專利名稱：桿狀病毒載體在基因治療中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用病毒載體的基因傳送。
WO-A-98/20027公開了一種在血管手術(shù)期間可用來進行動脈基因轉(zhuǎn)移的外膜周環(huán)。但是，還需要更多容易得到并且高效的基因轉(zhuǎn)移載體。在心血管的應用中，為了取得生物效應，也許只需要轉(zhuǎn)基因的短暫表達；見Yla-Herttuala等人，Lancet 355213-222(2000)。
很久以來，桿狀病毒一直被用作生物殺蟲劑和在昆蟲細胞中進行重組蛋白高效生產(chǎn)的工具。由于它們具有自然的高種屬特異性，并且就目前所知，它們不會在非無脊椎動物宿主中增殖，因此它們通常被認為是安全的。盡管已經(jīng)顯示病毒體能夠進入某些脊椎動物來源的細胞系，但是在使用自然病毒時，沒有檢測到病毒基因表達的證據(jù)。但是，含有合適的真核啟動子的苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)能夠在幾種哺乳動物細胞類型中高效地傳送和表達目的基因；例如，可以參閱Hofmann等人，PNAS USA 9210099-10103(1995)。另外，Barsoum等人在Hum.Gene.Ther.82011-8(1997)中報道了在被膜中含有皰疹性口腔炎病毒C糖蛋白的桿狀病毒能夠顯著增加對人類肝癌細胞系的轉(zhuǎn)導效率，拓寬了能被桿狀病毒轉(zhuǎn)導的哺乳動物細胞類型的范圍。通過在桿狀病毒基因組中包含一個編碼可選擇的顯性標記的表達盒，或者通過使用雜交的桿狀病毒-腺伴隨病毒載體，已經(jīng)取得了由桿狀病毒介導的對哺乳動物細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導；參閱Condreay等人，PNAS USA 96127-132(1999)以及Palombo等人，J.Viro1.725025-34(1998)。
Sandig等人在Hum.Gene.Ther 71937-45(1996)中報道了一些不成功的嘗試，即通過系統(tǒng)性應用或肝門內(nèi)應用以及直接注射入肝實質(zhì)的方法，在小鼠和大鼠中用桿狀病毒進行體內(nèi)基因傳送。有人假定其中的一個原因是桿狀病毒被血清補體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑失活。
WO-A-00/05394公開了桿狀病毒載體和它們在脊椎動物神經(jīng)細胞中進行基因轉(zhuǎn)移的應用。
本發(fā)明能夠在合適的載體中(基因從該載體中表達)利用桿狀病毒的優(yōu)點，如果這一載體施用(體內(nèi)或體外)于無血或基本無血的身體部位。因此，外膜周圍基因傳送，特別是環(huán)介導的局部基因傳送就能允許在基本無血清的情況下進行基因傳送，從而避免了血清組分的有害作用。該新方法也避免了另兩個在系統(tǒng)基因傳送中遇到的主要問題，即病毒從注射位點快速再分布和病毒局部濃度的下降。發(fā)明詳述在WO-A-98/20027和WO-A-99/55315(這些文獻的內(nèi)容在此作為參考文獻引用)中說明了合適的傳送系統(tǒng)、活性物質(zhì)、配方、劑量等。因此，只作為例子，傳送載體可以是環(huán)或包裹物。和那些出版物相比，用于基因傳送的載體是桿狀病毒。
桿狀病毒是已知的，并且熟練技術(shù)人員能夠構(gòu)建任何用于本發(fā)明的合適載體。同時，很明顯，對桿狀病毒生物學和AcMNPV基因組的廣泛知識將有助于設(shè)計改進的第二代病毒以用于基因轉(zhuǎn)移。構(gòu)建的簡單性和接受外源大片斷DNA(＞20kb)的能力允許開發(fā)桿狀病毒，該病毒具有增強的或靶向的細胞嗜性，以及更穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達和對轉(zhuǎn)基因表達的時間和細胞類型特異性的控制。用于本發(fā)明的重組桿狀病毒可以用已知的方法配制成藥劑用于治療。
本發(fā)明的實施路線和位點包括眼內(nèi)應用、關(guān)節(jié)內(nèi)應用、表皮內(nèi)應用、輸尿管、膀胱、輸卵管、膽囊、脊索、腦脊液室、胸膜腔和腹膜腔內(nèi)。已經(jīng)使用的位點(見實施例)是動脈、腦和骨骼肌，包括例如mycocytes、衛(wèi)星細胞和再生型成肌細胞?；騻魉涂梢酝ㄟ^直接注射或多種類型的導管來完成。
如果合適，在手術(shù)期間，身體部位可以變成“無血的”。這項技術(shù)經(jīng)常在腿部或手臂手術(shù)中使用，通過在手臂和大腿周圍施加壓迫壓力，從而阻止血液流動。接著可以在該身體部位灌注鹽水以除去血液，再進行桿狀病毒轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明可以用來傳送VEGF受體的激動劑，例如在WO-A-98/20027中更詳細描述的。而且，通過選擇合適的基因，它還可以用來治療癌癥，如腦部的癌癥。
