專利名稱：顯微鏡裝置以及使用該顯微鏡裝置的熒光觀察方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種在生物體組織等的熒光觀察等中使用的顯微鏡裝置以及使用了該顯微鏡裝置的被觀察物的熒光觀察方法。
背景技術：
在分子生物學領域等中，對生物體組織和細胞內離子、分子等的觀察是必須的技術。光學顯微鏡主要用于觀察生物體組織。另外，激光共聚焦顯微鏡用于用光照射生物體細胞的一部分并使其照射位置移動來觀察細胞的一部分。作為光學顯微鏡的主要觀察技術之一，有如下一種熒光觀察法對生物體組織的細胞內的離子、分子附加熒光色素，對該熒光色素照射激勵光，觀察被激勵的熒光色素所發(fā)出的熒光。熒光和激勵光的波長是不同的。因而，能夠通過對熒光進行分析來檢測細胞內分子、測量濃度。因此，熒光觀察具有以下優(yōu)點。(i)離子、分子的大小也能夠觀察。(ii)能夠僅觀察特定的離子、分子。(iii)熒光的亮度與離子、分子濃度相應地發(fā)生變化，因此能夠測量它們的濃度。然而，一般來說熒光觀察也具有以下缺點。(i)在激勵光的波長處于紫外波段的情況下，激勵光對于細胞來說是有毒的。(ii)當持續(xù)射出激勵光時熒光色素會褪色。褪色是指熒光的強度變弱。當使用能夠進行熒光觀察的熒光顯微鏡來觀察移動的細胞時，細胞有時會跑出顯微鏡的視野外而使觀察中斷。作為這種問題的解決方法，⑴降低物鏡的倍率來擴展視野，⑵以機械或化學的方式抑制細胞的移動，( 移動載物臺來使細胞的位置處于視野的中心。但是，(1)的方法使空間分辨率降低，O)的方法有可能對細胞產生不良影響。針對上述(3)的解決方法，在專利文獻1和專利文獻2中公開了一種為了對微小的觀察物進行觀察而具備對被觀察物進行追蹤的機構的光學顯微鏡。這些光學顯微鏡能夠使用透射光來控制細胞位置和觀察區(qū)域并進行透射光記錄。在專利文獻3 5中，公開了一種能夠使用熒光來控制細胞位置和觀察區(qū)域并進行熒光記錄的熒光顯微鏡。在非專利文獻1 5中，報告了一種將移動的草履蟲作為比較大的被觀察物固定在視野內來進行觀察的方法。作為能夠在培養(yǎng)液中自由移動的細胞中的在醫(yī)學和生物學領域受重視的細胞，可以舉出具有能夠保護人體免受細菌、病毒傷害的功能的免疫細胞(參照非專利文獻6)。與免疫功能有關的細胞內分子大量存在，而為了檢測這些分子、測量分子濃度的時間變化，必須使用熒光觀察。在免疫細胞中，不怎么附著于載玻片表面而進行浮游的細胞被分類為浮游細胞。皿中的浮游細胞的位置是根據培養(yǎng)液的對流、重力、皿的壁部和底部、水面以及細胞之間的相互作用等而始終改變的。為了觀察浮游細胞，也考慮了例如使用非專利文獻1中報告的奧先生等人的手法來追蹤一個細胞的方法。專利文獻1 日本特開平5-80255號公報專利文獻2 日本特開平7-2535487號公報專利文獻3 日本特開平7461097號公報專利文獻4 日本特開2005-214924號公報專利文獻5 日本特開2006-292420號公報專利文獻6 :W02003/102636號公報非專禾丨J 文獻 1 :H. Oku, N. Ogawa, Ishikawa, K. Hashimoto, "Two-dimensional tracking of a motile micro-organism allowing high-resolution observation with various imaging techniques", Review of Scientific Instruments, Vol. 76, No.3,20052 :H. Oku, M. Ishikawa, Theodorus, and K. Hashimoto, "High-speed autofocusing of a cell using diffraction patterns，，,Optics Express, Vol. 14,No. 9, pp.3952-3960,2006非專利文獻3 :奧寛雅，石井抱，石川正俊7 4夕π匕‘夕二 7 > 7 ^ — K A ,夕 v^r A，電子情報通信學會誌 D-II，Vol. J84-D-II, No. 6，pp. 994-1002，2001非專利文獻4 奧寛雅，石川正俊力口、> 7才一夕·■一 T応答可能&高速匕‘夕3 、巧,用可変焦點 > X O 構造，光學，Vol. 31，No. 10，pp. 758-764,2002非專利文獻5 橋本浩一微生物f用0 t 7夕歹^義七> * >夕‘，SORST ” 3 ^ >卜* >水?！