蠶絲制品的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蠶絲材料加工領(lǐng)域，尤其是提供醫(yī)用蠶絲材料。
【背景技術(shù)】
[0002] 蠶絲用于生物醫(yī)學(xué)縫線已有幾十年歷史，觀察到了潛在的宿主免疫反應(yīng)。這可能 是蠶絲在過往的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中不予考慮的主要原因。引發(fā)免疫反應(yīng)的主因與絲膠蛋白 (sericin)有關(guān)。故，從生絲（rawsilk)徹底除去絲膠蛋白，是組織工程化和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用 中制備絲織物、但避免生物相容性問題的關(guān)鍵步驟。
[0003] 常見的蠶絲是從家蠶（Bombyxmori)幼蟲的蠶繭獲得的。單個蠶繭纖維由被稱為 絲膠蛋白的膠狀蛋白包繞兩個絲素蛋白（fibroin)核心而成，其中由絲膠蛋白將多個絲素 蛋白纖維互相固定。絲素蛋白和絲膠蛋白分別占約75和25%wt.。
[0004] 蠶絲絲素蛋白在形態(tài)上以高度有序的晶態(tài)纖維結(jié)構(gòu)為特征。這種結(jié)構(gòu)使它不溶 于諸如水、乙醇、稀酸和堿等大多數(shù)溶劑。與絲素蛋白相反，球狀的絲膠蛋白易溶于水性溶 劑。紡織業(yè)對于去除絲膠蛋白也有極大興趣，因為蠶絲服裝的光澤會被絲膠掩蓋。因此，不 光是生物材料領(lǐng)域要研宄蠶絲，紡織業(yè)也在尋找最佳的脫膠方法。這導(dǎo)致出現(xiàn)多種脫膠方 法，包括，堿性溶液（加或不加表面活性劑）、尿素、酒石酸、檸檬酸、或諸如木瓜蛋白酶或內(nèi) 肽酶等酶類。傳統(tǒng)的脫膠法是將生絲置于有或無表面活性劑的堿性溶液中煮沸，表面活性 劑有助于使絲膠蛋白從纖維結(jié)構(gòu)中脫離出來。值得注意的是，通常是用0.02M碳酸鈉溶液 在KKTC處理30-60min來完成脫膠，尤其是在組織工程化研宄領(lǐng)域。這種堿性脫膠常常以 批量處理，使用的是肥皂或表面活性劑加堿。
[0005] 工業(yè)蠶絲生產(chǎn)通常涉及將天然蠶絲纖維（nativesilkfibres)溶解成絲素蛋白 溶液、再用合適的方法如離心法從這種溶液中再加工出（reprocessing)纖維。
[0006] 提供醫(yī)用蠶絲材料的方法幾乎是唯一的：將蠶絲纖維以摩爾比1:2:8溶于 含水體系如Lifo或CaCl2/EtOH/水中（CN101736430B)，然后通過諸如離心、電紡絲 (electrospinning)、由水性系統(tǒng)或有機溶劑系統(tǒng)注衆(zhòng)成形（casting)、凝膠化、起泡等等， 將該蠶絲溶液再加工為所需形式的材料（V印ari等，2007,US5, 252, 285A;Sung-WonHa 等，Biomacromolecules4 (3) 2003p. 488-496) 〇
[0007] 但這些由絲素蛋白溶液再加工出的蠶絲材料與天然蠶絲結(jié)構(gòu)不同，常導(dǎo)致三維產(chǎn) 物具有用于多種可能用途、尤其外科領(lǐng)域的用途時不令人滿意的特性（特別是力學(xué)特性）。
[0008] 為避免所得的蠶絲結(jié)構(gòu)的這些被削弱的特性，需要一些使用脫膠的蠶絲纖維作 為原材料的技術(shù)。蠶絲纖維用紡織工程化技術(shù)如編辮（braiding)、打結(jié)（knotting)、機 織（weaving)等加工時的高度可加工性，尤其在生物醫(yī)學(xué)制品領(lǐng)域，已得到Horan等（J Biomech39(12)2006,p. 2232-2240)證實。盡管用紡織工程化技術(shù)制備骨架能實現(xiàn)上述 各種進步，仍有一些特殊情況有益于使纖維粘合，這是紡織工程化技術(shù)很難或根本不能實 現(xiàn)的。