具有促進(jìn)抗原清除的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的治療性抗原結(jié)合分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供：在中性pH下對(duì)新生兒Fc受體(FcRn)的親和力提高的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域；包含所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其具有低免疫原性、高穩(wěn)定性并且僅形成少數(shù)聚集體；在中性或酸性pH下具有提高的FcRn結(jié)合活性而在中性pH下對(duì)預(yù)存抗藥抗體的結(jié)合活性又不提高的修飾抗原結(jié)合分子；抗原結(jié)合分子用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)抗原的攝入的用途；抗原結(jié)合分子用于降低血漿特定抗原濃度的用途；修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于增加單個(gè)抗原結(jié)合分子在其降解前可結(jié)合的抗原的總數(shù)的用途；修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動(dòng)力學(xué)的用途；用于降低對(duì)預(yù)存抗藥抗體的結(jié)合活性的方法；和用于產(chǎn)生所述抗原結(jié)合分子的方法。
【專利說明】具有促進(jìn)抗原清除的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的治療性抗原結(jié)合分子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及:在中性pH下對(duì)新生兒Fe受體(FcRn)的親和力提高的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域；包含所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其具有低免疫原性、高穩(wěn)定性并且僅形成少數(shù)聚集體；在中性或酸性PH下FcRn結(jié)合活性提高而在中性pH下對(duì)預(yù)存抗藥抗體的結(jié)合活性又不提高的修飾抗原結(jié)合分子；所述抗原結(jié)合分子用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)抗原的攝入的用途；所述抗原結(jié)合分子用于降低血漿特定抗原濃度的用途；所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于增加單個(gè)抗原結(jié)合分子在其降解前可結(jié)合的抗原的總數(shù)的用途；所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動(dòng)力學(xué)的用途；用于降低對(duì)預(yù)存抗藥抗體的結(jié)合活性的方法；和用于產(chǎn)生所述抗原結(jié)合分子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于其在血漿中的高穩(wěn)定性和很少副作用，越來越多的抗體被用作藥物。靶向可溶性抗原的常規(guī)抗體在注射后結(jié)合患者血漿中的抗原，然后以抗體-抗原復(fù)合物的形式穩(wěn)定地持續(xù)存在直到降解。雖然典型的抗體一般具有長(zhǎng)的半衰期(1-3周)，但是抗原具有少于一天的相對(duì)短的半衰期。與抗體的復(fù)合物中的抗原因此比僅抗原具有顯著較長(zhǎng)的半衰期。因此，在注射常規(guī)抗體后抗原濃度往往增加。已報(bào)告了靶向各種可溶性抗原的抗體的這種情況，例如IL_6(J Immunotoxicol.2005, 3, 131-9.(NPLl)) ；β淀粉狀蛋白(MAbs.20109-10 月;2 (5):576-88(NPL2)) ；MCP-1 (ARTHRITIS&RHEUMATISM2006, 54, 2387-92 (NPL3)) ；hepcidin(AAPS J.2010，12(4):646-57.(NPL4))和 sIL-6 受體(Blood.2008 年11月15日；112 (10):3959-64.(NPL5))。報(bào)告描述了在給予抗體時(shí)血漿總抗原濃度從基線增加至約10-1000倍(取決于抗原)。
[0003]由于不需要血漿總抗原濃度的這種增加，因此開發(fā)了通過治療性抗體消除抗原的策略。這些策略之一是使用針對(duì)IgG的新生兒Fe受體(FcRn)的結(jié)合親和力提高的pH依賴性抗原結(jié)合抗體來快速處理抗原(參見例如PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/JP2011/001888 (PTLl))。FcRn是存在于許多細(xì)胞的膜中的蛋白質(zhì)。在中性pH下對(duì)FcRn的結(jié)合活性提高的抗體可結(jié)合細(xì)胞表面上的FcRn,籍此抗體與受體一起以小囊泡內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞。由于小囊泡內(nèi)部的pH逐漸降低，因此抗原由于其在酸性PH下的低親和力而自pH依賴性抗原結(jié)合抗體中解離。解離的抗原然后被降解，同時(shí)FcRn和結(jié)合的抗體在降解前再循環(huán)返回細(xì)胞表面。因此，在中性pH下對(duì)FcRn的結(jié)合活性提高的pH依賴性抗原結(jié)合抗體可用來從血漿中消除抗原并降低其血漿濃度。
[0004]之前的研究也已表明提高在酸性pH下對(duì)FcRn的結(jié)合親和力的Fe工程改造還可改進(jìn)內(nèi)體再循環(huán)效率和抗 體的藥代動(dòng)力學(xué)。例如，M252Y/S254T/T256E (YTE)變體(J Biol Chem, 2006，281:23514-23524.(NPL6))、M428L/N434S (LS)變體(NatBiotechnol, 201028:157-159.(NPL7))、T250Q/M428L(J Immunol.2006, 176(I):346-56.(NPL8))和 N434H 變體(Clinical Pharmacology&Therapeutics(201I)89(2):283-290.(NPL9))顯示相對(duì)于天然IgGl半衰期改進(jìn)。
[0005]然而，這類取代還具有改變抗體性質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)，所述性質(zhì)對(duì)治療性抗體的研發(fā)是重要的，例如抗體的穩(wěn)定性、免疫原性、聚集行為和對(duì)預(yù)存抗體(例如類風(fēng)濕因子)的結(jié)合親和力。因此提供不僅僅提高抗體清除而且還滿足開發(fā)治療性抗原結(jié)合分子的標(biāo)準(zhǔn)的修飾FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域是本發(fā)明的主要目的。這些可開發(fā)性標(biāo)準(zhǔn)特別是高穩(wěn)定性、低免疫原性、低聚集體百分比和低的對(duì)預(yù)存抗藥抗體(ADA)的結(jié)合親和力。
[0006]下面顯示與本發(fā)明有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)文件。本說明書中引用的所有文件均通過引用結(jié)合到本文中。
[0007]引用列表
[0008]專利文獻(xiàn)
[0009][PTL1] PCT/JP2011/00188 (W0/2011/122011)，ANTIGEN-BINDING MOLECULES THATPROMOTE ANTIGEN CLEARANCE(促進(jìn)抗原清除的抗原結(jié)合分子)
[0010]非專利文獻(xiàn)
[0011][NPLl]Martin PL, Cornacoff J, Prabhakar U, Lohr T, Treacy G, SutherlandJEj Hersey S，Martin E ；Reviews Preclinical Safety and Immune-ModulatingEffects of Therapeutic Monoclonal Antibodies to Interleukin_6and TumorNecrosis Factor-alpha in Cynomolgus Macaques (食蟹彌猴中抗白介素 _6 和腫瘤壞死因子_α的治療性 單克隆抗體的臨床前安全性和免疫調(diào)節(jié)作用綜述)；JImmunotoxicol.2005，3，131-9。
[0012][NPL2]Davda JPj Hansen RJ.；Properties of a general PK/PDmodel ofantibody-1igand interactions for therapeutic antibodies that bind to solubleendogenous targets (與可溶性內(nèi)源祀結(jié)合的治療性抗體的抗體_配體相互作用的通用PK/H)模型的性質(zhì));MAbs.2010 年 9-10 月;2 (5): 576-88。
[0013][NPL3] Haringman JJj Gerlag DM, Smeets TJj Baeten Dj van denBosch F，Bresnihan B, Breedveld FC，Dinant HJj Legay F，Gram H，LoetscherP，Schmouder Rj Woodworth T，Tak PP.；A randomized controlled trial with ananti_CCL2(ant1-monocyte chemotactic proteinI)monoclonal antibody in patientswith rheumatoid arthritis (類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中用抗CCL2 (抗單核細(xì)胞趨化蛋白I)單克隆抗體的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn))；ARTHRITIS and RHEUMATISM2006，54，2387-92。
[0014][NPL4]Xiao JJj Krzyzanski Wj Wang YMj Li H，Rose MJj Ma Mj Wu Y，HinkleBjPerez-Ruixo JJ.；Pharmacokinetics of ant1-hepcidin monoclonal antibodyAbl2B9m and hepcidin in cynomolgus monkeys (食蟹猴中抗 hepcidin 單克隆抗體Abl2B9m 和 hepcidin 的藥代動(dòng)力學(xué))；AAPSJ.2010，12 (4)，646-57)。
[0015][NPL5] Ni shimoto N, Terao K，Mima Tj Nakahara H，Takagi N，KakehiT.；Mechani sms and pathologic significances in increase in seruminterleukin-6 (IL-6)and soluble IL_6receptor after administration of anant1-1L-6receptor antibody, tocilizumab, in patients with rheumatoid arthritisand Castleman disease (類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和巨大淋巴結(jié)增生癥患者中在給予抗IL_6受體抗體托珠單抗后血清白介素-6(IL-6)和可溶性IL-6受體增加的機(jī)制和病理意義)；Blood.2008 年 11 月 15 日；112(10):3959-64。
[0016][NPL6]J Biol Chem, 2006，281:23514-23524
[0017][NPL7]Nat Biotechnol, 201028:157-159
[0018][NPL8] J Immunol.2006，176(1): 346-56
[0019][NPL9]Clinical Pharmacology&Therapeutics(2011)89(2):283-290
[0020]發(fā)明概述
[0021]技術(shù)問題