鄙爪?(6)講演要旨集，pp. 23-26,2007年1月30日非專利文獻6 :D. Μ. r ^ ' ^ 會話t ^免疫細胞，日経寸^工> 7，pp. 52-60， 2006年5月號非專利文獻7 谷村保明白血球分類O自動化，MEDICAL IMAGING TECHNOLOGY, Vol. 14，No. 1，pp. 14-22，199
發(fā)明內容
發(fā)明要解決的問題現(xiàn)在，熒光觀察參數(shù)都是由觀察者根據主觀經驗而決定的。即，并非按照客觀的評價來決定該熒光觀察參數(shù)，而這就是現(xiàn)狀。在這種情況下，即使細胞的位置、分布、種類等發(fā)生變化，觀察者也很難隨機應變地調整熒光觀察參數(shù)。在觀察者想要觀察大量的細胞而過度擴大激勵光的照射范圍、照射時間的情況下，會對細胞和熒光色素造成不必要的不良影響。另外，獲取到的熒光圖像數(shù)據的量較大， 分析會花費較多時間。在以往的熒光顯微鏡中，也通過自動控制激勵光的種類、強度來連續(xù)地觀察細胞內的多個離子、分子的活化狀態(tài)，并將一次實驗中發(fā)生的細胞內的多個離子、分子的相互作用匯總來進行可視化。然而，該自動控制是按照預先決定的時序表而進行的，或者是與從熒光圖像中得到的細胞信息相結合地進行的。在僅將熒光圖像使用于控制的情況下，由于熒光的光強度較弱，因此用于得到控制用的圖像的曝光時間變長。即，控制所耗費的時間變長。因此，當細胞移動的最大速度較快時，控制未能有效地起作用的情況變多。這種控制法的主要目的在于對長時間觀察原本不移動的細胞時所產生的偏差進行校正。本發(fā)明鑒于上述問題，目的在于提供一種顯微鏡裝置以及使用了該顯微鏡裝置的被觀察物的熒光觀察方法，能夠通過將來自被觀察物的透射光等使用于控制中，從而在熒光觀察時自動控制被觀察物的位置、觀察區(qū)域等。為了達到上述目的，本發(fā)明的顯微鏡裝置的特征在于，具備載物臺，其載置被觀察物；第一光源，其對上述被觀察物照射照明光；第二光源，其對上述被觀察物照射用于激勵熒光的激勵光；圖像信息檢測部，其檢測通過上述照明光而得到的被觀察物的圖像信息； 熒光圖像信息檢測部，其通過被觀察物因激勵光而產生的熒光來檢測熒光圖像信息；以及控制部，其根據上述被觀察物的運動模型和從上述圖像信息檢測部輸入的上述被觀察物的圖像信息來決定上述被觀察物的熒光觀察區(qū)域，在上述熒光觀察區(qū)域內每隔規(guī)定的間隔獲取從上述圖像信息檢測部輸入的上述被觀察物的圖像信息和從上述熒光圖像信息檢測部輸入的熒光圖像信息。運動模型是指著眼于被觀察物所具有的物理特性或化學特性中的特定維度或特定維度的組合、或者特定維度的權重組合、以預測被觀察物在該維度上的時間空間變化為目的的模型。例如，是指表示被觀察物的位置、速度、分布、種類、形狀、離子濃度、分子濃度中的任一個或它們的組合的時間空間變化的數(shù)理模型。在上述結構中，控制部優(yōu)選按照PID控制等古典控制、最優(yōu)控制、準最優(yōu)控制等現(xiàn)代控制、H⑴控制、采樣值控制、有限時間整定控制、適應控制等主現(xiàn)代控制理論、神經網絡控制、模糊控制、遺傳算法控制等智能控制來決定熒光觀察區(qū)域。PID控制是指按照一種根據與偏差成比例的項、偏差的積分項、以及偏差的微分項中的任一個或它們的組合進行表達的控制規(guī)則來進行目標值與輸出值的偏差的最小化的控制方法。最優(yōu)控制是指制作表示熒光觀察的效率的評價函數(shù)、通過將該評價函數(shù)局部最小化或最大化來導出局部最優(yōu)的控制規(guī)則的控制方法。控制部優(yōu)選按照被觀察物的運動模型來決定熒光觀察區(qū)域的中心位置?？刂撇績?yōu)選具備用于控制第一光源的第一光源控制部和用于控制第二光源的第二光源控制部。載物臺優(yōu)選使被觀察物的位置移動的三維載物臺。熒光圖像信息檢測部優(yōu)選具備波長選擇單元，該波長選擇單元分離出至少一個以上的波長的熒光。