專利名稱：非聚集性人vh結(jié)構(gòu)域的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域。特別地，本發(fā)明涉及非聚集性人Vh結(jié)構(gòu)域以及 制備和使用其的方法。
背景技術(shù)：
抗體在鑒定及中和病原體的診斷和臨床應(yīng)用中起著重要作用。從成對的重鏈和輕 鏈多肽構(gòu)建抗體。當(dāng)抗體正確折疊時，各鏈折疊成通過更加線性的多肽序列連接的許多不 同球狀結(jié)構(gòu)域。例如，輕鏈折疊成可變和恒定(CJ結(jié)構(gòu)域。重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域 (Vh和VJ的相互作用導(dǎo)致抗原結(jié)合區(qū)(Fv)的形成。通常，Vh和八是最佳抗原結(jié)合所必需 的，雖然已顯示重鏈二聚體和氨基末端片段在輕鏈不存在的情況下可保持活性。輕鏈和重鏈可變區(qū)負(fù)責(zé)結(jié)合靶抗原，并因此可顯示抗體之間的顯著序列多樣性。 恒定區(qū)顯示較少的序列多樣性，其負(fù)責(zé)結(jié)合許多天然蛋白質(zhì)以引發(fā)重要的生物化學(xué)事件。 抗體的可變區(qū)包含分子的抗原結(jié)合決定簇，從而確定抗體對其靶抗原的特異性。大部分序 列變異性發(fā)生在互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)?？偣泊嬖?個⑶R，每可變重鏈和輕鏈各3個，稱為 VhCDRI、VhCDR2、VhCDR3、VlCDRI、VLCDR2 和 VLCDR3。CDR 外的區(qū)域稱為構(gòu)架區(qū)(FR)?？贵w的 該特征結(jié)構(gòu)提供了免疫系統(tǒng)可基于其發(fā)掘大量抗原結(jié)合多樣性以獲得對于大量抗原的特 異性的穩(wěn)定支架。駱駝(駱駝，單峰駱駝和美洲駝(llama))的免疫庫(r印ertoire)是獨(dú)特的，因?yàn)?其具有罕見類型的稱為重鏈抗體的抗體(Hamers等人，1993)。此類抗體缺乏輕鏈，從而它 們的結(jié)合部位(combining site)由一個結(jié)構(gòu)域組成，稱為VhH。在鯊魚中也觀察到單結(jié)構(gòu) 域抗體(sdAb)，稱為VNAR。sdAb提供了優(yōu)于來源于常規(guī)四鏈抗體的單鏈Fv(ScFv)片段的幾個有利方面。單 結(jié)構(gòu)域抗體在親和力方面與它們的scFv對應(yīng)物相當(dāng)，但在可溶性、穩(wěn)定性、對聚集的抗性、 可重折疊性(refoldabiIity)、表達(dá)產(chǎn)率以及DNA操作、文庫構(gòu)建和3-D結(jié)構(gòu)測定的容易性 方面超越scFv。sdAb的許多上述特性在涉及抗體的應(yīng)用中是令人期望的。然而，天然發(fā)生 的sdAb (駱駝VhH和鯊魚VNAR)的非人性質(zhì)由于免疫原性的原因限制了它們在人中的使用。 在這方面，人Vh結(jié)構(gòu)域(“Vh")是人中免疫療法的理想候選物。雖然可通過只基于結(jié)合 特性(作為選擇標(biāo)準(zhǔn))的淘選從文庫(例如，噬菌體展示文庫)分離天然發(fā)生的單結(jié)構(gòu)域 抗體(Arbabi-Ghahroudi等人，1997 ；Lauwereys等人，1998)，但在人Vh的情況下，事實(shí)并非 如此，因?yàn)樗鼈冊谌芤褐幸子谛纬筛叻肿恿烤奂w。一直以來都在嘗試分離非聚集性Vh (Davies等人，1994 ；Tanha等人，2001 ；Tanha 等人，2006 Jespers等人，2004a ；To等人，2005)。一個現(xiàn)有技術(shù)方法包括噬菌體展示文庫 和連續(xù)步驟將文庫經(jīng)歷加熱以使噬菌體展示的Vh變性；冷卻；以及在淘選的結(jié)合階段靶 向抗原(Jespers等人，2004a)。具有可逆去折疊特征的Vh在冷卻步驟中重新獲得它們的 結(jié)合，隨后在結(jié)合步驟中被選擇，而具有不可逆變性特征的VH(其包括不溶性Vh)由于聚集 而喪失，從而被除去。使用基于噬菌體載體的噬菌體展示文庫進(jìn)行所述方法。然而，該方法 需要Vh在噬菌體表面上的多價展示；已證明該方法對于基于噬菌體載體的展示文庫是有效的，但在用基于噬菌粒載體的系統(tǒng)提供的單價展示形式中是無效的(關(guān)于噬菌體展示系統(tǒng) 和它們的特征，參見Winter等人，1994 ；Bradbury和Marks，2004)。期望分離抗原特異性的、可溶的和結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定的Vh以用于臨床和診斷應(yīng)用。因此， 在本領(lǐng)域內(nèi)存在對非聚集性人Vh結(jié)構(gòu)域和產(chǎn)生非聚集性人￥11結(jié)構(gòu)域的方法的需要，所述非 聚集性人Vh結(jié)構(gòu)域減少了現(xiàn)有技術(shù)的不利方面。發(fā)明概述在一個方面，本發(fā)明包括抗體重鏈可變(Vh)結(jié)構(gòu)域?？紤]到與已知的乂11結(jié)構(gòu)域和 分離其的方法相關(guān)的問題，新型人Vh結(jié)構(gòu)域已進(jìn)行了工程改造，其展示有益于臨床和診斷 應(yīng)用的特性。 因此，在一個方面，本發(fā)明包括非聚集性人Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其在至少一個互補(bǔ) 決定區(qū)中包含至少一個形成二硫鍵的半胱氨酸，并且具有酸性等電點(diǎn)。Vh結(jié)構(gòu)域可以是可溶性的，能夠進(jìn)行可逆熱去折疊，或能夠結(jié)合蛋白A。Vh結(jié)構(gòu)域 可在⑶Rl中具有至少1個半胱氨酸，和/或其可在⑶R3中具有至少3個半胱氨酸。Vh可 在一個⑶R內(nèi)(例如⑶R內(nèi))或CDR之間(例如⑶R間)形成非典范(non-canonical) 二 硫鍵。此類⑶R內(nèi)或⑶R間二硫鍵可形成伸出的環(huán)(extended loop)。Vh可以是酶抑制劑， 并且可通過由二硫鍵形成的伸出的環(huán)(或CDR)進(jìn)行抑制。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的乂11可以以在CDRl的位點(diǎn)32上存在酸性殘基(天 冬氨酸或谷氨酸)為特征。VH結(jié)構(gòu)域還可具有低于6的酸性等電點(diǎn)。在本發(fā)明的另一個方面，非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫包含人構(gòu)架序列和至少一個 來自不同物種的CDR;例如，Vh結(jié)構(gòu)域可包含人構(gòu)架序列和駱駝CDR序列。備選地，在另外 的非限定性實(shí)例中，Vh結(jié)構(gòu)域可包含人構(gòu)架序列、人⑶R1/HI、人⑶R2/H2和駱駝⑶R3/H3。非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫還可包括混合的隨機(jī)化的序列或文庫。在另一個實(shí)施方案中，非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫包含選自SEQ IDNO 24-90、SEQ ID NO :101-131、SEQ ID NO 132-162的任一個和其組合的序列。在另外的方面，本發(fā)明可包括非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其可基于AVh種系序 列，例如1-f Vh區(qū)段、1-24VH區(qū)段和3-43VH區(qū)段。備選地，本發(fā)明的Vh和其文庫可基于駱 駝VhcDNA或駱駝種系Vh區(qū)段(具有酸性pi)。在另一個備選方案中，Vh和其文庫可基于駱 駝VhH cDNA或駱駝種系VhH區(qū)段(具有酸性pi)。在另一個實(shí)施方案中，Vh結(jié)構(gòu)域包括 huVHAm302 (SEQ ID NO 15)、huVHAm309 (SEQ ID NO 17)、huVHAm316(SEQ ID NO 19)、huVHAm303 (SEQID NO 164)、huVHAm304 (SEQ ID NO :16)、huVHAm305(SEQ ID NO 15165huVHAm307 (SEQ ID NO : 166)、huVHAm311 (SEQ ID NO : 167)、huVHAm315 (SEQID NO : 18)、huVHAm301 (SEQ ID NO : 163)、huVHAm312 (SEQ ID NO:
168)、huVHAm320(SEQ ID NO 171)、huVHAm317 (SEQ ID NO 170)、huVHAm313 (SEQID NO
169)、huVHAm431(SEQID NO 23)、huVHAm427(SEQ ID NO 21)、huVHAm416(SEQ ID NO 20)、 huVHAm424 (SEQ ID NO : 175)、huVHAm428 (SEQID NO :22)、huVHAm430 (SEQ ID N0:176)、 huVHAm406 (SEQ ID NO : 172)、huVHAm412 (SEQ ID NO : 173)或 huVHAm420 (SEQ ID NO: 174) 中的一個。在一個實(shí)施方案中，從基于噬菌粒的噬菌體展示文庫分離Vh結(jié)構(gòu)域。Vh結(jié)構(gòu)域的 分離可包括增強(qiáng)選擇非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域的能力或效率的選擇步驟。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中a)Vh結(jié)構(gòu)域基于 HVHP430 (SEQ ID NO 1) ；b)保持CDR3的位點(diǎn)99和IOOd上的Cys ；c)隨機(jī)化CDR3的剩余 的14個氨基酸殘基；d)隨機(jī)化氨基酸殘基94 ；和e)隨機(jī)化CDR1/H1的8個氨基酸殘基。在另一個方面，本發(fā)明包括Vh結(jié)構(gòu)域文庫，其中a) Vh結(jié)構(gòu)域基于HVHP430 (SEQ ID NO 1) ；b)位點(diǎn)93-102 (93/94-CDR3)上的氨基酸殘基來源于美洲駝VhH ；c)隨機(jī)化CDR1/H1 的8個氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中a) Vh結(jié)構(gòu)域基于 HVHP430 (SEQ ID NO 1) ；b) CDR3 包括選自 SEQ ID NO 24-90 和 SEQ ID NO :33_63 的序列； c)隨機(jī)化CDR1/H1的8個氨基酸殘基。在另一個方面，本發(fā)明還提供了通過下列步驟增加非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域的選擇的能 力或效率的方法a)提供基于噬菌粒的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫，其中通過Vh結(jié)構(gòu)域在噬菌體表 面上的多價展示產(chǎn)生文庫；和b)使用噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫和結(jié)合靶進(jìn)行淘選，其中該方法包括選擇非聚集性噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域的步驟。