[0022]鑒于上述情況構(gòu)思出本發(fā)明。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供在中性pH下對(duì)FcRn的親和力提高的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域；包含所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合分子具有低免疫原性、高穩(wěn)定性并且只形成少數(shù)聚集體；在中性或酸性PH下FcRn結(jié)合活性提高而在中性PH下對(duì)預(yù)存抗藥抗體的結(jié)合活性又不提高的修飾抗原結(jié)合分子；所述抗原結(jié)合分子用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)抗原的攝入的用途；所述抗原結(jié)合分子用于降低血漿特定抗原濃度的用途；所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于增加單個(gè)抗原結(jié)合分子在其降解前可結(jié)合的抗原的總數(shù)的用途；所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動(dòng)力學(xué)的用途；和用于產(chǎn)生所述抗原結(jié)合分子的方法。
[0023]解決問題的方案
[0024]本發(fā)明人對(duì)以下進(jìn)行了專心致志的研究:在中性pH下對(duì)FcRn的親和力提高的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域和具有低免疫原性、高穩(wěn)定性并且只形成少數(shù)聚集體的包含所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域特定位置上的取代提高在中性PH下對(duì)FcRn的親和力而又不顯著提高免疫原性、不顯著降低穩(wěn)定性和/或不顯著提高高分子量物類的比率。
[0025]此外，本發(fā)明人對(duì)以下進(jìn)行了專心致志的研究:在中性pH或酸性pH下對(duì)FcRn的親和力提高但是又不顯著提高對(duì)預(yù)存抗藥抗體的結(jié)合活性的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域和包含這類FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域特定位置上的取代降低在中性PH下對(duì)預(yù)存抗藥抗體的親和力而又不顯著降低FcRn結(jié)合活性。
[0026]具體地講，本發(fā)明涉及:
[0027][I]包含修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上包含氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436，其中數(shù)字表明按照EU編號(hào)的取代的位置。
[0028][2] [I]的抗原結(jié)合分子，其中FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有
[0029]a)在EU252和EU434位上的氨基酸的氨基酸取代；和
[0030]b)在選自以下一個(gè)或多個(gè)位置上的氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU387、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434和 EU436。
[0031][3] [I]或[2]的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含:
[0032]EU238位上的天冬氨酸，
[0033]EU250位上的纈氨酸，
[0034]EU252位上的酪氨酸，[0035]EU254位上的蘇氨酸，
[0036]EU255位上的亮氨酸，
[0037]EU256位上的谷氨酸，
[0038]EU258位上的天冬氨酸或異亮氨酸，
[0039]EU286位上的谷氨酸，
[0040]EU307位上的谷氨酰胺，
[0041]EU308位上的脯氨酸，
[0042]EU309位上的谷氨酸，
[0043]EU311位上的丙氨酸或組氨酸，
[0044]EU315位上的天冬氨酸，
[0045]EU428位上的異亮氨酸，
[0046]EU433位上的丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸、精氨酸或絲氨酸，
[0047]EU434位上的酪 氨酸或色氨酸，和/或
[0048]EU436位上的異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸或苯丙氨酸。
[0049][4] [2]的抗原結(jié)合分子，其中FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含在選自以下一個(gè)或多個(gè)位置組合上的氨基酸的氨基酸取代:
[0050]a)EU252、EU434 和 EU436 ；
[0051 ]b)EU252、EU307、EU311 和 EU434 ；
[0052]c)EU252、EU315 和 EU434 ；
[0053]d) EU252、EU308 和 EU434 ；
[0054]e)EU238、EU252 和 EU434 ；
[0055]f)EU252、EU434、EU307、EU311 和 EU436 ;和
[0056]g) EU252、EU387 和 EU434。
[0057][5] [4]的抗原結(jié)合分子，其中FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含:
[0058]a)EU252位上的酪氨酸、EU315位上的天冬氨酸和EU434位上的酪氨酸；或
[0059]b)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的異亮氨酸；或
[0060]c)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的亮氨酸；或
[0061]d)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或
[0062]e)EU252位上的酪氨酸、EU254位上的蘇氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的異亮氨酸。
[0063][6] [2]的抗原結(jié)合分子，其中FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在3個(gè)或更多個(gè)位置上包含氨基酸取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)位置是選自以下的組合之一:
[0064]a)EU252/EU434/EU307/EU311/EU286 ；
[0065]b)EU252/EU434/EU307/EU311/EU286/EU254 ；
[0066]c)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436 ；
[0067]d)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU254 ；
[0068]e)EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU250 ；
[0069]f)EU252/EU434/EU308/EU250 ；
[0070]g)EU252/EU434/EU308/EU250/EU436 ;和[0071 ] h)EU252/EU434/EU308/EU250/EU307/EU311。
[0072][7] [6]的抗原結(jié)合分子，其中FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含:
[0073]a)EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸和EU434位上的酪氨酸；或
[0074]b)EU252位上的酪氨酸、EU254位上的蘇氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸和EU434位上的酪氨酸；或
[0075]c)EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和436位上的異亮氨酸；或
[0076]d)EU252位上的酪氨酸、EU254位上的蘇氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的異亮氨酸；或
[0077]e)EU250位上的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU254位上的蘇氨酸、EU308位上的脯氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或
[0078]f)EU250位上的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或
[0079]g) EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或
[0080]h)EU250位上 的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU308位上的脯氨酸和EU434上的酪氨酸；或
[0081]i)EU250位上的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸和EU434的酪氨酸。
[0082][8] [2]的抗原結(jié)合分子，其中FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在3個(gè)或更多個(gè)位置上包含氨基酸取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)位置是選自以下的組合之一:
[0083]a) EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU286 ；
[0084]b) EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU250 和 EU308 ；
[0085]c) EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU250 和 EU286 和 EU308 ；
[0086]d) EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU250 和 EU286 和 EU308 和 EU428。
[0087][9] [8]的抗原結(jié)合分子，其中FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含:
[0088]a)EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或
[0089]b)EU250位上的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或
[0090]c)EU250位上的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或
[0091]d)EU250位上的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸。
[0092][10] [2]的抗原結(jié)合分子，其中FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在3個(gè)或更多個(gè)位置上包含氨基酸取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)位置是選自以下的組合之一:[0093]a) EU434 和 EU307 和 EU311 ;
[0094]b) EU434 和 EU307 和 EU309 和 EU311 ;或
[0095]c) EU434 和 EU250 和 EU252 和 EU436。
[0096][11] [10]的抗原結(jié)合分子，其中FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含:
[0097]a)EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的組氨酸和EU434位上的酪氨酸；或
[0098]b)EU307位上的谷氨酰胺、EU309位上的谷氨酸、EU311位上的丙氨酸和EU434位上的酪氨酸；或