優(yōu)選具備第一針孔和第二針孔，該第一針孔配置于第二光源與被觀察物之間，該第二針孔配置于熒光與熒光圖像信息檢測部之間。優(yōu)選具備針孔驅動部，該針孔驅動部使第一針孔或第二針孔移動和/或旋轉。優(yōu)選具備配置于第一光源與被觀察物之間的物鏡以及物鏡的驅動部。優(yōu)選具備配置于在被觀察物處產生的光與圖像信息檢測部之間的成像透鏡以及成像透鏡的驅動部。優(yōu)選具備配置于熒光與熒光圖像信息檢測部之間的成像透鏡以及成像透鏡的驅動部。優(yōu)選具備環(huán)境控制部，該環(huán)境控制部容納被觀察物且充滿環(huán)境氣體。環(huán)境控制部控制環(huán)境氣體的種類、環(huán)境氣體的溫度。作為環(huán)境氣體，能夠利用氮氣(單體)、氧氣(單
6體)、二氧化碳(單體)、空氣(混合物)、以及它們的混合氣體。環(huán)境控制部優(yōu)選具備能夠容納多個被觀察物的容納部。優(yōu)選具備被觀察物刺激單元，其刺激被觀察物。作為施加給被觀察物的刺激，例如能夠利用電刺激、磁刺激、力學刺激、超聲波刺激、溫度刺激、化學刺激、光刺激等。作為被觀察物刺激單元，例如為了對被觀察物施加電刺激和磁刺激，能夠利用包括電極、電流、電池、電阻、電容器、磁體、線圈、超導體、理想導體、電導體、半導體、絕緣體、電解質、壓電體、 焦電體、強電解質、離子傳導體等的電刺激控制裝置。例如為了對被觀察物施加力學刺激， 能夠利用包括短針、探針、致動器、壓電體、離心機、配重、彈簧等的力學刺激控制裝置?；蛘?，為了對被觀察物施加超聲波刺激，能夠利用電致伸縮振動器、磁致伸縮振動器等超聲波刺激控制裝置?；蛘撸鐬榱藢Ρ挥^察物施加溫度刺激，能夠利用包括加熱器、制冷器、熱導體、溫度計、熱像儀等的溫度刺激控制裝置。并且，例如為了對被觀察物施加化學刺激， 能夠利用包括使化學物質的濃度或狀態(tài)發(fā)生時間空間變化的吸移管、泵、注射器、推進器 (Propeller)、螺桿、微流體設備的化學刺激控制裝置。例如為了對被觀察物施加光刺激，能夠利用反射鏡、棱鏡、濾光器、燈、激光、微波激射器等光刺激控制裝置。當然，這些刺激控制裝置以及其部件是互補的。例如，光刺激控制裝置能夠通過對籠狀化合物(Caged Compounds)照射光以將其分解，來使細胞內外的化學物質的濃度或狀態(tài)發(fā)生時間空間變化，從而也能夠成為化學刺激控制裝置。另外，光刺激控制裝置能夠利用光來加熱測量液，從而也能夠成為溫度刺激控制裝置。為了達到上述目的，本發(fā)明的熒光觀察方法包括以下步驟第一步驟，根據被觀察物的圖像信息和被觀察物的運動模型來決定被觀察物的熒光觀察區(qū)域；以及第二步驟，在熒光觀察區(qū)域內的規(guī)定位置獲取熒光圖像信息。在上述結構中，優(yōu)選按照PID控制等古典控制、最優(yōu)控制、準最優(yōu)控制等現(xiàn)代控制、H c 控制、采樣值控制、有限時間整定控制、適應控制等主現(xiàn)代控制理論、神經網絡控制、 模糊控制、遺傳算法控制等智能控制來決定第一步驟的熒光觀察區(qū)域。在第一步驟與第二步驟之間，優(yōu)選根據被觀察物的圖像信息和被觀察物的運動模型中的至少一個來決定熒光觀察區(qū)域的中心位置。在第二步驟中，優(yōu)選獲取被觀察物的圖像信息。優(yōu)選在熒光觀察區(qū)域內的每個規(guī)定位置重復進行規(guī)定次數(shù)的各步驟。運動模型的參數(shù)優(yōu)選包括被觀察物的位置、速度、分布、種類、形狀、離子濃度、分子濃度中的任一個或它們的組合。發(fā)明的效果根據本發(fā)明的顯微鏡裝置，根據來自被觀察物的圖像信息和被觀察物的運動模型來決定熒光觀察區(qū)域，因此能夠自動進行熒光觀察。根據使用了本發(fā)明的顯微鏡裝置的熒光觀察方法，為了根據被觀察物的運動模型導出評價函數(shù)和自動控制規(guī)則而使用被觀察物的位置、分布、種類、狀態(tài)、離子濃度、分子濃度等作為反饋信息，由此針對被觀察物的動態(tài)變化也能夠隨機應變且自動地調整熒光觀察參數(shù)。


圖1是表示本發(fā)明的第一實施方式所涉及的顯微鏡裝置的結構的示意圖。