選擇步驟可以是將噬菌 體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫經(jīng)歷熱變性/復(fù)性的步驟，其可在淘選步驟(步驟b))之前發(fā)生。備選 地，選擇步驟可以是在淘選(步驟b))之后發(fā)生的測定單個克隆的序列以鑒定具有酸性pi 的Vh的步驟。在另一個備選方案中，選擇步驟可包括熱變性/復(fù)性和測定單個克隆的序列 以鑒定具有酸性Pl的VH。在一個實(shí)施方案中，該方法還可包括從基于噬菌粒的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫分 離特定Vh結(jié)構(gòu)域的步驟。在備選實(shí)施方案中，該方法可包括步驟c)提供基于噬菌體載體的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫，其中基于具有酸性pi的Vh 結(jié)構(gòu)域支架產(chǎn)生文庫；d)使用噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫和靶進(jìn)行淘選；和e)測定單個克隆的序列以鑒定具有酸性pi的Vh結(jié)構(gòu)域。用于所述方法的Vh結(jié)構(gòu)域支架可基于具有酸性pi的人種系序列、駱駝Vh cDNA、 具有酸性Pl的駱駝種系Vh區(qū)段、駱駝VhH cDNA、或具有酸性pi的駱駝種系VhH區(qū)段。可從 基于噬菌體載體的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫分離特定Vh結(jié)構(gòu)域。上述方法還可包括從基 于噬菌體載體的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫分離特定Vh結(jié)構(gòu)域的步驟。在另一個方面，本發(fā)明包括編碼本發(fā)明的Vh的核酸、包含所述核酸的載體和包含 所述核酸或載體的宿主細(xì)胞。在另一個方面，Vh可在宿主包括但不限于任何酵母株系中表 達(dá)。在另一個方面，本發(fā)明包括藥物組合物，所述組合物以Hvh結(jié)構(gòu)域與抗原結(jié)合的 有效量包含一種或多種Vh結(jié)構(gòu)域，和可藥用的賦形劑。在另一個方面，本發(fā)明包括Vh結(jié)構(gòu)域用于制備藥劑的用途，所述藥劑用于通過結(jié) 合抗原來治療或預(yù)防醫(yī)學(xué)病狀。本發(fā)明還提供了治療患者的方法，其包括對需要治療的患者施用包含一種或多種 Vh結(jié)構(gòu)域的藥物組合物。
在另一個方面，本發(fā)明提供了包括一種或多種Vh結(jié)構(gòu)域以及用于檢測和確定一種 或多種Vh結(jié)構(gòu)域與生物學(xué)樣品中特定抗原的結(jié)合的一種或多種試劑的試劑盒。本發(fā)明的Vh還可用于高通量篩選測定，例如微陣列技術(shù)，其中Vh結(jié)構(gòu)域的使用由 于其大小和穩(wěn)定性而優(yōu)于常規(guī)IgG。本發(fā)明的實(shí)施方案對基于噬菌粒的VJ^菌體展示文庫使用熱變性淘選方法?；?噬菌粒載體的噬菌體展示系統(tǒng)提供了優(yōu)于基于噬菌體載體的系統(tǒng)的許多有利方面，包括易 用性、分離高親和力結(jié)合劑的適合性以及快速抗體表達(dá)和分析。此外，輔助噬菌體的使用導(dǎo) 致多價展示(Rondot等人，2001 ；Baek,等人，2002 ；Soltes等人，2003)，從而導(dǎo)致結(jié)合劑的 高產(chǎn)率、更少的淘選輪次和更有效的富集。此外，對于噬菌粒載體系統(tǒng)，單價與多價形式之 間的轉(zhuǎn)換可通過使用合適類型的輔助噬菌體隨意地實(shí)現(xiàn)(Rondot等人，2001 ；0' Connell 等人，2002 ；Kirsch 等人，2005)。本發(fā)明的Vh以非聚集性和可逆熱去折疊特性為特征。本發(fā)明的方法將對由基于 噬菌體載體的展示文庫提供的上述生物物理學(xué)特性的選擇(Jespers，等人，2004)與用噬 菌粒載體構(gòu)建大容量文庫的方便結(jié)合在一起，從而導(dǎo)致通過進(jìn)入更大序列空間來對非聚集 性結(jié)合劑進(jìn)行更有效的選擇。本方法通過以多價展示形式(使用熱變性)和以單價展示形 式交替進(jìn)行淘選還可用于同時選擇(i)非聚集性和(ii)高親和力。所描述的選擇方法可 用于具有上述特征的噬菌粒文庫以改善對非聚集性結(jié)合劑，以及對具有可逆熱去折疊特性 的結(jié)合劑的富集。本發(fā)明展示了熱變性方法(Jespers等人，2004)至從噬菌粒載體形式的巨大的合 成人Vh文庫選擇非聚集性Vh的成功擴(kuò)展。當(dāng)使用hyperphage (M13K07 ΔρΙΙΙ輔助噬菌體) 和使用熱變性步驟通過噬菌體拯救(phage rescue)以多價展示形式進(jìn)行淘選時，文庫產(chǎn)生 顯示可逆熱去折疊的非聚集性VH。選擇以富集具有酸性pi和/或CDR1-CDR3間二硫鍵的 Vh為特征。文庫設(shè)計包括增加酶抑制性Vh在文庫中的頻率的特征。根據(jù)下列描述，本發(fā)明的另外的方面和有利方面將很顯然。詳細(xì)描述和實(shí)施例表 示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，且僅以舉例說明的方式給出，因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本發(fā)明范 圍內(nèi)的各種變化和變動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯然。附圖概述現(xiàn)將參考附圖通過舉例描述本發(fā)明的這些和其他特征，其中

圖1舉例說明(i)通過未還原/烷基化的(imred/alk)和還原/烷基化的(red/ alk)HVHP430 Vh的質(zhì)譜法獲得的分子質(zhì)量特征譜和(ii)HVHP430和4種抗α淀粉酶Vh的 烷基化反應(yīng)/質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的結(jié)果?；谒蠧DR Cys殘基參與二硫鍵形成的假定計算二硫鍵 的數(shù)目的理論值。二硫鍵的“總數(shù)”是⑶R內(nèi)/⑶R間二硫鍵和Cys 22與Cys 92之間的典 范二硫鍵的和。圖2Α顯示HVHP430的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)，隨機(jī)化的殘基以下劃線標(biāo)示。 Hl (高變環(huán) 1)橫跨殘基 26-32 (GFTFSNY ；SEQ ID NO 177) (Chothia,等人，1992)。CDRl (互 補(bǔ)決定區(qū)1)與Hl交迭并且橫跨殘基31-35 (NYAMS ；SEQ ID N0:178)。CDR和構(gòu)架區(qū)(FR) 的名稱和編號根據(jù)Kabat等人(1991)。圖2B顯示人Vh噬菌體展示文庫的構(gòu)建的示意性步驟。圖3顯示pMEDl噬菌粒載體的圖譜，多克隆位點(diǎn)和其緊鄰的周圍區(qū)域的核苷酸序
8列示于(ii)。RBS，核糖體結(jié)合部位；L，左；R，右；HA，血凝素；fd，絲狀噬菌體，fd。圖4顯示通過以單價展示形式(A)或多價展示形式(使用熱變性步驟)(B)淘選抗 α淀粉酶文庫而分離的Vh的大小排阻層析譜。(A)huVHAm455(點(diǎn)線)高度沉淀，從而產(chǎn) 生低吸光度信號。(B)huVHAm304 點(diǎn)劃線；huVHAm309 點(diǎn)線；huVHAm428 實(shí)線；huVHAm416 虛線。(C)顯示提高的峰分辨率的圖4B的放大。圖5顯示舉例說明Vh的聚集傾向(以它們的單體含量的百分比表示)的圖。圖6顯示確定由huVHAm302的位點(diǎn)32上的琥珀密碼子編碼的氨基酸的本體 的步驟。㈧通過質(zhì)譜法確定的huVHAm302的序列。空格確定了 FR與⑶R之間的邊 界(參見圖2A)。通過使用nanoRPLC-MS/MS分析huVHAm302的胰蛋白酶消化物所確定 的肽序列以粗體標(biāo)示(也參見圖6B)。發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)32上的琥珀密碼子編碼E(下劃線標(biāo) 示的)。huVHAm302的N末端被確定為焦谷氨酸(pyroQ)。根據(jù)m/z 939. 50 (2+)處的 占優(yōu)勢的雙質(zhì)子化離子的MS/MS光譜(數(shù)據(jù)未顯示)獲得N-末端胰蛋白酶酶解的肽序 列，pyroQVQLVESGGGLIKPGGSLR(SEQ ID N0:179)。此外，來自 m/z 1413. 71 (11+)處的質(zhì) 子化蛋白質(zhì)離子的CID的N末端片段離子也顯示huVHAm302的N末端為pyroQ(數(shù)據(jù)未 顯示)。確定的蛋白質(zhì)分子量(15，541.2Da)也表明蛋白質(zhì)的N末端為焦谷氨酸。來自 LSEEDLNHHHHHH(SEQ ID NO 180)的m/z 585.91 (3+)處的C末端胰蛋白酶酶解的肽離子在 DDA實(shí)驗(yàn)的全譜掃描(survey scan)中占優(yōu)勢。未觀察到在C末端組氨酸后附有氨基酸的 肽。此外，進(jìn)行m/z 1413.71(11+)處的蛋白質(zhì)離子[M+11H] 11+的碰撞誘導(dǎo)解離(CID)，從蛋 白質(zhì)的C末端片段離子獲得C-末端胰蛋白酶酶解的肽序列VTVSSGSEQKLSEEDLNHHHHHH (SEQ IDNO 181) (MS/MS數(shù)據(jù)未顯示)。(B)關(guān)于胰蛋白酶酶解的肽LSCamAAS⑶TVSDESMTWVR (SEQ ID NO 13 ；huVHAm302 的殘基 20-38)的 m/z 1036. 47(2+)處的雙質(zhì)子化離子的 MS/MS 譜。 位點(diǎn)32上的琥珀編碼的氨基酸E以下劃線標(biāo)示。質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)還顯示⑶R3Cys殘基形成了二 硫鍵。圖7顯示通過利用熱變性法淘選抗α淀粉酶的Vh文庫而分離的Vh (huVHAm431、 huVHAm416)的SDS-PAGE分析(箭頭表示二硫鍵介導(dǎo)的二聚體VH。R 還原的；NR:非還原 的)。圖8顯示sensorgram疊加，其顯示天然(粗線)和重折疊(細(xì)線)的huVHAm309 (A) 禾口 huVHAm416(B)以 0· 1、0· 2、0· 3、0· 4、0· 5、1 和 2 μ M(huVHAm309)以及 0· 1、0· 2、0· 3、0· 4、 0. 5、1、2和4μ M(huVHAm416)與固定的蛋白A的結(jié)合。圖9顯示通過對Vh(通過針對α淀粉酶的熱變性淘選法鑒定的)進(jìn)行ELISA產(chǎn) 生的結(jié)合分析，(A)V1^i固定的α淀粉酶(點(diǎn)柱)和牛血清白蛋白BSA(方格柱)的結(jié)合和 (B)辣根過氧化物酶-蛋白A綴合物與固定的Vh和BSA對照的結(jié)合。在A和B中，與BSA 的結(jié)合為背景水平。圖10顯示確定抗α淀粉酶Vh的酶抑制活性的方面。(A) α淀粉酶活性，測量為 ΔΑ405ηπι，作為時間的函數(shù)。對于淀粉酶結(jié)合劑huVHAm302 (實(shí)心正方形)可看到明顯的抑 制，對于對照Vh HVHP430(實(shí)心三角形)沒有看到明顯的抑制。(B)在不同濃度的抗α淀 粉酶Vh存在的情況下α淀粉酶的殘留活性。只有huVHAm302在所有測試Vh濃度下起著酶 抑制劑的作用。實(shí)心正方形huVHAm302 ；空心正方形huVHAm428 ；實(shí)心圓huVHAm304 ；空 心圓huVHAm416。
