專利名稱：家蠶的ssr標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術和遺傳學領域，具體地，本發(fā)明涉及一種適用于對鱗翅目昆蟲進行功能基因組研究、基因定位、親緣關系鑒定、或品種鑒定的包含簡單重復序列(SSR)的多核苷酸集及其用途。
背景技術：
家蠶(Bombyx mori)是我國重要的經(jīng)濟昆蟲。以家蠶為主體的絲綢業(yè)一直是我國的優(yōu)勢傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，目前全國共有栽桑養(yǎng)蠶農(nóng)戶2000萬戶，據(jù)國家統(tǒng)計局統(tǒng)計，2004年1-12月份全國工業(yè)總產(chǎn)值完成1385.35億元，同比增長26.92％；產(chǎn)品銷售收入完成1356.56億元，同比增長26.98％；利潤總額完成41.53億元，同比增長11.74％。據(jù)海關統(tǒng)計，2004年1-12月真絲綢商品出口31.99億美元，同比增長27.65％。其次，家蠶作為理想的生物反應器也日益受到重視。利用家蠶-NPV表達系統(tǒng)可生產(chǎn)珍貴的有用蛋白。第三，家蠶是理想的全變態(tài)型昆蟲的模式生物；在卵、幼蟲、蛹和成蟲各個發(fā)育階段都可以觀察到各種性狀，已經(jīng)積累了大批遺傳變異的品系。由于在一年之中能夠多世代繁殖，雌性個體所產(chǎn)后代數(shù)遠遠大于其它生物種類，有利于遺傳學研究和突變體的篩選。第四，危害農(nóng)林作物的大部分害蟲種類與家蠶同屬于鱗翅目，家蠶基因組的研究將直接推動對鱗翅目昆蟲的比較生物學和功能基因組研究，有可能將鱗翅目昆蟲的綜合治理提高到一個新的水平。除此之外，蠶桑業(yè)是我國古代文明的重要標志之一，數(shù)千年前的絲綢之路就是建立在蠶絲所開發(fā)的產(chǎn)品之上；對家蠶基因組進行研究，對弘揚我國悠久的歷史文明也有重要意義。
遺傳圖譜是以遺傳重組率為圖距單位，將染色體上的各種標記按照它們在染色體上的順序排列而成的一張連鎖圖譜。遺傳圖譜不但是進行育種，性狀改善檢測與選擇的依據(jù)也是構(gòu)建物理圖譜和序列圖譜，進行基因組學研究的基礎。最初遺傳圖譜是由肉眼可辨的形態(tài)突變等標記來制作的，當DNA分子標記被發(fā)現(xiàn)以來，由于其穩(wěn)定可靠重復性高操作簡便被廣泛應用于遺傳圖譜的制作。
SSR(Simple Sequence Repeat)又稱微衛(wèi)星DNA，是一種新興的分子標記，它是由2-5個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列，它廣泛分布于整個真核生物基因組的不同座位上。不同個體同一座位重復單位的重復數(shù)目可能不相同，因而形成多態(tài)性，即SSR分子標記。SSR比起RFLP和RAPD等其他的分子標記，具有多態(tài)性高，分析簡便，易于實現(xiàn)自動化高通量篩選，成本低等優(yōu)點，知道了其序列后，只要合成引物，做一次PCR反應就可得到結(jié)果，是一種理想的分子標記，它被廣泛地應用于人類及其他物種的遺傳圖譜地建立。但是，在家蠶基因組的研究領域還未被運用。目前除SSR外已有多項分子標記技術用于構(gòu)建家蠶連鎖圖，如RFLP(RestrictionFragment Length Polymorphisms)，RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)及AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphisms)等，并已取得一定進展。1998年Yasukochi用RAPD構(gòu)建了一個家蠶高密度連鎖圖，包含1018個遺傳標記，圖距約2cM(約500kb)，覆蓋27條常染色體和一條Z染色體。2001年，Yuan-De Tan等用AFLP構(gòu)建了一個家蠶的連鎖圖。2004年，Xiang ZH等用407個AFLP標記構(gòu)建了一張家蠶的連鎖遺傳圖，并將Gc基因定位。然而這些遺傳圖還不能滿足生產(chǎn)及研究的需要，以SSR分子標記構(gòu)建一張遺傳圖勢在必行。