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圖2是表示熒光觀察區(qū)域的模型的圖。圖3是表示使用了上述第一實施方式所涉及的顯微鏡裝置的熒光觀察過程的流程圖。圖4是表示第二實施方式所涉及的顯微鏡裝置的結構的示意圖。圖5是表示第三實施方式所涉及的顯微鏡裝置的結構的示意圖。圖6是表示第四實施方式所涉及的顯微鏡裝置的結構的示意圖。圖7是表示第五實施方式所涉及的顯微鏡裝置的結構的示意圖。圖8是表示第六實施方式所涉及的顯微鏡裝置的結構的示意圖。圖9是表示第七實施方式所涉及的顯微鏡裝置的結構的示意圖。圖10是表示第八實施方式所涉及的顯微鏡裝置的結構的示意圖。圖11是表示環(huán)境控制部的結構的示意圖，(A)是平面圖，(B)是沿(A)的X-X的截面圖。圖12是表示能夠觀察多個被觀察物的環(huán)境控制部的另外的結構的示意圖，(A)是平面圖，⑶是沿㈧的X-X的截面圖。圖13是表示觀察開始之后的細胞分布的一例的圖。圖14是對熒光觀察過程中使用了控制量U (k)的實施例的評價函數(shù)J和將熒光觀察區(qū)域寬度固定的情況下的比較例的評價函數(shù)J進行比較的示意圖。附圖標記說明1、30、35、40、45、50、55、60 顯微鏡裝置；2 被觀察物；3 :XY 或 XYZ 載物臺；4 照明用光源；5 激勵用光源；5Α 激勵光；6 物鏡；7 成像透鏡(透射光用)；8、9 濾波器； 10U0A 光學系統(tǒng)；12 成像透鏡(熒光用)；15 鏡筒部；16 圖像信息檢測部；17 熒光圖像信息檢測部；18、19 第一以及第二分束器(分色鏡)；20 控制部；21 個人計算機；22 顯示裝置；23 激勵用光源控制部；25 熒光波長選擇部；26 第三分色鏡；27 反射鏡；28 棱鏡；29 透鏡；32 物鏡用驅動部；37 透射光的成像透鏡用驅動部；52 熒光用成像透鏡用驅動部；53 第一針孔；54 第二針孔；56,58 針孔驅動部；60,80 環(huán)境控制部；62 主體部；64,84 容納部；65 樹脂板；66 載玻片；67 樹脂膜；67Α 細孔；68 氣體配管；68Α 輸入側；68Β 輸出側；69 環(huán)境氣體；70 保持部件；71,72 玻璃蓋片；74 培養(yǎng)液；85 障壁部；86 容納分區(qū)；F 熒光；T 透射光。
具體實施例方式下面，參照附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方式。在各圖中，對同一或對應的部件使用同一附圖標記。(第一實施方式)圖1是表示本發(fā)明的第一實施方式所涉及的顯微鏡裝置1的結構的示意圖。第一實施方式所涉及的顯微鏡裝置1具備載物臺3，其載置被觀察物2，能夠使被觀察物2的位置自由移動；光學系統(tǒng)10 ；以及控制部20，其控制載物臺3的位置等。光學系統(tǒng)10具有照明用光源4，其對被觀察物2照射照明光以檢測被觀察物2的像、位置；激勵用光源5，其照射用于激發(fā)出從被觀察物2產生的熒光的激勵光；鏡筒部15， 其配置有用于形成以下光路的光學部件，該光路為照射照明用光源4的光而從被觀察物2
8得到透過光T的光路、將激勵光5A導向被觀察物2的光路以及由被觀察物2產生的熒光F 的光路；圖像信息檢測部16，其檢測從鏡筒部15射出的來自被觀察物2的透射光所形成的圖像信息；以及熒光圖像信息檢測部17，其檢測從鏡筒部15射出的被觀察物2的熒光圖像信息。被觀察物2例如可以是作為生物試樣的細胞等。載物臺3上載置被觀察物2，通過后述的控制部20來控制被觀察物2的位置。該載物臺3是所謂的電動載物臺，可以是在載置被觀察物2的二維平面(X-Y平面)上進行驅動控制的XY載物臺，或者也可以是在三維上進行驅動控制的XYZ載物臺。三維的驅動也可以由機械手(Manipulator)來進行(參照非專利文獻3)。在此，也可以通過控制照明用光源4、激勵用光源5的照射位置、后述的針孔所配置的位置來進行觀察區(qū)域的XY軸方向上位置控制。也可以通過控制后述的物鏡、成像透鏡、針孔所配置的位置來進行觀察區(qū)域的ζ軸方向上的位置控制(參照專利文獻6、非專利文獻2、4)。在照明用光源4是透射光用的光源的情況下，照明用光源4只要是發(fā)出包含可由被觀察物2吸收的波長或反射的波長的光的光源即可。作為這種照明用光源4，能夠使用鹵素燈等各種燈、發(fā)光二極管、各種激光。