專利名稱：顯微切割膜性載玻片清洗再利用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及顯微切割分子生物學切片清洗領域，具體的說是一種顯微切割 膜性載玻片的清洗再利用技術。
背景技術：
激光捕獲顯微切割(Laser Capture Microdissection)技術及其系統的出現， 使得相關科研工作者可以精確分離待研究的目的組織標本、細胞(體外培養(yǎng)的 活細胞及固定在切片中的組織細胞)、細胞器甚至染色體區(qū)帶，用于后續(xù)研究， 其控制樣本的精確性受到全世界科研工作者的青睞，目前多數有實力的研究機 構均己配備此技術及相關設施。
用組織切片進行顯微切割時，需要用到一種專用的膜性載玻片耗材，其價 格昂貴，同時，由于用于研究的目的標本需要富集足夠的數量，使得研究過程 中該耗材使用數量較大。目前每片膜性載玻片僅能使用一次，有兩個原因造成 該載玻片不可重復利用首先是激光切割膜性載玻片造成的機械缺損；第二個 原因是粘在膜上的組織、核酸、蛋白及其他小分子物質難以去除。之所以難去 除，是因為膜沒有玻璃材質的普通載玻片那樣的強度，不能在膜的表面刮擦； 膜和固體承載體是粘合在一起，因此膜性載玻片不能經受高溫高壓；膜由特殊 材質做成使得膜具有特殊黏附性，清潔膜表面物質時需兼顧不能損傷膜的黏附 性，-帶有黏附性的膜與組織標本粘合十分牢固，普通方法極難使兩者分離，即 使是免疫組化過程中抗原修復時所需要的高溫(95°C10分鐘)都很難使標本從 膜上脫落。
對于第一種原因，因為是損毀性的，沒有辦法避免。但是，該方法之所以稱為"顯微切割"，是因為所要切割的部分是在顯微鏡視野(一般用100倍、200
倍)下選取目的標本，每次切割所損害膜的面積甚至不到1/100，廣大剩余的膜
提供了再利用的空間，因此十分有必要提出針對第二種原因的解決方案。 目前用于處理含有廢棄標本、核酸、蛋白等物質的試劑瓶及孔板的方法主
要有機械/洗滌劑清洗、強酸/強堿浸泡過夜、高溫高壓、紫外線照射、鈷60照 射等方法。這些措施均不能達到既完整去除殘留物又保持膜的黏附特性及完整 性的目的。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在克服現有技術的不足之處而提供一種使耗材表面殘留的組織、 核酸、蛋白及其他小分子物質得以清除，同時又能充分保持顯微切割膜性載玻 片的完整性及黏附性效果，以保障后續(xù)實驗順利進行，從而使膜性載玻片得到 最大程度利用的顯微切割膜性載玻片清洗再利用方法。
為達到上述目的，本發(fā)明是這樣實現的
顯微切割膜性載玻片清洗再利用方法，可按如下步驟依次實施
(1) 將膜性載玻片置于硼酸、酒精及EDTA混合溶液A中浸泡、搖晃3 5 分鐘，并重復一次；
(2) 雙蒸水沖洗2 3分鐘；將膜性載玻片轉移至蛋白酶K溶液中，56X:孵 育1 2小時；
(3) 將載玻片置于清水，用帶有塑膠手套的手指輕觸膜性載玻片中的膜上
標本，雙蒸水沖洗，去除大塊標本；
(4) 將載玻片置于鹽酸、酒精及EDTA混合溶液B中浸泡5 10小時；用雙 蒸水及無水乙醇交替反復沖洗膜性載玻片5 10次，并使最后一次沖洗結束于 無水乙醇；
(5) 將膜性載玻片迅速轉移至超凈臺，通風，將無水乙醇迅速吹干，同時， 打開紫外燈對膜性載玻片的兩個表面分別照射30 50分鐘。作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述歩驟(2)中蛋白酶K溶液的pH為5 8， 濃度為80 150ug/ml。
