專利名稱：中性纖維素酶催化核心及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
0003本發(fā)明涉及在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)高水平的新型截短型纖維素酶蛋白的方法，涉及通過遺傳工程技術(shù)產(chǎn)生的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體；以及涉及由此類轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的新型纖維素酶蛋白。新型纖維素酶蛋白是新型的纖維素酶催化核心。用本發(fā)明的纖維素酶核心結(jié)構(gòu)域處理含纖維素的織物被公開，其提供了減少的染料再沉淀以及增加的磨損的特殊優(yōu)勢。
背景技術(shù)：
0004纖維素酶是水解纖維素中β-D-葡萄糖苷鍵的酶。傳統(tǒng)上，纖維素水解酶已被劃分為三種主要類別內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或者纖維素生物水解酶以及β-葡萄糖苷酶(Knowles，J.等TIBTECH 5255-261(1987))。已知纖維素酶是由為數(shù)眾多的細(xì)菌、酵母和真菌產(chǎn)生的。
0005已被開發(fā)的使用纖維素水解酶的各種應(yīng)用中，主要的應(yīng)用涉及將(木質(zhì))纖維素漿降解為糖以用于(生物)乙醇生產(chǎn)、紡織品處理如“石洗(stonewashing)”和“生物拋光”以及用于去污劑組合物。同樣已知纖維素酶在用于去除污漬即清潔的去污劑組合物中是有用的。例如，英國(Great Britain)申請?zhí)?,075,028、2,095,275和2,094,826舉例說明了使用加入纖維素酶的去污劑的改善的清潔性能。此外，英國申請?zhí)?,358,599舉例說明了在去污劑中使用纖維素酶以減少含棉織物的粗糙感。
0006在處理紡織品的過程中，纖維素酶的另一個(gè)有用的特征是其具有通過使舊織物顏色更加鮮明而修理舊織物的能力。例如，反復(fù)洗滌含棉織物導(dǎo)致該織物產(chǎn)生灰色脫落物。據(jù)信是由于由機(jī)械作用引起的斷裂而雜亂無序的小纖維造成的，有時(shí)被稱為“起球”。這種灰色脫落物在有色的織物上特別明顯。因而，已發(fā)現(xiàn)纖維素酶去除纖維的無序表層并從而改善織物整體外觀的能力具有價(jià)值。因?yàn)樽鳛槔w維素酶的主要用途的去污劑，一般是在堿性條件下進(jìn)行操作，所以強(qiáng)烈需要在pH7-10下表現(xiàn)出高活性的纖維素酶。被充分表征的真菌纖維素酶，諸如來自異常腐質(zhì)霉(Humicola insolens)和里氏木霉(Trichoderma reesei)的那些纖維素酶，在中性至弱堿性pH條件下充分地發(fā)揮作用。大量在強(qiáng)堿性pH條件下表現(xiàn)纖維素酶活性的酶已從芽孢桿菌(Bacillus)和其它原核生物中分離出來，參見例如PCT公開文本號WO 96/34092和WO 96/34108。因此，不論是真菌纖維素酶還是細(xì)菌纖維素酶都已被充分研究。然而，第三類纖維素酶，即那些由放線菌(Actinomycete)中分離的纖維素酶，還較少引起關(guān)注。Wilson等，Critical Reviews Biotechnology，1245-63(1992)已經(jīng)研究了由褐色高溫單孢菌(Thermomonospora fusca)、彎曲高溫單孢菌(Thermonomospora curvata)和雙孢小雙孢菌(Microbispora bispora)所產(chǎn)生的纖維素酶，并表明許多此類纖維素酶表現(xiàn)出寬pH特征以及良好的溫度穩(wěn)定性。同樣，Nakai等Agric.Biol.Chem.，513061-3065(1987)和Nakai等Gene，65229-238(1988)已證實(shí)了來自鏈霉屬(Streptomyces)菌株KSM-9的耐堿型纖維素酶casA。此纖維素酶具有最適堿性pH和極好的溫度穩(wěn)定性。
0007盡管本領(lǐng)域的知識涉及許多具有期望特性的維素酶組合物，包括一些來自于放線菌的實(shí)例，但對于具有變化譜特征的新型纖維素酶仍有著持續(xù)的需求，所述新型纖維素酶用于例如紡織品處理、去污劑組合物的組分、漿和紙的處理、動物飼料添加劑、烘焙加工助劑和生物量轉(zhuǎn)化劑。申請人已發(fā)現(xiàn)了具有此類整套特征的纖維素酶，其在纖維素酶的這些已知的應(yīng)用方面是有用的。
發(fā)明概述0008本發(fā)明涉及纖維素酶催化核心的結(jié)構(gòu)域、構(gòu)建物、載體和宿主細(xì)胞，其包括一個(gè)或多個(gè)被可操縱地連接于異源編碼序列的啟動子序列。
0009根據(jù)本發(fā)明，提供新型纖維素酶或者所述纖維素酶的衍生物，其可從放線菌(Actinomycete)獲得。優(yōu)選地，本發(fā)明的纖維素酶包括根據(jù)圖1E(SEQ ID NO_)的氨基酸序列，或者與之具有95％以上序列同一性的衍生物。
0010本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的目的是提供具有優(yōu)異特性的新型纖維素酶，用于去污劑、處理紡織品、作為飼料添加劑以及用于漿和紙的制造。
0011在一種實(shí)施方式中，提供了一種編碼圖1E所示氨基酸序列的DNA序列。在此實(shí)施方式的一個(gè)方面，所述DNA序列在圖2中表示。
0012根據(jù)一種實(shí)施方式，提供了一種包括編碼本發(fā)明纖維素酶的DNA的組合物。優(yōu)選地，該DNA編碼一種根據(jù)圖1E(SEQ ID NO_)的氨基酸序列，或者與之具有76％以上序列同一性、優(yōu)選地80％以上序列同一性以及更優(yōu)選地90％以上序列同一性的衍生物和由此產(chǎn)生的纖維素酶。本發(fā)明進(jìn)一步包括與取自圖2中所示DNA的DNA探針在適宜條件下雜交的DNA以及由此產(chǎn)生的纖維素酶。
0013在另一實(shí)施方式中，提供了包含編碼圖1E所示氨基酸序列的DNA的載體。在此實(shí)施方式的一個(gè)方面，所述載體是pKB107。
0014在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了已用載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述載體包括編碼圖1E所示氨基酸序列的DNA。在一方面，當(dāng)宿主細(xì)胞是鏈霉菌屬某種時(shí)，宿主細(xì)胞可以任選地缺失cyc2基因(土臭味素通路基因(geosmin pathwaygene))。
0015在最后的實(shí)施方式中，提供了本文所述的新型纖維素酶催化核心結(jié)構(gòu)域的使用方法。
0016所述方法可以被用于使用本發(fā)明的纖維素酶核心結(jié)構(gòu)域處理含纖維素織物。所述方法提供了減少的染料再沉淀、增加的磨損、改善的織物手感(即變?nèi)彳?、光滑的織物表面、去除小球和/或防止起球的特殊優(yōu)勢。
0017在其它方面，所述方法被用于增強(qiáng)動物飼料的可消化性、用于去污劑、用于處理漿和紙以及用于生產(chǎn)淀粉和處理它們的副產(chǎn)品。
0018通過下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)勢將變得明顯起來。然而應(yīng)當(dāng)理解，詳細(xì)描述和具體實(shí)例盡管表明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但僅是以舉例說明的方式提供，因?yàn)楦鶕?jù)此詳細(xì)描述，在本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)的各種變化和修改對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是明顯的。


0019圖1舉例說明了多種纖維素酶蛋白。圖1A是前體蛋白(pre-protein)。圖1B是成熟的11AG8纖維素酶蛋白。圖1C是無CBD的233個(gè)氨基酸的11AG8纖維素酶蛋白。圖1D是無CBD的230個(gè)氨基酸的11AG8纖維素酶蛋白。圖1E是221個(gè)氨基酸的11AG8纖維素酶催化核心，即無CBD和接頭。信號序列為粉紅色。接頭長度為12個(gè)氨基酸，9個(gè)殘基為棕色，3個(gè)為紅色。233個(gè)氨基酸蛋白中的三個(gè)氨基酸為紅色(并僅在圖1A中加下劃線)。CBD為藍(lán)色。
0020圖2是一個(gè)DNA序列，其編碼11AG8纖維素酶的221個(gè)氨基酸催化核心。
0021圖3表示pSEGCT11 AG8載體，其包括來源于密蘇里游動放線菌(Actinoplanes missouriensis)的葡萄糖異構(gòu)酶啟動子、變鉛青鏈霉菌(S.lividans)纖維素酶celA的信號序列、編碼來自鏈霉菌屬某種的纖維素酶11AG8基因的多核苷酸、纖維素酶11AG3的終止子序列。
0022圖4表示pSEA4CT-11AG8載體，其包括來源于黑曲霉(Aspergillus niger)的A4啟動子、變鉛青鏈霉菌纖維素酶celA的信號序列、
編碼來自鏈霉菌屬某種的纖維素酶11AG8基因的多核苷酸、纖維素酶11AG3的終止子序列。
pSEGCT11AG8的GI啟動子已被用黑曲霉A4啟動子替換。
0023圖5表示pKB105的構(gòu)建策略。
0024圖6表示pKB105載體，其包括來源于黑曲霉的A4啟動子、變鉛青鏈霉菌纖維素酶celA的信號序列、編碼來自鏈霉菌屬某種的11AG8纖維素酶的221個(gè)氨基酸催化核心的多核苷酸、纖維素酶11AG3的終止子序列。
0025圖7表示pKB107載體，其是大腸桿菌(E.coli)序列已被去除的pKB105。
0026圖8表示各種纖維素酶樣品在本文所述NPC試驗(yàn)中的活性。50R6是來自商用生產(chǎn)菌株IndiAgeNeutra L的蛋白樣品。pKB105和pKB107是由各自載體表達(dá)的蛋白樣品。該催化核心表現(xiàn)出比商業(yè)產(chǎn)品更高的活性。