為了避免透射光T與激勵光5A、熒光F相干擾， 優(yōu)選利用光學濾波器8等從照明用光源輸出的光中濾除與激勵光5A、熒光F相同的波長頻帶。從照明用光源4照射到被觀察物2的照明光成為來自被觀察物2的透射光T或反射光而被圖像信息檢測部16所檢測。來自被觀察物2的圖像是所謂的明場像、暗場像等的圖像 fn息ο激勵用光源5只要是能夠激勵被觀察物2本身或被觀察物2所含有的熒光體的光源即可。作為這種激勵用光源5，能夠將氙氣燈、汞燈等燈、氬激光等各種激光作為激勵光 5A。為了使激勵光5A不與透射光T、熒光F相干擾，優(yōu)選通過光學濾波器9等濾除不需要的波長頻帶。也可以通過未圖示的光投射管將激勵用光源5導入到被觀察物2。鏡筒部15構成為包括由第一以及第二分束器18、19、物鏡6以及成像透鏡7構成的光學部件，以形成使因照明用光源4的光而在被觀察物2處產生的光、激勵光5A以及熒光F通過的光路。在圖示的情況下，示出了倒立型的顯微鏡裝置的一例。在此，因照明用光源4的光而在被觀察物2處產生的光也可以不是透射光T而是反射光。第一以及第二分束器18、19也可以配置在鏡筒部15中設置的未圖示的端口上。分束器18、19能夠使用可使照明用光源4的波長與從被觀察物2產生的熒光F的波長相分離的分色鏡等。在下面的說明中，將分束器18、19作為分色鏡來進行說明。第一分色鏡18具有反射短波長的光且透射長波長的光的作用，因此激勵光5A反射而入射到紙面上方的被觀察物2。另一方面，通過利用波長比激勵光5A的波長長的光，來自被觀察物2的透射光T透過第一分色鏡18。第二分色鏡19配置于第一分色鏡18的下方。透過第一分色鏡18的來自被觀察物2的透射光T通過第二分色鏡19和成像透鏡7，從而從鏡筒部15射出到圖像信息檢測部 16。也可以通過事先在成像透鏡7與圖像信息檢測部16之間配置未圖示的濾波器，來使透射光T不與激勵光5A、熒光F相干擾地入射到圖像信息檢測部16。透過第一分色鏡18的來自被觀察物2的熒光F被第二分色鏡19反射并通過成像透鏡12，之后射出到熒光圖像信息檢測部17。也可以通過事先在成像透鏡12與熒光圖像信息檢測部17之間配置未圖示的濾波器，來使熒光F不與激勵光5A、透射光T相干擾地入射到熒光圖像信息檢測部17。圖像信息檢測部16具備能夠獲取基于照明用光源4的光經過被觀察物2的透射光T、反射光而得到的圖像信息的檢測器。在透射光T的光軸上并且在緊挨著檢測透射光T 的圖像信息檢測部16之前設置成像透鏡7。檢測器中能夠使用攝像元件，例如CCD型攝像元件、CMOS型攝像元件。并且，也可以通過例如使用了液氮、珀耳帖元件的冷卻裝置來對這些攝像元件進行冷卻，以提高S/N比(信噪比)并減少噪聲。檢測器也可以具備進行圖像處理的計算機。另外，也可以具備目鏡以用于目視觀察。熒光圖像信息檢測部17具備能夠獲取來自被觀察物2的熒光圖像的檢測器。該檢測器能夠根據目的而使用銀鹽相機、攝像元件。作為攝像元件，與圖像信息檢測部16同樣地，能夠使用CXD型攝像元件、CMOS型攝像元件。并且，也可以通過使用了液氮、珀耳帖元件的冷卻裝置來對這些攝像元件進行冷卻，以提高S/N比(信噪比)并減少噪聲。也可以在熒光F的光路上并且緊挨著檢測熒光F的熒光圖像信息檢測部17之前設置成像透鏡 12。另外，也可以具備目鏡以用于目視觀察。圖像信息檢測部16用的成像透鏡7與熒光圖像信息檢測部17用的成像透鏡12 也可以是不同的透鏡。例如，也可以降低圖像信息檢測部16用的成像透鏡7的倍率，同時提高熒光圖像信息檢測部17用的成像透鏡12的倍率。在這種情況下，能夠擴大圖像信息檢測部16所獲取的透射光T的圖像的視野，并且在熒光圖像信息檢測部17中能夠得到被觀察物2的更加擴大的熒光圖像。在圖1中，為了說明而將透射光T的光路、激勵光5A以及熒光F的光路示為不重合，但是這些光路也可以是一致的。在圖像信息檢測部16與熒光圖像信息檢測部17之間， 有時會產生視野中心位置以及焦點位置的偏差。在這種情況下，也可以預先測量這些偏差， 將其用作被觀察物2的位置控制以及觀察區(qū)域控制中的偏移。通過施加偏移，能夠對視野中心位置、焦點位置的偏差進行校正。通過圖像信息檢測部16將基于被觀察物2的透射光T、反射光而得到的圖像信息輸入到控制部20?？刂撇?0進行圖像信息的處理以及基于圖像信息的處理結果的載物臺 3的控制?？刂撇?0由電子計算機構成。作為這種電子計算機，能夠使用個人計算機21。 