因此研發(fā)了不同的策略來用溶劑、粘合劑（埋在樹脂中）或加熱處理（US3 510 390A)使天然以及合成的纖維粘在一起。一種將蠶絲纖維與相鄰纖維粘合的方法用到離 子液體。這些離子液體起到多種生物聚合物包括蠶絲的溶劑的作用。例如，Haverhals等(Macromolecularmaterialsandengineering295,IJanuary2010,p. 425-430)表明，用 1-乙基-3-甲基咪唑乙酸鹽可以將天然未脫膠的蠶絲"焊接（weld)"到一起。該工藝被描 述和展示為，將纖維表面粘合成無中斷且無解體的結(jié)構(gòu)（US8 202 379BI)。
[0009] 另一種用于將蠶絲纖維彼此粘連的化學(xué)試劑是甲酸。早在1915年就有人描述 了從短蠶絲纖維制備均質(zhì)纖維漿的工藝（GB12374A)。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，Ghanaati等 (JTERM，2010 (4)p. 464-472)用甲酸將脫膠的無紡蠶絲纖維粘合在一起，形成可移植的穩(wěn)定 骨架，但不會形成一長串粘在一起的蠶絲纖維。
[0010] 顯然，生物醫(yī)學(xué)材料（尤其植入材料）必需要有顯著的力學(xué)穩(wěn)定性，特別是要抵抗 壓力時，而這類材料的任何意外斷裂都必須阻止或排除。因此，需要改進的方法來基于改進 了力學(xué)特性和形態(tài)特性的蠶絲而提供結(jié)實耐用的生物醫(yī)學(xué)材料。這些方法應(yīng)允許穩(wěn)健、可 再現(xiàn)且可靠的制備方法；另一方面，這些產(chǎn)物應(yīng)允許制得的生物材料能加以應(yīng)用，尤其用于 醫(yī)藥和用于細胞培養(yǎng)方法中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 因此，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供這樣的方法；這樣的方法應(yīng)該也特別適于醫(yī)學(xué)目 的，尤其適于療法和外科手術(shù)。
[0012] 因此，本發(fā)明提供制備三維蠶絲制品的方法，其中，將三維蠶絲制品用蠶絲溶劑 (silksolvent)處理一段時間，使該蠶絲制品發(fā)生部分解體（partialdisintegration)， 之后，通過物理的（physical) (6-片層（sheet)誘導(dǎo)而將該部分解體的蠶絲制品重新穩(wěn)固。
[0013] 本發(fā)明中，"三維蠶絲制品"應(yīng)該不僅理解為，其三維中沒有一維不與其它兩維發(fā) 生關(guān)聯(lián)的那些制品，而且理解為，由至少兩層絲素蛋白疊加而限定的那些制品，所述兩層絲 素蛋白中，一層是均勻的絲素蛋白層（區(qū)，域，相，等），一層是纖維狀絲素蛋白層，它們從空 間上允許產(chǎn)生非均質(zhì)（anisotropic)材料性質(zhì)。
[0014] 本發(fā)明的方法提供改進了力學(xué)特性的蠶絲結(jié)構(gòu)物（silkconstructs)，尤其絲素 蛋白結(jié)構(gòu)物。這允許將本發(fā)明方法可獲得的產(chǎn)物移植到會暴露于特定機械作用力的區(qū)域 中。例如，在神經(jīng)導(dǎo)管（nerveconduit)的例子中，體內(nèi)移植物可能暴露于能引起這類移植 物崩解的壓力。在這樣的情形中，由未經(jīng)處理的絲素蛋白構(gòu)成的（梭織）管紗會崩解，阻礙 所述管紗所覆蓋正在生長的神經(jīng)。本發(fā)明的方法使移植物能抵抗這類引起擠壓（crush)或 挫傷（contusion)的力量。鑒于之前在絲素蛋白結(jié)構(gòu)物上實施了解體步驟或再穩(wěn)定步驟但 未制出具有本發(fā)明所述優(yōu)點的產(chǎn)物，說明是這兩個步驟的組合導(dǎo)致了產(chǎn)物具有本發(fā)明所述 的改進的特性。