本發(fā)明的另一方面涉及器官移植和管移植，這些器官和管可以在體外灌注鹽水并注射桿狀病毒。
用下面的實驗工作來說明本發(fā)明。
用BacTo-BacTM桿狀病毒表達系統(tǒng)(Gibco BRL)產(chǎn)生重組病毒。以2×106個細胞/毫升的細胞密度在草地夜蛾(sf9)懸浮培養(yǎng)物(SF-900培養(yǎng)基，Gibco BRL)中培養(yǎng)3天，以使病毒擴增。對于50毫升培養(yǎng)基，用200微升初級轉(zhuǎn)染上清液作為接種物。為了得到1升擴增的病毒，用2毫升擴增的病毒原液作為接種物。在室溫下，以16,000g對細胞培養(yǎng)基離心20min，以除去細胞碎片。澄清的上清液轉(zhuǎn)移入底部鋪有1.5毫升溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)的25％蔗糖的超離心管中，通過離心(120,000g，4℃，1.5h)對病毒進行濃縮。病毒沉淀重懸于35毫升用冰預冷的PBS中，轉(zhuǎn)移入含有3毫升溶于PBS的25％蔗糖的超離心管中，用如上所述的方法進行離心。最終的病毒沉淀重懸于10毫升冷的PBS中，用0.45μm濾器過濾，并在4℃下避光保存?zhèn)溆?。通過對Sf9細胞的噬菌斑測定來確定病毒的滴度。分析病毒制備物中的脂多糖和細菌污染物。重組腺病毒的制備編碼核定位的LacZ的腺病毒(pCMVnlslacZAd5)按照Laitinen等人描述的方法(此處同前)進行構(gòu)建和制備。按照Laitinen等人在Hum.Gene.Ther，91481-6(1998)中描述的方法分析病毒制備物中的可復制病毒、脂多糖和細菌污染物。體外基因轉(zhuǎn)移以每孔(Falcon Culture，Becton Dickinson，Meylan，F(xiàn)rance)10,000細胞的密度將兔主動脈細胞(RAASMC；Yla-Herttuala等人(1995)，supra)和人類癌細胞/類內(nèi)皮細胞ECV-304(ATTC CRL-1998)進行平板培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)導之前，讓細胞在無血清培養(yǎng)基(DMEM，100U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素，Gibco BRL))貼壁3h。以200或1000的MOIs將病毒加入培養(yǎng)基中，在37℃下讓細胞孵育90min。在轉(zhuǎn)導后，在有或沒有10nM正丁酸(Sigma，St.Louis，MD，USA)的情況下，加入含有10％胎牛血清的生長培養(yǎng)基。孵育18h后，除去培養(yǎng)基，并用PBS對細胞清洗三遍。細胞用1.25％的戊二醛固定15min，接著用PBS清洗三遍。將細胞加入X-Gal(MBI Fermentas，Lithuania)染色液(1mg/ml，2mM/MgCl2，5mM K3Fe(CN)6，5mM K4Fe(CN)6，1X PBS)中，在37℃孵育3h。接著用PBS清洗細胞，進一步用4％的多聚甲醛(PFA)固定10min。用PBS清洗之后，細胞用Mayers Carmalum復染5min。對藍色的X-Gal陽性細胞計數(shù)，轉(zhuǎn)導效率用陽性細胞占細胞總數(shù)的百分比表示。ONPG試驗如Ruponen等人在Biochim.Biophys.Acta 1415331-41(1999)中所描述的，用發(fā)色底物鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG，Sigma)測定轉(zhuǎn)導的RAASMC細胞中由lacZ編碼的β-半乳糖苷酶的活性。體外毒性試驗在96孔平板上，以20,000細胞每孔的密度將細胞在100微升含有10％胎牛血清和抗生素(100U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素)的生長培養(yǎng)基中進行平板培養(yǎng)。用轉(zhuǎn)導效率試驗中的方法進行病毒轉(zhuǎn)導，在37℃下細胞孵育48h。除去生長培養(yǎng)基，并用PBS清洗細胞。接著加入不含酚紅但含有MTT溶液(3-(4，5二甲基噻唑基-2)2，5-二苯基四唑溴，5mg/ml，終濃度0.3mg/ml)的無血清DMEM，細胞孵育2h。為了溶解暗藍色的甲臜晶體，除去MTT溶液，在每個孔中加入150微升的1M DMSO，徹底混勻。在570nm波長下測定吸收值。通過和無病毒或無丁酸的孔(100％存活)的吸收值比較來計算存活百分比。動物試驗使用了雄性新西蘭白兔(NZW)(n＝12；2.8-3.7kg)。用芬太尼-氟丁酰酮(0.3ml/kg，s.c.；Janssen Pharmaceutica，Beerse，Belgium)和咪達唑侖(1.5mg/kg，i.m.，Roche，Basel，Switzerland)進行麻醉。用頸中線切開法使左頸動脈和右頸動脈暴露。