359aa多肽及其載體和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了359aa多肽及其載體和應(yīng)用。本發(fā)明利用生物工程技術(shù)，基因重組一段359個(gè)氨基酸多肽對(duì)應(yīng)的DNA序列到pcDNA3.1真核表達(dá)載體。經(jīng)酶切和序列分析證明重組成功后，將此真核表達(dá)重組多肽轉(zhuǎn)染到心肌細(xì)胞中，免疫印跡證明多肽的蛋白表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了多肽的重組。接著對(duì)多肽的抗心肌IR后凋亡功能進(jìn)行了研究，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明此多肽具有抑制心肌IR后細(xì)胞凋亡的重要保護(hù)功能。該多肽類似物高效表達(dá)，純化工藝簡(jiǎn)單，有利于進(jìn)一步大規(guī)模制備?？蔀閷ふ襂R后細(xì)胞損傷有效的干預(yù)靶點(diǎn)并開發(fā)新的治療藥物提供理論依據(jù)。對(duì)于應(yīng)用于IR的臨床治療實(shí)現(xiàn)心臟血管再通后的遠(yuǎn)期預(yù)后具有十分重要的開發(fā)前景。
【專利說明】
359aa多肽及其載體和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是359aa多肽及其載體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 心肌缺血作為多種心臟疾病尤其是急性ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)產(chǎn)生的結(jié)果，是世界范圍內(nèi)致死致殘的主要原 因之一，嚴(yán)重危害人類的健康，而盡早恢復(fù)血流是減輕缺血心肌損傷的基礎(chǔ)。近年來，隨著 溶栓治療術(shù)、經(jīng)皮穿刺冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)和冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)等治療方法的出現(xiàn)， 由STEMI所導(dǎo)致的心肌缺血性損傷得到有效控制，但同時(shí)伴隨血管再通所產(chǎn)生的心肌缺血 再灌注（ischemia/reperfusion，IR)則利弊相輔，因其本身會(huì)相反地對(duì)心肌產(chǎn)生進(jìn)一步損 傷，進(jìn)而阻礙心肌從缺血中的恢復(fù)和影響血管再通療效，因此日益被人們所重視并成為目 前全球研究的熱點(diǎn)。近年來研究表明，心肌IR進(jìn)程中發(fā)生心肌細(xì)胞凋亡、壞死和壞死性凋 亡，其中細(xì)胞凋亡發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，而細(xì)胞凋亡過程受多種信號(hào)通路的調(diào)控。因此，加強(qiáng) 拮抗心肌細(xì)胞凋亡的研究、探索治療靶點(diǎn)具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種359aa多肽，具 有抗心肌細(xì)胞凋亡的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的另一目的是提供上述359aa多肽的應(yīng)用。
[0004] 技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] 359aa多肽在制備用于抑制心肌IR后細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用，所述的359aa多肽 的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 編碼所述的359aa多肽的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007] 含有所述的359aa多肽的編碼基因的DNA序列的載體。
[0008]所述的載體，將359aa多肽的DNA序列連接進(jìn)pcDNA3.1真核表達(dá)載體，構(gòu)建出重組 表達(dá)質(zhì)粒。
[0009]有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用生物工程技術(shù)，基因重組一段359個(gè)氨基 酸(amino acid)多肽對(duì)應(yīng)的DNA序列到pcDNA3.1真核表達(dá)載體。經(jīng)酶切和序列分析證明重 組成功后，將此真核表達(dá)重組多肽轉(zhuǎn)染到心肌細(xì)胞中，免疫印跡證明多肽的蛋白表達(dá)，實(shí)現(xiàn) 了多肽的重組。接著對(duì)多肽的抗心肌IR后凋亡功能進(jìn)行了研究，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明此多肽具 有抑制心肌IR后細(xì)胞凋亡的重要保護(hù)功能。該多肽類似物高效表達(dá)，純化工藝簡(jiǎn)單，有利于 進(jìn)一步大規(guī)模制備?？蔀閷ふ襂R后細(xì)胞損傷有效的干預(yù)靶點(diǎn)并開發(fā)新的治療藥物提供理論 依據(jù)。對(duì)于應(yīng)用于IR的臨床治療實(shí)現(xiàn)心臟血管再通后的遠(yuǎn)期預(yù)后具有十分重要的開發(fā)前 景。
【附圖說明】
[0010]圖1是359aa多肽對(duì)應(yīng)DNA序列免疫印跡蛋白表達(dá)結(jié)果結(jié)果圖；
[0011]圖2是LDH檢測(cè)359aa多肽對(duì)心肌細(xì)胞活性的抑制結(jié)果圖；
[0012]圖3是TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)359aa多肽抗進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果圖；
[0013]圖4是免疫熒光技術(shù)檢測(cè)多肽片段的核轉(zhuǎn)位情況結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等 譯，科學(xué)出版社，2002年）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
[0015] 實(shí)施例1 359aa多肽重組