個人計算機21具備顯示被觀察物2的圖像等的顯示器裝置22。個人計算機21對圖像信息檢測部16以及熒光圖像信息檢測部17中的攝影的開始和結束、攝影速度、攝影像素數(shù)、面元(binning)數(shù)、增益、位數(shù)等進行控制。通過光學系統(tǒng)10將透過被觀察物2的透射光T的圖像信息輸入到控制部20中， 控制部20利用該圖像信息來控制載物臺3上的被觀察物2的位置。在顯微鏡裝置1中，根據從圖像信息檢測部16輸入的被觀察物2的圖像信息和被觀察物2的運動模型來決定被觀察物2的熒光觀察區(qū)域，移動載物臺3來在熒光觀察區(qū)域內的每隔規(guī)定間隔的位置上獲取從圖像信息檢測部16輸入的被觀察物2的圖像信息和從熒光圖像信息檢測部17輸入的熒光圖像信息。在此，運動模型的參數(shù)包括被觀察物2的位置、速度、分布、種類、形狀、離子濃度、 分子濃度中的任一個或它們的組合。具體地說，為了進行熒光觀察，控制部20進行包括如下三個步驟的控制，從而能
10夠控制被觀察物2的熒光信息的獲取，該三個步驟為在第一步驟中，根據從圖像信息檢測部16輸入的被觀察物2的透射光的圖像信息來決定被觀察物2的熒光觀察區(qū)域，在第二步驟中，按照被觀察物2的運動模型來決定熒光觀察區(qū)域的中心位置，在第三步驟中，以規(guī)定的間隔進行熒光觀察區(qū)域內的熒光觀察和明場觀察。在此，能夠按照后述的最優(yōu)控制規(guī)則等智能控制來決定熒光觀察區(qū)域。(位置控制算法)首先，根據第一步驟中的被觀察物2的透射光的圖像信息來對控制被觀察物2的細胞位置的方法、即細胞位置控制算法進行說明。在圖像信息檢測部16中，獲取被觀察物2的透射光的圖像，接著從圖像信息中提取圖像特征量。通過圖像信息的二值化來在存在觀察對象的區(qū)域中提取圖像特征量，此時， 通過使用僅在觀察對象剛才存在的區(qū)域附近進行提取的自窗口法，能夠不被障礙物擾亂地僅提取觀察對象(參照非專利文獻1)。具體地說，基于上述的二值數(shù)據來計算0次、1次、2次矩(moments)作為透射光圖像特征量。由控制部20的個人計算機21讀出該圖像特征量，求出被觀察物2的重心和方向。也可以利用卡爾曼濾波器、粒子濾波器等來預測被觀察物2的運動。接著，確定載物臺3的馬達旋轉角的目標值，對該馬達進行反饋控制，以使被觀察物2的重心移動到視野中心。例如，能夠使用CTZ載物臺作為載物臺3。在該反饋控制中， 能夠使用利用比例、積分、微分中的任一個或它們的組合的控制手法。另外，為了觀察被觀察物2的特定部位、或者獲取被觀察物2的立體圖像，也可以有意地確定載物臺3的馬達旋轉角的目標值來對該馬達進行反饋控制，以使偏離被觀察物 2的重心的特定位置移動到視野中心。也可以使用上述自窗口法以外的方法，例如也可以從被觀察物2的衍射像中提取出透射光圖像特征量(參照非專利文獻2)。為了重構、即再現(xiàn)被觀察物2的軌跡，將上述CTZ載物臺3的位移信息事先記錄在個人計算機21中。由此能夠得到被觀察物2的軌跡。使用透射光T是為了以高亮度穩(wěn)定地拍攝成為追蹤對象的被觀察物2的全部像。 除了透射光T以外，也能夠使用來自應用了反射照明(印i-illumination)的被觀察物2的反射光。能夠使用與照明用光源4同樣的光源作為反射光的光源。在這種情況下，來自被觀察物2的圖像是反射光圖像。此外，當對被觀察物2過度照射來自照明用光源4的透射光T時，有可能會提高被觀察物2的溫度。因此，本實施方式的控制部20能夠對來自照明用光源4的光的強度、照射時間等進行調整。(熒光觀察方法)接著，說明使用了本發(fā)明的顯微鏡裝置1的熒光觀察方法。將熒光試劑搭載在被觀察物2上或注入被觀察物2。在被觀察物2是細胞的情況下，只要使用hdo-l(AM體，同仁化學研究所)這樣的熒光試劑、以適度的濃度施加規(guī)定時間即可。hdo-KAM體)不發(fā)出熒光F，但是可通過微生物的細胞膜。通過細胞膜的hdo-1 (AM體)利用體內的酯酶而變化為脫AM體。即，當hdo-1 (AM 體)通過細胞膜時，變化為能夠發(fā)出熒光F但是不能通過細胞膜的hdo-l。hdo-l在與Ca2+離子結合時和離解時發(fā)出不同波長的熒光F。處于結合狀態(tài)和離解狀態(tài)的hdo-Ι的量根據Ca2+濃度而發(fā)生變化。