小心地將動脈和周圍組織分開，并將一個3厘米長的硅橡膠環(huán)(見Laitinen等人(1997)，supra)放置在它周圍。在環(huán)放置之后五天，用latinen等人(1997)在supra中描述的方法將兔子重新麻醉，進行基因轉(zhuǎn)移，并比較質(zhì)粒/脂質(zhì)體、假型逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒的轉(zhuǎn)染效率。打開環(huán)，充入500微升含有1×109pfu腺病毒或桿狀病毒的基因轉(zhuǎn)移溶液。在每只動物中，左頸動脈用腺病毒處理，右頸動脈用桿狀病毒處理。在基因轉(zhuǎn)移之后3、7和14天，每天處死四只兔子，并將動脈切下進行組織分析。所有動物方法都是經(jīng)過允許的。組織分析帶環(huán)的動脈平均分成三份近端部分浸在4％PFA/15％蔗糖中固定4h，在15％蔗糖(PH7.4)中沖洗過夜，并用石蠟包埋。中間部分浸在4％PFA/PBS(PH7.4)中固定30min，用PBS(PH7.4)沖洗，并用OCT化合物(Miles Scientific，Naperyille，IL，USA)包埋。遠端部分在液氮中快速冷凍，在-70℃保存以提取mRNA并進行逆轉(zhuǎn)錄酶多聚酶鏈式反應(RT-PCR)。
用X-Gal(MBT Fermentas)對從每只兔子中隨機選取的冰凍切片(10微米)染色18h以確定β半乳糖苷酶陽性細胞。由兩個獨立的觀察者對8片隨機選取的切片進行觀察，以每平方毫米外膜或動脈壁上的X-Gal陽性細胞來計算基因轉(zhuǎn)移效率。報道結(jié)果的平均值±平均值的標準誤差(SEM)。如Yla-Hertualla(1995)在supra中所描述的，石蠟切片用于免疫細胞化學檢測內(nèi)皮細胞(CD-31；1∶50稀釋；Dako，Hamburg，Germany)、巨噬細胞(RAM-11；1∶100稀釋；Dako)、平滑肌細胞(HHF-35；1∶50稀釋；Dako)和T細胞(MCA-805；1∶100稀釋；Dako)。免疫染色的對照包括不用第一抗體的切片以及和類屬相匹配的免疫球蛋白一同孵育的切片。用蘇木精-伊紅染色的石蠟切片和Image-Pro PlusTM軟件結(jié)合Olympus AX70顯微鏡(0lympus Optical，Japan)進行形態(tài)測量和圖象分析。RT-PCR用Trizol試劑(Gibco-BRL)從頸動脈片斷中提取總RNA，并用過量的RQ1無RNA酶的DNA酶(Promega，Madison，WI，USA)進行處理。M-MulV逆轉(zhuǎn)錄酶(MBI Fermentas)用作cDNA合成。選擇CMV啟動子的5’的引物和編碼區(qū)3’的引物來設(shè)計LacZ的引物，以區(qū)別內(nèi)源基因和轉(zhuǎn)導基因。用多聚酶Dynazyme(Finnzymes，Espoo，F(xiàn)inland)進行擴增。
在LacZ擴增中，引物SEQ ID NO1用作腺病毒(A)的正向引物，引物SEQ ID NO2用作桿狀病毒(B)的正向引物，SEQ ID NO3用作兩者的反向引物。熱起始(95℃5min，58℃3min)后進行39個循環(huán)，每個包含95℃1min，58℃2min，72℃3min，最后在72℃下進行10min的延伸反應。用5微升的第一次PCR產(chǎn)物以及正向引物SEQ ID NO4(A)和SEQ ID NO5(B)進行第二次PCR。兩者的反向引物是SEQ ID NO6。第一個PCR循環(huán)在95℃進行5min，接著按照第一次PCR的參數(shù)進行20個循環(huán)。體外基因轉(zhuǎn)移為了測試桿狀病毒原液，在存在或不存在10mM丁酸鹽的情況下，以每細胞200或1000pfu的感染復數(shù)(MOI)轉(zhuǎn)導RAASMC細胞和ECV-304細胞，并計算X-Gal陽性細胞的百分比。該結(jié)果與在同樣條件下用LacZ-腺病毒轉(zhuǎn)導的細胞進行比較(表1)。同發(fā)表的結(jié)果符合，(Condreay等人，supra)在細胞培養(yǎng)基中加入丁酸鹽能顯著增加轉(zhuǎn)基因的表達，特別是對桿狀病毒而言。RAASMC細胞(在MOI1000時，91％感染)似乎比ECV-304細胞(在MOI1000時，21％感染)對桿狀病毒的轉(zhuǎn)導更敏感。用定量生化試驗結(jié)合鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)測量了RAASMC細胞中β半乳糖苷酶的活性程度。該結(jié)果和X-Gal染色相一致，顯示在桿狀病毒轉(zhuǎn)導的細胞中用丁酸鹽處理后，轉(zhuǎn)基因的表達增加。體外毒性用3-(4，5二甲基噻唑基-2)2，5-二苯基四唑溴試驗測量病毒制備物的細胞毒性(表2)。在MOI200或1000，并且不存在丁酸鹽的情況下，桿狀病毒和腺病毒對RAASMC細胞都不表現(xiàn)較大的細胞毒性。但是，在丁酸鹽存在的情況下，用MOI1000的桿狀病毒時，在這些細胞中探測到了一些細胞毒性。