9、VhH2和VhH3的大羊駝(L. glama) cDNA VhH、單峰 駝(C. dromedarius) cDNA VhH、種系VhH區(qū)段和種系Vh區(qū)段、人種系Vh區(qū)段和HVHP430文庫 Vh的理論P(yáng)l分布的圖。圖12A顯示來自美洲駝VhH⑶R3質(zhì)粒文庫的⑶R3序列的樣品，來源于VhH2亞家 族的CDR3序列由星號標(biāo)記；半胱氨酸殘基以下劃線標(biāo)示。編號系統(tǒng)是由Kabat等人(1991) 描述的編號系統(tǒng)。圖12B顯示來自美洲駝VhH CDR3質(zhì)粒文庫的CDR3序列的樣品的長度分 布；水平線表示平均CDR3長度以及中值(M)。圖13顯示來自HVHP430LGH3Vh噬菌體展示文庫的Vh的樣品的⑶R3長度分布，其 中分析了 31個Vh ；水平線表示平均CDR3長度以及中值(M)。圖14顯示酸性人種系Vh區(qū)段的序列。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域。特別地，本發(fā)明涉及非聚集性人Vh結(jié)構(gòu)域和分 離其的方法。本發(fā)明包括在至少一個互補(bǔ)決定區(qū)中具有至少1個形成二硫鍵的半胱氨酸并且 具有酸性等電點(diǎn)的非聚集性人Vh結(jié)構(gòu)域和其文庫。所描述的Vh結(jié)構(gòu)域還可以是可溶性的， 能夠可逆熱去折疊的和/或能夠結(jié)合蛋白A的。Vh結(jié)構(gòu)域可在CDRl中包含至少一個半胱 氨酸。所描述的Vh結(jié)構(gòu)域可在⑶R3中包含至少3個半胱氨酸。Vh可展示高溶解度和/或可逆熱去折疊。它們還可能能夠結(jié)合蛋白A。在特定的 非限定性實(shí)施方案中，人\結(jié)構(gòu)域具有低于6的等電點(diǎn)。本發(fā)明WVh結(jié)構(gòu)域和其文庫還可 在Hl/⑶Rl的位點(diǎn)32或Hl/⑶Rl中或Hl/⑶Rl、H2/⑶R2或H3/⑶R3中的其他位點(diǎn)上包含 Asp 或 Glu0如本文中所使用的，“VH結(jié)構(gòu)域”或“VH”是指抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域。該術(shù)語包括天 然發(fā)生的Vh結(jié)構(gòu)域和已通過選擇或工程改造進(jìn)行了改變(以改變它們的特征，包括例如穩(wěn) 定性或溶解度)的Vh結(jié)構(gòu)域。該術(shù)語包括能夠用作Vh結(jié)構(gòu)域的同源物、衍生物或片段。如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，Vh結(jié)構(gòu)域包括3個“互補(bǔ)決定區(qū)”或“⑶R”; 通常，各⑶R是可變重鏈內(nèi)與其他⑶R組合以形成抗原結(jié)合部位的區(qū)域。在本領(lǐng)域內(nèi)熟知的 是CDR促成抗原決定簇的結(jié)合和識別。然而，可能并非所有CDR是結(jié)合抗原所必需的。例 如，但不期望限于，1、2或3個CDR可促成本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域?qū)乖慕Y(jié)合和識別。Vh結(jié)構(gòu) 域的CDR在本文中稱為CDR1、CDR2和CDR3。根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)進(jìn)行本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域中氨基酸的編號，所述編號系統(tǒng)是 指 Kabat 等人’ Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版.Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. (1991)巾卞艮白勺 編(compilation)用于重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的編號系統(tǒng)。該系統(tǒng)對于本領(lǐng)域 技術(shù)人員來說是熟知的，并且對于給定的抗體可通過在抗體序列的與“標(biāo)準(zhǔn)”Kabat編號的 序列具有同源性的區(qū)域上進(jìn)行比對來確定。根據(jù)Kabat編號，CDR的位置如下CDR1_殘 基 31-35B ；CDR2-殘基 50-65 ；和 CDR 3-殘基 95-102。Vh結(jié)構(gòu)域也以與⑶R交迭的高變區(qū)(標(biāo)記為H1、H2和H3)為特征。Hl定義為殘基 26-32，H2 定義為 52-56，以及 H3 定義為殘基 95-102 (http //www. bioinf. org. uk/abs/)。 高變區(qū)直接參與抗原結(jié)合。
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本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域和其文庫在至少一個⑶R中包含至少一個形成二硫鍵的半胱 氨酸。術(shù)語“形成二硫鍵的半胱氨酸”意指通過它們的巰基的氧化與另一個半胱氨酸形成 “二硫橋”(也稱為“二硫鍵合”或“二硫鍵”)的半胱氨酸。不期望受理論束縛，二硫橋幫助 蛋白質(zhì)和酶保持它們的結(jié)構(gòu)構(gòu)型。特別地，％結(jié)構(gòu)域包含典范(S卩，高度保守的)的Cys 22 與Cys 92之間的二硫鍵。除了該典范二硫鍵外，本發(fā)明的Vh包含至少1個非典范二硫鍵。 后者可以在Vh結(jié)構(gòu)中的任何非典范位置上；例如，非典范二硫鍵可在構(gòu)架區(qū)中，CDR中，高 變環(huán)中或其任何組合中。在一個實(shí)施方案中，存在偶數(shù)數(shù)目的形成二硫鍵的Cys。例如，但不期望以任何方 式限于，在⑶Rl中可存在至少一個形成二硫鍵的Cys ；在另一個非限定性實(shí)例中，在⑶R3 中可存在至少一個Cys ；在另一個非限定性實(shí)例中，在⑶R3中可存在至少3個Cys。Vh結(jié)構(gòu) 域的形成二硫鍵的Cys可形成CDR內(nèi)二硫鍵或CDR間二硫鍵。例如，但不期望限于，Vh的 ⑶R3中的Cys殘基形成⑶R內(nèi)二硫鍵；在另一個非限定性實(shí)例中，Vh的⑶Rl和⑶R3中的 Cys殘基形成⑶R間二硫鍵。此外，不期望受理論束縛，本發(fā)明的Vh的⑶R中非典范二硫鍵可用于產(chǎn)生酶抑制 劑；特別地，二硫鍵可形成突出的⑶R環(huán)，特別地⑶R3環(huán)，用于接近隱蔽表位或酶活性部位。 也已顯示非典范二硫鍵在單結(jié)構(gòu)域抗體穩(wěn)定性(Nguyen等人，2000 ；Harmsen等人，2000 ； Muyldermans等人，1994 ；Vu等人，1997 ；Diaz等人，2002)中以及在就新型拓?fù)鋵W(xué)和增加的
庫多樣性塑造結(jié)合部位中是非常重要的。從制藥觀點(diǎn)來看，針對牽涉許多疾病狀態(tài)的病理生物學(xué)的酶和蛋白酶的基于抗體 的抑制劑的產(chǎn)生是特別有益的。由于它們的預(yù)期較低的免疫原性、較小的尺寸、和穩(wěn)定性， 人Vh結(jié)構(gòu)域?qū)τ谥委煈?yīng)用是優(yōu)良的。然而，AVh結(jié)構(gòu)域在溶液中傾向于形成高分子量聚集體。此類聚集體包括不如單 體可溶的結(jié)構(gòu)并且顯示與其他分子或表面的非特異性相互作用(有時稱為“粘性”)。Vh結(jié) 構(gòu)域可形成二聚體或多聚體或高分子量聚集體，此類結(jié)構(gòu)沒有一種是期望的或有用的。術(shù) 語“非聚集性”是指減少的Vh結(jié)構(gòu)域形成此類聚集體的傾向或Vh結(jié)構(gòu)域不能形成此類聚集 體。本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域是非聚集性的。這可通過在凝膠過濾柱例如但不限于Superdex 75柱上洗脫來驗(yàn)證，其中Vh結(jié)構(gòu)域基本上是單體?！盎旧鲜菃误w”是指95%、96%、97%、 98%、99%或100%的Vh結(jié)構(gòu)域洗脫為單體。優(yōu)選，本發(fā)明的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域是穩(wěn)定的 并且不隨時間流逝而沉淀。本發(fā)明結(jié)構(gòu)域和其文庫還具有酸性pi。術(shù)語"pi"或"等電點(diǎn)"是指Vh結(jié) 構(gòu)域不攜帶凈電荷時的PH。一般地，當(dāng)pH為pi時，溶解度最低。酸性等電點(diǎn)可低于7;例 如，酸性Pl可低于7、6、5、4、3、2或1，或其間的任何值，或在由這些值描述的范圍之內(nèi)；在 非限定性實(shí)例中，本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域的pi低于6。中性pi是7，堿性pi高于7。不期望受 到限定，本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域的酸性pi主要源于非隨機(jī)化的區(qū)域，包括例如，構(gòu)架區(qū)。本發(fā)明的Vh的“溶解度”是指其溶解于溶劑中的能力，如根據(jù)平衡時溶解在溶劑中 的溶質(zhì)的最大量測量的。本發(fā)明WVh在單體形式上是可溶的，并且無粘性。所描述的乂11結(jié) 構(gòu)域在水性緩沖液例如但不限于TriS緩沖液、PBS緩沖液、HEPES緩沖液、碳酸鹽緩沖液或 水中是可溶的。本發(fā)明的Vh還可展示“可逆熱去折疊”。熱去折疊是指溫度誘導(dǎo)的分子從其天然折疊構(gòu)象至二級去折疊構(gòu)象的去折疊。如果分子可從二級去折疊構(gòu)象恢復(fù)至其天然折疊構(gòu) 象，那么熱去折疊是可逆的。通過分子的熱重折疊效率(TRE)測量可逆熱去折疊。上述非 聚集性Vh結(jié)構(gòu)域可顯示比聚集性Vh結(jié)構(gòu)域更高的TRE且更有效地重折疊成它們的天然狀 態(tài)。本發(fā)明Vh去折疊所處的溫度將隨性質(zhì)和其熔化溫度而變化。通常，大多數(shù)Vdf 在高于60°C、高于85°C或高于90°C的溫度下去折疊。在非限定性實(shí)例中，本發(fā)明WVh可能 能夠在于高于80°C或甚至高于90°C的溫度下進(jìn)行延長的溫育后重新獲得抗原特異性。Vh還可結(jié)合蛋白A(其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的分子)。通常將蛋白A偶 聯(lián)至其他分子而不影響抗體結(jié)合部位；例如，但不期望限于，可將蛋白A偶聯(lián)至熒光染料、 酶、生物素、膠體金、放射性碘和磁性膠乳(latex)和瓊脂糖珠粒。