S卩，隨著Ca2+ 濃度上升，基于結合狀態(tài)的hdo-Ι的熒光F增加，相反地，基于離解狀態(tài)的^ido-I的熒光 F減少。根據該特性，通過對各個波長的熒光F的強度進行比較，能夠求出Ca2+濃度。具體地說，在使用后述的顯微鏡裝置40的情況下，能夠按波長分出兩個波長的熒光觀察像，將按每像素計算出的熒光強度比代入預先制作出的標準曲線，則可求出Ca2+濃度。不僅是Ca2+離子，通過交換顯微鏡裝置1中的濾波器9以及分色鏡18、19、26，也能夠利用以其它離子、分子為對象的熒光色素。(熒光觀察區(qū)域的控制算法)說明用于使用顯微鏡裝置1來減少熒光觀察張數(shù)以及增加能夠進行熒光觀察的細胞數(shù)的控制。作為該控制，為了進行熒光觀察而進行載物臺3的Z軸方向、即成像透鏡7的位置的時間變化，更具體地說是熒光觀察區(qū)域寬度的時間變化。作為熒光觀察的順序，最初決定進行熒光觀察的區(qū)域。圖2是表示熒光觀察區(qū)域的模型的圖。圖的斜線所示的位置表示進行熒光觀察的區(qū)域。對該觀察區(qū)域進行等分。分割的寬度d(在此，d>0)是根據所觀察的對象而決定的。接著，在觀察區(qū)域的各點進行熒光觀察。然后，在間隔數(shù)十秒的時間之后，重新設定觀察區(qū)域，進行熒光觀察。將這種觀察重復T次(在此，T > 0)。—張熒光觀察中照射激勵光5A的時間e( > 0)與觀察點的數(shù)量N(k)(在此，k > 0)相乘后得到的值eN(k)為一次熒光觀察中照射激勵光5A的總時間。e是可變且能夠擴大的，但是在此為了簡單而將其設為固定。通過下述(1)式來給出第K e {0,1,…，T-1} 次的熒光觀察的區(qū)域寬度。[數(shù)1]2x(k) = N(k)d (1)當熒光觀察時間從第k次的試驗轉變到第k+Ι次的熒光F時，將x(k)更新為 x(k+l)。導入通過下述(2)式給出的J(T)來作為熒光觀察的評價函數(shù)。[數(shù)2]S[\k)-ry\k)] (2)在此，q( > 0)、r ( > 0)分別是與熒光觀察所需的時間和所觀察的細胞數(shù)有關的權重。y(k)是在熒光觀察區(qū)域寬度&(10內進行熒光觀察的細胞數(shù)。在( 式中，熒光觀察張數(shù)N(k)越少，(2)式的右邊部分越小，進行熒光觀察的細胞數(shù)y(k)越多，(2)式的右邊部分越小。另一方面，當N(k)變少時，y(k)也變少。因而問題被轉換為找出使評價函數(shù)J(t)最小化的熒光觀察參數(shù)N(k)的問題。根據⑴式，N(k)與x(k)存在⑴式的關系，因此下面求出x(k)的最優(yōu)控制規(guī)則。利用下述(3)式來更新時刻k下的x(k)。[數(shù)3]
權利要求
1.一種顯微鏡裝置，其特征在于，具備 載物臺，其載置被觀察物；第一光源，其對上述被觀察物照射照明光；第二光源，其對上述被觀察物照射用于激勵熒光的激勵光；圖像信息檢測部，其檢測在上述被觀察物處產生的基于光的圖像信息；熒光圖像信息檢測部，其檢測在上述被觀察物處產生的基于熒光的熒光圖像信息；以及控制部，其根據上述被觀察物的運動模型和從上述圖像信息檢測部輸入的上述被觀察物的圖像信息來決定上述被觀察物的熒光觀察區(qū)域，在上述熒光觀察區(qū)域內每隔規(guī)定的間隔獲取從上述圖像信息檢測部輸入的上述被觀察物的圖像信息和從上述熒光圖像信息檢測部輸入的熒光圖像信息。
2.根據權利要求1所述的顯微鏡裝置，其特征在于，上述控制部按照最優(yōu)控制、準最優(yōu)控制等現(xiàn)代控制來決定上述熒光觀察區(qū)域。
3.根據權利要求1所述的顯微鏡裝置，其特征在于，上述控制部按照上述被觀察物的運動模型和上述被觀察物的圖像信息中的至少一個來決定上述熒光觀察區(qū)域的中心位置。
4.根據權利要求1所述的顯微鏡裝置，其特征在于，上述控制部根據上述被觀察物的運動模型和上述被觀察物的圖像信息中的至少一個來控制上述載物臺使其對上述被觀察物進行跟蹤，并且控制上述被觀察物的熒光信息的獲取。
5.根據權利要求1所述的顯微鏡裝置，其特征在于，上述控制部通過PID控制等古典控制來控制上述載物臺，該PID控制為基于上述圖像信息的比例、積分、微分中的任一個或它們的組合的控制。