對于原代培養(yǎng)的WHHL(Watanabe可遺傳的高脂血)兔成纖維細胞也得到了相似的結(jié)果，除了一個是例外，即在有丁酸鹽并且MOI1000的情況下，對于桿狀病毒沒有探測到細胞毒性作用。(數(shù)據(jù)沒有顯示)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移為了確定桿狀病毒是否可用來進行體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，在基因轉(zhuǎn)移之后3、7和14天處死NZW兔子。由于β半乳糖苷酶的核定向表達，較強的X-Gal染色位于轉(zhuǎn)導細胞的細胞核中。從桿狀病毒轉(zhuǎn)導(每動脈1×109pfu)的頸動脈中計算β半乳糖苷酶活性陽性的細胞數(shù)目，并且和類似處理的腺病毒轉(zhuǎn)導的動脈相比較。兩種病毒都介導標記基因傳送到管壁上。在第三天，用桿狀病毒處理的動脈和用腺病毒處理的動脈中轉(zhuǎn)基因陽性細胞的數(shù)目分別為每平方毫米外膜12±5和23±7個β半乳糖苷酶陽性細胞(對于整個動脈壁而言，分別是每平方毫米11±4個細胞和19±6個細胞)。在第7天，相應的值分別是17±6和22±7(15±5和18±6)。在第14天，這些值是0.1±0和0.2±0.1(0.1±0和0.1±0.1)。因此，桿狀病毒介導的基因表達是短暫的，并且和腺病毒介導的基因轉(zhuǎn)移具有相似的效率和時間模式。用RT-PCR也證實了轉(zhuǎn)基因在動脈壁中的表達。
對桿狀病毒處理的動脈和腺病毒處理的動脈，內(nèi)膜/中膜比率(所有動脈)的平均值分別是0.18±0.03和0.12±0.01，這表明處理方法沒有破壞管壁?；蜣D(zhuǎn)移之后7天，動脈的組織學在外膜外沒有檢測到β半乳糖苷酶活性。對于兩種病毒，用RAM-11和MCA-805免疫染色分別發(fā)現(xiàn)巨噬細胞滲入了轉(zhuǎn)導的動脈并探測到T細胞在動脈中。在整個實驗過程中，動脈結(jié)構(gòu)和內(nèi)皮保持完整。表3總結(jié)了所有時間點的組織學發(fā)現(xiàn)。表1用桿狀病毒和腺病毒對RAASMC和ECV-304細胞系進行的轉(zhuǎn)導細胞系 MOI丁酸鹽(mM) 陽性細胞(％)桿狀病毒 腺病毒RAASMC 200 0 1.0±0.3 1.7±0.810 52.5±0.8 42.1±1.110000 5.3±1.3 48.0±5.810 90.6±1.6 87.6±2.3ECV-304 200 0 0 44.2±2.910 2.6±1.7 89.4±1.910000 0.3±0.3 87.51±4.010 20.8±7.7 97.6±1.4±s.e.m.表2桿狀病毒和腺病毒在RAASMC細胞中的細胞毒性的MTT試驗MOI 丁酸鹽(mM) 桿狀病毒(％)*腺病毒(％)*200 0 82±3 98±410 78±2 101±21000 0 81±1 99±110 65±1 90±3*同模擬轉(zhuǎn)導的細胞相比，RAASMC細胞的存活百分率?！纒.e.m.表3基因轉(zhuǎn)移之后3、7和14天，轉(zhuǎn)導的動脈中組織學發(fā)現(xiàn)的總結(jié)時間點 病毒 巨噬細胞 PMN細胞 內(nèi)容是否完整3d腺病毒 +++ 是桿狀病毒 ++++ 是7d腺病毒 + + 是桿狀病毒 + + 是14d 腺病毒 ++- 是桿狀病毒 ++- 是-，無；+輕微；++中度和+++和對照動脈相比嚴重滲入。PMN，多形核。實施例2用和實施例1中基本相同的方法，表明桿狀病毒基因轉(zhuǎn)移在腦部和骨骼肌中也是可行的。用桿狀病毒/LacZ，大鼠腦部多種類型的腦細胞顯示陽性轉(zhuǎn)染，特別是腦室中的脈絡(luò)叢細胞和內(nèi)皮細胞。轉(zhuǎn)染細胞的輪廓和用腺病毒轉(zhuǎn)染的明顯不同。
進一步，桿狀病毒感染已經(jīng)在兔子骨骼肌中證實。用25G針將編碼LacZ的桿狀病毒(1.8×1010PFU)直接注射入NZW兔子的內(nèi)收肌。注射量是0.5毫升。基因轉(zhuǎn)移之后7天，收集組織樣品，用X-Gal染色過夜。這些結(jié)果清楚地表明桿狀病毒可以用來轉(zhuǎn)染哺乳動物的多種細胞類型，即不僅僅是動脈細胞。


了編碼核定位的β半乳糖苷酶的桿狀病毒轉(zhuǎn)染盒的構(gòu)建。通常，這是一個標準的、帶有多角體蛋白啟動子的公共結(jié)構(gòu)域桿狀病毒，并且在其中克隆入了限制性酶切位點和CMV-NTLacZ表達盒。LacZ表達盒與多角體蛋白啟動子反向定位。CMV-NTLacZ表達盒的序列在SEQ IDNO7中。