還可將蛋白A固定至固體 支持物上和用作可靠方法用于從混合物例如從血清、腹水或細(xì)菌提取物純化免疫球蛋白， 或?qū)⑵渑c上述分子之一偶聯(lián)以檢測抗體的存在?？蓪⒈景l(fā)明的Vh結(jié)合蛋白A的能力用于 Vh純化和在診斷測試、免疫印跡和免疫組織化學(xué)中用于檢測。Vh結(jié)構(gòu)域的文庫也包括在本發(fā)明內(nèi)。Vh結(jié)構(gòu)域文庫可包括許多種展示形式，包括 噬菌體展示、核糖體展示、微生物細(xì)胞展示、酵母展示、逆轉(zhuǎn)錄病毒展示或微珠展示形式或 任何其他合適的形式。本發(fā)明的Vh和天然發(fā)生的駱駝VhH和鯊魚VNAR單結(jié)構(gòu)域抗體的分析顯示在展示 高溶解度和可逆熱去折疊方面的類似性。通過Pl的分析(參見實(shí)施例8)，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)駱駝VhH 庫具有豐富的具有酸性Pl的克隆(53%酸性對43%堿性)。在種系克隆(單峰駝)中，Vh 庫主要由具有堿性Pl的Vh區(qū)段組成，然而VhH庫的情況恰好相反，其主要包含具有酸性pi 的VhH區(qū)段。目前還觀察到人種系Vh庫中絕大部分Vh區(qū)段(92%)是堿性的。因此，目前 已確定TVh溶解度與酸性pi之間的明確關(guān)系；雖然并非所有非聚集性Vh是酸性的，但酸性 Vh是非聚集性的。因此，可通過使用酸性支架進(jìn)行文庫構(gòu)建和/或使隨機(jī)化偏向酸性殘基 和/或偏離堿性殘基來增加文庫中非聚集性Vh的比例。本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域和其文庫還可在⑶R1、⑶R2和/或⑶R3中包括酸性氨基酸。 例如，但不期望限于，Vh結(jié)構(gòu)域和其文庫可在H1/CDR1的位點(diǎn)32或在H1/CDR1中或在Hl/ CDR1、H2/CDR2或H3/CDR3中其他位點(diǎn)上包括Asp或Glu。本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域和其文庫可基于本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何合適的Vh序列。術(shù)語“基 于”是指使用“支架”作為起始Vh結(jié)構(gòu)域，通過本發(fā)明的方法獲得Vh結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可容易地理解，雖然Vh結(jié)構(gòu)域文庫可基于單個支架或許多支架，但可隨機(jī)化CDR/高變 環(huán)。這樣，可獲得大量Vh結(jié)構(gòu)域，其中序列在隨機(jī)化區(qū)域中變化；這在本領(lǐng)域內(nèi)稱為Vh結(jié)構(gòu) 域的“庫”或“文庫”。Vh結(jié)構(gòu)域庫中的Vh結(jié)構(gòu)域可各自識別相同或不同的表位。此外，本 發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域所基于的支架可具有非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域的一個或多個上述特征。在特定的非限定性實(shí)例中，本發(fā)明結(jié)構(gòu)域基于具有酸性pi 序列。本發(fā) 明的Vh結(jié)構(gòu)域可基于具有酸性pi的任何人種系序列，特別地來自Vh3家族的序列，以及更 特別地具有蛋白A結(jié)合活性的序列；例如，但不被認(rèn)為是限定性的，Vh結(jié)構(gòu)域可基于人種 系序列1-f Vh區(qū)段、1-24Vh區(qū)段和3-43Vh區(qū)段(參見圖14 ；SEQ ID NO 182-184)。備選 地，Vh結(jié)構(gòu)域可基于駱駝Vh cDNA或具有酸性pi的駱駝種系Vh區(qū)段。用作文庫支架的酸 性駱駝種系Vh區(qū)段可以是本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何此類區(qū)段；在特定的非限定性實(shí)例中，Vh區(qū) 段可以是Nguyen等人，2000中描述的區(qū)段。在另外的備選實(shí)例中，所描述的Vh和其文庫可基于駱駝VhH cDNA或具有酸性pi的駱駝種系VhH區(qū)段。用作文庫支架的酸性駱駝Vh 或VhHcDNA或種系序列可以是本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何此類序列；例如，但不限于Harmsen等 人(2000)，Tanha等人(2002)中描述的此類序列，Nguyen等人(2000)中在具有NCBI登錄 號AB091838-AB092333的VhH的庫中的此類序列，或人序列的VBASE數(shù)據(jù)庫中的此類序列 (Medical ResearchCounci1, Centre for Protein Engineering)。本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域和其文庫還可基于在⑶R1、⑶R2和/或⑶R3中還包含酸性氨 基酸的支架。在非限定性實(shí)例中，支架可在Hl/⑶Rl的位點(diǎn)32上，或Hl/⑶Rl中或Hl/⑶R1、 H2/CDR2或H3/CDR3中的其他位點(diǎn)上包含Asp或Glu。本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域和其文庫還可基于嵌合支架；例如，但不期望限于，嵌合支架可 在人構(gòu)架序列上包含一個或多個駱駝或鯊魚⑶R/高變環(huán)序列。在特定的非限定性實(shí)例中， 嵌合支架在人Vh構(gòu)架(人⑶R1/H1和⑶R2/H2)上包含駱駝⑶R3/H3環(huán)。嵌合抗體結(jié)構(gòu)域 在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，用于獲得它們的方法在本領(lǐng)域內(nèi)也是熟知的。在特定的非限定性實(shí)例中，本發(fā)明提供了 Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中a)Vh結(jié)構(gòu)域基 于HVHP430 (SEQ ID NO 1) ；b)保持CDR3的位點(diǎn)99和IOOd上的Cys ；c)隨機(jī)化CDR3的剩 余14個氨基酸殘基；d)隨機(jī)化氨基酸殘基94 ；和e)隨機(jī)化CDR1/H1的8個氨基酸殘基。在 另外的非限定性實(shí)例中，提供了 Vh結(jié)構(gòu)域文庫，其中a)VH結(jié)構(gòu)域基于HVHP430(SEQ ID NO 1) ；b)位點(diǎn)93-102 (93/94-CDR3)上的氨基酸殘基來源于美洲駝VhH ;c)隨機(jī)化CDR1/H1的 8個氨基酸殘基。在另一個非限定性實(shí)例中，提供了 Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中a) Vh結(jié)構(gòu)域 基于 HVHP430 (SEQ ID NO 1) ；b)CDR3 包含選自 SEQ ID NO 24-90 和 SEQ ID NO 33-63 的 序列；c)隨機(jī)化CDR1/H1的8個氨基酸殘基。本發(fā)明的文庫中的非聚集性Vh的比例，如上所述，可以比常規(guī)文庫中的大。在另一個方面，本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域和其文庫可以是混合的隨機(jī)化文庫。在該類型 的文庫中，通過使用隨機(jī)化的寡核苷酸和本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法體外產(chǎn)生CDR。在一個實(shí)例中，通過使用本發(fā)明的方法分離非聚集性、可重折疊的Vh。其中，3種具 有酸性pl，且2種具有形成⑶Rl-⑶R3間二硫鍵的⑶RlCys殘基。此外，3種在它們的⑶R3 中具有一對Cys的Vh (以及親本支架，HVHP430)形成⑶R3內(nèi)二硫鍵。然而，在一個實(shí)施方 案中，包含橫跨CDRl至CDR3的非典范二硫鍵的本發(fā)明的乂11在淘選的重折疊步驟中比具有 ⑶R3內(nèi)二硫鍵或只具有Cys22與Cys92之間的典范二硫鍵的Vh更有效地重折疊成它們的 天然結(jié)構(gòu)。因此，可在淘選的結(jié)合步驟中有利地選擇此類VH。此外，大多數(shù)非聚集性的可重 折疊Vh具有低于6的理論pl，這可能是由于高于pI6 (和特別地更接近于pI7)的Vh變得 易于聚集(因?yàn)樗鼈兊膬綦姾山咏?)。在9種利用熱變性方法分離的Vh中，4種具有最 低溶解度的Vh中，有3種具有大約7. 0(6. 4-7. 3)的pi。本發(fā)明的Vh可以是展示本文中描述的期望的特征的任何VH。在特定的非限定 性實(shí)例中，人 Vh 結(jié)構(gòu)域可包括 huVHAm302(SEQ ID NO 15)、huVHAm309 (SEQ ID N0:17)、 huVHAm316(SEQ ID NO 19)、huVHAm303 (SEQID NO 164)、huVHAm304 (SEQ ID NO 16)、 huVHAm305 (SEQ ID NO 15165huVHAm307 (SEQ ID NO :166)、huVHAm311 (SEQ ID N0:167)、 huVHAm315 (SEQID NO : 18)、huVHAm301 (SEQ ID NO : 163)、huVHAm312 (SEQ ID NO: 168)、 huVHAm320 (SEQ ID NO :171)、huVHAm317 (SEQ ID NO : 170)、huVHAm313 (SEQID N0:169)、 huVHAm431 (SEQ ID NO 23)、huVHAm427 (SEQ ID NO 21)、huVHAm416 (SEQ ID NO 20)、