1991年Rhode Island大學的M.R.Goldsmith提出了國際蠶分子育種計劃(International silkworm project)，也叫基因標記育種計劃。該計劃主要包括兩步工作第一步是制作蠶分子基因圖，第二步是數(shù)量性狀(QTL，Quantitative Trait Locus)定位分析。最后利用分子標記直接在DNA水平進行重要經(jīng)濟性狀的選擇、固定，實施“分子育種”，用很短的時間育成兼具高抗、強健、絲多、質(zhì)優(yōu)、易繁等特性的新品種。計劃提出之后即與日本和印度蠶業(yè)界通過非正式合作，開展了蠶分子遺傳圖及數(shù)量性狀定位分析等研究。此外，日本東京大學以家蠶P50品系的絲腺為材料，構(gòu)建了一個約含35589重組克隆的BAC庫，平均插入片段為168kb，豐度(redundancy)為家蠶基因組大小的11.3倍，已有成品出售家蠶基因組由28對染色體構(gòu)成，總堿基數(shù)約470Mb，估計有20,000個功能基因。為了保持我國在蠶桑業(yè)上以及在蠶學研究中的領先地位，我國在國際蠶分子育種計劃中的研究不能落后于其他國家。因此，構(gòu)建一張精細的家蠶SSR遺傳圖譜是其中工作的重中之重，從而為今后的數(shù)量性狀定位分析(或單基因性狀定位分析)，以及分子育種研究工作打下堅實的基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適用于對鱗翅目昆蟲進行功能基因組研究、基因定位、親緣鑒定、或品種鑒定的包含簡單重復序列(SSR)的多核苷酸集。
本發(fā)明的目的還在于提供適合于擴增所述簡單重復序列的引物。
本發(fā)明的目的還在于提供采用所述的多核苷酸進行功能基因組研究、基因定位、親緣鑒定、或品種鑒定等的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種家蠶的分子連鎖遺傳圖譜，其中，由SSR分子標記制成的高密度遺傳連鎖圖，標記的分布均勻，對未知基因進行定位十分方便。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的SSR標記序列單一，每一個標記都有對應的引物序列。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，家蠶的分子連鎖遺傳圖譜及其SSR標記以及其序列都是單一的。
在本發(fā)明的第二方面，提供所述的家蠶的分子連鎖遺傳圖譜在家蠶各個品種間的親緣關系鑒定，在鱗翅目昆蟲間的親緣關系研究，以及在家蠶基因的定位研究中的應用。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種用于分子連鎖遺傳分析的多核苷酸集，所述的多核苷酸集包括SEQ ID NO3n所示的SSR位點序列，其中n為1-518的正整數(shù)(即由518個SSR位點序列所構(gòu)成的多核苷酸集)。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸集還包括分別由SEQ ID NO3n-2所示的正向引物和SEQ ID NO3n-1所示的反向引物所構(gòu)成的引物對，其中n為1-518的正整數(shù)，并且第n對引物對對應于序列如SEQ ID NO3n所示的SSR位點序列。
在本發(fā)明的第四方面，提供所述的多核苷酸集的用途，所述的多核苷酸集作為SSR標志物用于確定鱗翅目昆蟲間的親緣關系；鱗翅目昆蟲基因的定位；鱗翅目昆蟲各物種間的保守性分析；鱗翅目昆蟲的進化分析；或鱗翅目昆蟲的品種鑒定。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的鱗翅目昆蟲選自家蠶、棉鈴蟲、或玉米螟等；更優(yōu)選地，所述的鱗翅目昆蟲為蠶。