[0016]提取人的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的 mRNA序列（上游-Forward: 5，-CGAATTCGGATGGTGAACTTCACAGTAGATCAGA-3，；下游-Reverse: 5 ' -CCTCTCGAGGTCCCACAGCTTCTTCATCATG-3 '），其序列如SEQ ID NO. 1 所示，對(duì)應(yīng)表達(dá)的氨基 酸序列如SEQ ID N0.2所示。擴(kuò)增得到的片段通過水平電泳進(jìn)行分離，使用回收試劑盒獲得 該片段純化產(chǎn)物。在37°C下使用EC0Rl\Xhol酶對(duì)片段純化產(chǎn)物以及pcDNA3.1-HA載體質(zhì)粒， 進(jìn)行酶切2小時(shí)。通過水平電泳分離，使用回收試劑盒獲得暴露粘性末端的片段產(chǎn)物。在16 °C水浴下，將片段與載體以核酸量(3~10): 1的比例進(jìn)行連接12小時(shí)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受 態(tài)大腸桿菌中，涂布于Amp+瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)12小時(shí)。在含Amp+瓊脂平板上挑選克隆， 以堿裂解法小提重組質(zhì)粒后，以EC0Rl\Xhol酶切鑒定。并同時(shí)構(gòu)建eEF2 A1-795和eEF2A795-15QQ 質(zhì)粒，分別標(biāo)記為eEF2-l，eEF2-2。將提取的重組質(zhì)粒送至上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行 測(cè)序，結(jié)果在NCBI核酸比對(duì)網(wǎng)站進(jìn)行核對(duì)，結(jié)果顯示正確。
[0017] 將正確連接的359aa多肽真核表達(dá)載體使用Lipofectamine 2000Transfection Reagent轉(zhuǎn)染入H9c2細(xì)胞，48小時(shí)后搜集樣品，RIPA細(xì)胞裂解液裂解，加入上樣緩沖液后， 100 °C水浴15分鐘，13，OOOrpm離心15分鐘，進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，孵育HA-抗，小鼠來源二抗， Odyssey Infrared Imaging成像系統(tǒng)成像，免疫印跡結(jié)果證明了此多肽的表達(dá)，如圖1所 不。
[0018] 實(shí)施例2重組肽抗凋亡功能的檢測(cè)
[0019] 1)LDH檢測(cè)證明重組肽細(xì)胞水平的抗心肌缺血再灌組后細(xì)胞損傷的效應(yīng)
[0020]將心肌細(xì)胞H9c2分別以20000個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，利用Lipo fectamin 2000kit將359aa多肽真核表達(dá)載體和其它對(duì)照組轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，36小時(shí)后進(jìn)行 缺氧/復(fù)氧刺激，取細(xì)胞培養(yǎng)液，4°C下13000rpm離心后，使用LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)（南京建 成），在450nm測(cè)量吸收值。吸收值大小反映了細(xì)胞損傷情況，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以時(shí)間為橫坐 標(biāo)，吸收值為縱坐標(biāo)做圖。LDH檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，顯示與空載對(duì)照相比，359aa多肽真核表 達(dá)實(shí)驗(yàn)組明顯減輕了細(xì)胞損傷。
[0021] 2)TUNEL證實(shí)重組肽細(xì)胞水平的抗心肌缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的效應(yīng)
[0022]將心肌細(xì)胞H9c2分別以10000個(gè)/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板，利用Lipo fectamin 2000kit將359aa多肽真核表達(dá)載體和其它對(duì)照組轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，36小時(shí)后進(jìn)行 缺氧/復(fù)氧刺激，去除培養(yǎng)液，冰上用預(yù)冷PBS洗滌，使用4 %多聚甲醇固定40分鐘，預(yù)冷PBS 洗滌，使用羅氏TUNEL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。TUNEL檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，顯示與空 載對(duì)照相比，359aa多肽真核表達(dá)實(shí)驗(yàn)組明顯拮抗了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
[0023] 3)細(xì)胞免疫熒光證實(shí)重組肽細(xì)胞水平的胞內(nèi)定位未發(fā)生了改變
[0024]將心肌細(xì)胞H9c2分別以10,000個(gè)/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板，利用Lipo fectamin 2000kit將359aa多肽真核表達(dá)載體和其它對(duì)照組轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，36小時(shí)后進(jìn)行 缺氧/復(fù)氧刺激，去除培養(yǎng)液，冰上用預(yù)冷PBS洗滌3次，使用4%多聚甲醇固定40分鐘，預(yù)冷 PBS洗滌，l%Triton-100通透10分鐘，PBS洗滌后5%BSA固定2小時(shí)。使用一抗HA(1:50)孵育 10小時(shí)，PBS洗滌后二抗R綠、DAPI(1:1000)孵育2小時(shí)。Leica熒光顯微鏡下觀察，ImageJ進(jìn) 行圖像后處理。如圖4所示，免疫熒光顯示359aa多肽真核表達(dá)未發(fā)生入核的現(xiàn)象。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.359aa多肽在制備用于抑制心肌IR后細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用，所述的359aa多肽的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 編碼權(quán)利要求l所述的359aa多肽的基因，其DNA序列如SEQIDN0.2所示。3. 含有權(quán)利要求2所述的359aa多肽的編碼基因的DNA序列的載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于:將359aa多肽的DNA序列連接進(jìn)pcDNA3.1真 核表達(dá)載體，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK106039285SQ201610353341
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月25日
【發(fā)明人】沈愛國(guó), 劉曉娟, 張超, 吳翔
【申請(qǐng)人】南通大學(xué)