0027圖9是一張表現(xiàn)新型Neutra G磨損性能的圖(與商業(yè)產(chǎn)品IndiAgeNeutraG的性能相比)。不論是何種類型斜紋粗棉布，以65％的NPC活性添加的新型NeutraG表現(xiàn)出與以100％活性添加的IndiAgeNeutra G非常相近的磨損性能。當(dāng)以與IndiAgeNeutra G相同的活性添加時(shí)，新型Neutra G表現(xiàn)出明顯更高的磨損性能。
0028圖10是一張表現(xiàn)與商業(yè)產(chǎn)品IndiAgeNeutra G的性能相比，新型NeutraG的回染性能的圖。在相似磨損水平下，新型Neutra G和目前的商業(yè)IndiAgeNeutra G之間未觀察到明顯的回染性能。
0029圖11表示了IndiAgeNeutra L和KB107C的DSC溫度記錄圖。相對于IndiAgeNeutra L的67.87℃的熔點(diǎn)，KB107C分子具有68.7℃的熔點(diǎn)(Tm)，這表明KB107C更加穩(wěn)定。
發(fā)明詳述0030現(xiàn)在，本發(fā)明將通過僅使用下列定義和實(shí)施例作為參考的方式來加以詳細(xì)描述。此處所指的所有專利和出版物，包括此類專利和出版物中公開的所有序列，被特意明確并入本文作為參考。
0031除非在本文中另作定義，此處所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。Singleton等DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)和Hale&Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)為技術(shù)人員提供了有關(guān)本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語的普通字典。盡管與本文所述相似或等同的任何方法和材料都可以被用于本發(fā)明的實(shí)踐或檢測，但還是描述了優(yōu)選的方法和材料。數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)字。除非另作說明，分別地，核酸是按照5′至3′方向從左至右書寫；氨基酸序列是按照氨基至羧基方向從左至右書寫。對于本領(lǐng)域的定義和術(shù)語，專業(yè)人員具體參考Sambrook等1989和Ausubel FM等1993。應(yīng)當(dāng)理解，由于可以改變，本發(fā)明并非被限定于所述的具體方法、方案和試劑。
0032此處所提供的標(biāo)題并非是限定本發(fā)明的各個(gè)方面或?qū)嵤┓绞?，其可以作為整體通過參考說明書而被包含于其中。因此，下面即將被定義的術(shù)語作為整體通過參考說明書而被更充分地定義。
定義0033術(shù)語“核酸分子”包括RNA、DNA和cDNA分子。應(yīng)當(dāng)理解，由于遺傳密碼的簡并性，可以產(chǎn)生大量編碼給定蛋白諸如纖維素酶的核苷酸序列。本發(fā)明考慮了每一種編碼目前要求保護(hù)的纖維素酶的可能的變體核苷酸序列，考慮到遺傳密碼的簡并性，所有這些序列都是有可能的。
0034術(shù)語“氨基酸”包括涉及被整合入蛋白質(zhì)、多肽或肽(統(tǒng)稱為“多肽”)中的氨基酸。該氨基酸可以是天然存在的氨基酸，或者除非另作限定，可以包括天然氨基酸已知的類似物，其以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮作用。
0035“衍生物”是意欲表示一種來源于天然蛋白的多肽或蛋白質(zhì)，是通過在天然蛋白的C-末端、N-末端或者兩者上加入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，在天然氨基酸序列中的一個(gè)或大量不同位點(diǎn)置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，在天然蛋白的單個(gè)或兩個(gè)末端或者在該氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或者在天然氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而獲得的。酶衍生物的制品優(yōu)選地通過修飾編碼天然蛋白的DNA序列，將該DNA序列轉(zhuǎn)化進(jìn)合適的宿主并表達(dá)該修飾的DNA序列以形成衍生物酶而獲得。制備衍生物的可選方法是本領(lǐng)域所熟知的，并且包括例如，天然蛋白或其衍生物的蛋白水解切割。與前體酶的氨基酸序列(例如根據(jù)本發(fā)明的野生型或天然狀態(tài)的酶)相比，本發(fā)明纖維素酶的衍生物包括包含改變的氨基酸序列的肽，其保留了前體酶的特征性酶促特性，但在某些具體方面具有改變的特性。例如，改變的纖維素酶可以具有增加的最適pH或增加的溫度耐受性，但將保留其特征性纖維素水解活性。此外，如此處所用，當(dāng)涉及表達(dá)載體組分時(shí)，術(shù)語“來源于”表示與參考序列一致的序列是天然存在的或人工改造的變體，或者是化學(xué)合成的復(fù)制體(copy)或其變體，其保留了所需的功能。因此，來源于游動放線菌葡萄糖異構(gòu)酶基因的啟動子序列的參考將包括來自密蘇里游動放線菌葡萄糖異構(gòu)酶基因的功能性啟動子序列、來自改造的蛋白衍生物諸如GIT的功能性啟動子序列及類似物。(參見歐洲專利申請351029)。同樣，共同未決申請USSN 10/992,149中所述的啟動子(一種或多種)可在此處使用。
0036特定氨基酸序列的“保守取代”指對那些對于功能活性并非關(guān)鍵的氨基酸進(jìn)行的氨基酸取代，或者用其它具有相似特性(例如酸性的、堿性的、荷正電或負(fù)電的、極性的或非極性的等)的氨基酸進(jìn)行的氨基酸取代，以使對甚至關(guān)鍵氨基酸的取代也基本不改變活性。提供了功能上相似的氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域所熟知的。
0037術(shù)語“啟動子”在此被定義為一DNA序列，其結(jié)合RNA聚合酶并指導(dǎo)該聚合酶至感興趣編碼序列的正確的下游起始位點(diǎn)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄。術(shù)語“啟動子”也被理解為包括轉(zhuǎn)錄為mRNA后用于翻譯的5’非編碼區(qū)(在啟動子和翻譯起點(diǎn)之間)和順式作用轉(zhuǎn)錄控制元件諸如增強(qiáng)子。該啟動子對于在鏈霉菌中表達(dá)感興趣的編碼序列是有效的。
0038當(dāng)一核酸與另一核酸序列被以功能相關(guān)方式放置時(shí)，則該核酸被“可操縱地連接”。例如，如果編碼分泌前導(dǎo)物即信號肽的DNA被表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白，則該信號肽的DNA被可操縱地連接于編碼多肽的DNA；如果啟動子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則其被可操縱地連接于該序列；或者如果放置核糖體結(jié)合位點(diǎn)以利于翻譯，則該核糖體結(jié)合位點(diǎn)被可操縱地連接于編碼序列。一般而言，“可操縱地連接”表示被連接的DNA序列是相鄰的，且在分泌前導(dǎo)物的情況下，是相鄰的并處于閱讀相。然而，增強(qiáng)子不必是相鄰的。連接是通過在方便的限制性位點(diǎn)進(jìn)行連接反應(yīng)完成的。如果此類位點(diǎn)不存在，則根據(jù)常規(guī)實(shí)踐，使用合成的寡核苷酸連接物或接頭。
0039如此處所用，術(shù)語“基因”表示涉及產(chǎn)生多肽鏈的DNA片段，其可以包括或者可以不包括編碼序列之前和之后的區(qū)域，例如5′非翻譯(5′UTR)或″前導(dǎo)″序列和3′UTR或″末尾″序列，以及單個(gè)編碼片段(外顯子)間的插入序列(內(nèi)含子)。
0040當(dāng)被用于有關(guān)核酸部分時(shí)，術(shù)語“異源的”表示該核酸包括兩種或多種亞序列，其在自然界中正常情況下相互間未發(fā)現(xiàn)處于相同的關(guān)系。例如，核酸典型地通過重組產(chǎn)生，其具有兩種或多種序列，例如來自不相關(guān)的基因，它們被排列以產(chǎn)生新的功能性核酸，例如來自一種來源的啟動子和來自另一種來源的編碼區(qū)。同樣，異源蛋白通常將指兩種或多種亞序列，其在自然界中相互間未發(fā)現(xiàn)處于相同的關(guān)系(例如融合蛋白)。
0041如此處所用，術(shù)語“分離的”或“純化的”指從與其天然相關(guān)的至少一種組分中移出的核酸或者氨基酸。
0042在本上下文中，術(shù)語“基本純的多肽”表示含有按重量計(jì)至多10％(10wt.％)與其天然相關(guān)的其它多肽物質(zhì)的多肽制品(優(yōu)選更低百分比的其它多肽物質(zhì)，例如，至多8wt.％、至多6wt.％、至多5wt.％、至多4wt.％、至多3wt.％、至多2wt.％、至多1wt.％和至多1/2wt.％)。因此，優(yōu)選基本純的多肽為至少92％的純度，即該多肽占多肽制品中存在的總多肽物質(zhì)的至少92wt.％，且優(yōu)選更高的百分比諸如至少94％的純度、至少95％的純度、至少96％的純度、至少97％的純度、至少98％的純度、至少99％和至多99.5％的純度。此處所公開的多肽優(yōu)選地為基本純的形式。具體而言，優(yōu)選此處所公開的多肽為“基本純的形式”，即該多肽制品基本上無與其天然相關(guān)的其它多肽物質(zhì)。這可以通過例如用已熟知的重組方法制備該多肽來完成。據(jù)此，術(shù)語“基本純的多肽”與術(shù)語“分離的多肽”和“分離形式的多肽”含義相同。
0043術(shù)語“重組體”當(dāng)被用于涉及例如細(xì)胞、或核酸、蛋白或載體時(shí)，表示該細(xì)胞、核酸、蛋白或載體通過導(dǎo)入異源核酸或蛋白或者通過改變天然核酸或蛋白已被改造，或者表示該細(xì)胞來源于被如此改造的細(xì)胞。因此，例如，重組體細(xì)胞表達(dá)在天然(非重組)形式的細(xì)胞中不曾發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達(dá)在其他情況下異常表達(dá)、表達(dá)不足或完全不表達(dá)的天然基因。