在本發(fā)明的第五方面，提供一種確定兩種鱗翅目昆蟲之間的親緣關系的方法，所述方法包括(1)從所述的用于分子連鎖遺傳分析的多核苷酸集中選出第m個SSR位點序列作為標記，其中m為1-518的正整數(shù)；(2)用對應于該SSR位點的序列如SEQ ID NO3m-2和3m-1所示引物對，對所述兩種鱗翅目昆蟲的基因組DNA進行擴增，從而獲得擴增產(chǎn)物；(3)比較兩種鱗翅目昆蟲的擴增產(chǎn)物，從而確定兩種鱗翅目昆蟲之間的親緣關系。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，通過電泳分析擴增產(chǎn)物的條帶數(shù)目和位置情況，擴增產(chǎn)物的條帶數(shù)目和位置一致性越高，表示兩種鱗翅目昆蟲之間的親緣關系越近；擴增產(chǎn)物的條目數(shù)目和位置差異越大，表示兩種鱗翅目昆蟲之間的親緣關系越遠。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的電泳是凝膠電泳。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的兩種鱗翅目昆蟲都是家蠶(即可用于種內(nèi)比較)；或者所述的兩種鱗翅目昆蟲中一種昆蟲是家蠶，而另一種昆蟲不是家蠶(即可用于種間比較)。
在本發(fā)明的第六方面，提供一種對鱗翅目昆蟲的基因進行定位的方法，所述的方法包括(a)提供一鱗翅目昆蟲群體，其中所述群體中攜帶所述基因的個體與不攜帶所述基因的個體在表型上存在差異；(b)通過分析所述鱗翅目昆蟲中與該基因相關的表型，確定所述鱗翅目昆蟲群體中各個體的待定位基因的基因型；(c)根據(jù)待定位基因所在的染色體，從所述的用于分子連鎖遺傳分析的多核苷酸集中選出位于同一染色體上的一個或多個SSR位點序列(如第p個SSR位點序列，其中p為1-518的正整數(shù))作為連鎖標記；(d)用對應于該SSR位點序列的引物對，對該鱗翅目昆蟲群體中各個體的基因組DNA進行擴增，從而獲得擴增產(chǎn)物，并根據(jù)擴增產(chǎn)物的特征(更優(yōu)選的，為擴增產(chǎn)物的電泳條帶特征)確定各個體中該SSR位點序列的基因型；(e)根據(jù)該群體中各個體的待定位基因的基因型情況以及該群體中各個體的所述SSR位點序列的基因型情況，確定待定位基因與該SSR位點序列的連鎖程度(更優(yōu)選的，其中遺傳距離小就表示兩者的連鎖程度高，遺傳距離大就表示兩者的連鎖程度低)；(f)根據(jù)步驟(e)中所獲得的連鎖程度，將所述基因定位于與該基因連鎖程度最高的兩個SSR位點序列之間。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在同一染色體上選用6-20個SSR序列位點。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，對于第p個SSR位點序列，選用對應于該SSR位點序列的序列如SEQ ID NO3p-2和3p-1所示引物對。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1為以同位素標記的探針對基因組文庫的原位雜交圖。
圖2為ABI 377測序儀膠圖。
圖3為本發(fā)明測序方法示意圖。
圖4-31為連鎖遺傳圖第1-28號染色體圖，其中“Chr.”表示染色體(Chromosome)。
圖32為mln定位示意圖。
圖33顯示了用S0710和S2306所對應的兩對SSR引物對8個家蠶品系的PCR擴增，擴增產(chǎn)物的電泳圖譜。其中，M＝marker，Bao＝寶中長，Hua＝華八，Qiu＝秋風，Jing＝菁松，A用S0710對應的SSR引物擴增的帶，B用S2306對應的SSR引物擴增的帶。
圖34顯示了518個SSR標記及其相應的引物的序列。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，開發(fā)出了一種適用于對鱗翅目昆蟲進行功能基因組研究、基因定位、親緣鑒定、或品種鑒定的多核苷酸集，所述的多核苷酸集中包含有多個簡單重復序列(SSR)。
更具體的，本發(fā)明人以家蠶為研究對象，開發(fā)出所述的SSR位點，這些SSR位點可構(gòu)成一張家蠶基因組的高密度連鎖圖，所述的SSR的部分或全部可作為分子標記被應用于家蠶的功能基因組研究以及蠶桑業(yè)的品種篩選中，提供一個技術平臺對一些重要的經(jīng)濟性狀基因進行定位克隆，最終實現(xiàn)分子標記輔助選擇育種。所述的SSR位點作為標志物或標記還可應用于家蠶以外的其它蠶品種中。