13huVHAm424 (SEQ ID NO 175)、huVHAm428 (SEQID NO 22)、huVHAm430 (SEQ ID NO 176)、 huVHAm406 (SEQ ID NO 172)、huVHAm412 (SEQ ID NO 173)或 huVHAm420 (SEQ ID NO : 174) 中的一個。在另一個非限定性實(shí)例中，AVh結(jié)構(gòu)域或其文庫包括選自SEQ ID N0:101至 131，或132-162中的任一個的序列，或選自圖12A中顯示的那些(SEQID NO 24-90)中的任 一個的序列，或其組合。本文中描述的Vh結(jié)構(gòu)域可通過下文中描述的新方法獲得。在非限定性實(shí)例中，可 從基于噬菌粒的噬菌體展示文庫分離Vh結(jié)構(gòu)域。使用完全合成設(shè)計的基于噬菌粒的噬菌 體展示文庫，然后進(jìn)行以富集具有本文中提及的期望的特性的人Vh為特征的選擇是之前未 曾用于人Vh的方法。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過下列步驟增加非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域的選擇的 能力或效率的方法a)提供基于噬菌粒的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫，其中通過Vh結(jié)構(gòu)域在噬菌體的 表面上的多價展示來產(chǎn)生文庫；和b)使用噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫和結(jié)合的靶進(jìn)行淘選，其中該方法包括選擇非聚集性噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域的步驟。在一個實(shí)例中，選擇步驟 可在淘選步驟之前發(fā)生，并且可包括將噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫經(jīng)歷熱變性/復(fù)性步驟。備 選地，選擇步驟可在淘選后發(fā)生，并且可包括測定單個克隆的序列以鑒定具有酸性Pl的VH。 在另一個備選實(shí)例中，進(jìn)行熱變性/復(fù)性步驟和測序步驟。例如，但不期望限于，增加非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域的選擇的能力或效率的方法可包 括a)提供基于噬菌粒的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫，其中通過Vh結(jié)構(gòu)域在噬菌體表 面上的多價展示來產(chǎn)生文庫；b)將基于噬菌粒的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫經(jīng)歷熱變性/復(fù)性步驟；和c)使用噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫和靶進(jìn)行淘選。在另一個非限定性實(shí)例中，增加非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域的選擇的能力或效率的方法可 包括a)提供基于噬菌粒的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫，其中通過Vh結(jié)構(gòu)域在噬菌體表 面上的多價展示來產(chǎn)生文庫；b)使用噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫和靶進(jìn)行淘選；和c)測定單個克隆的序列以鑒定具有酸性pi的Vh結(jié)構(gòu)域。上述方法可包含隨后的淘選輪次；例如，可進(jìn)行2、3、4、5、6、7、8、9或10輪淘選。所 述方法還可包括通過擴(kuò)增編碼Vh結(jié)構(gòu)域的核酸序列；將擴(kuò)增的核酸序列克隆入表達(dá)載體； 在允許編碼Vh結(jié)構(gòu)域的核酸表達(dá)的條件下用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；和回收具有期望的特 異性的Vh結(jié)構(gòu)域來分離特定的Vh結(jié)構(gòu)域?？赏ㄟ^本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法制備基于噬菌粒的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫。 例如，但不期望限于，可通過下列來制備文庫將噬菌粒(各自包含編碼Vh結(jié)構(gòu)域的核酸) 插入細(xì)菌種類；將細(xì)菌種類與hyperphage接觸，并且將細(xì)菌種類經(jīng)歷用于感染的條件；和， 將噬菌粒插入的和hyperphage-感染的細(xì)菌種類經(jīng)歷用于產(chǎn)生噬菌體_VH結(jié)構(gòu)域文庫的條 件。
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用于本發(fā)明的方法的“噬菌?！笔峭ㄟ^修飾質(zhì)粒衍生的載體，其包含噬菌體的復(fù)制 起點(diǎn)以及質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)。噬菌粒包含絲狀噬菌體gill或其片段；在該實(shí)例中，編碼Vh結(jié)構(gòu) 域的核酸以與全長或截斷的gin產(chǎn)物(PlII)融合的形式表達(dá)并且通過PlII在噬菌體顆 粒上展示。噬菌粒還包含編碼Vh結(jié)構(gòu)域的核酸；各噬菌?？砂幋aVh結(jié)構(gòu)域的庫的不同 成員的核酸。噬菌粒至細(xì)菌種類的插入可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法來進(jìn)行。噬菌粒中編碼的Vh結(jié)構(gòu)域可基于任何合適的Vh序列。Vh結(jié)構(gòu)域支架可以是本領(lǐng) 域內(nèi)已知的任何合適的支架。在特定的非限定性實(shí)例中，本發(fā)明WVh結(jié)構(gòu)域基于具有酸性 Pl的\序列。本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域可基于具有酸性Pl的任何已知的人種系序列，特別地來 自VH3家族的序列，和更特別地具有蛋白A結(jié)合活性的序列；例如，但不被認(rèn)為是限定性的， Vh結(jié)構(gòu)域可基于人種系序列l(wèi)_fVH區(qū)段，1-24Vh區(qū)段和3-43Vh區(qū)段(參見圖14)。備選地， Vh結(jié)構(gòu)域可基于駱駝Vh cDNA或具有酸性pi的駱駝種系Vh區(qū)段。用作文庫支架的酸性駱駝 種系Vh區(qū)段可以是本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何此類區(qū)段；在特定的非限定性實(shí)例中，Vh區(qū)段可以 是Nguyen等人，2000中描述區(qū)段。在另一個備選實(shí)例中，所描述的Vh和其文庫可基于 駱駝VhH cDNA或具有酸性pi的駱駝種系VhH區(qū)段。用作文庫支架的酸性駱駝VhH cDNA可 以是本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何此類cDNA ；例如，但不限于，VH區(qū)段可以是Harmsen等人(2000)， Tanha等人(2002)中描述的Vh區(qū)段，具有NCBI登錄號AB091838-AB092333的VhH的庫中 的Vh區(qū)段或Nguyen等人(2000)中的Vh區(qū)段。上文中描述了 Vh結(jié)構(gòu)域可基于的各種其他 支架。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公認(rèn)的，雖然文庫中Vh結(jié)構(gòu)域可基于支架，但由于選擇的區(qū)域 的隨機(jī)化，大量不同的Vh結(jié)構(gòu)域存在于文庫中。本發(fā)明的文庫中非聚集性Vh的比例可比常 規(guī)文庫中的大?？蓪⑹删２迦肴魏魏线m的細(xì)菌種類和株系；本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉此類細(xì)菌種類 和株系。不期望受到限定，細(xì)菌種類可以是例如大腸桿菌(E.coli)；在另一個非限定性實(shí) 例中，大腸桿菌株系可以是TGl、XLl-blue、SURE、T0P10F，、XLl-Blue MRF，或 ABLE K。用 于將噬菌粒插入細(xì)菌種類的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。在如上文中剛剛描述的本發(fā)明的方法中，通過Vh結(jié)構(gòu)域在噬菌體表面上的多價展 示來產(chǎn)生使用的文庫。這可通過將已將噬菌粒插入其中的細(xì)菌種類與hyperphage接觸，然 后將細(xì)菌種類經(jīng)歷用于感染的條件來實(shí)現(xiàn)。“Hyperphage”是一種類型的輔助噬菌體，其具有野生型pill表型，從而能夠以高 效率感染F(+)大腸桿菌細(xì)胞；然而，它們的功能性pill基因的缺乏意味著噬菌粒編碼的 PiII-抗體融合物在噬菌體組裝中是PiII的唯一來源。這導(dǎo)致在它們的表面上攜帶抗體片 段的噬菌體顆粒的比例有相當(dāng)大的增加和導(dǎo)致噬菌體顆粒多價展示抗體片段。在一個非限 定性實(shí)例中，hyperphage可以是Μ13Κ07ΔρΙΙΙ。然而，其他合適的同源物可用于本發(fā)明的 方法；例如，但不期望以任何方式限于，Ex-phage (Baek等人，2002)或Phaberge(Sc)Ites等 人，2003)。hyperphage感染細(xì)菌種類的條件在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的；例如，但不期望以任何方 式限于，所述條件可以是Arbabi-Ghahroudi，等人(2008)或Rondot等人(2001)中描述的 條件，或適合于hyperphage感染細(xì)菌的任何其他條件。然后將感染的細(xì)菌種類經(jīng)歷用于產(chǎn)生噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫的條件。此類條件 在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的；例如，但不期望限于，合適的條件描述于(Arbabi-Ghahroudi，等人，
152008 ；Harrison，等人，1996)中。在本發(fā)明的方法中，使用噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫和靶進(jìn)行淘選。如對于本領(lǐng)域技 術(shù)人員來說是已知的，“淘選”是指其中將絲狀噬菌體展示的抗體文庫(例如，本發(fā)明的噬 菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫)的庫暴露于目的靶(或“抗原”)的過程。靶可以是固定的或可獲得 的，或可在固體表面上，溶液中，細(xì)胞表面上，或可以是任何其他合適的形式。可通過不同方 法包括用含有去垢劑例如Tween 20的緩沖液充分清洗來去除非結(jié)合的噬菌體-抗體；備選 地，可利用鏈霉抗生物素蛋白磁珠捕獲出結(jié)合至生物素化的靶的噬菌體。然后可利用本領(lǐng) 域內(nèi)熟知的方法從靶中洗脫結(jié)合的噬菌體_抗體。然后可在F+細(xì)菌宿主中擴(kuò)增(繁殖) 洗脫的噬菌體抗體?？稍?輪或多于1輪的淘選中進(jìn)行選擇和擴(kuò)增的過程；例如，可進(jìn)行 2，3，4，5，6，7，8，9或10輪淘選。這導(dǎo)致抗體-噬菌體結(jié)合劑至靶的特異性富集和導(dǎo)致單 特異性抗體(例如Vh結(jié)構(gòu)域)的分離。用于淘選的條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知 的；例如，條件可以是Marks等人(1991)，Griffiths等人(1994)，或Sidhu等人(2004)， Hoogenboom(2002)，Bradbury (2004)中描述的條件或任何其他合適的條件。用于淘選步驟的“靶”可以是任何合適的選擇的靶。例如，靶可以是大體上純化的 抗原、綴合至分子例如生物素或類似分子的抗原、部分純化的抗原、細(xì)胞、組織；靶還可以是 固定的或可獲得的，或可在固體表面上，在溶液中，在細(xì)胞表面上或可以是任何其他合適形 式(參見HOOgenbOOm，2005)?？