0044術(shù)語“分泌型信號肽”表示編碼多肽(“分泌肽(secretory peptide)”)的DNA序列，作為較大多肽的組成部分，其引導(dǎo)該較大多肽經(jīng)過合成該多肽的細(xì)胞的分泌通道。在通過分泌通道運(yùn)輸期間，該較大的多肽通常被切割以去除分泌肽。
0045“載體”指被設(shè)計(jì)為將核酸導(dǎo)入一種或多種細(xì)胞類型的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌粒、盒以及類似載體。
0046如此處所用，“表達(dá)載體”表示一種DNA構(gòu)建物，其包含被可操縱地連接于合適的調(diào)控序列的DNA序列，所述調(diào)控序列能夠影響該DNA在合適宿主中的表達(dá)。此類調(diào)控序列可以包括影響轉(zhuǎn)錄的啟動子、控制轉(zhuǎn)錄的任選的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、增強(qiáng)子以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。“表達(dá)載體”可以重組生成或合成產(chǎn)生，其帶有一系列具體的核酸元件，這些元件允許特定核酸在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。
0047術(shù)語“選擇性標(biāo)記”指一種能夠在宿主中表達(dá)的基因，其使對含有導(dǎo)入的核酸或載體的宿主進(jìn)行選擇變得容易?？蛇x擇性標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于抗微生物劑(例如潮霉素、博來霉素或氯霉素)和/或賦予宿主細(xì)胞代謝優(yōu)勢諸如營養(yǎng)優(yōu)勢的基因。
0048“宿主株”或“宿主細(xì)胞”表示用于表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物的合適宿主，該表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物包含編碼根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶的多核苷酸。具體而言，宿主株可以是細(xì)菌諸如鏈霉菌屬某種或者芽孢桿菌屬某種。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，“宿主細(xì)胞”表示由絲狀真菌菌株細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞和原生質(zhì)體，且具體而言是木霉屬某種(Trichoderma sp.)或曲霉屬某種(Aspergillus sp.)。
優(yōu)選實(shí)施方式A.宿主生物0049根據(jù)本發(fā)明可以被使用的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌和真菌細(xì)胞。優(yōu)選的真菌宿主細(xì)胞包括絲狀真菌細(xì)胞諸如曲霉屬(Trichoderma)細(xì)胞和木霉屬(Aspergillus)細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)菌宿主細(xì)胞包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、放線菌屬(Actinomyces)和鏈霉菌屬(Streptomyces)細(xì)胞。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、緩慢芽孢桿菌(B.Lentus)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、淀粉液化芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、凝結(jié)芽胞桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、B.lautus、巨大芽胞桿菌(B.megatherium)和蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞還包括鏈霉屬細(xì)胞，諸如灰色鏈霉菌(S.griseus)、變鉛青鏈霉菌(S.lividans)、S.rubiginosis、納塔爾鏈霉菌(S.natalensis)、天藍(lán)色鏈霉菌(S.coelicolor)和阿維鏈霉菌(S.avermitilis)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是變鉛青鏈霉菌(S.lividans)的菌株，且最特別優(yōu)選的為菌株TK23和/或TK24。
0050在一種實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞已被改造以減少或消除土臭味素或類土臭味素化合物的產(chǎn)生。土臭味素(geosmin)是由常見的細(xì)菌，鏈霉菌屬某種產(chǎn)生的化學(xué)物。這是一個(gè)希臘詞，翻譯為“土壤的臭味(smell of earth)”。因此，土臭味素或類土臭味素化合物的減少或消除將產(chǎn)生臭味較少的組合物。
B.DNA構(gòu)建物和載體0051本發(fā)明的核酸構(gòu)建物包括編碼新型纖維素酶的序列，可以通過已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備，例如Beaucage和Caruthers(1981)Tetrahedron Letters221859-1869所描述的亞磷酰胺方法或Matthes等(1984)EMBO Journal 3801-805所描述的方法。核酸構(gòu)建物可以是混合的合成來源與基因組來源，并可以通過連接合成DNA片段或基因組DNA片段加以制備。核酸構(gòu)建物也可以使用特定引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)加以制備，例如如美國專利號4,683,202或Saiki等Science 239(1988)，487-491中所述。
0052本發(fā)明的DNA構(gòu)建物可以被插入載體，諸如表達(dá)載體。各種適合于在真菌、酵母和細(xì)菌中克隆、轉(zhuǎn)化和表達(dá)多肽的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一般地，該載體或盒將包含本發(fā)明的啟動子、任選的信號序列、感興趣的編碼區(qū)和終止子序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，載體將包括一個(gè)或多個(gè)位于信號序列和終止子序列間的克隆位點(diǎn)。
0053在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，當(dāng)纖維素酶基因被轉(zhuǎn)入鏈霉菌宿主細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)化作用包括使用載體，其包括本發(fā)明的啟動子、編碼來源于鏈霉菌纖維素酶基因的信號序列的核酸，優(yōu)選變鉛青鏈霉菌纖維素酶基因、以及編碼細(xì)菌纖維素酶的多核苷酸，具體而言，是來源于鏈霉菌菌株的纖維素酶基因，最特別地，是變鉛青鏈霉菌纖維素酶基因。該信號序列也可以來源于鏈霉菌菌株具體而言變鉛青鏈霉菌的其它信號序列。
0054可以被用于本發(fā)明實(shí)踐的示例性載體包括pSEGCT、pSEGCT11AG8和pSEACT。此類載體的構(gòu)建是本領(lǐng)域所熟知的，并參考美國專利號6,287,839；美國專利號6,562,612和國際公布號WO 02/50245。pSEGCT的構(gòu)建涉及使用兩種質(zhì)粒，pIJ486，其在Ward等(1986)Mol.Gen.Genet.203468-478中有所描述，和pIJ488，其在Yanisch-Perron等(1985)Gene 33103-119中有所描述。此外，參考了Hopwood等(1983)J.Gen.Microbiol.1292257-2260?？梢允褂玫钠渌d體包括pSEA4CT-11AG8、pKB105和pKB107，如實(shí)施例中所述。
C.宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化0055本發(fā)明的載體將被轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞。一般的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(Ausubel等1994，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY和Campbell等1989 Curr.Genet 1653-56)。一些此類一般技術(shù)包括，但不限于使用微?；蚧驑?生物射彈法)、在轉(zhuǎn)化過程前對絲狀真菌細(xì)胞壁進(jìn)行滲透(例如通過使用高濃度的堿，例如0.05M至0.4M CaCl2或者乙酸鋰)、原生質(zhì)體融合、電穿孔或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利號6,255,115)以及在Campbell等(1989)Curr.Genet.1653-56，1989和Penttila，M等(1988)Gene，6311-22中描述的用聚乙二醇和CaCl2處理原生質(zhì)體或原生質(zhì)球。
0056細(xì)菌的轉(zhuǎn)化和表達(dá)方法在Brigidi，DeRossi，Bertarini、Riccardi和Matteuzzi(1990)，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett. 55135-138中公開。在Ferrari等美國專利號5,264,366中提供了優(yōu)選的用于蛋白酶缺失芽孢桿菌菌株的優(yōu)選的通用轉(zhuǎn)化和表達(dá)流程。