并且，由于鱗翅目昆蟲之間具有較近的親緣關系，所述的SSR位點還可應用于蠶以外的其它鱗翅目昆蟲的基因組研究中。
簡單重復序列如本文所用，所述的“簡單重復序列(SSR)”又稱為“串聯(lián)重復序列(Short TandemRepeats，STR)，或“微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)”，是指一種短序列，例如一種單、二、三、四、或五-核苷酸，其在某一特定的核苷酸序列中至少重復一次。
盡管所述的多核苷酸集中的各SSR分布于整個基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)這兩端的序列設計一對特異引物，通過PCR技術將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴增出來，利用測序或電泳分析等技術就可獲得其長度多態(tài)性。
由于這些SSR位點序列在鱗翅目不同種中具有高度保守性，因此它們可被廣泛地應用。本發(fā)明中所提到的SSR位點可以在不同譜系、群體，甚至在屬內(nèi)相近的種之間通用。
由于這些SSR位點均勻地分部在鱗翅目昆蟲的各條染色體上，因此利用本發(fā)明的微衛(wèi)星標記可構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖。
引物本發(fā)明還提供了可用于擴增所述的SSR標記引物。所述的引物根據(jù)這些SSR位點兩端的保守序列進行設計。引物的設計方法為本領域技術人員所熟知的方法。更特別的，本發(fā)明在設計引物時，采用相近的Tm溫度，以便使這些引物能夠在高通量的擴增和檢測中使用。
采用所述的引物，可擴增出鱗翅目昆蟲基因組中相應的SSR位點。并且，采用相同的引物對，以不同的鱗翅目昆蟲的基因組DNA為模板，可獲得包含多態(tài)性SSR結(jié)構(gòu)(如SSR重復次數(shù)不同、或長度不同等)的多核苷酸。
應用本發(fā)明的簡單重復序列及其相應的引物具有多種用途。包括但不限于用于比較鱗翅目各動物之間的親緣關系包括種內(nèi)比較如不同品系的家蠶之間，或種間的比較如家蠶與棉鈴蟲之間。
鱗翅目昆蟲基因的定位通過觀察待鑒定的基因與其所在染色體上的一些SSR序列位點之間的連鎖關系，可將所述基因定位于與該基因連鎖程度最高的兩個SSR位點序列之間。
鱗翅目昆蟲各物種間的保守性分析通過對這些家蠶SSR位點在其他鱗翅目昆蟲中進行擴增，尋找能夠在其他鱗翅目昆蟲中得以擴增的位點。如果位點能夠被成功擴增，說明這個位點在家蠶與家蠶以外的被擴增對象中共同存在，家蠶的這個位點就能被其他昆蟲所利用。
鱗翅目昆蟲的進化分析微衛(wèi)星標記可以作為物種間關系研究的手段，進行物種間的進化分析。根據(jù)遺傳距離確定物種間的進化關系。
昆蟲例如家蠶的品種鑒定家蠶的品種多達3000多個，僅保留在中國的品種就達到1000多個。傳統(tǒng)的方法是利用外部形態(tài)標記對這些品種進行鑒定，由于品種多，能夠利用的形態(tài)標記數(shù)量較少，在品種鑒定方面一直是個難點。利用本發(fā)明入開發(fā)的SSR標記，對家蠶品種進行PCR擴增，尋找每一個品種所對應的品種特異性SSR標記，就能夠?qū)崿F(xiàn)家蠶品種在形態(tài)特征結(jié)合分子標記的前提下進行品種鑒定。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 微衛(wèi)星標記位點的獲得將家蠶P50品系五齡第三天幼蟲的后部絲腺用液氮研磨成粉末，與等體積4×Homogenization Buffer(均質(zhì)緩沖液，配方Tris.HCl(pH＝9.5)40mM，EDTA(pH＝8.0)40mM，KCl 40mM，亞精胺16mM)混合，然后埋入兩倍體積的低熔點瓊脂糖凝膠中。再將此包埋了絲腺組織的膠塊，先經(jīng)消化緩沖液(0.5M EDTA，10％十二烷基肌氨酸鈉)平衡，再用蛋白酶K消化。之后用TE洗脫3～4次，去除蛋白酶K的活力。