序列表<110>Ark Therapeutics Ltd.<120>病毒載體的基因傳送<130>REP06446WO<140>未知<141>2001-05-29<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>1ttggaggcct aggcttttgc 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>2ttggcctaga gtcgacggat 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>3tgaggggacg acgacagtat 20<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>4ggtagaagac cccaaggact tt 22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>5ccaagaagaa acgcaaagtg 20<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>6cgccattcgc cattcag 17<210>7<211>4495<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述重組桿狀病毒<400>7ccattgcata cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaata 60tgaccgccat gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca 120ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 180ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 240acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 300ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt caatgacggt 360aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc tacttggcag 420tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacaccaat 480gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 540gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa taaccccgcc 600ccgttgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt 660ttagtgaacc gtcagatctc tagaagcttg gcctagagtc gacggatccg gggaattccc 720cagtctcagg atccaccatg gggcccaaga agaaacgcaa agtggggagc atgggggatc 780ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg 840cagcacatcc ccctttccca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc 900ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgctttgcc tggtttcgca ccagaagcgg 960tgccggaaag ctggctggag tgcgatcttc ctgaggccga tactgtcgtc gtcccctcaa 1020actggcagat gcacggttac gatgcgccca tctacaccaa cgtaacctat cccattacgg 1080tcaatccgcc gtttgttccc acggagaatc cgacgggttg ttactcgctc acatttaatg 1140ttgatgaaag ctggctacag gaaggccaga cgcgaattat ttttgatggc gttaactcgg 1200cgtttcatct gtggtgcaac gggcgctggg tcggttacgg ccaggacagt cgtttgccgt 1260ctgaatttga cctgagcgca tttttacgcg ccggagaaaa ccgcctcgcg gtgatggtgc 1320tgcgttggag tgacggcagt tatctggaag atcaggatat gtggcggatg agcggcattt 1380tccgtgacgt ctcgttgctg cataaaccga ctacacaaat cagcgatttc catgttgcca 1440ctcgctttaa tgatgatttc agccgcgctg tactggaggc tgaagttcag atgtgcggcg 1500agttgcgtga ctacctacgg gtaacagttt ctttatggca