乖c例如生物素的綴合使得選擇步驟容易進(jìn)行和更有效， 和需要低得多的量的純化抗原。還可基于所得的基于噬菌粒的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫或 Vh結(jié)構(gòu)域的期望的特異性選擇靶。靶可以是任何類型的目的分子；例如，靶可以是酶、細(xì)胞 表面抗原、TNF、白細(xì)胞介素、ICAM家族中的分子等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解，通過本 文中描述的方法獲得的Vh結(jié)構(gòu)域文庫可被導(dǎo)向任何目的靶或具有治療重要性的靶。例如， 但不期望以任何方式進(jìn)行限定，酶可以是α淀粉酶、碳酸酐酶或溶菌酶。本發(fā)明的方法還可包括選擇非聚集性噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域的步驟。在一個實(shí)施方案中，選擇步驟可在淘選步驟之前發(fā)生并且可包括將噬菌體-Vh結(jié) 構(gòu)域文庫經(jīng)歷熱變性/復(fù)性步驟。該步驟包括Vh結(jié)構(gòu)域的熱去折疊，隨后重折疊成它們的 天然構(gòu)象，并且可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法來進(jìn)行；參見例如Jespers等人(2004)。 例如，但不期望限于，可將噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫在大約55°C至大約90°C的范圍內(nèi)的溫度 下經(jīng)歷變性；溫度可以是55、60、65、70、75、80、85或90°C，或其間的任何溫度。在一個實(shí)施 方案中，噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫保持在該升高的溫度下，進(jìn)行大約1分鐘至大約30分鐘的 范圍內(nèi)的時間；例如但不期望限于，溫度可保持1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 分鐘，或其間的任何時間。然后，通過 將溫度返回至更低的溫度，例如室溫或更低，4或5°C (進(jìn)行與用于變性的時間相似的時間) 來將噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫經(jīng)歷復(fù)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)，噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫中Vh 變性所處的溫度將取決于Vh結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)和它們的熔化溫度。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理 解，在一些實(shí)施方案中，可將更高的變性溫度與更短的暴露時間組合；類似地在其他實(shí)施方 案中，可將更低的變性溫度與更長的暴露時間組合?？梢栽诒绢I(lǐng)域內(nèi)已知的任何合適的水 性緩沖液中進(jìn)行變性/復(fù)性步驟；例如，但不期望以任何方式進(jìn)行限定，緩沖液可以是Tris 緩沖液、PBS緩沖液、HEPES緩沖液、碳酸鹽緩沖液或水。在另一個實(shí)施方案中，該方法可包括測定單個克隆的序列以鑒定具有酸性Pl的Vh
16的步驟。非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域的該篩選步驟基于可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法確定的理論 Pl值。例如，但不期望限于，可利用可商購獲得的軟件包確定理論pi。如之前所描述的，本 發(fā)明已顯示具有酸性Pl WVh可以是可溶性的和非聚集性的?；谥煌ㄟ^DNA測序獲得的 Pl值從聚集性Vh中篩選非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域避免了對大量Vh的亞克隆、表達(dá)、純化和生物物 理學(xué)表征的需要。在另外的實(shí)施方案中，進(jìn)行熱變性/復(fù)性步驟和測序步驟。本文中描述的方法還可包括通過下列來分離特定Vh結(jié)構(gòu)域擴(kuò)增編碼回收的噬菌 體-Vh結(jié)構(gòu)域中的Vh結(jié)構(gòu)域的核酸序列；將擴(kuò)增的核酸序列克隆入表達(dá)載體；在允許編碼 Vh結(jié)構(gòu)域的核酸表達(dá)的條件下用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；和回收具有期望的特異性的Vh結(jié) 構(gòu)域。用于進(jìn)行此類步驟的方法和特定條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。上述方法是使用基于噬菌粒載體的噬菌體展示(通過使用hyperphage產(chǎn)生)和 基于熱變性或理論P(yáng)l的分析的選擇步驟的新型組合。該新型方法可增加選擇非聚集性人 Vh的效率。在非限定性實(shí)例中，本方法可選擇包含非典范二硫鍵的Vh結(jié)構(gòu)域，如上文所描 述的；不期望限于，非典范二硫鍵可在⑶Rl和/或⑶R3中發(fā)生。在另一個實(shí)例中，上述方 法可選擇具有酸性Pl的Vh結(jié)構(gòu)域。與基于噬菌體載體的系統(tǒng)相比較，本方法的基于噬菌粒載體的噬菌體展示系統(tǒng)提 供了許多有利方面，包括使構(gòu)建大文庫(其在非免疫文庫的情況下是期望的)變得容易； 適合于從免疫或親和力成熟文庫中分離高親和力結(jié)合劑；使用于提高親和力或生物物理學(xué) 性質(zhì)的操作變得容易；和易于從抗體-pin融合物轉(zhuǎn)換至未融合的抗體片段(以進(jìn)行快速 抗體表達(dá)和分析)。此外，在本發(fā)明的方法中導(dǎo)致多價展示(Rondot等人，2001 ；Baek,H.等 人，2002 ;Soltes，G.等人，2003)的輔助噬菌體，例如，hyperphage (M13K07 Δ pill)的使 用，提供了由基于噬菌體載體的展示系統(tǒng)給予的有利方面(由于親合力效應(yīng))，包括結(jié)合 劑的高產(chǎn)率和淘選的更少輪次(0' Cormell等人，2002)；抗細(xì)胞表面抗原的抗體的更有效 富集；和用于選擇針對需要自交聯(lián)的細(xì)胞表面受體的抗體的適合性(Becerril等人，1999 ； Huie等人，2001)。此外，對于噬菌粒載體系統(tǒng)，可通過使用合適類型的輔助噬菌體容易地進(jìn) 行單價與多價形式之間的轉(zhuǎn)換(Rondot等人，2001 ；0' Connell等人，2002 ；Kirsch等人， 2005)。為了進(jìn)一步利用基于噬菌粒的文庫在選擇非聚集性Vh方面提供的有利方面，我們 決定使用hyperphage技術(shù)(Rondot等人，2001)以使上述熱變性策略(Jespers等人，2004) 適應(yīng)于基于噬菌粒的文庫。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過下列步驟增加非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域的選擇 的能力或效率的方法，包括a)提供基于噬菌體載體的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫，其中基于具有酸性pi的Vh 結(jié)構(gòu)域支架產(chǎn)生文庫；b)使用噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫和靶進(jìn)行淘選；和c)測定單個克隆的序列以鑒定具有酸性pi的Vh結(jié)構(gòu)域可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法制備基于噬菌體載體的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文 庫。例如，但不期望限于，可通過下列來制備文庫將噬菌體載體(各自包含編碼Vh結(jié)構(gòu)域 的核酸)插入細(xì)菌種類；和，將噬菌體載體-插入的細(xì)菌種類經(jīng)歷用于產(chǎn)生噬菌體-Vh結(jié)構(gòu) 域文庫的條件。
“噬菌體載體"是指通過修飾噬菌體基因組衍生的載體，其包括噬菌體的復(fù)制起 點(diǎn)但不包括質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)；噬菌體載體可以具有或可以不具有抗生素抗性標(biāo)記。用于產(chǎn)生基于噬菌體載體的噬菌體展示文庫的方法在本領(lǐng)域內(nèi)已良好建立，并且 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。本文中描述的方法還可包括通過下列來分離特定結(jié)構(gòu)域擴(kuò)增編碼回收的噬 菌體-Vh結(jié)構(gòu)域中的Vh結(jié)構(gòu)域的核酸序列；將擴(kuò)增的核酸序列克隆入表達(dá)載體；在允許編 碼Vh結(jié)構(gòu)域的核酸表達(dá)的條件下用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；和回收具有期望的特異性的Vh 結(jié)構(gòu)域。用于進(jìn)行這些步驟的方法和特定條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。本發(fā)明還涉及融合至貨物分子(cargo molecule)的本發(fā)明的Vh。如本文中所使用 的，“貨物分子”是指為了靶向、增加親和力、提供第二功能或否則提供有益效應(yīng)的目的的任 何分子。貨物分子可具有與本發(fā)明的\相同或不同的特異性。例如，但不期望限于，貨物分 子可以是毒素、抗體的Fc區(qū)域、完整抗體或酶(如在抗體導(dǎo)向的酶前體藥物療法(ADEPT) 的背景中(Bagshawe，1987:2006))；具有相同或不同特異性的一種或多于一種的單結(jié)構(gòu)域 例如VH、\、VhH、VNAR等；用于靶向的藥物遞送的脂質(zhì)體；治療性分子，放射性同位素；或提 供期望的作用的任何其他分子。將貨物分子偶聯(lián)或附著至本發(fā)明的VH結(jié)構(gòu)域的方法對于 本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。本發(fā)明的方法和Vh結(jié)構(gòu)域文庫不必限于噬菌體展示技術(shù)，其還可擴(kuò)展至其他形 式。例如，但不期望限于，本發(fā)明的方法和Vh結(jié)構(gòu)域文庫可以是核糖體和mRNA展示、微生 物細(xì)胞展示、逆轉(zhuǎn)錄病毒展示、微珠展示等(參見HOOgenbOOm，2005)。用于進(jìn)行這些類型的 展示方法的條件在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。還可以以多聚體形式重組產(chǎn)生本發(fā)明的VH;在非限定性實(shí)例中，Vh可產(chǎn)生為二聚 體、三聚體、五聚體等。以多聚體形式存在的本發(fā)明WVh的提供可增加Vh的親和力。