0057鏈霉菌的轉(zhuǎn)化和表達(dá)可以在Hopwood等GENETIC MANIPULATION OFSTREPTOMYCESA LABORATORY MANUAL，(1985)John Innis Foundation，Norwich UK中發(fā)現(xiàn)。
0058在其它實(shí)施方式中，曲霉和木霉的轉(zhuǎn)化和表達(dá)被在例如美國專利號5,364,770；美國專利號6,022,725和Nevalainen等1992，The Molecular Biology ofTrichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous andHeterologous Genes，in MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY，Eds.Leon andBerka，Marcel Dekker，Inc.pp.129-148中加以描述。
D.細(xì)胞培養(yǎng)0059宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以被培養(yǎng)在常規(guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中?？梢詫⒂糜诒晦D(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基修改為適于活化啟動子并選擇轉(zhuǎn)化體。具體培養(yǎng)條件諸如溫度、pH以及類似條件，可以是用于宿主細(xì)胞的那些條件，所述宿主細(xì)胞是經(jīng)挑選用于表達(dá)的，而且這些條件對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯然的。此外，優(yōu)選的培養(yǎng)條件可以在科技文獻(xiàn)諸如Sambrook，(1982)supra；Kieser，T，MJ.Bibb，MJ.Buttner，KF Chater，和D.A.Hopwood(2000)PRACTICAL STREPTOMYCESGENETICS.John Innes Foundation，Norwich UK；Harwood等(1990)MOLECULARBIOLOGICAL METHODS FOR BACILLUS，John Wiley中和/或從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；www.atcc.org)中發(fā)現(xiàn)。真菌宿主細(xì)胞諸如木霉細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體，一般可以通過其較快的生長速率或在固體培養(yǎng)基上形成具有光滑而非粗糙輪廓的圓形克隆而與不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體相區(qū)別。
E.表達(dá)的多肽的回收0060由轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽可以通過常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括從培養(yǎng)基中通過離心或過濾分離宿主細(xì)胞，或者如有必要，破裂細(xì)胞并從細(xì)胞碎片和沉淀物移取上清液。
F.純化蛋白的方法0061一般在澄清之后，將上清或?yàn)V液中的蛋白質(zhì)組分通過鹽例如硫酸銨的方法加以沉淀。然后將沉淀的蛋白質(zhì)溶解并通過各種色譜方法例如離子交換色譜、凝膠過濾色譜、親合色譜以及其它本領(lǐng)域承認(rèn)的方法加以純化。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，為了纖維素酶的生產(chǎn)，優(yōu)選在堿性條件下使用含基于纖維素酶的能量源的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
G.應(yīng)用0062根據(jù)本發(fā)明的紡織品處理考慮用包含本發(fā)明纖維素酶的組合物進(jìn)行紡織品加工或清潔。此類處理包括，但不限于石洗、改變含纖維素織物的質(zhì)地、觸感和/或外觀、或者在含纖維素織物的制造或清潔/修復(fù)過程中所用的其它技術(shù)。此外，本發(fā)明上下文中的處理考慮從纖維素織物或纖維中去除“未成熟”棉或“死”棉。未成熟棉明顯比成熟棉更加無定形，原因在于例如不均勻的染色。織物使用某些標(biāo)準(zhǔn)諸如織物的厚度、柔軟度、硬度、光滑度和豐度(fullness)來進(jìn)行主觀評價(jià)?？椢锸指兄溉擞捎|覺得到的對于紡織品材料的主觀評價(jià)，具體而言是柔軟度，并由專家小組各成員評價(jià)，從而產(chǎn)生專家組分?jǐn)?shù)(panel score)。可選地，手感可以使用Kawabata評估體系進(jìn)行客觀地評價(jià)。參見例如，Kawabata，S.，″The Standardizationand Analysis of Hand Evaluation，″Textile Machinery Society of Japan，Osaka，1980。
0063本發(fā)明所考慮的組合物進(jìn)一步包括用于清洗污染的、制成的含纖維素織物的纖維素酶組分。例如，本發(fā)明的纖維素酶可以被用于洗衣店所用的去污劑組合物。根據(jù)本發(fā)明有用的去污劑組合物包括特殊的配方諸如預(yù)洗、預(yù)浸以及家用彩色修理組合物。如此處所述，此類處理組合物可以是需要稀釋的濃縮物的形式或稀溶液的形式，其可以直接應(yīng)用于含纖維素織物。用于紡織品纖維素酶處理的一般處理技術(shù)在例如歐洲專利公布號220 016以及英國申請?zhí)?,368,599和2,095,275中被加以描述。
0064出于本領(lǐng)域已知的目的，根據(jù)本發(fā)明對纖維素物質(zhì)進(jìn)行處理進(jìn)一步考慮對動物飼料、漿和/或紙、食品以及谷物進(jìn)行處理。例如，已知纖維素酶能夠提高動物飼料的價(jià)值、改善木漿的排水性能、強(qiáng)化食品，以及在谷物的濕法碾磨加工或干法碾磨加工過程中減少谷物中的纖維。
0065用本文所述的纖維素酶處理廢紙可以使紙脫墨。因此，在由廢紙加工再循環(huán)紙的過程中，使用本文中所述的纖維素酶可以極大地減少殘留墨跡的纖維，從而提高廢紙的白度?？梢员挥糜诒景l(fā)明的廢紙的實(shí)例包括用過的印刷紙諸如舊報(bào)紙、舊雜志紙和含機(jī)械漿和化學(xué)漿的低等級或中等級舊印刷紙；包含化學(xué)漿的用過的無木材紙；及其包被的紙。此處所用的術(shù)語“脫墨劑”表示那些在廢紙脫墨過程中通常使用的藥品，包括堿諸如NaOH或Na2CO3、硅酸鈉、過氧化氫、磷酸鹽、陰離子或非離子表面活性劑、捕集劑諸如油酸、pH穩(wěn)定劑如助劑、螯合劑或分散劑。
0066用本文所述的纖維素酶處理紙漿可以在不明顯降低其強(qiáng)度的條件下顯著改善紙漿的游離度(排水性)。因此，本纖維素酶提供了一種改善紙漿游離度的方法，包括用本文所述的纖維素酶處理紙漿的步驟。可以通過本發(fā)明的方法進(jìn)行處理的紙漿實(shí)例包括廢紙紙漿、再循環(huán)紙板紙漿、牛皮紙漿、亞硫酸鹽漿或加工/熱處理的紙漿以及其它高產(chǎn)率紙漿。
0067此外，動物飼料中葡聚糖的可消化性可以通過在此類飼料中使用本文所述的纖維素酶而得以改善。因此，此處所提供的是一種改善動物飼料的可消化性的方法，包括用本文所述的纖維素酶處理動物飼料的步驟。
0068根據(jù)本發(fā)明的處理包括制備水溶液，其含有有效量的纖維素酶或者纖維素酶與其它任選組分的組合，所述其它任選組分包括，例如緩沖液、表面活性劑和/或分散劑。有效量的纖維素酶組合物是指纖維素酶的濃度足以達(dá)到預(yù)期的目的。因此，例如在根據(jù)本發(fā)明的石洗組合物中“有效量的”纖維素酶是指將提供預(yù)期效果的量，例如在接縫和布塊(fabric panel)上產(chǎn)生穿舊的且退色的外觀。同樣，組合物中意欲用于改善含纖維素織物的手感和/或外觀的“有效量”的纖維素酶是指其量在手感方面產(chǎn)生可測量的改善，例如改善織物的光滑度或外觀，例如去除容易降低織物外觀清晰度的起球和小纖維。所使用的纖維素酶的量還決定于所用的設(shè)備、所用的加工參數(shù)(纖維素酶處理溶液的溫度、暴露于纖維素酶的時(shí)間及類似的參數(shù))、纖維素酶活性(例如當(dāng)與較低活性的纖維素酶組合物相比，使用較高活性的纖維素酶組合物的特定溶液將要求較低的纖維素酶濃度)以及織物類型。含水處理溶液中的纖維素酶的準(zhǔn)確濃度可以由普通技術(shù)人員根據(jù)以上各因素以及所期望的結(jié)果容易地確定，所述含水處理溶液中將加入將要被處理的織物。在石洗過程中，一般優(yōu)選地，纖維素酶以大約0.5至5,000ppm且最優(yōu)選地大約10至200ppm總蛋白的濃度存在于含水處理溶液中。在用于改善含纖維素織物的手感和/或外觀的組合物中，一般優(yōu)選地，纖維素酶以大約0.1至2,000ppm且最優(yōu)選地大約0.5至200ppm總蛋白的濃度存在于含水處理溶液中。
0069在一種優(yōu)選的處理實(shí)施方式中，緩沖液被應(yīng)用于該處理組合物，以便使緩沖液的濃度足以使溶液的pH保持在使所用纖維素酶顯示出活性的范圍內(nèi)。纖維素酶顯示活性時(shí)的pH決定于所用纖維素酶的特性。所用緩沖液的準(zhǔn)確濃度將決定于若干因素，技術(shù)人員可以容易地考慮這些因素。例如，在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，對緩沖液以及緩沖液濃度進(jìn)行選擇以便將最終纖維素酶溶液的pH保持在最適纖維素酶活性所要求的pH范圍內(nèi)。本發(fā)明纖維素酶的最適pH范圍的測定可以根據(jù)熟知的技術(shù)加以確定。pH在所述纖維素酶的活力范圍內(nèi)的合適緩沖液對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是熟知的。