gggtgaaacg caggtcgcca 1560gcggcaccgc gcctttcggc ggtgaaatta tcgatgagcg tggtggttat gccgatcgcg 1620tcacactacg tctgaacgtc gaaaacccga aactgtggag cgccgaaatc ccgaatctct 1680atcgtgcggt ggttgaactg cacaccgccg acggcacgct gattgaagca gaagcctgcg 1740atgtcggttt ccgcgaggtg cggattgaaa atggtctgct gctgctgaac ggcaagccgt 1800tgctgattcg aggcgttaac cgtcacgagc atcatcctct gcatggtcag gtcatggatg 1860agcagacgat ggtgcaggat atcctgctga tgaagcagaa caactttaac gccgtgcgct 1920gttcgcatta tccgaaccat ccgctgtggt acacgctgtg cgaccgctac ggcctgtatg 1980tggtggatga agccaatatt gaaacccacg gcatggtgcc aatgaatcgt ctgaccgatg 2040atccgcgctg gctaccggcg atgagcgaac gcgtaacgcg aatggtgcag cgcgatcgta 2100atcacccgag tgtgatcatc tggtcgctgg ggaatgaatc aggccacggc gctaatcacg 2160acgcgctgta tcgctggatc aaatctgtcg atccttcccg cccggtgcag tatgaaggcg 2220gcggagccga caccacggcc accgatatta tttgcccgat gtacgcgcgc gtggatgaag 2280accagccctt cccggctgtg ccgaaatggt ccatcaaaaa atggctttcg ctacctggag 2340agacgcgccc gctgatcctt tgcgaatacg cccacgcgat gggtaacagt cttggcggtt 2400tcgctaaata ctggcaggcg tttcgtcagt atccccgttt acagggcggc ttcgtctggg 2460actgggtgga tcagtcgctg attaaatatg atgaaaacgg caacccgtgg tcggcttacg 2520gcggtgattt tggcgatacg ccgaacgatc gccagttctg tatgaacggt ctggtctttg 2580ccgaccgcac gccgcatcca gcgctgacgg aagcaaaaca ccagcagcag tttttccagt 2640tccgtttatc cgggcaaacc atcgaagtga ccagcgaata cctgttccgt catagcgata 2700acgagctcct gcactggatg gtggcgctgg atggtaagcc gctggcaagc ggtgaagtgc 2760ctctggatgt cgctccacaa ggtaaacagt tgattgaact gcctgaacta ccgcagccgg 2820agagcgccgg gcaactctgg ctcacagtac gcgtagtgca accgaacgcg accgcatggt 2880cagaagccgg gcacatcagc gcctggcagc agtggcgtct ggcggaaaac ctcagtgtga 2940cgctccccgc cgcgtcccac gccatcccgc atctgaccac cagcgaaatg gatttttgca 3000tcgagctggg taataagcgt tggcaattta accgccagtc aggctttctt tcacagatgt 3060ggattggcga taaaaaacaa ctgctgacgc cgctgcgcga tcagttcacc cgtgcaccgc 3120tggataacga cattggcgta agtgaagcga cccgcattga ccctaacgcc tgggtcgaac 3180gctggaaggc ggcgggccat taccaggccg aagcagcgtt gttgcagtgc acggcagata 3240cacttgctga tgcggtgctg attacgaccg ctcacgcgtg gcagcatcag gggaaaacct 3300tatttatcag ccggaaaacc taccggattg atggtagtgg tcaaatggcg attaccgttg 3360atgttgaagt ggcgagcgat acaccgcatc cggcgcggat tggcctgaac tgccagctgg 3420cgcaggtagc