氧-13-羰基-5-2”，5”-二甲氧基苯乙酰基-紫杉烷A，14-脫氧-13-羰基-5-苯甲酰丙?；?紫杉烷A，14-脫氧-13-羰基-5-苯丁?；?紫杉烷A，5-苯丙?；?紫杉烷A，5-苯丙烯酰基-紫杉烷A或者9-乙?；?5-苯丙酰基-紫杉烷A。
4.一種通式(I)化合物的制備方法，包括(1)在水溶性有機溶劑中，用堿性水溶液處理新杉素A進行選擇性水解，得式a-l化合物，即14β-去乙酰-新杉素A；(2)在堿性介質(zhì)存在下，在有機溶劑中，化合物式a-1與二硫化碳，碘甲烷反應(yīng)進行原磺酰酯化生成式-2化合物，即14β-去乙酰-14β-原磺酸酯-新杉素A；(3)經(jīng)步驟2得到的式-2化合物14β-去乙酰-14β-原磺酸酯-新杉素A經(jīng)過脫氧處理，生成式a-3化合物，即14-脫氧-新杉素A；(4)經(jīng)步驟3得到的式a-3化合物14-脫氧-新杉素A，經(jīng)過烯丙位氧化，得式a-4化合物，即14-脫氧-13-氧-新杉素A；(5)經(jīng)步驟4得到的式a-4化合物14-脫氧-13-氧-新杉素A用堿水解，干燥后，于有機溶劑中，經(jīng)有機堿處理，與乙酸酐反應(yīng)進行選擇性?；玫绞絘-5化合物，即5α-去乙酰-14-脫氧-13-氧-新杉素A；(6)經(jīng)步驟5得到的式a-5化合物于干燥的有機溶劑中，在DCC和有機堿存在下與R’COOH反應(yīng)成酯得到通式Ia化合物，即5α-去乙酰-14-脫氧-13-氧-5α-R’酰基-新杉素A。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(1)中使用的有機溶劑為甲醇，乙醇，THF以及甲醇/二氯甲烷溶液，甲醇/丙酮溶液的混合溶劑；堿性水溶液為KOH或K2CO3水溶液；反應(yīng)在0℃-40℃下進行，優(yōu)選10℃-15℃。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(2)中使用的堿性介質(zhì)是包括氫氧化鈉，氫鈉，叔丁醇鉀的無水堿；所述的有機溶劑包括四氫呋喃，乙醚，二氧六環(huán)不干擾反應(yīng)的無水有機溶劑。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(3)中反應(yīng)一般在50-100℃進行，優(yōu)選為70-80℃。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(5)中，所述的反應(yīng)首先在甲醇或甲醇/四氫呋喃混合溶劑中進行，20-40℃下經(jīng)2-4mol/L KOH或K2CO3水溶液處理，得到全水解產(chǎn)物；所述的反應(yīng)有機溶劑和堿選用吡啶或二氯甲烷/DMAP，反應(yīng)在溫度為20-50℃下進行，優(yōu)選為20-30℃。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(6)中，有機溶劑為不干擾反應(yīng)的惰性有機溶劑，優(yōu)選為甲苯；有機堿包括DMAP，4-PP，三乙胺，優(yōu)選DMAP；反應(yīng)一般在20-50℃條件下進行，優(yōu)選為30-35℃。
10.一種通式(I)化合物的制備方法，包括以下步驟(1)新杉素A在有機溶劑中，經(jīng)堿作用反應(yīng)水解，得到全水解產(chǎn)物2α，5α，10β，14β-四去乙酰-新杉素A；干燥后，經(jīng)有機堿處理，與乙酸酐反應(yīng)進行選擇性?；墒絙-1化合物，即5α-去乙酰-新杉素A；(2)經(jīng)步驟2得到的化合物b-1于干燥的有機溶劑中，在DCC和有機堿存在下與R’COOH反應(yīng)成酯得到通式Ib化合物5α-去乙酰-5α-R’酰基-新杉素A。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述的溶劑包括甲醇，乙醇，甲醇/二氯甲烷，甲醇/丙酮，甲醇/四氫呋喃混合溶劑，其中優(yōu)選為甲醇，甲醇/四氫呋喃；所用堿包括K2CO3或KOH，反應(yīng)在10-60℃下進行，優(yōu)選20-40℃。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的有機溶劑可以是不干擾反應(yīng)的惰性有機溶劑；所述的有機堿包括DMAP，4-PP，三乙胺；反應(yīng)在20-40℃條件下進行。