存在 于多聚體形式中的單體單位可具有相同的或不同的特異性。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的Vh的核酸。如本文中所使用的，“核酸”或“多核苷酸” 包括核酸、寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸和其任何片段、變體或衍生物。核酸或多核苷酸可以 是雙鏈的、單鏈的或三鏈的DNA或RNA(包括cDNA)或遺傳或合成來源的DNA-RNA雜交體， 其中核酸包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何組合以及堿基包括但不限于腺嘌呤、胸 腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶、肌苷、黃嘌呤和次黃嘌呤的任何組合。可將核酸或多核苷 酸與碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或其他材料組合?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù) 之一(包括但不限于具有相應(yīng)于目的核苷酸序列的部分序列的序列或其變異序列的寡核 苷酸的自動化合成)，利用可商購獲得的寡核苷酸合成儀例如AppliedBiosys terns Model 392 DNA/RNA合成儀來化學(xué)合成目的核酸序列。本發(fā)明的核酸還可包含在載體中。可使用任何合適的載體，并且本領(lǐng)域技術(shù) 人員對該主題十分熟悉。本發(fā)明還提供了包含上述核酸或載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是任何合適的宿 主細(xì)胞，例如，但不限于大腸桿菌或酵母細(xì)胞。合適的大腸桿菌株系的非限定性特定實(shí)例 是TG1、BL21(DE3)和 BL21 (DE3) pLysS。本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域可具有對于臨床和診斷應(yīng)用來說是期望的特性。在一個實(shí)施 方案中，可使用可檢測的標(biāo)志物或標(biāo)記來標(biāo)記VH。可使用多種標(biāo)記技術(shù)之一(包括本領(lǐng)
18域內(nèi)已知的過氧化物酶、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記以及本領(lǐng)域內(nèi)已知的放射性標(biāo)記)來進(jìn)行抗體的標(biāo) 記。本發(fā)明的可檢測的標(biāo)志物或標(biāo)記可以是例如非放射性或熒光標(biāo)志物例如生物素、熒光 素(FITC)、吖啶、膽固醇或羧基-X-羅丹明，其可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的熒光和其他成像技術(shù) 來檢測。備選地，可檢測的標(biāo)志物或標(biāo)記可以是放射性標(biāo)志物包括例如，放射性同位素。放 射性同位素可以是發(fā)射可檢測的輻射的任何同位素。由放射性同位素發(fā)射的放射性可通過 本領(lǐng)域內(nèi)熟知的技術(shù)來檢測。例如，來自放射性同位素的Y發(fā)射可使用Y成像技術(shù)，特別 地閃爍成像技術(shù)來檢測。此外，還可通過與綠色熒光蛋白(GFP)、RFP、YFP等的融合來進(jìn)行 檢測。本發(fā)明還可用于高通量篩選測定例如微陣列技術(shù)，其中Vh結(jié)構(gòu)域的使用是有 利的或提供了與常規(guī)IgG相比有用的另一選擇。在另一個方面，本發(fā)明提供了以將其結(jié)合至抗原的有效量包含一種或多于一種的 Vh和可藥用的賦形劑的藥物組合物。合適的藥物賦形劑對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知 的。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療患者的方法，包括給需要治療的患者施 用包含一種或多種Vh的藥物組合物。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，很顯然的是文庫例如本文 中公開的文庫可以是靶的結(jié)合劑的來源。因此，它們可用于治療、診斷和檢測?？杀槐景l(fā)明 的Vh結(jié)構(gòu)域靶向的適應(yīng)癥是癌癥(用于腫瘤標(biāo)志物的檢測和/或任何癌癥的治療)、炎性 疾病(其包括通過抗體調(diào)節(jié)靶分子、殺死靶細(xì)胞、阻斷分子相互作用)、自身免疫疾病(例 如，狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)、神經(jīng)退行性疾病(例如帕金森氏病、阿爾茨海默病等)、由朊 病毒、病毒、細(xì)菌和真菌因子引起的感染性疾病或，一般地由任何已知的或未知的微生物或 因子引起的感染導(dǎo)致的任何感染性疾病。靶可包括特異于給定的疾病狀態(tài)的任何分子。例 如，但不期望以任何方式限定，靶可包括細(xì)胞表面抗原、酶、TNF、白細(xì)胞介素、ICAM家族中 的分子等。根據(jù)本發(fā)明獲得的文庫還可用于獲得用于檢測病原體的Vh結(jié)構(gòu)域。病原體可 包括人、動物或植物病原體例如細(xì)菌、真細(xì)菌、古細(xì)菌、真核微生物(例如，原生動物、真菌、 酵母和霉菌)、朊病毒、病毒和生物毒素(例如，細(xì)菌或真菌毒素或植物凝集素)。本領(lǐng)域技 術(shù)人員易于理解，通過本文中描述的方法獲得的Vh結(jié)構(gòu)域文庫可被導(dǎo)向任何目的靶。在非 限定性實(shí)例中，靶可以是酶；在另外的實(shí)例中，但不期望限于，酶可以是溶菌酶、α淀粉酶 或碳酸酐酶。在另一個方面，本發(fā)明預(yù)期提供可用于檢測和確定一種或多于一種的Vh與生物學(xué) 樣品中特定抗原的結(jié)合的試劑盒。試劑盒包括一種或多于一種的Vh和一種或多種試劑。可 標(biāo)記一種或多于一種的Vh結(jié)構(gòu)域。此外，試劑盒還可包含陽性對照試劑。還可包括試劑盒 的使用說明書。本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域還可用于抗體微陣列技術(shù)。該技術(shù)是常規(guī)免疫測定的另一選 擇，并且可平行進(jìn)行數(shù)千個測定。抗體Vh結(jié)構(gòu)域在該類型的測定中優(yōu)于完整IgG，因?yàn)樗鼈?是小的、穩(wěn)定的且高特異性的試劑。用于抗體微陣列的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。本發(fā)明將在下列實(shí)施例中得到進(jìn)一步說明。然而，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明 目的并且不應(yīng)當(dāng)用于以任何方式限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例除非另外指出，否則使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)(Sambrook等人，1989)進(jìn)行分子 生物學(xué)工作。通過引入第二非相容性Sfi I位點(diǎn)和6個His密碼子來修飾噬菌粒 pHEN4 (Arbabi-Ghahroudi等人，1997)。將稱為pMEDl的新型載體用于噬菌體展示文庫的構(gòu) 建。將PSJF2H質(zhì)粒用于單結(jié)構(gòu)域抗體在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。除了其以與His6而非 His5融合的形式表達(dá)蛋白質(zhì)外，PSJF2H與pSJF2 (Tanha等人，2003)相同。實(shí)施例1 :HVHP430 Vh文庫的構(gòu)建構(gòu)建完全合成的基于噬菌粒的人Vh噬菌體展示文庫。當(dāng)在HVHP430支架(圖2k, SEQ ID NO 1)上構(gòu)建Vh文庫時，保持2個CDR3 Cys以促進(jìn) CDR內(nèi)二硫鍵的形成，從而增加文庫中酶抑制性Vh的頻率。隨機(jī)化剩余的14個CDR3位點(diǎn)、位點(diǎn) 94以及8個H1/CDR1位點(diǎn)(圖2A)。讓CDR2保持不變，因?yàn)橐扬@示其參與蛋白A結(jié)合(Randen 等人，1993 ；Bond等人，2003)。除此以外，缺乏CDR2的VNAR(Stanfield等人，2004)或利用它們 的CDRl和CDR3 (Decanniere等人，1999)或只利用CDR3 (Desmyter等人，2001)進(jìn)行抗原識別的 路馬它VhH顯示納摩爾的親和力。按照圖2B中顯示的方案用噬菌粒載體(圖3)構(gòu)建文庫。將人Vh HVHP430 (其在CDR3中在位點(diǎn)99和IOOd上具有2個Cys殘基)(To等人， 2005)用作構(gòu)架以通過隨機(jī)化⑶Rl和⑶R3中以及位點(diǎn)94上的殘基構(gòu)建文庫。使用含有 HVHP430基因的質(zhì)粒(作為模板)和弓丨物對HVHBR1-R/HVHFR2_F和HVHBR3-R/HVHFR5_F (關(guān) 于使用的引物的列表，參見表1)，利用標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)構(gòu)建了 2個分別具有隨機(jī) 化的Hl/⑶Rl和94/⑶R3密碼子的交迭片段。表1.用于Vh克隆的引物的列表。
權(quán)利要求
非聚集性VH結(jié)構(gòu)域或其文庫，所述VH結(jié)構(gòu)域在至少一個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中包含至少一個形成二硫鍵的半胱氨酸，并且包括酸性等電點(diǎn)(pI)。
2.權(quán)利要求1的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述Vh結(jié)構(gòu)域是可溶性的，能夠可 逆熱去折疊，和/或能夠結(jié)合蛋白A。
3.權(quán)利要求1或2的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述乂11結(jié)構(gòu)域在CDRl中包含 至少一個形成二硫鍵的半胱氨酸。
4.權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述Vh結(jié)構(gòu)域在CDR3 中包含至少3個形成二硫鍵的半胱氨酸。
5.權(quán)利要求3或4的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述Vh結(jié)構(gòu)域在1個CDR內(nèi) 或⑶R之間包含非典范二硫鍵。
6.權(quán)利要求5的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述Vh結(jié)構(gòu)域包含通過CDR內(nèi)或 CDR間非典范二硫鍵形成的伸出的環(huán)。
7.權(quán)利要求1至6的任一項(xiàng)的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述Vh結(jié)構(gòu)域包含 存在于CDRl的位點(diǎn)32上的酸性氨基酸殘基。