agagcgggta aactggctcg gattagggcc gcaagaaaac tatcccgacc 3480gccttactgc cgcctgtttt gaccgctggg atctgccatt gtcagacatg tataccccgt 3540acgtcttccc gagcgaaaac ggtctgcgct gcgggacgcg cgaattgaat tatggcccac 3600accagtggcg cggcgacttc cagttcaaca tcagccgcta cagtcaacag caactgatgg 3660aaaccagcca tcgccatctg ctgcacgcgg aagaaggcac atggctgaat atcgacggtt 3720tccatatggg gattggtggc gacgactcct ggagcccgtc agtatcggcg gaattccagc 3780tgagcgccgg tcgctaccat taccagttgg tctggtgtca aaaataataa taaccgggca 3840gggggatcgc agatcggcca gataccgatg ctgccgcagc aaaaagcagg agcagatgcc 3900gccgtcgcag saaagatgtc gcasaggagg aggcgatgct gccggcggag gaggcgaagt 3960aagtagaggg ctgggctggg ctgtgggggg gtgtggggtg cgggactggg cagtctggga 4020gtccctctca ccacttttct tacctttcta ggatgctgcc gtcgccgccg ctcatacacc 4080ataaggttaa aaaaatacta gatgcacaga atagcaagtc catcaaaact cctgcgtgag 4140aattttacca gacttcaaga gcatctcgcc acatcttgaa aaatgccacc gtccgatgaa 4200aaacaggagc ctgctaagaa acaatgccac ctgtcaataa atgttgaaaa ctcatcccat 4260tcctgcctct tggtccttgg gcttggggag gggtgcgcgg atgtggttag ggaacatgac 4320tggtcaaatg ggaagggctt caaaagaatt cccaatattg actaccaagc cacctgtaca 4380gatctgcctg catgctttgc atacttctgc ctgctgggga gcctggggac tttccacacc 4440ctaactgaca cacattccac agccggatct gaggaacccc tagtgatgga gttgg 449權(quán)利要求
1.一種傳送基因產(chǎn)物的方法，其中基因通過桿狀病毒載體提供，并且載體應用于無血或通常無血的身體區(qū)室。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中傳送是外膜周圍的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中基因產(chǎn)物是VEGF受體的激動劑。
4.根據(jù)前面任一項權(quán)利要求的方法，用來治療內(nèi)膜增生。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中區(qū)室含有動脈細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中區(qū)室含有腦細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中區(qū)室含有骨骼肌。
8.一種用來外膜周圍基因產(chǎn)物傳送的裝置，其中基因通過桿狀病毒載體提供，并且該基因可以從該載體中表達。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的裝置，其形式是環(huán)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的裝置，其形式是包裹物。
11.根據(jù)權(quán)利要求8到10中任一項的裝置，其中基因產(chǎn)物是VEGF受體的增效劑。
全文摘要
在基因產(chǎn)物的傳送方法中，基因通過桿狀病毒載體提供，并且載體應用在無血或通常是無血的身體區(qū)室中。在用于基因產(chǎn)物的外膜周圍傳送的裝置中，基因通過桿狀病毒載體提供，并且該基因可以在該桿狀病毒載體中表達。
文檔編號A61K35/76GK1430675SQ0181017
公開日2003年7月16日 申請日期2001年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月26日
發(fā)明者S·伊拉－赫圖阿拉, K·J·艾蘭尼 申請人:Ark治療學有限公司