然后先用限制性內(nèi)切酶消化緩沖液將膠塊平衡，再加入限制性內(nèi)切酶Sau3A1部分酶切(另一部分的DNA采用Tsp 509I部分酶切)。將此膠塊埋入0.5％低熔點瓊脂糖凝膠中，經(jīng)脈沖場凝膠電泳，從而分離得到大片段家蠶DNA。割膠回收挑選7kb以上長度的DNA片段，裝入pUC18載體(購自華美生物工程公司)，電轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B(購自國家人類基因組南方研究中心)，構(gòu)建隨機基因組文庫。挑選非空載的單克隆菌落于384孔板中培養(yǎng)，然后將384孔板中的克隆(采用機械手，Beckman 3000型)，原位印跡于尼龍膜上培養(yǎng)。用Sambrook的經(jīng)典雜交法以(CA)12和(CT)12為探針雜交(圖1)。雜交得到的陽性克隆用ABI3700自動DNA測序儀測序，通用引物(GT)7或(GA)7，第一次的測序結(jié)果用于設計正向引物。用設計的正向引物對同一個克隆進行第二次測序，第二次的測序結(jié)構(gòu)被用于在DNA重復序列的另一邊設計反向引物(圖3)。引物設計用軟件Primer Premier 5.0(Premier Biosoft International，Palo Alto，Calif.)。為了高通量的操作，所有設計的引物都采用同一個標準55-60℃熔解溫度，40-60％的GC含量，18-25bp的引物和100-330-bpPCR產(chǎn)物長度。
以6個家蠶品系P50，C108，菁松，蘭10，法50B，54A為模板，PCR擴增這些SSR標記，通過8％聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，然后根據(jù)肉眼讀帶，并在“天能凝膠處理系統(tǒng)”的軟件(購自天能公司)幫助下，判斷條帶的大小區(qū)別，以鑒定這些標記的多態(tài)性、擴增重復性，最后選取約780個在家蠶品系P50和C108間有多態(tài)的SSR引物進行熒光標記(采用的熒光標記為FAM，TET，HEX，或TEMRA)。用此780個SSR標記所對應的引物對含189個個體的回交群體(BCF1群體，P50×C108)×C108)進行PCR擴增和基因型分析(Genotyping)，PCR結(jié)果用高通量的ABI377測序儀進行檢測，然后進行電泳分析，結(jié)果見圖2，將出現(xiàn)一條帶的個體記做1，為純合型，將兩條帶的個體記做2，為雜合型。將這些數(shù)據(jù)結(jié)果用遺傳作圖軟件(Mapmaker 3.0，Lander等，1987，LanderES，Green P，Abrahamson Je等1987.MAPMAKER，an interactive computer package forconstructing primary genetic linkage map of experimental and naturalpopulations.Genomics，1174-180))進行分析，而將這些SSR標記分為32個連鎖群，并精確計算了各個標記的位置及距離，平均圖距大致3.5cM(大致550個標記)。進行上述分析的原理是兩個標記的遺傳距離與其兩者間的交換率成正比，通常將1％的交換率定義為1cM的遺傳圖距。
然后，再利用家蠶的雌不交換原理，以雌性的F1個體回交親本，其產(chǎn)生的后代為分析群體來檢測各個標記間是否連鎖，而將這些標記確定為28個連鎖群，與家蠶的28個染色體數(shù)一致。最后利用已經(jīng)定位到各個染色體上形態(tài)標記及CAPS(CleavedAmplification Polymorphism Sequence)標記將此28個連鎖群與實際的家蠶染色體一一對應，如圖4～31所示，最終繪制成家蠶的SSR連鎖遺傳圖，其最終包含SSR標記518個(具體序列詳見SEQ ID NO3n(圖34)，其中n＝1-518的正整數(shù))，覆蓋3432cM，平均圖距6.27cM，每個連鎖群含有標記7-40個不等(見圖4-31)。所有的SSR標記及其相應的引物見圖34所示，而518個SSR標記的正向引物(圖34中簡稱“正向”)序列為SEQID NO3n-2，反向引物(圖34中簡稱“反向”)序列為SEQ ID NO3n-1。