[0099]c)EU307位上的谷氨酰胺、EU309位上的谷氨酸、EU311位上的組氨酸和EU434位上的酪氨酸；或
[0100]d)EU250位上的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸。
[0101][12][1]-[11]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中高分子量物類的比率小于2%。
[0102][13] [1]-[12 ]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合分子包含具有以下的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域:
[0103]a)在pH5.5-6.5下比在pH7_8下對(duì)抗原的結(jié)合活性低或
[0104]b)對(duì)抗原的“鈣濃度依賴性結(jié)合”活性。
[0105][14] [1]-[5]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子,其中所述結(jié)合分子在pH7下對(duì)FcRn的結(jié)合活性為50-150nM, Tm高于63.(TC，Epibase評(píng)分小于250。
[0106][15] [1]-[3]和[6]_[7]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子在pH7下對(duì)FcRn的結(jié)合活性為15-50nM，Tm高于60°C，Epibase評(píng)分小于500。
[0107][16] [1]-[3]和[8]_[9]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中在pH7下所述結(jié)合分子對(duì)FcRn的結(jié)合活性強(qiáng)于15nM，Tm高于57.5°C, Epibase評(píng)分小于500。
[0108][17] [1]-[3]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含以下氨基酸取代:
[0109]a)在EU238、EU255和/或EU258位上的氨基酸取代，和
[0110]b)在3個(gè)或更多個(gè)位置上的氨基酸取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)位置是表4-7提供的組合之一。
[0111][18] [1]-[17]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中
[0112]a)在FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的EU257位上，氨基酸不是選自以下的氨基酸:丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和蘇氨酸，和/或
[0113]b)在FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的EU252位上，氨基酸不是色氨酸。
[0114][19][1]-[18]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中抗原結(jié)合分子具有與包含完整FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的對(duì)照抗體的結(jié)合親和力相比不顯著提高的對(duì)預(yù)存抗藥抗體的結(jié)合活性。
[0115][20] [19]的抗原結(jié)合分子，其中FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域還在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上包含氨基酸取代:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0116][21] [20]的抗原結(jié)合分子，其中FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的氨基酸取代:
[0117]EU387位上的精氨酸，
[0118]EU422位上的谷氨酸、精氨酸或絲氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、蘇氨酸或谷氨酰胺；[0119]EU424位上的谷氨酸或精氨酸、賴氨酸或天冬酰胺；
[0120]EU426位上的天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸或酪氨酸；
[0121]EU433位上的天冬氨酸；
[0122]EU436位上的蘇氨酸；
[0123]EU438位上的谷氨酸、精氨酸、絲氨酸或賴氨酸；和
[0124]EU440位上的谷氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺。
[0125][22] [1]-[21]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)或更多個(gè)取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)取代是表12-13提供的組合之一。
[0126][23] [1]-[22]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)或更多個(gè)取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)取代是表14-15提供的組合之一。
[0127][24] [20]-[23]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含:
[0128]a)EU252位上的酪氨酸、EU387位上的精氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或
[0129]b)EU252位上的酪氨酸、EU422位上的谷氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或 [0130]c)EU252位上的酪氨酸、EU422位上的精氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或
[0131]d)EU252位上的酪氨酸、EU422位上的絲氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或
[0132]e)EU252位上的酪氨酸、EU424位上的谷氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或
[0133]f)EU252位上的酪氨酸、EU424位上的精氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或
[0134]g) EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的纈氨酸和EU438位上的谷氨酸；或
[0135]h) EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的纈氨酸和EU438位上的精氨酸；或
[0136]i)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的纈氨酸和EU438位上的絲氨酸；或
[0137]j)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的纈氨酸和EU440位上的谷氨酸。
[0138][25] [1]-[24]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合分子是抗體。
[0139][26] [1]-[25]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)抗原的攝入的用途。
[0140][27] [1]-[25]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子用于降低血漿特定抗原濃度的用途，其中所述抗原結(jié)合分子包含可結(jié)合所述抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0141][28] 一種用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動(dòng)力學(xué)的方法，所述方法包括在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上將氨基酸取代引入所述抗原結(jié)合分子的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的步驟:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
[0142][29] 一種用于延遲消除受試者中的抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上將氨基酸取代引入所述抗原結(jié)合分子的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的步驟:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
[0143][30] 一種延長(zhǎng)抗原結(jié)合分子的血漿滯留時(shí)間的方法，所述方法包括在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上將氨基酸取代引入所述抗原結(jié)合分子的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的步驟:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
[0144][31] 一種用于提高抗原結(jié)合分子的血漿抗原消除速率的方法，所述方法包括在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上將氨基酸取代引入所述抗原結(jié)合分子的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的步驟:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
[0145][32] 一種用于提高抗原結(jié)合分子消除血漿抗原的能力的方法，所述方法包括在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上將氨基酸取代引入所述抗原結(jié)合分子的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的步驟:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。 [0146][33] [28]-[32]中任一個(gè)的方法，其中將另外的氨基酸取代在EU256位上引入FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中。
[0147][34] [28]-[33]中任一個(gè)的方法，其中所述方法還包括在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上將氨基酸取代引入FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的步驟:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0148][35] 一種用于產(chǎn)生[1]_[25]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟:
[0149](a)選擇親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上引入氨基酸取代來改變所述親本 FcRn:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ；
[0150](b)選擇抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且改變抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸以得到PH依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或鈣離子依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