[0015] 本發(fā)明的部分解體步驟可視為蠶絲制品在暴露于解體溶液，蠶絲溶劑的區(qū)域內(nèi)的 部分溶解。這涉及絲素蛋白中使之成形的beta-片層結(jié)構(gòu)的部分解體。解體可以達到終產(chǎn) 物所需的程度，例如，僅僅靠近表面或貫穿整個蠶絲制品，當(dāng)然是產(chǎn)物尚未變成溶液。起始 材料（即，蠶絲制品）的總體形狀在部分解體步驟的全過程中基本保留。因此，蠶絲溶劑只 是施用有限的時間段，不會一直用到徹底溶解的程度（達到平衡）。蠶絲（絲素蛋白）材 料（再次）徹底液化成溶液或懸浮液的情形在本發(fā)明中不會發(fā)生，僅僅是產(chǎn)物的有限區(qū)域 內(nèi)發(fā)生部分的去固化過程。此（部分）"溶解"步驟允許絲素蛋白分子更緊密地聚集在以 形成連續(xù)相為特征的產(chǎn)物的解體區(qū)域（disintegratedarea)內(nèi)部。在蠶絲制品上實施的 解體步驟所能達到的程度因此導(dǎo)致本發(fā)明終產(chǎn)物的不同產(chǎn)物特征。
[0016]可見，本發(fā)明的"解體"明顯有別于其它蠶絲加工步驟，如脫膠（"脫膠 (degumming) "是指將兩類蛋白彼此分離，S卩，使絲膠蛋白脫離絲素蛋白纖維，它類似于使外 殼與核心脫咼）。
[0017] 在再穩(wěn)定步驟中，蠶絲制品的解體部分再次固化，但形成了與該蠶絲制品的未解 體部分相比有不同形態(tài)和力學(xué)特征的區(qū)域。由于該再穩(wěn)定步驟，蠶絲制品再次徹底固化，通 常形成非均質(zhì)的終產(chǎn)物，其中最顯著暴露于溶絲液的表面經(jīng)歷了最廣延的結(jié)構(gòu)變化，而蠶 絲制品的內(nèi)部（或未暴露于溶絲液（"蠶絲溶劑"）的表面）能夠維持幾乎不變或至少未變 到更多暴露于蠶絲溶劑的部位所達到的程度。本發(fā)明的再穩(wěn)定步驟因此引起形態(tài)上的晶樣 狀態(tài)（morphologicalcrystalline-likestate)。所述再穩(wěn)定步驟是通過物理的0-片層 誘導(dǎo)來進行的。解體引起蠶絲的"無規(guī)"結(jié)構(gòu)。此后，解體的蠶絲經(jīng)物理處理而實現(xiàn)片 層再折疊。實施該步驟的典型方式是除去無規(guī)蠶絲形式中解體區(qū)的水分子，直至發(fā)生這類 再折萱。
[0018] 蠶絲絲素蛋白是多形性材料，有三種不同的相（phases)，通常稱為蠶絲I、II和 III。蠶絲I代表一種螺旋且無規(guī)卷曲的水溶性結(jié)構(gòu)狀態(tài)，可見于離心處理前的蠶腺體或 作為（含水）蠶絲溶液（也稱再生絲（regeneratedsilk))。蠶絲II的特征在于不對稱 0 -片層結(jié)構(gòu)，其中甘氨酸的氫側(cè)鏈大都暴露在0 -片層的一側(cè)、丙氨酸的疏水甲基側(cè)鏈在 另一側(cè)。結(jié)果，各個片層通過并肩式排列而自我裝配，通過強氫鍵和范德華力而穩(wěn)定。
[0019] 通過暴露于熱或剪切力，引起蠶絲I向蠶絲II的結(jié)構(gòu)變化。這種相變（phase transition)也可以通過用甲醇或其它促進蠶絲分子失水的試劑處理蠶絲結(jié)構(gòu)來獲得。結(jié) 果，從無規(guī)卷曲（蠶絲I)向片層形成（蠶絲II)的轉(zhuǎn)變因鏈-鏈相互作用的增強而被 誘導(dǎo)。除了所述相變，此過程還確保水穩(wěn)定性蠶絲結(jié)構(gòu)。其它引起和控制beta-片層形成 的方法是，高壓蒸汽滅菌（Park等，J.Mat.Sci43 (2008)，6967-6985)和水冷退火法（water annealingmethods,Hu等，Biomacromol. 12(2011)，1686-1696)。