作為另一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述步驟(1)混合溶液A中硼酸的濃度為1%; 所述步驟(1)混合溶液A中酒精的濃度為70%，所述步驟(1)混合溶液A中 EDTA的濃度為0. 25mol/L 。
進一歩地，本發(fā)明所述步驟(1)混合溶液A中硼酸、酒精及EDTA的體積 比為O. 5 1.5: (96. 5 99): 0. 5 2。
更進一歩地，本發(fā)明所述步驟(4)混合溶液B中鹽酸的濃度為1 1.5%; 所述歩驟(4)混合溶液B中酒精的濃度為30%;所述歩驟(4)混合溶液B中 EDTA的濃度為0. 25mol/L。
另外，本發(fā)明所述步驟(4)混合溶液B中鹽酸、酒精及EDTA的體積比為 0. 5 L5: (96. 5 99): 0. 5 2。
其次，本發(fā)明在步驟a)前，可將顯微切割完畢的膜性載玻片置于二甲苯
中，45 5(TC孵箱孵育20 30分鐘。需要注意的是，冰凍組織標本無需此步驟。
與現有技術相比，本發(fā)明具有如下特點
1、 整個操作流程中不涉及高溫、強酸堿等對膜有損害的因素；
2、 通過使用混合溶液A、混合溶液B，保證了在清洗過程中，充分保護膜 的黏附性，經上述處理的膜性載玻片性狀幾乎沒有任何改變；
3、 紫外線照射后，可以使載玻片上的有機膜的黏性達到最佳狀態(tài)；
4、 清洗后的載玻片上不含有對實驗有影響的成分；
5、 所需試劑均為生物實驗室常規(guī)試劑，且價格低廉，借助玻璃切片盒，可 批量操作；
6、 重復利用可節(jié)省3 5倍的載玻片數量，節(jié)省大量科研經費。


下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步描述。本發(fā)明的保護范圍不僅局限于下列內容的表述。
圖1為驗證顯微切割膜性載玻片是否清洗干凈而進行的2%瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施方式
實施例1
用本方法清洗殘留肺癌組織(石蠟包埋標本)的顯微切割膜性載玻片。 取兩片粘貼有肺癌組織(石蠟包埋標本)的顯微切割完畢的膜性載玻片， 其中一片不使用本方法清洗， 一片使用本方法清洗。
將顯微切割完畢的膜性載玻片置于二甲苯屮，5(TC孵箱孵育20分鐘(冰 凍組織標本無需此步驟)；將載玻片置于硼酸、酒精、EDTA混合溶液A (混合溶 液A為P/。硼酸、70%酒精、O.25mol/L EDTA的混合溶液，其體積配比為1: 98:
1)中浸泡、搖晃4分鐘，并重復一次；雙蒸水沖洗2分鐘；將膜性載玻片轉移
至pH6、 80ug/ml的蛋白酶K溶液，56。C孵育2小時；將載玻片置于清水，用 帶有塑膠手套的手指輕觸膜上的標本，雙蒸水沖洗去除大塊標本；將載玻片置 于鹽酸、酒精、EDTA混合溶液B (混合溶液B為1. 5%鹽酸、30%酒精、0. 25mol/L EDTA的混合溶液，其體積配比為l: 98: 1)中浸泡7小時；用雙蒸水及無水乙 醇交替反復沖洗膜性載玻片8次，并保證最后一次沖洗結束于無水乙醇；將載
玻片迅速轉移至超凈臺，通風，將無水乙醇迅速吹干，同時，打開紫外燈對膜
性載玻片的兩個表面分別照射30分鐘。 實施例2
顯微切割膜性載玻片清洗再利用方法，可按如下步驟依次實施