0070除纖維素酶與緩沖液之外，所述處理組合物可以任選地含有表面活性劑。合適的表面活性劑包括與所用的纖維素酶以及織物相容的任何表面活性劑，包括例如陰離子、非離子以及兩性表面活性劑。合適的陰離子表面活性劑包括，但不限于直鏈或支鏈烷基苯磺酸鹽；含有直鏈或支鏈烷基基團(tuán)或烯基基團(tuán)的烷基或烯基醚磺酸酯；烷基或烯基磺酸鹽；烯烴磺酸鹽；鏈烷磺酸鹽及類似物。陰離子表面活性劑的合適的相反離子包括，但不限于堿金屬離子諸如鈉和鉀；堿土金屬離子諸如鈣和鎂；銨離子；以及含有碳數(shù)2或3的1至3個(gè)烷醇基團(tuán)的鏈烷醇胺。兩性表面活性劑包括，例如季銨鹽磺酸鹽和三甲銨乙內(nèi)酯型兩性表面活性劑。此類兩性表面活性劑在同一分子中同時(shí)具有正電基團(tuán)和負(fù)電基團(tuán)。非離子型表面活性劑一般包括聚乙二醇醚、以及高級脂肪酸的鏈烷醇酰胺或其環(huán)氧烷烴加合物、和脂肪酸甘油單酯。表面活性劑的混合物也可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式加以利用。
0071可以制備濃縮的纖維素酶組合物用于本文所述的方法中。此類濃縮物包含濃縮量的上述纖維素酶組合物、緩沖液和表面活性劑，優(yōu)選地在水溶液中。當(dāng)如此配制時(shí)，纖維素酶濃縮物可以用水容易地稀釋以便迅速而準(zhǔn)確地制備含有所需濃度的每種組分的纖維素酶制劑。在配制含水濃縮物時(shí)，可以將這些濃縮物稀釋以便達(dá)到如上所示的纖維素酶溶液中所需的組分濃度。顯而易見，此類纖維素酶濃縮物使得能夠容易地配制纖維素酶溶液，并使得能夠切實(shí)可行地將此組合物輸送至將被使用的部位。該處理濃縮物可以是本領(lǐng)域已知的任何形式，例如液體、乳劑、凝膠或軟膏。此類形式是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
0072在使用固體纖維素酶濃縮物時(shí)，該纖維素酶組合物可以是顆粒、粉末、附聚物或固體盤?？梢耘渲祁w粒以便包含各種物質(zhì)從而降低顆粒溶入洗滌介質(zhì)的速率。此類物質(zhì)和顆粒在美國專利號5,254,283中被公開，該專利以其整體并入本文作為參考。
0073如果需要，其它物質(zhì)也可以與本發(fā)明的纖維素酶組合物一起使用或者放入本發(fā)明的纖維素酶組合物中，包括石料、浮石、填充劑、溶劑、酶活化劑和抗再沉淀劑，這取決于組合物的最終用途。
0074以舉例方式，將具體描述石洗的方法，但是，所述參數(shù)可被技術(shù)人員方便地修改以用于其它應(yīng)用，即改善纖維的手感和/或外觀。將含纖維素織物與含纖維素酶的石洗組合物接觸，并因此使纖維素酶與織物接近，所述石洗組合物通過將處理組合物與石洗組合物相混合而含有有效量的纖維素酶。隨后，將含纖維素酶的水溶液與織物攪動。如果處理組合物是水溶液，則可以將織物直接浸入溶液。同樣，當(dāng)石洗組合物是濃縮物時(shí)，將濃縮物稀釋入裝有含纖維素織物的水浴中。當(dāng)石洗組合物為固體形式例如預(yù)洗凝膠或固體棒時(shí)，石洗組合物可以通過將組合物直接應(yīng)用于織物或者應(yīng)用于洗滌液而與織物相接觸。
0075在能夠有效地進(jìn)行酶促作用以賦予含纖維素織物石洗外觀的條件下，將含纖維素的織物與石洗溶液一起溫育。例如，在石洗過程中可以調(diào)整pH、液體比例、溫度和反應(yīng)時(shí)間從而優(yōu)化石洗組合物起作用的條件?！坝行l件”必然是指pH、液體比例和溫度，其使得纖維素酶能夠與含纖維素織物有效地進(jìn)行反應(yīng)，在此情況下以產(chǎn)生石洗效果。將本發(fā)明使用石洗組合物的條件最大化是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)的。
0076此處所用的石洗過程中的液體比例，即石洗組合物溶液(即洗滌液)的重量與織物重量之比，一般是足以獲得預(yù)期的斜紋粗棉布織物石洗效果的量，并決定于所使用的方法。優(yōu)選地，液體比例為大約3∶1至大約50∶1；更優(yōu)選地大約5∶1至大約20∶1；且最優(yōu)選地大約10∶1至大約15∶1。
0077使用本石洗組合物的石洗過程中的反應(yīng)溫度受兩個(gè)競爭性因素控制。首先，較高的溫度一般對應(yīng)于增強(qiáng)的反應(yīng)動力學(xué)，即更快的反應(yīng)，與在較低溫度下所需的反應(yīng)時(shí)間相比，其允許減少反應(yīng)時(shí)間。因此，反應(yīng)溫度一般是至少大約10℃以及更高。其次，纖維素酶是一種蛋白質(zhì)，其在超出給定的反應(yīng)溫度時(shí)損失活力，該溫度決定于所用纖維素酶的性質(zhì)。因此，如果使反應(yīng)溫度上升過高，將因?yàn)槔w維素酶的變性而損失纖維素水解活性。盡管本領(lǐng)域中纖維素酶使用的標(biāo)準(zhǔn)溫度一般為范圍35℃至65℃，且同樣期望這些條件適于本發(fā)明的纖維素酶，但是對于所用的具體纖維素酶，最佳的溫度條件應(yīng)當(dāng)根據(jù)的熟知的技術(shù)加以確定。
0078反應(yīng)時(shí)間決定于進(jìn)行石洗的具體條件。例如，纖維素酶的pH、溫度和濃度都將影響最適反應(yīng)時(shí)間。一般而言，反應(yīng)時(shí)間為大約5分鐘至大約5小時(shí)，且優(yōu)選地大約10分鐘至大約3小時(shí)，更優(yōu)選地，大約20分鐘至大約1小時(shí)。
0079根據(jù)本發(fā)明的仍一優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的纖維素酶可以被應(yīng)用于去污劑組合物。根據(jù)本發(fā)明的去污劑組合物被用作預(yù)洗組合物、預(yù)浸組合物，或者用于常規(guī)清洗或漂洗循環(huán)過程中的清潔。優(yōu)選地，本發(fā)明的去污劑組合物包括有效量的纖維素酶、表面活性劑，且任選地包括以下所述的其它組分。
0080本發(fā)明的去污劑組合物中所用的有效量的纖維素酶，其量足以提供由纖維素酶在含纖維素織物上所產(chǎn)生的理想的效果，例如去球、軟化、抗起球、表面小纖維的清除、抗泛灰以及清潔。優(yōu)選地，去污劑組合物中的纖維素酶以濃度為去污劑的大約10ppm至大約20,000ppm使用。
0081去污劑組合物中所用的纖維素酶的濃度經(jīng)優(yōu)選地選擇，以使得當(dāng)稀釋入洗滌介質(zhì)后，纖維素酶的濃度范圍為大約0.01至大約1000ppm，優(yōu)選地大約0.02至大約500ppm，且最優(yōu)選地大約0.5至大約250ppm的總蛋白。去污劑組合物中所用纖維素酶的量將決定于該去污劑在被加入水中以形成洗滌溶液時(shí)將被稀釋的程度。
0082本發(fā)明的去污劑組合物可以是本領(lǐng)域所認(rèn)知的任何形式，例如，如液體、顆粒、乳劑、凝膠或軟膏形式。此類形式是技術(shù)人員所熟知的。當(dāng)使用固體去污劑組合物時(shí)，優(yōu)選地將纖維素酶配制為顆粒。優(yōu)選地，可以將顆粒配制為使其額外地含有纖維素酶保護(hù)劑。可以將顆粒配制為使其含有降低顆粒溶于洗滌介質(zhì)的溶解速率的物質(zhì)。此類物質(zhì)和顆粒在美國專利號5,254,283中被公開，該專利被整體并入本文作為參考。
0083本發(fā)明的去污劑組合物使用表面活性試劑，即表面活性劑，包括陰離子、非離子和兩性表面活性劑，它們在去污劑組合物中的用途是熟知的。
0084適用于本發(fā)明的去污劑組合物的陰離子表面活性劑包括直鏈或支鏈烷基苯磺酸鹽；含有直鏈或支鏈烷基基團(tuán)或烯基基團(tuán)的烷基或烯基醚磺酸酯；烷基或烯基磺酸鹽；烯烴磺酸鹽；鏈烷磺酸鹽。陰離子表面活性劑的合適的相反離子包括堿金屬離子諸如鈉和鉀；堿土金屬離子諸如鈣和鎂；銨離子；以及含有碳數(shù)2或3的1至3個(gè)烷醇基團(tuán)的鏈烷醇胺。兩性表面活性劑包括，例如季銨鹽磺酸鹽和三甲銨乙內(nèi)酯型兩性表面活性劑。此類兩性表面活性劑在同一分子中同時(shí)具有正電基團(tuán)和負(fù)電基團(tuán)。非離子型表面活性劑一般包括聚乙二醇醚、以及高級脂肪酸鏈烷醇酰胺或其環(huán)氧烷烴加合物、和脂肪酸甘油單酯以及類似物。適用于本發(fā)明的表面活性劑在英國專利申請?zhí)? 094 826 A中公開，其公開內(nèi)容在此被并入本文作為參考。也可以使用此類表面活性劑的混合物。一般被用于本發(fā)明去污劑組合物的表面活性劑或表面活性劑混合物的量為總?cè)ノ蹌┙M合物的大約1wt.％至大約95wt.％，且優(yōu)選地為總?cè)ノ蹌┙M合物的大約5wt.％至大約45wt.％。除纖維素酶組合物和表面活性劑(一種或多種)外，本發(fā)明的去污劑組合物可以任選地含有一種或多種下列組分除纖維素酶外的水解酶0085合適的水解酶包括作用于酯鍵的羧酸酯水解酶、硫酯水解酶、磷酸單酯水解酶和磷酸二酯酶；作用于糖基化合物的葡糖苷水解酶；水解N-糖基化合物的酶；作用于醚鍵的硫醚水解酶；以及α-氨基-?；?肽水解酶、肽基-氨基酸水解酶、?；?氨基酸水解酶、二肽水解酶、以及作用于肽鍵的肽基-肽水解酶。其中優(yōu)選的是羧酸酯水解酶、葡糖苷水解酶和肽基-肽水解酶。合適的水解酶包括(1)屬于肽基-肽水解酶的蛋白酶，諸如胃蛋白酶、胃蛋白酶B、凝乳酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶A、胰凝乳蛋白酶B、彈性蛋白酶、腸激酶、組織蛋白酶C、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、無花果蛋白酶、凝血酶、纖維蛋白溶酶、高血壓蛋白原酶、枯草桿菌蛋白酶、曲霉菌肽酶A(aspergillopeptidase A)、膠原酶、梭菌肽酶B(clostridiopeptidase B)、激肽釋放酶、gastrisin、組織蛋白酶D、菠蘿蛋白酶、角蛋白酶、胰凝乳蛋白酶C、胃蛋白酶C、曲霉菌肽酶B(aspergillopeptidase B)、尿激酶、羧肽酶A和B、以及氨基肽酶；