實施例2 使用遺傳圖上的SSR標記鑒定家蠶品種由于這些SSR標記是根據(jù)家蠶的P50品系的基因組文庫測序得到的。而家蠶各個品種間的親緣關系也都很近，所以這些SSR標記也都能應用于其它的家蠶品種中。
微衛(wèi)星標記的一大特點就是多態(tài)性很高，因此，本圖譜上的微衛(wèi)星標記也可應用于各個家蠶品種中。將多個SSR標記在家蠶的各個品種群體間進行PCR反應，用ABI 377測序儀，甚至瓊脂糖凝膠電泳都可檢測分析這些標記在各個家蠶品種間的片段長度或差別。也可通過這種方法得到家蠶各品種間的指紋圖譜，并同時可根據(jù)這些指紋圖譜鑒定出家蠶的品種。
在本實施例中，隨機選取了十幾個SSR標記，用這些標記所對應的SSR引物，以8個家蠶的品種8213、799、寶中長(Baozhongchang，簡稱Bao)、華八(Huaba，簡稱Hua)、831、秋風(Qiufeng，簡稱Qiu)、871和菁松(Jingsong，簡稱Jing)的基因組DNA序列作為模板，進行PCR擴增。
用這些引物在不同的家蠶品種中進行PCR擴增得到了不同的PCR擴增條帶組合。根據(jù)肉眼讀帶，并在“天能凝膠處理系統(tǒng)”的軟件幫助下，判斷條帶的大小區(qū)別，以鑒定這些標記的多態(tài)性以及條帶大小組合的區(qū)別。結(jié)果選出了有代表性的S0710和S2306作為特定SSR標記，它們所對應的兩對SSR引物對上述家蠶品種的擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖33所示。
由上述結(jié)果可知，可通過這兩個引物進行這8個家蠶品種的品種鑒定。并且，只需要用部分DNA樣品，就可以進行。即使是在家蠶的卵或幼蟲時期等難以進行鑒定的時期也可進行品種的鑒定，既可節(jié)省時間，也可避免錯誤，結(jié)果可靠，因此這在蠶的品種保藏與鑒定方面有著重要的意義。
實施例3 使用遺傳圖上的SSR標記分析鱗翅目其它代表性昆蟲的微衛(wèi)星位點家蠶是鱗翅目的代表，而微衛(wèi)星不但具有多態(tài)性高的優(yōu)點，其兩側(cè)的序列也具備保守性高的特點。
由于開發(fā)一套SSR標記花費巨大，所以對于每一個物種都進行這樣的科學研究是不實際的。如果，在一個物種中開發(fā)出的微衛(wèi)星位點也可應用到與其親緣關系比較近的物種中，則會節(jié)省了大量的時間及費用。因此，本發(fā)明人進一步進行了家蠶SSR標記在鱗翅目昆蟲中應用的研究。
本發(fā)明人從遺傳圖上的家蠶的各個染色體上都挑選3-10個標記，隨機挑選共165個，應用到家蠶以及另外的8個以桑葉為食的鱗翅目的昆蟲中天蠶(大蠶蛾科)；柞蠶(大蠶蛾科)；蓖麻蠶(大蠶蛾科)；桑螟(螟蛾科)；桑尺蠖(尺蛾科)；燈蛾(燈蛾科)；白毛蟲(夜蛾科)；棉鈴蟲(夜蛾科)。
利用這165個SSR標記的相應的引物，以這些昆蟲的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，并測定擴增片段的大小后發(fā)現(xiàn)在家蠶中開發(fā)的SSR標記在桑葉食性的鱗翅目昆蟲中具有一定的保守性，并得到如表1和表2的數(shù)據(jù)。
表1




表2

其中，“o”表示未發(fā)生擴增，“1”表示發(fā)生擴增；擴增效率＝(能夠擴增清晰條帶的引物數(shù)/不能夠擴增清晰條帶的引物數(shù))×100％。
如表1和表2所示，可以得到，家蠶中開發(fā)的SSR標記在其它的昆蟲中都有一定比例的保守性，比如S0104可在家蠶、蓖麻蠶、桑螟、桑尺蠖和燈蛾中有效擴增，S0416可在家蠶、天蠶、柞蠶、蓖麻蠶、桑螟、桑尺蠖、燈蛾、白毛蟲和棉鈐蟲中有效擴增。這些可以擴增的SSR標記便可以直接用于相關昆蟲的品種鑒定和親緣關系分析等，從而避免了重復開發(fā)所造成的浪費。因此，這些標記可以用來進行相關常見的鱗翅目害蟲的鑒定，遺傳圖譜構(gòu)建等工作，也為治理這些害蟲提供了有用的信息。