(1) 將顯微切割完畢的膜性載玻片置于二甲苯中，45 5(TC孵箱孵育20
30分鐘；
(2) 將膜性載玻片置于硼酸、酒精及EDTA混合溶液A中浸泡、搖晃3分鐘， 并重復一次；所述混合溶液A中硼酸的濃度為1%，酒精的濃度為70%， EDTA的濃度為0.25mol/L ;其中硼酸、酒精及EDTA的體積比為0.5: 96.5: 0.5。
(3) 雙蒸水沖洗3分鐘；將膜性載玻片轉移至蛋白酶K溶液中，56。C孵育l 小時；蛋白酶K溶液的pH為6，濃度為90ug/ml。
(4) 將載玻片置于清水，用帶有塑膠手套的手指輕觸膜性載玻片中的膜上 標本，雙蒸水沖洗，去除大塊標本；
(5) 將載玻片置于鹽酸、酒精及EDTA混合溶液B中浸泡7小時；用雙蒸水 及無水乙醇交替反復沖洗膜性載玻片7次，并使最后一次沖洗結朿于無水乙醇； 所述鹽酸的濃度為1%，酒精的濃度為30%， EDTA的濃度為0. 25mol/L;其中鹽 酸、酒精及EDTA的體積比為0.5: 96.5: 0.5。
(6) 將膜性載玻片迅速轉移至超凈臺，通風，將無水乙醇迅速吹干，同時， 打開紫外燈對膜性載玻片的兩個表面分別照射40分鐘。
實施例3
顯微切割膜性載玻片清洗再利用方法，可按如下步驟依次實施
(1) 將膜性載玻片置于硼酸、灑精及EDTA混合溶液A中浸泡、搖晃5分鐘， 并重復一次；所述硼酸的濃度為1%;所述酒精的濃度為70%，所述EDTA的濃度 為0.25mol/L ，其中硼酸、酒精及EDTA的體積比為1: 97: 1。
(2) 雙蒸水沖洗3分鐘；將膜性載玻片轉移至蛋白酶K溶液中，56"C孵育2 小時；所述步驟(2)中蛋白酶K溶液的pH為7，濃度為100ug/ml。
(3) 將載玻片置于清水，用帶有塑膠手套的手指輕觸膜性載玻片中的膜上 標本，雙蒸水沖洗，去除大塊標本；
(4) 將載玻片置于鹽酸、酒精及EDTA混合溶液B中浸泡9小時；用雙蒸水 及無水乙醇交替反復沖洗膜性載玻片9次，并使最后一次沖洗結束于無水乙醇; 所述鹽酸的濃度為1%;所述酒精的濃度為30%;所述EDTA的濃度為0. 25mol/L， 其中鹽酸、酒精及EDTA的體積比為1.5: 98: 1。
(5) 將膜性載玻片迅速轉移至超凈臺，通風，將無水乙醇迅速吹干，同時，打開紫外燈對膜性載玻片的兩個表面分別照射35分鐘。
目前能檢測到的最微量的生物分子即為核酸，為了檢驗清洗效果，分別從清 洗過和未清洗過的載玻片上取O. 5X0. 5cm大小的膜，放入200ul Eppendorf管 中，向管中加入80u l雙蒸水，37t:孵育l小時。分別取出4ul液體作為模板， 配置50ul標準體系(dNTP: 0. 5ul， Taq酶:0. 5ul，上下游引物各O. 5ul， 10Xbuffer: 5u]， dd跳43. 5ul)，進行多聚酶鏈反應(PCR)，經40個循環(huán) 擴增后，分別取6ul液體放入2%瓊脂糖凝膠進行電泳如圖1，泳道l為Marker 標志；泳道2為經本方法處理后的樣本，未擴增出任何條帶，表明經本方法清 洗后的膜上已經沒有核酸污染，該膜性載玻片可以繼續(xù)用于顯微切割；泳道3 為未經處理的樣本，明顯有核酸模板存在。