[0020] 再穩(wěn)定步驟優(yōu)選按照本發(fā)明通過用再穩(wěn)定溶液處理來進行。也可以使用不同的再 穩(wěn)定溶液的多種組合。
[0021] 用再穩(wěn)定溶液進行的再穩(wěn)定可以用任何能實現(xiàn)蠶絲的e-片層形成的溶液來進 行。所述結(jié)晶（通過用再穩(wěn)定溶液處理進行的再穩(wěn)定）常常由兩種目前業(yè)內(nèi)的方法來誘導(dǎo)， 是浸沒在諸如甲醇或乙醇等醇溶液中。醇浸沒既簡單又快速，但如果必須要避免使用醇的 話，可以使用諸如甲酸等無醇再穩(wěn)定溶液。
[0022] 作為本發(fā)明的測試系統(tǒng)，研宄了用于神經(jīng)修復(fù)的蠶絲絲素蛋白對照（control)結(jié) 構(gòu)。更具體地，對坐骨神經(jīng)（N.ischiadicus)缺損的搭橋已在大鼠體內(nèi)觀察到，顯示出令人 意外的結(jié)果（見實施例部分）。
[0023] 在本發(fā)明過程中意外發(fā)現(xiàn)，蠶絲制品（尤其三維絲素蛋白產(chǎn)物），在應(yīng)用了本發(fā)明 的兩個處理步驟后，可以有效改進其力學(xué)特性，尤其是它們抵抗體內(nèi)移植后瓦解的抗性。這 使得能產(chǎn)生與經(jīng)絲素蛋白溶液再處理（無本發(fā)明的加固步驟）的蠶絲纖維相比具有顯著優(yōu) 勢和潛能的三維蠶絲制品。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明提供更結(jié)實耐用的復(fù)雜蠶絲結(jié)構(gòu)，給當(dāng)今手術(shù)帶來明顯好處。而且， 該制備過程整體上是可靠的，適于進行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。優(yōu)選地，本發(fā)明的蠶絲溶劑包 括LiBr、LiSCN、六氟代-2-丙醇（HFIP)、含乙醇和0&(：12的混合物或含甲醇和硝酸鈣的混 合物；或它們的混合物。根據(jù)優(yōu)選實施方案，LiBr在蠶絲溶劑中的使用濃度是1-10M，優(yōu) 選3-10M，尤其5-7M。根據(jù)優(yōu)選實施方案，LiSCN的使用濃度是1-17. 5M，優(yōu)選5-15M，尤其 8-12M。根據(jù)優(yōu)選實施方案，HFIP在溶液中的使用濃度是1-100 % (v/v)，優(yōu)選50-100 % (v/v)HFIP，尤其90-100 % (v/v)HFIP。乙醇可以，例如，在蠶絲溶劑中使用含水溶液，其 包含1-50% (v/v)乙醇，優(yōu)選5-40% (v/v)乙醇，尤其10-30% (v/v)乙醇。CaCl2可以， 例如，在蠶絲溶劑中與乙醇的摩爾比為1 :〇? 3-1:3 (即，ImolCaCl2:0. 3molEtOH至Imol CaCl2:3molEt0H)，優(yōu)選 1:1-1:2. 5,尤其 1:1. 5-1:2. 2。
[0025] 本發(fā)明的方法適用于廣泛多種不同的蠶絲制品，尤其絲素蛋白制品。優(yōu)選，所 述三維蠶絲制品是梭織物（wovenfabric),無紡織物（non-wovenfabric),管紗（tube), 編織物（knittedproduct)或壓制品（pressedproduct)。盡管本發(fā)明的方法可以用任何 絲架（silkscaffold)來實施，但所述方法特別適于處理由蠶絲纖維構(gòu)成的骨架。那些制 品可以轉(zhuǎn)而形成一個區(qū)域有解體而其它區(qū)域仍保留原始絲纖維結(jié)構(gòu)的絲架，優(yōu)選提供非均 質(zhì)（anisotropic)制品，S卩，表面已解體、內(nèi)部仍包含絲纖維的制品。尤其優(yōu)選使用絲素蛋 白制品或由天然蠶絲纖維構(gòu)成的梭織制品（wovenproduct)。本發(fā)