[0151](c)獲得編碼其中將(a)和(b)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接的抗原結(jié)合分子的基因，和
[0152](d)使用(C)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子。
[0153][36] [35]的方法，其中在步驟a)中將另外的氨基酸取代在EU256位上引入FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中。
[0154][37] [35]-[36]中任一個(gè)的方法,其中所述方法還包括在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上將氨基酸取代引入FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的步驟:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0155][38] 一種包含修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子,其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上包含氨基酸取代:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438和EU440，其中與包含完整FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子的結(jié)合親和力相比所述抗原結(jié)合分子對(duì)預(yù)存抗藥抗體(ADA)的結(jié)合親和力在中性pH下不顯著提高。
[0156][39] [38]的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合分子另外在中性或酸性pH范圍內(nèi)對(duì)FcRn的結(jié)合親和力提高。
[0157][40] [38]或[39]的抗原結(jié)合分子，其中取代一個(gè)或多個(gè)選自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440 的位置的氨基酸選自
[0158]a) EU387位上的精氨酸；
[0159]b)EU422位上的谷氨酸、精氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、蘇氨酸或谷氨酰胺；
[0160]c)EU424位上的谷氨酸、精氨酸、賴氨酸或天冬酰胺；
[0161]d)EU426位上的天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸或酪氨酸；
[0162]e) EU433位上的天冬氨酸
[0163]f)EU436位上的蘇氨酸
[0164]g)EU438位上的谷氨酸、精氨酸、絲氨酸或賴氨酸；和
[0165]h)EU440位上的谷氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺。
[0166][41] [38]-[40]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含表10提供的一個(gè)或多個(gè)位置或組合之一的氨基酸取代。
[0167][42] [38]-[40]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含表11提供的氨基酸取代或取代組合的任一個(gè)。
[0168][43] [39]-[42]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域還包含選自以下的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)位置上的氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU434 和EU436，其中所述取代使得FcRn結(jié)合活性在中性pH或酸性pH范圍內(nèi)增加。
[0169][44] [39]-[43]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在以下的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域位置上包含氨基酸取代:
[0170]i) a) EU438/EU440 或 b) EU424 ;和
[0171]ii)a) EU434, b) EU252/EU254/EU256 ；c) EU428/EU434 ;或 d) EU250/EU428。
[0172][45] [44]的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含以下氨基酸取代:
[0173]i) a) EU438R/EU440E 或 b) EU424N ;和
[0174]ii)a)M434H ；b)M252Y/S254T/T256E ；c)M428L/N434S ；或 d)T250Q 和 M428L(EU 編號(hào))。
[0175][46] [45]的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)取代是表13和15中提供的組合之一。
[0176][47] [39]-[42]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含以下位置的取代:
[0177]a)在選自 EU387、EU422、EU424、EU438、EU440、EU433 的一個(gè)或多個(gè)位置上或其中兩個(gè)位置是選自EU422/EU424和EU438/EU440的組合之一的兩個(gè)或更多個(gè)位置；和
[0178]b)其中兩個(gè)位置是表9提供的組合之一的兩個(gè)或更多個(gè)位置。
[0179][48] [47]的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代是表12或14提供的組合之一。
[0180][49] [39]-[48]中任一個(gè)的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合分子包含pH依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或鈣離子依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0181][50] 一種用于降低包含F(xiàn)cRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性的方法,所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在中性或酸性pH下對(duì)FcRn的結(jié)合活性提高且在中性pH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性提高，所述方法包括以下步驟:
[0182]a)提供具有在中性或酸性pH下對(duì)FcRn的結(jié)合活性提高且在中性pH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性提高的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子；和
[0183]b)在選自 EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440 的一個(gè)或多個(gè)位置上取代FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的氨基酸，得到具有修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子。
[0184][51] [50]的方法，其中步驟b)包括在3個(gè)或更多個(gè)位置上取代氨基酸，其中所述3個(gè)或更多個(gè)位置為表10提供的組合之一。
[0185][52] [50]的方法，其中步驟b)包括將3個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代引入FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，其中所述3個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代為表11提供的組合之一。
[0186][53] 一種用于增加單個(gè)抗原結(jié)合分子可結(jié)合的抗原總數(shù)而與親本抗體相比又不顯著提高在中性PH 下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性的方法，所述方法包括以下步驟:
[0187]a)提供包含親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，
[0188]b)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變步驟a)的親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ;和
[0189]c)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變步驟b)的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0190][54] 一種用于促進(jìn)以抗原結(jié)合的形式攝入細(xì)胞中的不含抗原的抗原結(jié)合分子在胞外釋放而與親本抗體相比又不顯著提高所述抗原結(jié)合分子在中性PH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性的方法，所述方法包括以下步驟:
[0191]a)提供包含親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，
[0192]b)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 和 EU428 ；和
[0193]c)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變步驟b)的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0194][55] 一種用于提高抗原結(jié)合分子消除血漿抗原的能力而與親本抗體相比又不顯著提高在中性PH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性的方法，所述方法包括以下步驟:
[0195]a)提供包含親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，
[0196]b)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 和 EU428 ；和
[0197]c)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變步驟b)的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0198][56] 一種用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動(dòng)力學(xué)而與親本抗體相比又不顯著提高在中性pH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性的方法，所述方法包括以下步驟:
[0199]a)提供包含親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，
[0200]b)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ;和
[0201]c)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變步驟b)的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0202][57] 一種用于降低血漿總抗原濃度或血漿游離抗原濃度而與親本抗體相比又不顯著提高在中性PH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性的方法，所述方法包括以下步驟:
[0203]a)提供包含親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合分子包含可結(jié)合所述抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，
[0204]b)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ;和
[0205]c)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變步驟b)的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
[0206][58] 一種用于產(chǎn)生包含在中性或酸性pH下對(duì)FcRn的結(jié)合活性提高且在中性pH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性降低的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟:
[0207](a)提供在中性或酸性pH范圍內(nèi)對(duì)FcRn的結(jié)合活性提高且在中性pH范圍內(nèi)對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性提高的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，
[0208](b)在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代氨基酸:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440，
[0209](C)選擇抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且改變抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸以得到PH依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或選擇鈣離子依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
[0210](d)獲得編碼其中將(a)和(b)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接的抗原結(jié)合分子的基因，和
[0211] (e)使用(C)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子，其中與具有完整FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親本抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域相比，所產(chǎn)生的所述抗原結(jié)合分子在中性或酸性PH下對(duì)FcRn的結(jié)合活性提高且在中性PH下對(duì)內(nèi)源ADA的結(jié)合活性降低。[0212][59] [58]的方法，其中在中性或酸性pH范圍內(nèi)對(duì)FcRn和預(yù)存ADA的結(jié)合活性提高且在中性PH范圍內(nèi)對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性提高的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上包含氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
[0213][60] [53]-[57]中任一個(gè)的方法，其中在步驟a)中引入的氨基酸取代位于3個(gè)或更多個(gè)位置，其中所述3個(gè)或更多個(gè)位置是表4-7提供的組合之一。
[0214][61] [53]-[60]中任一個(gè)的方法，其中在步驟b)中引入的氨基酸取代位于3個(gè)或更多個(gè)位置，其中所述3個(gè)或更多個(gè)位置為表10提供的組合之一。
[0215]附圖簡(jiǎn)述
[0216][圖1A]圖1A顯示現(xiàn)有技術(shù)的抗體(“常規(guī)抗體”)與具有增強(qiáng)的FcRn的pH依賴性抗原結(jié)合抗體相比從血漿中消除抗原的示意圖，所述兩種抗體在中性PH下均結(jié)合可溶性抗原。常規(guī)抗體與血漿中的抗原結(jié)合，并且被細(xì)胞非特異性地?cái)z入酸性內(nèi)體。在內(nèi)體的酸性條件下，常規(guī)抗體結(jié)合小囊泡內(nèi)的FcRn，并轉(zhuǎn)運(yùn)回到細(xì)胞表面，抗體在此再次釋放。在整個(gè)內(nèi)化和再循環(huán)過程期間抗原與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在中性PH下FcRn結(jié)合提高的pH依賴性抗原結(jié)合抗體與細(xì)胞表面上的FcRn結(jié)合，并快速內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)，因而以比常規(guī)抗體高的頻率內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)。在內(nèi)體的酸性條件下，抗原從修飾抗體上解離,并轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，在此被蛋白水解性降解。仍與FcRn結(jié)合的抗體再循環(huán)返回細(xì)胞表面。在此，再循環(huán)的游離抗體可再次與另一抗原結(jié)合。通過重復(fù)FcRn介導(dǎo)的攝取、抗原解離和降解及抗體再循環(huán)的這個(gè)循環(huán)，在中性pH下與FcRn的結(jié)合親和力提高的這種pH依賴性抗原結(jié)合抗體可比常規(guī)抗體遞送顯著較多量的抗原至溶酶體，因此與常規(guī)抗體相比，可更顯著地降低血漿總抗原濃度。
[0217][圖1B]圖1B顯示內(nèi)體中可溶性抗原從具有pH依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的IgG抗體中解離的圖示。這導(dǎo)致抗原消除增加，并允許抗體與血漿中的另一抗原結(jié)合。
[0218][圖2]圖2顯示包含F(xiàn)e變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力(x軸)和y軸上的Tm的示圖(Fe變體F1-F599:空心正方形；Fc變體F600-F1052:實(shí)心正方形)。
[0219][圖3]圖3顯示包含F(xiàn)e變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力(x軸)和高分子量(HMW)部分(以％表示)(y軸)的示圖(Fe變體F1-F599:空心正方形，F(xiàn)e變體F600-F1050:實(shí)心正方形)。
[0220][圖4]圖4顯示包含F(xiàn)e變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力(x軸)和免疫原性評(píng)分(Epibase評(píng)分)的示圖(Fe變體F1-F599:空心正方形，F(xiàn)e變體F600-F1052:實(shí)心正方形)。
[0221][圖5]圖5顯示包含其hFcRn結(jié)合親和力強(qiáng)于15nM的Fe變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力(X軸)和熔解溫度Tm(y軸)的示圖(其Kd小于或等于15nM的F1-F599的Fe變體:空心正方形，其Kd小于或等于15nM的F600-F1052的Fe變體(第I組):實(shí)心正方形)。
[0222][圖6]圖6顯示包含其hFcRn結(jié)合親和力強(qiáng)于15nM的Fe變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力(X軸)和HMW(以％表示)(y軸)的示圖(其Kd小于或等于15nM的F1-F599的Fe變體:空心正方形；其Kd小于或等于15nM的F600-F1052的Fe變體(第I組):實(shí)心正方形)。[0223][圖7]圖7顯示包含其hFcRn結(jié)合親和力強(qiáng)于15nM的Fe變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力和免疫原性評(píng)分的示圖(其Kd小于或等于15nM的F1-F599的Fe變體:空心正方形；其Kd小于或等于15nM的F600-F1052的Fe變體(第I組):實(shí)心正方形)。
[0224][圖8]圖8顯示包含其hFcRn結(jié)合親和力介于15nM和50nM之間的Fe變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力和Tm的示圖(其Kd= 15_50nM的F1-F599的Fe變體，空心正方形；其Kd = 15-50nM的F600-F1052的Fe變體(第2組):實(shí)心正方形)
[0225][圖9]圖9顯示包含其hFcRn結(jié)合親和力介于15nM和50nM之間的Fe變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力和HMW(% )的示圖(其Kd = 15_50nM的F1-F599的Fe變體，空心正方形；其Kd = 15-50nM的F600-F1052的Fe變體(第2組):實(shí)心正方形)。
[0226][圖10]圖10顯示包含其hFcRn結(jié)合親和力介于15nM和50nM之間的Fe變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力和免疫原性評(píng)分的示圖(其Kd = 15-50nM的F1-F599的Fe變體，空心正方形；其Kd = 15-50nM的F600-F1052的Fe變體(第2組):實(shí)心正方形)。
[0227][圖11]圖11顯示包含其hFcRn結(jié)合親和力介于50nM和150nM之間的Fe變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力和Tm的示圖(其Kd = 50_150nM的F1-F599的Fe變體，空心正方形；其Kd = 50-150nM的F600-F1052的Fe變體(第3組):實(shí)心正方形)。
[0228][圖12]圖12顯示包含其hFcRn結(jié)合親和力介于50nM和150nM的Fe變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力和HMW (% )的示圖(其Kd = 50_150nM的F1-F599的Fe變體，空心正方形；其Kd = 50-150nM之間的F600-F1052的Fe變體(第3組):實(shí)心正方形)。
[0229][圖13]圖13顯示包 含其hFcRn結(jié)合親和力介于50nM和150nM之間的Fe變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力和免疫原性評(píng)分的示圖(其Kd = 50-150nM的F1-F599的Fe變體:空心正方形；其Kd = 50-150nM的F600-F1052的Fe變體(第3組):實(shí)心正方形)。
[0230][圖14]圖14顯示包含其hFcRn結(jié)合親和力介于150nM和700nM之間的Fe變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力和Tm的示圖(其Kd = 150_700nM的F1-F599的Fe變體，空心正方形；其Kd = 150-700nM的Fe變體F600-F1052 (第4組):實(shí)心正方形)。
[0231][圖15]圖15顯示包含其hFcRn結(jié)合親和力介于150nM和700nM之間的Fe變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力和HMW(% )的示圖(其Kd = 150_700nM的F1-F599的Fe變體:空心正方形；其Kd = 150-700nM的F600-F1052的Fe變體(第4組):實(shí)心正方形)。
[0232][圖16]圖16顯示包含其hFcRn結(jié)合親和力介于150nM和700nM之間的Fe變體的抗體的hFcRn結(jié)合親和力和免疫原性評(píng)分的示圖(其Kd = 150-700nM的F1-F599的Fe變體:空心正方形；其Kd = 150-700nM的F600-F1052的Fe變體(第4組):實(shí)心正方形)。