(2)葡糖苷水解酶(為主要成分的纖維素酶被排除在本組之外)α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、溶菌酶、果膠酶、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶。其中優(yōu)選的是α-淀粉酶和β-淀粉酶。它們在酸性至中性體系中發(fā)揮作用，但從細(xì)菌中獲得的一種酶在堿性體系中表現(xiàn)出高活性；(3)羧酸酯水解酶，包括羧基酯酶、脂肪酶、果膠酯酶和葉綠素酶。其中特別有效的是脂肪酶。
0086根據(jù)目的所需，將除纖維素酶外的水解酶加入去污劑組合物。依據(jù)純化的蛋白，應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地以0.001t.％至5wt.％，且更優(yōu)選地0.02wt.％至3wt.％的量加入水解酶。此酶應(yīng)當(dāng)以顆粒形式使用，所述顆粒由粗制酶單獨(dú)制成或者由粗制酶與去污劑組合物中的其它組分組合制成。粗制酶的顆粒以純化酶占顆粒的0.001wt.％至50wt.％的量使用。該顆粒以0.002wt.％至20wt.％且優(yōu)選地0.1wt.％至10wt.％的用量使用。當(dāng)與纖維素酶一起使用時(shí)，這些顆?？梢员慌渲茷楹忻副Ｗo(hù)劑和溶解延遲物質(zhì)。
陽離子表面活性劑和長鏈脂肪酸鹽0087此類陽離子表面活性劑和長鏈脂肪酸鹽包括飽和或不飽和脂肪酸鹽、烷基或烯基醚的羧酸鹽、α-硫代脂肪酸鹽或酯、氨基酸型表面活性劑、磷酸酯表面活性劑、包括那些具有3至4個(gè)烷基取代基以及多至1個(gè)苯基取代的烷基取代基的季銨鹽。合適的陽離子表面活性劑和長鏈脂肪酸鹽在英國專利申請?zhí)? 094 826 A中被公開，其公開內(nèi)容在此被并入本文作為參考。該組合物可以含有大約1wt.％至大約20wt.％的此類陽離子表面活性劑和長鏈脂肪酸鹽。
助洗劑A.二價(jià)螯合劑0088該組合物可以含有大約0wt.％至大約50wt.％的一種或多種助劑組分，選自下列化合物的堿金屬鹽和鏈烷醇胺鹽磷酸鹽、膦酸鹽、膦基羧酸鹽、氨基酸鹽、氨基聚乙酸鹽高分子電解質(zhì)、非解離聚合物(non-dissociating polymers)、二羧酸鹽和鋁硅酸鹽。合適的二價(jià)螯合劑在英國專利申請?zhí)? 094 826 A中被公開，其公開內(nèi)容在此被并入本文作為參考。
B.堿金屬或無機(jī)電解質(zhì)0089該組合物可以含有基于組合物的大約1至大約50wt.％，優(yōu)選地大約5至大約30wt.％下列化合物的一種或多種堿金屬鹽，如堿或無機(jī)電解質(zhì)硅酸鹽、碳酸鹽和硫酸鹽，以及有機(jī)堿諸如三乙醇胺、二乙醇胺、單乙醇胺和三異丙醇胺?？乖俪练e劑0090該組合物可以含有大約0.1至大約5wt.％的一種和多種下列化合物，如抗沉淀劑聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和羧甲基纖維素。
0091其中，羧甲基纖維素和/或聚乙二醇與本發(fā)明的纖維素酶組合物的組合提供了一種特別有用的污漬清除組合物。
漂白劑0092將本發(fā)明的纖維素酶與漂白劑，諸如單過硫酸鉀、重碳酸鈉、過硼酸鈉、硫酸鈉/過氧化氫加合物以及氯化鈉/過氧化氫加合物或/和光敏感型漂白染料諸如磺酸化苯二甲藍(lán)染料的鋅鹽或鋁鹽，組合使用進(jìn)一步改善了去污效果。同樣，可以使用EP 684 304中所述的漂白劑和漂白催化劑。
上藍(lán)劑和熒光染料0093如有必要，可以將各種上藍(lán)劑和熒光染料加入該組合物中。合適的上藍(lán)劑和熒光染料在英國專利申請?zhí)? 094 826 A中被公開，其公開內(nèi)容在此被并入本文作為參考。
結(jié)塊抑制劑0094下列結(jié)塊抑制劑可以被加入粉末狀去污劑中對甲苯磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、乙酸鹽、硫代琥珀酸鹽、滑石、精細(xì)研磨的硅石、無定形硅石、粘土、硅酸鈣(諸如Micro-Cell of Johns Manville Co.)、碳酸鈣和氧化鎂。
抗氧化劑0095抗氧化劑包括，例如叔丁基-羥基甲苯、4，4′-亞丁基雙(6-叔丁基-3-甲基苯酚)、2，2′-亞丁基雙(6-叔丁基-4-甲基苯酚)、單苯乙烯甲酚、二苯乙烯甲酚、單苯乙烯苯酚、二苯乙烯苯酚和1，1-雙(4-羥基-苯基)環(huán)己烷。
增溶劑0096增溶劑包括，例如低碳醇類諸如乙醇、苯磺酸鹽、低碳烷基苯磺酸鹽諸如對甲苯磺酸鹽，二元醇諸如丙二醇、乙?；交撬猁}、乙酰胺、吡啶二羧酸酰胺、苯甲酸鹽和脲。
0097本發(fā)明的去污劑組合物可以在酸性至堿性pH的寬pH范圍內(nèi)使用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的去污劑組合物可以在弱酸性、中性或者堿性去污劑洗滌介質(zhì)中使用，所述介質(zhì)具有從5以上至不大于約12的pH。
0098除以上組分外，如需要，可以將香精、緩沖液、防腐劑、染料以及類似物與本發(fā)明的去污劑組合物一起使用。此類組分按本領(lǐng)域此前的用量常規(guī)使用。
0099當(dāng)本發(fā)明中所用的去污劑基礎(chǔ)物為粉末形式時(shí)，其可以通過任何已知的制備技術(shù)加以制備，包括噴霧干燥法和造粒法。具體而言，優(yōu)選通過噴霧干燥法、團(tuán)聚法、干燥混合法或非塔式線路法(non-tower route method)獲得的去污劑基礎(chǔ)物。通過噴霧干燥法獲得的去污劑基礎(chǔ)物并未限定制備條件。通過噴霧干燥法獲得的去污劑基礎(chǔ)物是中空的顆粒，其是通過將耐熱組分諸如表面活性劑和助洗劑的含水漿噴灑進(jìn)入熱空間而獲得。在噴霧干燥以后，可以加入香精、酶、漂白劑、無機(jī)堿助洗劑。與諸如通過噴霧干燥造?；驁F(tuán)聚法獲得的高稠度顆粒狀去污劑基礎(chǔ)物一起，也可以在制備該基礎(chǔ)物之后加入各種組分。
0100當(dāng)去污劑基礎(chǔ)物是液體時(shí)，其可以是均一的溶液或者不均一的分散系。為消除由去污劑中纖維素酶造成的羧甲基纖維素分解，期望在加入組合物以前，將羧甲基纖維素顆?；蛘甙?。
0101在工業(yè)或家庭用途中，本發(fā)明的去污劑組合物可以與含纖維素織物例如污損的織物，在此類環(huán)境中所常規(guī)使用的溫度、反應(yīng)時(shí)間和液體比例下一起溫育。
0102此外，根據(jù)本發(fā)明的去污劑可以配制為中性pH下適宜溶液中的預(yù)洗劑，在此溶液中存在充分的活性以提供所需的軟化、去球、防起球、表面小纖維的清除或者清潔。當(dāng)去污劑組合物是作為液體、噴霧劑、凝膠或膏組合物的預(yù)浸(例如預(yù)洗或預(yù)處理)組合物時(shí)，纖維素酶一般是按預(yù)浸或預(yù)處理組合物總重量的大約0.0001至大約1wt.％使用的。在此類組合物中，可以任選地使用表面活性劑，當(dāng)使用表面活性劑時(shí)，其一般以預(yù)浸劑總重量大約0.005至大約20wt.％的濃度存在。該組合物的剩余部分包括預(yù)浸劑中所使用的常規(guī)組分，即稀釋劑、緩沖液、其它酶類(蛋白酶)以及類似物，濃度為它們的常規(guī)濃度。
0103包含此處所述的纖維素酶的組合物預(yù)計(jì)可以作為單一的組合物用于家庭使用，該組合物適用于使已退色的織物恢復(fù)色彩(參見例如美國專利號4,738,682，其在此以其整體并入本文作為參考)，和用于污漬清除劑以及用于去除起球和抗起球(起球預(yù)防)。
0104根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶的用途可以在飼料添加劑以及在漿和紙的加工過程中特別有效。其它此類工業(yè)應(yīng)用在例如PCT公布號95/16360和芬蘭授權(quán)專利號87372中被分別描述。
0105為進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明及其優(yōu)勢，提供了下列具體實(shí)施例，其應(yīng)當(dāng)理解為被提供用于對本發(fā)明進(jìn)行舉例說明，而不應(yīng)當(dāng)以任何方式被解釋為對本發(fā)明范圍的限定。
0106以下實(shí)驗(yàn)公開內(nèi)容中，應(yīng)用了下列縮略語eq(當(dāng)量)；M(摩爾的)；μM(微摩爾)；N(正常)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；μmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；g(克)；mg(毫克)；kg(千克)；μg(微克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(納米)；℃(攝氏度)；h(小時(shí))；min(分鐘)；sec(秒)；msec(毫秒)；Ci(居里)；mCi(毫居里)；μCi(微居里)；TLC(薄層色譜)；Ts(甲苯磺?；?；Bn(芐基)；Ph(苯基)；Ms(甲磺?；?；Et(乙基)、Me(甲基)。
實(shí)施例0107本發(fā)明在下列實(shí)施例中被進(jìn)一步地詳細(xì)描述，所述實(shí)施例并非意欲以任何方式限定本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。所附的附圖意欲被視為本發(fā)明的說明或描述的完整部分。對于在其中描述的所有內(nèi)容，所有引用的參考文獻(xiàn)在此被明確并入本文作為參考。提供下列實(shí)施例用以舉例說明而非限定所要求保護(hù)的發(fā)明。
實(shí)施例1載體的構(gòu)建0108此實(shí)施例舉例說明了質(zhì)粒的構(gòu)建，該質(zhì)粒包括新型纖維素酶催化核心。
0109如本文中圖3所示以及美國專利號6,562,612的實(shí)施例6中所述，含GI啟動子的pSEGCT11 AG8載體被用作制作本發(fā)明所用載體的基礎(chǔ)。pSEA4CT-11AG8載體的構(gòu)建在美國專利申請系列號10/992,149(2004年11月18日提交)的實(shí)施例2中有所描述，并參考本申請的圖4(pSEA4CT-11 AG8的圖譜)。