6.根據權利要求1所述的顯微鏡裝置，其特征在于，上述控制部具備用于控制上述第一光源的第一光源控制部和用于控制上述第二光源的第二光源控制部。
7.根據權利要求1所述的顯微鏡裝置，其特征在于，上述載物臺是使上述被觀察物的位置移動的二維或三維載物臺。
8.根據權利要求1所述的顯微鏡裝置，其特征在于，上述熒光圖像信息檢測部具備波長選擇單元，該波長選擇單元對至少一個以上的波長的熒光進行分離。
9.根據權利要求1所述的顯微鏡裝置，其特征在于，還具備第一針孔和第二針孔，該第一針孔配置于上述第二光源與上述被觀察物之間， 該第二針孔配置于上述熒光與上述熒光圖像信息檢測部之間。
10.根據權利要求9所述的顯微鏡裝置，其特征在于，還具備針孔驅動部，該針孔驅動部使上述第一針孔或上述第二針孔移動和/或旋轉。
11.根據權利要求1所述的顯微鏡裝置，其特征在于，還具備配置于上述第一光源與上述被觀察物之間的物鏡以及該物鏡的驅動部。
12.根據權利要求1所述的顯微鏡裝置，其特征在于，還具備配置于上述被觀察物處產生的光與上述圖像信息檢測部之間的成像透鏡以及該成像透鏡的驅動部。
13.根據權利要求1所述的顯微鏡裝置，其特征在于，還具備配置于上述熒光與上述熒光圖像信息檢測部之間的成像透鏡以及該成像透鏡的驅動部。
14.根據權利要求13所述的顯微鏡裝置，其特征在于，還具備環(huán)境控制部，該環(huán)境控制部容納上述被觀察物且充滿有環(huán)境氣體。
15.根據權利要求14所述的顯微鏡裝置，其特征在于，上述環(huán)境控制部具備能夠容納多個上述被觀察物的容納部。
16.根據權利要求1所述的顯微鏡裝置，其特征在于，還具備被觀察物刺激單元，該被觀察物刺激單元刺激上述被觀察物。
17.一種被觀察物的熒光觀察方法，獲取被觀察物的圖像信息和該被觀察物的熒光圖像信息，該熒光觀察方法的特征在于，包括以下步驟第一步驟，根據上述被觀察物的圖像信息和上述被觀察物的運動模型來決定上述被觀察物的熒光觀察區(qū)域；以及第二步驟，在上述熒光觀察區(qū)域內的規(guī)定位置處獲取上述熒光圖像信息。
18.根據權利要求17所述的被觀察物的熒光觀察方法，其特征在于，按照諸如PID控制等古典控制以及諸如最優(yōu)控制、準最優(yōu)控制等現(xiàn)代控制來決定上述第一步驟的熒光觀察區(qū)域。
19.根據權利要求17所述的被觀察物的熒光觀察方法，其特征在于，在上述第一步驟與上述第二步驟之間，根據上述被觀察物的圖像信息和上述被觀察物的運動模型中的至少一個來決定上述熒光觀察區(qū)域的中心位置。
20.根據權利要求17所述的被觀察物的熒光觀察方法，其特征在于，在上述第二步驟中，獲取上述被觀察物的圖像信息。
21.根據權利要求17 20中的任一項所述的被觀察物的熒光觀察方法，其特征在于，在上述熒光觀察區(qū)域內的每個規(guī)定位置處將各上述步驟重復進行規(guī)定次數(shù)。
22.根據權利要求17所述的被觀察物的熒光觀察方法，其特征在于，上述運動模型的參數(shù)包括上述被觀察物的位置、速度、分布、種類、形狀、離子濃度、分子濃度中的任一個或它們的組合。
全文摘要
提供一種控制細胞等被觀察物的位置和控制熒光記錄的顯微鏡裝置以及熒光觀察方法。顯微鏡裝置(1)具備載物臺(3)，其載置被觀察物(2)；被觀察物(2)的照明用光源(4)；激勵用光源(5)，其對被觀察物(2)激發(fā)熒光F；圖像信息檢測部(16)，其檢測基于在被觀察物(2)處產生的光T的圖像信息；熒光圖像信息檢測部(17)，其檢測基于熒光F的熒光圖像信息；以及控制部(20)，其根據被觀察物(2)的運動模型和從圖像信息檢測部(16)輸入的被觀察物(2)的圖像信息來決定被觀察物(2)的熒光觀察區(qū)域，在熒光觀察區(qū)域內每隔規(guī)定的間隔獲取從圖像信息檢測部(16)輸入的被觀察物(2)的圖像信息和從熒光圖像信息檢測部(17)輸入的熒光圖像信息。
文檔編號G02B21/00GK102216827SQ20098014545
公開日2011年10月12日 申請日期2009年6月10日 優(yōu)先權日2008年9月13日
發(fā)明者五十嵐康伸, 出口雄規(guī), 小原健, 橋本浩一, 鈴木健史 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構