此外，從以上數(shù)據(jù)中可以看到，雖然棉鈴蟲是一個外食性的昆蟲，并不取食桑葉，但來自家蠶的SSR標記中棉鈴蟲中的擴增效率是最高的，達74.5％。由此可見，食性性狀并非SSR標記在不同物種中保守性的主要影響條件。另外也可初步確定SSR標記在大蠶蛾科與蠶蛾科間的保守性較差。
實施例4 以SSR標記遺傳圖進行家蠶的mln基因定位首先可根據(jù)之前的研究結(jié)果(Doira，1992；Goldsmith，1995 Doira，H.(1992)Genetical Stocks and Mutations of Bombyx mori.InImportant Genetic Resources(ed.H.Doira)，pp.1-73.Silkworm Genetic Division，Institute of GeneticResources，F(xiàn)aculty of Agriculture，Kyushu University，F(xiàn)ukuoka，Japan.Goldsmith，M.R.(1995)Genetics of the silkwormrevisiting an ancient model system，pp.21-76 inMolecular Model Systems in the Lepidoptera.Cambridge University Press，New York)，mln基因位于家蠶的第18號染色體上，mln在上面的位置是41.5，性狀為成蟲的體色為暗黑色。
因此，可選取本SSR連鎖遺傳圖上第18號染色體上的標記(如18號染色體上的所有標記，S1801-S1820)去對mln基因進行更加精確的定位。第18號染色體上有20個SSR標記(見圖21)，通過對這些標記在mln的作圖群體(即mln與正常個體的雜交型，再與mln個體交配得到的后代群體，共171個個體)中的多態(tài)性驗證后發(fā)現(xiàn)，其中的10個標記S1801，S1802，S1806，S1807，S1808，S1809，S1811，S1812，S1818，S1819，在作圖群體中具有多態(tài)性(即是在mln及正常個體的擴增條帶有區(qū)別)。
使用上述10個標記所對應的引物對，以mln的作圖群體中各個體(171個)的DNA為模板，進行PCR擴增，電泳，并采用肉眼分析每個個體的基因型(Genotype)。
PCR結(jié)果用高通量的ABI 377測序儀進行檢測，將出現(xiàn)一條帶的個體記做1，為純合型，將兩條帶的個體記做2，為雜合型。而此群體中的mln基因的基因型也將純合型記為1，雜合型記為2。就可得到在此作圖群體中的第一染色體上的SSR標記和mln基因的基因型數(shù)據(jù)，將這些數(shù)據(jù)用遺傳作圖軟件(Mapmaker 3.0)分析(根據(jù)mln與這些SSR的連鎖程度來確定mln與這個標記間的遺傳距離)，便可繪制出一張帶有這些標記以及mln基因的連鎖圖，以將mln基因用SSR標記定位。
結(jié)果如圖32所示，圖中繪出了10個有多態(tài)的標記中的8個，也標出了mln基因在這些SSR標記中的位置。并且可見，其中的兩個SSR標記(S1807，S1808)與mln基因的距離非常近，所以這兩個基因為mln基因的育種提供了很大的便利。同時，這為今后對mln基因的克隆打下了良好的基礎。
上述結(jié)果表明，本發(fā)明的遺傳圖對于基因的定位克隆有著非常重要的意義，提供了一個很好的工作平臺。
以上的實施例進一步證明本發(fā)明的SSR分子遺傳圖是一張高密度，高質(zhì)量，應用廣泛的遺傳圖。其所包含的SSR分子標記是一筆巨大的財富。不但可以用于單一質(zhì)量性狀，而且可以用于數(shù)量性狀的定位，為下一步的圖位克隆打下基礎。而且也可以就用于家蠶的分子輔助育種。另外還可以應用于多個方面，比如群體遺傳學研究，各物種間的保守性研究，DNA和物種間的進化研究，法醫(yī)學研究，品種鑒定等。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種家蠶的分子連鎖遺傳圖譜，其特征在于由SSR分子標記制成的高密度遺傳連鎖圖，標記的分布均勻，對未知基因進行定位十分方便。
2.如權(quán)利要求1所述的分子連鎖遺傳圖譜，其特征在于SSR標記序列單一，每一個標記都有對應的引物序列。