0110質(zhì)粒pKB105是通過用編碼新型纖維素酶催化核心的序列替換編碼全長11AG8纖維素酶的片段，由質(zhì)粒pSEA4CT-11 AG8構(gòu)建而成的。參見圖5(其中編碼新型纖維素酶催化核心的序列被命名為“11AG8核心I”)。圖6表示pKB105載體。
0111新型纖維素酶催化核心表達(dá)載體pKB107來源于pKB105。去除pKB105中的大腸桿菌DNA序列產(chǎn)生質(zhì)粒pKB107。為了去除大腸桿菌序列，用SphI、EcoRI和HindIII在37℃下將pKB105消化過夜。用Qiagen試劑盒純化消化后的DNA，然后重新連接用于轉(zhuǎn)化鏈霉菌宿主細(xì)胞。圖7表示pKB107載體。
實(shí)施例2表達(dá)與活性0112下列實(shí)施例描述了新型纖維素酶的表達(dá)與活性。
2A.轉(zhuǎn)化與表達(dá)0113實(shí)施例1中構(gòu)建的表達(dá)載體pSEA4CT-11 AG8和pKB107被用于本實(shí)施例。
0114在這些實(shí)驗(yàn)中，用上述載體轉(zhuǎn)化宿主變鉛青鏈霉菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化技術(shù)為Hopwood等，GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES，A LABORATORYMANUAL.The John Innes Foundation，Norwich，United Kingdom(1985)中所述的原生質(zhì)體法。
0115用如上所述的表達(dá)載體之一轉(zhuǎn)化變鉛青鏈霉菌細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在azo-CMC培養(yǎng)板上鋪板，并通過“暈”的產(chǎn)生鑒定出表達(dá)纖維素酶的克隆。在30℃，存在50ug/ml硫鏈絲菌肽的情況下，使產(chǎn)生暈的克隆在搖瓶里的TS中生長3天。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無抗生素的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，并繼續(xù)生長另外的3天。取樣用于酶活性分析。
0116TS＝16g Difco胰化蛋白胨、4g Difco大豆蛋白胨、20g酪蛋白(水解產(chǎn)物)sigm和5g K2HPO4，定容至1升。經(jīng)高壓滅菌后，加入50％的過濾除菌的葡萄糖，至終濃度1.5％。
0117生產(chǎn)培養(yǎng)基2.4g檸檬酸*H2O；8.3g Biospringer酵母提取物；2.4g(NH4)2SO4；72.4g MgSO4*7H2O；0.1g CaCl2*2H2O；0.3ml Mazu DF204(防沫劑)；5ml鏈霉菌修飾的痕量元素(1升貯存液，含250g檸檬酸*H2O；3.25gFeSO4*7H2O；5g ZnSO4*7H2O；5g MnSO4*H2O；0.25g H3BO3)；10g葡萄糖，將體積調(diào)至1升。用NaOH將pH調(diào)至6.9。
2B.回收0118從每一搖瓶中取1ml樣品并在14,000rpm下離心。將上清部分用于酶分析。
0119此外，用轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。在各時(shí)點(diǎn)，移取發(fā)酵肉湯樣品用于分析。離心除去細(xì)胞物質(zhì)。
2C.纖維素酶活性的改性分析0120本實(shí)施例說明了，通過使用微量滴定板，一種簡便、直接、可靠且省時(shí)的試驗(yàn)可以被用于評價(jià)纖維素酶活性。
0121使用來自前面定量發(fā)酵樣品的、具有2201單位/mL活性的標(biāo)準(zhǔn)酶參照物。稀釋緩沖液100mM磷酸鈉，pH8.0，經(jīng)0.2um濾膜除菌，被用于稀釋樣品和底物。通過將12g NaH2PO4混入800mfl去離子水以制備稀釋緩沖液，并用6N NaOH將pH調(diào)至達(dá)pH8.0，定容至終體積1.0L，然后0.2um濾膜除菌。
0122將標(biāo)準(zhǔn)酶參照物40×(40倍)稀釋，然后2×系列稀釋3至5次。將搖瓶樣品2×系列稀釋3至5次。將發(fā)酵罐樣品20至50×稀釋，隨后2×系列稀釋，3至5次。因此，對于每一實(shí)驗(yàn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)酶參照物而言，都有總共3至5個(gè)不同蛋白濃度的樣品。
0123對于該試驗(yàn)，將180uL 0.5mg/ml 2-硝基苯基β-D-纖維二糖苷(Sigma)在稀釋緩沖液中(見上)與20ul樣品于室溫下在96孔板(″9017″型，Costar，Cambridge，MA)中混合。
0124通過使用Spectra MAX250分光光度計(jì)(Spectra，Sunnyvale，CA，U.S.A.)在8分鐘內(nèi)以9秒的時(shí)間間隔在405nm處讀取吸光度來測量纖維素酶活性，并確定動力學(xué)平均值。
0125結(jié)果在圖8中表示。Y-軸是NPC單位/ml。由此可見，與完整的纖維素酶相比，去除CBD顯著增加了中性纖維素酶的活性。
實(shí)施例3
洗滌性能0126下列實(shí)施例比較了顆?；膶?shí)驗(yàn)新型催化核心樣品KB107C混合物(95％KB107C+5％IndiAgeNeutra L)與商業(yè)11AG8產(chǎn)品IndiAgeNeutra G(GenencorIntl.)的洗滌性能。每一輪使用相同的總ONPC活性給予酶。
0127用于35kg斜紋粗棉布基質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法可以被概括如下步驟1脫漿(55℃/20分鐘)步驟2瀝干與漂洗步驟3纖維素酶處理(55℃/pH 6.5/60分鐘)步驟4冷漂洗(1-2分鐘)步驟5熱漂洗(70℃/5分鐘)步驟6冷漂洗(1-2分鐘)步驟7在萃取器中萃取步驟8在滾筒式干燥器中干燥步驟9評價(jià)試驗(yàn)0128在55℃下用0.57g/L配制的Optisize和0.25g/L Triton X-100脫漿20分鐘。
0129用新顆粒(95％KB107C+5％IndiAgeNeutra L)和IndiAgeNeutra G在生產(chǎn)級腹式洗衣機(jī)(production scale belly washer)中處理脫漿的斜紋粗棉布基質(zhì)，條件如下●液體比例(LR)15∶1(525 L水，35Kg脫漿的斜紋粗棉布牛仔褲)●表面活性劑Lutensol AT80，于0.14g/L●處理溫度55℃；pH6.5±0.2(磷酸二氫鈉緩沖液，用乙酸調(diào)節(jié)pH)●處理時(shí)間60分鐘●漂洗3次0130使用下列酶劑量進(jìn)行了多種試驗(yàn)1)IndiAgeNeutra G，1,702×103單位/輪；2)0.65×顆粒，1,106×103單位/輪(#1,65％活力)；3)IndiAgeNeutra G，1,702×103單位/輪-雙倍于#1；4)0.65×顆粒，1106×103單位/輪(試驗(yàn)3，65％活力)-雙倍于#2；和5) 0.65×顆粒，1,702×103單位/輪。
0131纖維素酶處理后，從試驗(yàn)1-5的每一輪中隨機(jī)選取五條斜紋粗棉布褲腿，微微漂白以去除該斜紋粗棉布的前面上的回染。在Unimac中，將所有選取的斜紋粗棉布褲腿與10g/L次氯酸鈉(6.15％活性)和蘇打灰一起在65℃下漂白20分鐘，隨后進(jìn)行表面活性劑洗滌。
回染和磨損的評估0132為對纖維素酶處理后的回染和磨損水平定量，用Minolta的Chroma MeterCR-200從每條斜紋粗棉布褲腿獲取6個(gè)反射計(jì)讀數(shù)。CIE L*值被用于定量測定磨損情況，而CIE b*值被用于定量測定回染情況。L*表示亮度，而-b*表示CIELAB彩色空間中的藍(lán)色。因此，較高的L*表示較高的磨損，而較高的-b*表示較高的回染。
0133如“Precise Color Communication”，Minolta Camera Co.，Ltd，1993，2.Hunter，R.S.abd G+Harold，R.“The measurement of Appearance”，J.Wiley and Sons，NY，2ndedition，1987中所述，進(jìn)行測量。
結(jié)果0134試驗(yàn)結(jié)果表明，1×活力的商業(yè)IndiAgeNeutra G的洗滌強(qiáng)度大致等同于0.65×活力的新型Neutra G(95％KB107C+5％IndiAgeNeutra L)。該結(jié)果在以下的表1中以及圖9和10中表示。
表1IndiAgeNeutra G與0.65×新型Neutra G的磨損與回染性能

注*SB/靛藍(lán)用纖維素酶處理的硫磺底(sulfur bottom)/靛藍(lán)染色的斜紋粗棉布**靛藍(lán)用纖維素酶處理的靛藍(lán)染色的斜紋粗棉布***SB/I-BL用纖維素酶處理，隨后經(jīng)漂白的硫磺底/靛藍(lán)染色的斜紋粗棉布0135在測試條件下，65％活性的新型Neutra G(95％KB107C+5％IndiAgeNeutra L)表現(xiàn)出與100％活性的IndiAgeNeutra G非常相似的磨損性能，而100％活性的新型Neutra G明顯表現(xiàn)出比100％活性的IndiAgeNeutra G更高的磨損性能。在相似的磨損性能下，新型Neutra G與IndiAgeNeutra G之間未觀察到回染性能方面的顯著差異。
實(shí)施例4
差示掃描量熱法(Differential Scanning Calorimetry)0136下列實(shí)施例描述了新型纖維素酶熱穩(wěn)定性的測定。
0137按以上實(shí)施例2所述制備KB107C。然后按如下配制KB107C蔗糖40.0％檸檬酸鈉，二水合物 2.84％(2.50％無水)磷酸鈉，二堿價(jià)七水合物 4.72％(2.50％無水)山梨酸鉀 0.25％對羥基苯甲酸甲酯 0.03％對羥基苯甲酸丙酯 0.01％
總計(jì) 47.85％活性 7500-9000U/gpH 5.8-6.0138加入對羥基苯甲酸酯作為貯存液15％對羥基苯甲酸甲酯；5％對羥基苯甲酸丙酯；80％丙二醇。以上配方與商業(yè)產(chǎn)品IndiAgeNeutra L相同。