8.權(quán)利要求1的非聚集性VH結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述￥11結(jié)構(gòu)域包括低于6的等電點(diǎn)ο
9.權(quán)利要求1的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述￥11結(jié)構(gòu)域包含選自SEQID NO 24-90，SEQ ID NO :101_131，SEQ ID NO 132-162 的任一個和其組合的序列。
10.權(quán)利要求1的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述Vh結(jié)構(gòu)域包含人構(gòu)架序列和 至少一個來自不同物種的⑶R。
11.權(quán)利要求10的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述Vh結(jié)構(gòu)域包含人構(gòu)架序列、 人 CDR1/H1、人 CDR2/H2 和駱駝 CDR3/H3。
12.權(quán)利要求1的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述Vh結(jié)構(gòu)域包含混合的隨機(jī)化 的序列。
13.權(quán)利要求1的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述Vh結(jié)構(gòu)域是酶抑制劑。
14.權(quán)利要求1的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述￥11結(jié)構(gòu)域基于人種系序列1-f Vh區(qū)段、1_24Vh區(qū)段和3-43Vh區(qū)段。
15.權(quán)利要求1的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述Vh結(jié)構(gòu)域基于具有酸性pi的 人種系序列、駱駝VhcDNA、具有酸性pi的駱駝種系Vh區(qū)段、駱駝VhH cDNA或具有酸性pi的 駱駝種系VhH區(qū)段。
16.權(quán)利要求1的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中所述￥11結(jié)構(gòu)域是huVHAm302、 huVHAm309、huVHAm316、huVHAm303、huVHAm304、huVHAm305、huVHAm307、huVHAm311、 huVHAm315、huVHAm301、huVHAm312、huVHAm320、huVHAm317、huVHAm313、huVHAm431、 huVHAm427、huVHAm416、huVHAm424、huVHAm428、huVHAm430、huVHAm406、huVHAm412 和 huVHAm420 中的一個。
17.權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中從基于噬菌粒的噬 菌體展示文庫分離所述Vh結(jié)構(gòu)域。
18.權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)的非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中通過選擇步驟從基 于噬菌粒的噬菌體展示文庫分離所述Vh結(jié)構(gòu)域，所述選擇步驟增強(qiáng)對非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域的選擇的能力或效率。
19.增加對非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域的選擇的能力或效率的方法，包括a)提供基于噬菌粒的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫，其中通過Vh結(jié)構(gòu)域在噬菌體表面上 的多價展示來產(chǎn)生所述文庫；和b)使用所述噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫和靶進(jìn)行淘選，其中所述方法包括選擇非聚集性噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域的步驟。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述選擇步驟是在淘選步驟(步驟b))之前發(fā)生的將噬 菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫經(jīng)歷熱變性/復(fù)性的步驟。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其中所述選擇步驟是在淘選步驟(步驟b))后發(fā)生的測 定單個克隆的序列以鑒定具有酸性Pl的Vh的步驟。
22.權(quán)利要求19的方法，其包括a)提供基于噬菌粒的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫，其中通過Vh結(jié)構(gòu)域在噬菌體表面上 的多價展示來產(chǎn)生所述文庫；b)將所述基于噬菌粒的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫經(jīng)歷熱變性/復(fù)性步驟；和c)使用所述噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫和靶進(jìn)行淘選。
23.權(quán)利要求19的方法，其包括a)提供基于噬菌粒的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫，其中通過Vh結(jié)構(gòu)域在噬菌體表面上 的多價展示來產(chǎn)生所述文庫；b)使用所述噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫和靶進(jìn)行淘選；和c)測定單個克隆的序列以鑒定具有酸性pi的Vh結(jié)構(gòu)域。
24.權(quán)利要求19至23的任一項(xiàng)的方法，其還包括從基于噬菌粒的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展 示文庫分離特定Vh結(jié)構(gòu)域的步驟。
25.增加對非聚集性Vh結(jié)構(gòu)域的選擇的能力或效率的方法，包括a)提供基于噬菌體載體的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫，其中基于具有酸性pi的Vh結(jié)構(gòu) 域支架產(chǎn)生所述文庫；b)使用所述噬菌體-Vh結(jié)構(gòu)域文庫和靶進(jìn)行淘選；和c)測定單個克隆的序列以鑒定具有酸性pi的Vh結(jié)構(gòu)域。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述Vh結(jié)構(gòu)域支架基于具有酸性pi的人種系序列、駱駝 Vh cDNA、具有酸性pi的駱駝種系Vh區(qū)段、駱駝VhH cDNA或具有酸性pi的駱駝種系VhH區(qū) 段。
27.權(quán)利要求25的方法，其還包括從基于噬菌體載體的Vh結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫分離 特定Vh結(jié)構(gòu)域的步驟。
28.編碼權(quán)利要求1至18的任一項(xiàng)的Vh結(jié)構(gòu)域的核酸。
29.包含權(quán)利要求28的核酸的載體。
30.包含權(quán)利要求28的核酸或權(quán)利要求29的載體的宿主細(xì)胞。
31.藥物組合物，其包含有效量的用于結(jié)合抗原的一種或多于一種的權(quán)利要求1至18 的任一項(xiàng)的Vh結(jié)構(gòu)域，和可藥用的賦形劑。
32.權(quán)利要求1至18的任一項(xiàng)的￥11結(jié)構(gòu)域或其文庫在制備藥劑中的用途，所述藥劑用 于通過與抗原結(jié)合來治療或預(yù)防醫(yī)學(xué)病狀。
33.治療患者的方法，其包括給需要治療的患者施用包含一種或多于一種的權(quán)利要求 1至18的任一項(xiàng)的Vh結(jié)構(gòu)域的藥物組合物。
34.試劑盒，其包括一種或多于一種的權(quán)利要求1至18的任一項(xiàng)的Vh結(jié)構(gòu)域和一種或 多種試劑，其用于檢測和確定所述一種或多于一種的Vh結(jié)構(gòu)域與生物學(xué)樣品中特定抗原的纟口口。
35.權(quán)利要求1至18的任一項(xiàng)的Vh結(jié)構(gòu)域在用于分析樣品的高通量篩選測定中的用途。
36.Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中a)所述Vh結(jié)構(gòu)域基于HVHP430(SEQ IDNO 1) ；b)保持CDR3 的位點(diǎn)99和IOOd上的Cys ；c)隨機(jī)化CDR3的剩余的14個氨基酸殘基；d)隨機(jī)化氨基酸 殘基94 ；和e)隨機(jī)化CDR1/H1的8個氨基酸殘基。
37.Vh結(jié)構(gòu)域文庫，其中a)所述Vh結(jié)構(gòu)域基于HVHP430 (SEQ IDNO 1) ；b)在位點(diǎn) 93-102 (93/94-⑶R3)上的氨基酸殘基來源于美洲駝VhH ;c)隨機(jī)化⑶R1/H1的8個氨基酸 殘基。
38.Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其中a)所述Vh結(jié)構(gòu)域基于HVHP430(SEQ IDNO 1) ；b)CDR3包 含選自SEQ ID NO 24-90和SEQ ID NO :33_63的序列；c)隨機(jī)化CDR1/H1的8個氨基酸殘基。
39.權(quán)利要求1-18或36-38的任一項(xiàng)的Vh結(jié)構(gòu)域或其文庫，其偶聯(lián)至貨物分子，或用 可檢測的標(biāo)記或標(biāo)志物進(jìn)行標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及非聚集性VH結(jié)構(gòu)域或其文庫。VH結(jié)構(gòu)域在至少一個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中包含至少一個形成二硫鍵的半胱氨酸和酸性等電點(diǎn)(pI)。增加對非聚集性VH結(jié)構(gòu)域的選擇的能力或效率的方法包括結(jié)合選擇非聚集性噬菌體-VH結(jié)構(gòu)域的步驟淘選基于噬菌粒的VH結(jié)構(gòu)域噬菌體展示文庫。還提供了包含非聚集性VH結(jié)構(gòu)域的物質(zhì)的組合物以及使用方法。
文檔編號C40B40/10GK101939333SQ200880125344
公開日2011年1月5日 申請日期2008年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者J·坦納, M·阿巴比-格赫勞迪 申請人:加拿大國家研究委員會