可以理解地是，以上關于本發(fā)明的具體描述，僅用于說明本發(fā)明而并非受 限于本發(fā)明實施例所描述的技術方案，本領域的普通技術人員應當理解，仍然 可以對本發(fā)明進行修改或等同替換，以達到相同的技術效果；只要滿足使用需 要，都在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1、顯微切割膜性載玻片清洗再利用方法，其特征在于，按如下步驟依次實施(1)將膜性載玻片置于硼酸、酒精及EDTA混合溶液A中浸泡、搖晃3～5分鐘，并重復一次；(2)雙蒸水沖洗2～3分鐘；將膜性載玻片轉移至蛋白酶K溶液中，56℃孵育1～2小時；(3)將載玻片置于清水，用帶有塑膠手套的手指輕觸膜性載玻片中的膜上的標本，雙蒸水沖洗，去除大塊標本；(4)將載玻片置于鹽酸、酒精及EDTA混合溶液B中浸泡5～10小時；用雙蒸水及無水乙醇交替反復沖洗膜性載玻片5～10次，并使最后一次沖洗結束于無水乙醇；(5)將膜性載玻片迅速轉移至超凈臺，通風，將無水乙醇迅速吹干，同時，打開紫外燈對膜性載玻片的兩個表面分別照射30～50分鐘。
2、 根據權利要求l所述的顯微切割膜性載玻片清洗再利用方法，其特征在 于所述步驟(2)中蛋白酶K溶液的pH為5 8，濃度為80 150ug/ml。
3、 根據權利要求2所述的顯微切割膜性載玻片清洗再利用方法，其特征在 于所述步驟(1)混合溶液A中硼酸的濃度為1%;所述步驟(1)混合溶液A 中酒精的濃度為70%，所述步驟(1)混合溶液A中EDTA的濃度為0. 25mol/L 。
4、 根據權利要求3所述的顯微切割膜性載玻片清洗再利用方法，其特征在 于所述步驟(l)混合溶液A中硼酸、酒精及EDTA的體積比為0. 5 1. 5: (96. 5 99): 0. 5 2。
5、 根據權利要求4所述的顯微切割膜性載玻片清洗再利用方法，其特征在 于所述歩驟(4)混合溶液B中鹽酸的濃度為1 1. 5%;所述步驟(4)混合溶 液B中酒精的濃度為3(^;所述步驟(4)混合溶液B中EDTA的濃度為0. 25mol/L。
6、 根據權利要求5所述的顯微切割膜性載玻片清洗再利用方法，其特征在 于所述步驟(4)混合溶液B中鹽酸、酒精及EDTA的體積比為0. 5 1. 5: (96. 5 99): 0. 5 2。
7、 根據權利要求1 6之任一所述的顯微切割膜性載玻片清洗再利用方法， 其特征在于在步驟(l)前，將顯微切割完畢的膜性載玻片置于二甲苯中，45 50。C孵箱孵育20 30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開一種顯微切割膜性載玻片的清洗再利用技術，可按如下步驟依次實施(1)將膜性載玻片置于硼酸、酒精及EDTA混合溶液A中浸泡、搖晃；(2)雙蒸水沖洗；將膜性載玻片轉移至蛋白酶K溶液中，孵育；(3)將載玻片置于清水，用手指輕觸膜上標本，雙蒸水沖洗；(4)將載玻片置于鹽酸、酒精及EDTA混合溶液B中浸泡；用雙蒸水及無水乙醇沖洗膜性載玻片，并使最后一次沖洗結束于無水乙醇；(5)將膜性載玻片迅速轉移至超凈臺，將無水乙醇迅速吹干，同時，進行紫外光照射。本發(fā)明使耗材表面殘留的組織、核酸、蛋白及其他小分子物質得以清除，同時又能充分保持顯微切割膜性載玻片的完整性及黏附性效果。
文檔編號B08B3/00GK101576653SQ20091001215
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月22日 優(yōu)先權日2009年6月22日
發(fā)明者陳洪鐸, 高興華, 齊瑞群 申請人:中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院