0139用1.2 M硫酸銨將IndiAgeNeutra L和KB107C從該制劑中沉淀。將沉淀重懸并透析入20mM磷酸鈉，pH6.8中。Slide-A-Lyzer 7K透析盒(Pierce，IL)被用于透析，并在24小時(shí)內(nèi)更換四次緩沖液進(jìn)行透析。最終的透析液被用于稀釋蛋白樣品。相對于最終透析液作為參照，對樣品的過熱容量(excessive heat capacity)進(jìn)行測量。
0140用超靈敏掃描微量熱量計(jì)VP-DSC E-2000(Microcal，Inc.，Northhampton，Ma.)測量過熱容量曲線。應(yīng)用90℃/分鐘的加熱速率，且蛋白質(zhì)濃度在0.2mg/ml的范圍內(nèi)。之前已經(jīng)公開了DSC測量的標(biāo)準(zhǔn)方法以及該技術(shù)的原理(Freire，E.(1995)Differential Scanning Calorimetry Methods.Mol. Biol. 41，191-218)。
0141IndiAgeNeutra L和KB107C的熱穩(wěn)定性作為溫度(20-100℃)的函數(shù)，分別表示為IndiAgeNeutra L和KB107C的熱中點(diǎn)(themal midpoint，Tm)67.8℃和68.7℃(參見圖11)。在該儀器給定的靈敏度下，對于KB107C而言，升高1℃的轉(zhuǎn)變溫度的作用是顯著的。這表明，KB107C的熱動力學(xué)特征與IndiAgeNeutra L的不同，并且與其在應(yīng)用研究中的強(qiáng)化性能相一致。
0142應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅為舉例說明的目的，其各種修改和變動對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是不言自明的，并且將包括在本申請的精神和范圍以及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。對于所有目的，本文中所引用的所有出版物、專利以及專利申請以其整體并入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.一種分離的纖維素酶，包括SEQ.ID NO_中所提供的氨基酸序列；或其衍生物，其具有纖維素水解活性并與SEQ.ID NO_具有至少95％的序列同一性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶，其中所述纖維素酶包括SEQ ID NO_中所提供的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶，其中所述纖維素酶是由與SEQ ID NO(圖2)具有至少90％序列同一性的DNA序列編碼的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶，其中所述纖維素酶可從放線菌(Actinomycete)獲得。
5.一種分離的纖維素酶，來自于放線菌，當(dāng)在SDS-PAGE上測量時(shí)具有大約23kD的分子量，并具有大約5.16的計(jì)算等電點(diǎn)。
6.一種分離的DNA序列，其編碼圖1E所示的氨基酸序列(SEQ ID NO_)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA序列，其中所述DNA序列在圖2(SEQ IDNO_)中表示。
8.一種表達(dá)載體，包括根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體進(jìn)一步包含被可操縱地連接于所述DNA分子的aprE啟動子或glaA啟動子或A4啟動子。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體進(jìn)一步包含被可操縱地連接于所述DNA分子的A4啟動子。
11.一種表達(dá)載體，包含編碼具有SEQ.ID NO_的氨基酸序列的多核苷酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體是pKB107。
13.一種宿主細(xì)胞，其用根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
14.權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是鏈霉菌屬某些種(Streptomyces spp)或芽孢桿菌屬某些種(Bacillus spp)。
15.權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是鏈霉菌屬某些種。
16.權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是鏈霉菌屬某些種，其中cyc2基因(土臭味素通路基因)已被缺失。
17.權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是絲狀真菌諸如曲霉屬(Aspergillus)或木霉屬(Trichoderma)，或者酵母諸如酵母屬(Saccharomyces)。
18.一種組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述組合物是去污劑組合物。
20.一種去污劑組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶。
21.一種生產(chǎn)具有纖維素活性的酶的方法，包括(a)用包含如權(quán)利要求6所限定的多核苷酸的表達(dá)載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化分離的宿主細(xì)胞；(b)在適于所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生所述酶的條件下，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；以及(c)回收所述的酶。
22.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求21所述的纖維素酶的方法，所述方法包括(a)在適于編碼所述纖維素酶的所述DNA表達(dá)的條件下，使根據(jù)權(quán)利要求13所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長；和(b)收集所產(chǎn)生的包含所述纖維素酶的含水混合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述纖維素酶被進(jìn)一步從所述含水混合物中純化。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬某些種或鏈霉菌屬某些種。
25.一種處理含纖維素織物的方法，包括將所述含纖維素的織物與根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶相接觸的步驟。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述處理是石洗。
27.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述處理提供了有色的含纖維素織物的局部顏色變化。
28.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述處理提供了含纖維素織物上的表面拋光效果。
29.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述處理提供了含纖維素織物的改良的手感。
30.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述處理提供了對含纖維素織物的顏色澄清。
31.權(quán)利要求25所述的方法，其中對所述織物的處理是通過浸泡、洗滌或漂洗所述織物來進(jìn)行的。
32.一種處理紙漿的方法，包括將所述紙漿與根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶相接觸的步驟。
33.一種改善動物飼料可消化性的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶處理含纖維素飼料的步驟。
34.根據(jù)權(quán)利要求1所述纖維素酶的用途，用作動物飼料添加劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求1所述纖維素酶的用途，用于處理紡織物。
36.根據(jù)權(quán)利要求1所述纖維素酶的用途，用于處理漿和紙。
37.根據(jù)權(quán)利要求1所述纖維素酶的用途，用于去污劑組合物中。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型纖維素酶蛋白及其衍生物在宿主細(xì)胞中的克隆以及高水平表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及表達(dá)所述新型纖維素酶的轉(zhuǎn)化體，以及包含DNA基因片段或其變體的表達(dá)載體，使用遺傳工程技術(shù)，所述的DNA基因片段或變體編碼來自于放線菌的新型纖維素酶。本發(fā)明也涉及新型纖維素酶組合物及其在工業(yè)加工過程中的使用方法。具體而言，本發(fā)明涉及用來自放線菌屬某些種(Actinomycete spp.)的新型纖維素酶處理紡織品。本發(fā)明還涉及使用來自于放線菌屬某些種的纖維素酶以增強(qiáng)動物飼料的可消化性，以及將所述纖維素酶用于去污劑中、用于漿和紙的處理，和用于淀粉生產(chǎn)及其副產(chǎn)品的處理。
文檔編號C11D3/386GK101087876SQ200580044174
公開日2007年12月12日 申請日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者鮑鍇, 王華明 申請人:金克克國際有限公司