3.如權(quán)利要求1所述的分子連鎖遺傳圖譜，其特征在于家蠶的分子連鎖遺傳圖譜及其SSR標記以及其序列都是單一的。
4.如權(quán)利要求1所述的家蠶的分子連鎖遺傳圖譜在家蠶各個品種間的親緣關系鑒定，在鱗翅目昆蟲間的親緣關系研究，以及在家蠶基因的定位研究中的應用。
5.一種用于分子連鎖遺傳分析的多核苷酸集，其特征在于，所述的多核苷酸集包括SEQ ID NO3n所示的SSR位點序列，其中n為1-518的正整數(shù)。
6.如權(quán)利要求5的多核苷酸集，其特征在于，所述的多核苷酸集還包括分別由SEQ ID NO3n-2所示的正向引物和SEQ ID NO3n-1所示的反向引物所構(gòu)成的引物對，其中n為1-518的正整數(shù)，并且第n對引物對對應于序列如SEQ ID NO3n所示的SSR位點序列。
7.如權(quán)利要求5所述的多核苷酸集的用途，其特征在于，所述的多核苷酸集作為SSR標志物用于確定鱗翅目昆蟲間的親緣關系；鱗翅目昆蟲基因的定位；鱗翅目昆蟲各物種間的保守性分析；鱗翅目昆蟲的進化分析；或鱗翅目昆蟲的品種鑒定。
8.一種確定兩種鱗翅目昆蟲之間的親緣關系的方法，其特征在于，所述方法包括(1)從權(quán)利要求5所述的用于分子連鎖遺傳分析的多核苷酸集中選出第m個SSR位點序列作為標記，其中m為1-518的正整數(shù)；(2)用對應于該SSR位點的序列如SEQ ID NO3m-2和3m-1所示引物對，對所述兩種鱗翅目昆蟲的基因組DNA進行擴增，從而獲得擴增產(chǎn)物；(3)比較兩種鱗翅目昆蟲的擴增產(chǎn)物，從而確定兩種鱗翅目昆蟲之間的親緣關系。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，通過電泳分析擴增產(chǎn)物的條帶數(shù)目和位置情況，擴增產(chǎn)物的條帶數(shù)目和位置一致性越高，表示兩種鱗翅目昆蟲之間的親緣關系越近；擴增產(chǎn)物的條目數(shù)目和位置差異越大，表示兩種鱗翅目昆蟲之間的親緣關系越遠。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的兩種鱗翅目昆蟲都是家蠶；或者所述的兩種鱗翅目昆蟲中一種昆蟲是家蠶，而另一種昆蟲不是家蠶。
11.一種對鱗翅目昆蟲的基因進行定位的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)提供一鱗翅目昆蟲群體，其中所述群體中攜帶所述基因的個體與不攜帶所述基因的個體在表型上存在差異；(b)通過分析所述鱗翅目昆蟲中與該基因相關的表型，確定所述鱗翅目昆蟲群體中各個體的待定位基因的基因型；(c)根據(jù)待定位基因所在的染色體，從權(quán)利要求5所述的用于分子連鎖遺傳分析的多核苷酸集中選出位于同一染色體上的一個或多個SSR位點序列作為連鎖標記；(d)用對應于該SSR位點序列的引物對，對該鱗翅目昆蟲群體中各個體的基因組DNA進行擴增，從而獲得擴增產(chǎn)物，并根據(jù)擴增產(chǎn)物的特征確定各個體中該SSR位點序列的基因型；(e)根據(jù)該群體中各個體的待定位基因的基因型情況以及該群體中各個體的所述SSR位點序列的基因型情況，確定待定位基因與該SSR位點序列的連鎖程度；(f)根據(jù)步驟(e)中所獲得的連鎖程度，將所述基因定位于與該基因連鎖程度最高的兩個SSR位點序列之間。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于分子連鎖遺傳分析的多核苷酸集，本發(fā)明還公開了適合于擴增所述的多核苷酸集中相應的多核苷酸的引物對。本發(fā)明的多核苷酸集可用于確定鱗翅目昆蟲間的親緣關系；確定鱗翅目昆蟲基因的定位；鱗翅目昆蟲各物種間的保守性分析；鱗翅目昆蟲的進化分析；或鱗翅目昆蟲的品種鑒定等。
文檔編號C40B40/04GK1970792SQ20061013623
公開日2007年5月30日 申請日期2006年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者黃勇平, 李明輝, 苗雪霞, 趙國屏 申請人:中國科學院上海生命科學研究院