[0233][圖17]圖 17 顯示在注射 Fv4-1gGl、Fv4-F652、Fv4-F890 和 Fv4-F946 后的人 FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中和在對(duì)照小鼠(無抗體注射)中隨時(shí)間推移的血漿抗原(hsIL-6R)濃度的示圖。
[0234][圖18]圖 18 顯示在注射 Fv4-1gGl、Fv4-F652、Fv4-F890 和 Fv4-F946 后在人 FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中隨時(shí)間推移的血漿抗體濃度的示圖。
[0235][圖19]圖19顯示在對(duì)照(無抗體注射)和在注射Fv4-1gGl、Fv4-Fll和Fv4-F652后的人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中隨時(shí)間推移的血漿抗原(hsIL-6R)濃度的示圖。
[0236][圖20]圖20顯示在注射Fv4-1gGl、Fv4-Fll和Fv4_F652后在人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中隨時(shí)間推移的血漿抗體濃度的示圖。[0237][圖21]圖21顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)人源化抗IL_6受體抗體Fv4-1gGl (圖21-1)、其YTE變體(圖21_2)和LS變體(圖21_3)的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。
[0238][圖22]圖22顯示來自15名RA患者的血清針對(duì)人源化抗IL_6受體抗體Fv4-1gGl (圖 22-1)、Fv4-N434H(圖 22-2)、Fv4_Fll (圖 22-3)、Fv4_F68 (圖 22-4),Fv4-890 (圖22-5)和Fv4_F947 (圖22-6)的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。
[0239][圖23]圖23顯示圖22所示的來自15名RA患者的血清針對(duì)Fv4-1gGl、Fv4_Fll、Fv4-F68、Fv4-F890和Fv4_F947的ECL反應(yīng)的平均值(圖23_1)、幾何平均值(圖23_2)和中位值(圖23-3)。
[0240][圖24]圖24顯示來自15名RA患者的血清針對(duì)人源化抗IL_6受體抗體Fv4-1gGl (圖 24-1)和變體 Fv4_F890、Fv4_F1058、Fv4_F1059、Fv4_F1060、Fv4_F1061、Fv4-F1062、Fv4-F1063、Fv4_F1064、Fv4_F1065、Fv4_F1066、Fv4_F1067、Fv4_F1068、Fv4-F1069、Fv4-F1070、Fv4_F1071、Fv4_F1072 和 Fv4_F1073(圖 24-2 至圖 24-18)的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。
[0241][圖25]圖25顯示圖24所示的來自15名RA患者的血清針對(duì)Fv4_IgGl、變體 Fv4-F890、Fv4-F1058、Fv4_F1059、Fv4_F1060、Fv4_F1061、Fv4_F1062、Fv4_F1063、Fv4-F1064、Fv4-F1065、Fv4_F1066、Fv4_F1067、Fv4_F1068、Fv4_F1069、Fv4_F1070、Fv4-F1071、Fv4-F1072和Fv4-F1073的ECL反應(yīng)的平均值(圖25-1)、幾何平均值(圖25-2)和中位值(圖25-3)。
[0242][圖26]圖26顯示來自15名RA患者的血清針對(duì)變體Fv4_F1104、Fv4_F1105和Fv4-F1106的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。
[0243][圖27]圖27顯示來自15名RA患者的血清針對(duì)變體Fv4_F1107、Fv4_F1108、Fv4-F1109、Fv4-F1110、Fv4_Fllll、Fv4_F1112、Fv4_F1113 和 Fv4_F1114(圖 27—1 至圖27-8)的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。
[0244][圖28]圖28顯示來自15名RA患者的血清針對(duì)變體Fv4_F1230(圖28-1)、Fv4-F1231(圖28-2)、Fv4-F1232(圖28-3)的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。
[0245][圖29]圖29顯示來自15名RA患者的血清針對(duì)變體Fv4_F947、Fv4_F1119、Fv4-F1120、Fv4-F1121、Fv4-F1122、Fv4-F1123 和 Fv4-F1124 的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。
[0246][圖30]圖30-1至圖30_4顯示來自15名RA患者的血清針對(duì)變體Fv4_F939、Fv4-F1291、Fv4-F1268和Fv4_F1269的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。圖30-5至圖30-9顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體Fv4-F1243、Fv4_F1245、Fv4_F1321、Fv4_F1340和Fv4-F1323的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。
[0247][圖31]圖31顯示來自15名RA患者的血清針對(duì)變體Fv4_F890(圖31-1)和Fv4-F1115( = F890+S424N,圖31-2)的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。
[0248][圖32]圖32顯示來自15或30名RA患者的血清針對(duì)變體Fv4_YTE(圖32-1)、Fv4-F1166( = YTE+Q438R/S440E,圖 32-2), Fv4_F1167( = YTE+S424N,圖 32-3),Fv4-LS (圖 32-4)、Fv4-Fl 170 ( = LS+Q438R/S440E,圖 32-5)、Fv4_Fl 171 (LS+S424N，圖32-6)、Fv4-N434H(圖 32-7)、Fv4_Fl 172 ( = N434H+Q438R/S440E,圖 32-8)、Fv4_Fl 173 (=N434H+S424N，圖32-9)的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。
[0249][圖33]圖33顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體Fv4_LS、Fv4_F1380(圖
33-2)、Fv4-F1384(圖 33-3)、Fv4_F1385 (圖 33-4)、Fv4_F1386 (LS+S426Y，圖 33-5),Fv4-F1388(圖 33-6)和 Fv4_F1389 (LS+Y436T，圖 33-7)的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。
[0250][圖34]圖34顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F939的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。
[0251][圖35]圖35顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1378的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。
[0252][圖36]圖36顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1379的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖。
[0253][圖37]圖37顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1262的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0254][圖38]圖38顯示來自 30名RA患者的血清針對(duì)變體Fl138的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0255][圖39]圖39顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1344的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0256][圖40]圖40顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1349的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0257][圖41]圖41顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1350的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0258][圖42]圖42顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1351的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0259][圖43]圖43顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1261的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0260][圖44]圖44顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1263的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0261][圖45]圖45顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1305的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0262][圖46]圖46顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1306的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0263][圖47]圖47顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1268的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0264][圖48]圖48顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1269的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0265][圖49]圖49顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1413的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0266][圖50]圖50顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1416的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0267][圖51]圖51顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1419的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0268][圖52]圖52顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1420的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0269][圖53]圖53顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1370的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0270][圖54]圖54顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1371的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0271][圖55]圖55顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1599的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0272][圖56]圖56顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1600的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0273][圖57]圖57顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1566的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0274][圖58]圖58顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1448的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0275][圖59]圖59 顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1601的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0276][圖60]圖60顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1602的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0277][圖61]圖61顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1603的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0278][圖62]圖62顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1531的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0279][圖63]圖63顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1604的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0280][圖64]圖64顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1605的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0281][圖65]圖65顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1586的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0282][圖66]圖66顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1592的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0283][圖67]圖67顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1610的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0284][圖68]圖68顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1611的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0285][圖69]圖69顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1612的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0286][圖70]圖70顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1613的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖[0287][圖71]圖71顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1614的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0288][圖72]圖72顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1615的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0289][圖73]圖73顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1567的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0290][圖74]圖74顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1572的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0291][圖75]圖75顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1576的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0292][圖76]圖76顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1578的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0293][圖77]圖77顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1579的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0294][圖78]圖78顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1641的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0295][圖79]圖79顯 示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1642的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0296][圖80]圖80顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1643的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0297][圖81]圖81顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1644的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0298][圖82]圖82顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1645的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0299][圖83]圖83顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1646的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0300][圖84]圖84顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1647的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0301][圖85]圖85顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1648的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0302][圖86]圖86顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1649的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0303][圖87]圖87顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1650的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0304][圖88]圖88顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1651的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0305][圖89]圖89顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1652的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0306][圖90]圖90顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1653的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0307][圖91]圖91顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1654的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0308][圖92]圖92顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1655的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0309][圖93]圖93顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1329的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0310][圖94]圖94顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1331的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0311][圖95]圖95顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1718的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0312][圖96]圖96顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1719的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0313][圖97]圖97顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1720的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0314][圖98]圖98顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1721的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0315][圖99]圖99顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