13.一種通式(I)化合物的制備方法，包括以下步驟(1)將新杉素A溶于無水乙醇中，加入培養(yǎng)的銀杏懸浮細胞中，濃度可為10-40mg/L，反應(yīng)2-18天得到式c-1化合物，即9α-羥基-新杉素A；(2)經(jīng)步驟1得到的式c-1化合物9α-羥基-新杉素A在有機溶劑中，經(jīng)堿作用，得到全水解產(chǎn)物(2α，5α，10β，14β-四去乙酰-9α-羥基-新杉素A)，干燥后，經(jīng)有機堿處理，與乙酸酐反應(yīng)進行選擇性?；玫绞絚-2即5α-去乙酰-9α-乙?；?新杉素A；(3)經(jīng)得到羥基化合物于干燥的有機溶劑中，在DCC和有機堿存在下與R’COOH反應(yīng)成酯得到式Ic化合物，即5α-去乙酰-5α-R’酰基-9α-乙?；?新杉素A。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于步驟(1)中，新杉素A加入濃度可為10-40mg/L，優(yōu)選20-30mg/L；新杉素A的加入時期為細胞周期的6-18天，優(yōu)選12-18天；反應(yīng)時間可為2-18天，優(yōu)選6-10天。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述的有機溶劑為甲醇，乙醇，也可以是混合溶劑如甲醇/二氯甲烷，甲醇/丙酮，甲醇/四氫呋喃，所用堿一般為K2CO3或KOH，反應(yīng)溫度控制在20-60℃，優(yōu)選20-40℃。隨后?；话阍谶拎ぶ羞M行，室溫-40℃下反應(yīng)。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述的有機溶劑可以是不干擾反應(yīng)的惰性有機溶劑，有機堿包括DMAP，4-PP，三乙胺，反應(yīng)在20-40℃條件下進行。
17.一種通式(I)化合物的制備方法，它包括以下步驟(1)新杉素A在有機溶劑中，經(jīng)堿作用，得到全水解產(chǎn)物，即2α，5α，10β，14β-四去乙酰-新杉素A，干燥后，經(jīng)有機堿處理，與乙酸酐反應(yīng)進行選擇性?；墒絛-1化合物，即5α，14β-二去乙酰-新杉素A)；(2)經(jīng)步驟1得到式d-1化合物5α，14β-二去乙酰-新杉素A在有機堿存在下，與保護基的作用得到式d-2化合物；(3)經(jīng)步驟2得到式d-2化合物于干燥的有機溶劑中，在DCC和有機堿存在下與R’COOH反應(yīng)成酯得到式d-3化合物，即5α，14β-二去乙酰-14β-Pg-5α-R’?；?新杉素A，所述的式d-3化合物可干燥后直接溶于有機溶劑，在酸性介質(zhì)中脫去保護，得到式d-4化合物；(4)經(jīng)對步驟3得到的式d-4化合物脫保護后，得到的產(chǎn)物濃縮干燥后，溶于有機溶劑，用PCC氧化可得到通式(I)化合物。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的有機溶劑是干燥的不干擾反應(yīng)的有機溶劑，有機堿一為有機弱堿；反應(yīng)一般在-78--20℃條件下進行，優(yōu)選-50--30℃。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述的有機溶劑是不干擾反應(yīng)的惰性有機溶劑，有機堿包括DMAP，4-PP，三乙胺；反應(yīng)一般在20-40℃條件下進行。
20.一種通式(I)化合物的制備方法，該方法包括將式d-4化合物經(jīng)氧化劑氧化，再與酸性介質(zhì)反應(yīng)硅膠發(fā)生雙鍵轉(zhuǎn)移，生成通式(I)化合物。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述的氧化劑包括TPAP，PCC，PCC/乙酸鈉，優(yōu)選為PCC或TPAP；酸性介質(zhì)可以是硅膠，三氟乙酸，對甲苯磺酸，鹽酸，HF，其中優(yōu)選為硅膠或HF。
22.一種藥用組合物，其特征在于含有治療有效劑量的通式(I)化合物和/或立體異構(gòu)體或其藥用鹽和藥學(xué)上可接受的載體。
23.如權(quán)利要求1所述的化合物及其立體異構(gòu)體或其藥用鹽在制備抗惡性腫瘤藥物中的用途。
24.如權(quán)利要求1所述的化合物及其立體異構(gòu)體或其藥用鹽在制備治療多藥耐藥腫瘤的藥物和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥腫瘤的耐藥性藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的通式(I)所述的紫杉烷衍生物及其制備方法，以及含有該化合物的藥物組合物和用于在制備抗惡性腫瘤藥物中應(yīng)用；本發(fā)明還涉及在制備治療多藥耐藥腫瘤的藥物和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/337GK1393438SQ0112960
公開日2003年1月29日 申請日期2001年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月21日
發(fā)明者梁曉天, 郭積玉, 尹大力, 張猛, 朱蔚華, 戴均貴, 韓銳, 劉紅巖 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所