1671的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0316][圖100]圖100顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1670的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0317][圖101]圖101顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1711的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0318][圖102]圖102顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1712的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0319][圖103]圖103顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1713的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0320][圖104]圖104顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1722的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0321][圖105]圖105顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1723的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0322][圖106]圖106顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1724的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0323][圖107]圖107顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1725的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0324][圖108]圖108顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1675的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0325] [圖109]圖109顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1714的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖[0326][圖110]圖110顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1715的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0327][圖111]圖111顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1716的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0328][圖112]圖112顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1717的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0329][圖113]圖113顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1683的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0330][圖114]圖114顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1756的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0331][圖115]圖115顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1757的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0332][圖116]圖116顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1758的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0333][圖117]圖117顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1759的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0334][圖118]圖118顯 示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1681的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0335][圖119]圖119顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1749的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0336][圖120]圖120顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1750的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0337][圖121]圖121顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1751的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0338][圖122]圖122顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1760的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0339][圖123]圖123顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1761的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0340][圖124]圖124顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1762的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0341][圖125]圖125顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1763的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0342][圖126]圖126顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1752的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0343][圖127]圖127顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1753的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0344][圖128]圖128顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1754的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0345][圖129]圖129顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1755的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0346][圖130]圖130顯示來自30名RA患者的血清針對(duì)變體F1685的電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)的示圖
[0347][圖131]圖 131 顯示在注射 Fv4_IgGl、Fv4_F1243 和 Fv4_F1245 后在人 FcRn 轉(zhuǎn)基因小鼠中隨時(shí)間推移的血漿抗體濃度的示圖。
[0348][圖132]圖 132 顯示在注射 Fv4-1gGl、Fv4-F1243 和 Fv4-F1245 后的人 FcRn 轉(zhuǎn)基因小鼠中和在對(duì)照小鼠(無抗體注射)中隨時(shí)間推移的血漿抗原(hsIL-6R)濃度的示圖。
[0349][圖133]圖133顯示在注射Fv4_IgGl、Fv4_F1389后在人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中隨時(shí)間推移的血漿抗體濃度的示圖。
[0350][圖134]圖134顯示SPR分析的傳感圖。在不同條件(pH、Ca濃度)下，對(duì)抗hlgA抗體的hlgA結(jié)合進(jìn)行了分析。
[0351][圖135]圖135顯示在注射GA2-F760和GA2-F1331后在人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中隨時(shí)間推移的血漿抗體濃度的示圖。
[0352][圖136]圖136顯示在注射GA2-F760和GA2-F1331后在人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中隨時(shí)間推移的血漿hlgA濃度的示圖。
[0353][圖137]圖137顯示在注射278-F760和278-F1331后在人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中隨時(shí)間推移的血漿抗體濃度的示圖。
[0354][圖138]圖138顯示在注射278-F760和278-F1331后在人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠中隨時(shí)間推移的血漿hIgE(Asp6)濃度的示圖。
[0355]實(shí)施方案的描述
[0356]發(fā)明詳述
[0357]在描述本發(fā)明的材料與方法之前，應(yīng)了解這些描述只是說明性的，并無意是限制性的。還應(yīng)了解本發(fā)明不限于本文描述的特定的大小、形狀、尺寸、材料、方法、方案等，因?yàn)檫@些可按照例行實(shí)驗(yàn)和/或優(yōu)化改變。本說明書中所用術(shù)語只用于描述具體形式或?qū)嵤┓桨傅哪康?，并無意限制僅受隨附權(quán)利要求書限制的本發(fā)明的范圍。除非另有說明，否則本文所用全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。在有沖突的情況下，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。
[0358]本說明書中提及的各出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)的公開內(nèi)容通過引用以其整體明確結(jié)合到本文中。然而，本文無一內(nèi)容應(yīng)被解釋為承認(rèn)本發(fā)明無資格通過先前發(fā)明先于這類公開內(nèi)容。
[0359]本文所用措詞“一個(gè)”、“一種”和“所述”意指“至少一個(gè)”，除非另有明確說明。
[0360]描述于W0/2011/122011的研究表明在pH7.4下與FcRn的結(jié)合提高的抗原結(jié)合分子(例如抗IL6受體抗體)能夠從血漿消除抗原，并降低血漿總抗原濃度。因此，可通過pH依賴性抗原結(jié)合(在PH7.4下與血漿中的抗原結(jié)合，在pH6.0下在酸性內(nèi)體內(nèi)解離抗原)或通過離子化鈣濃度依 賴性抗原結(jié)合(在高離子化鈣濃度下與血漿內(nèi)的抗原結(jié)合，在低離子化鈣濃度下在內(nèi)體內(nèi)解離抗原)改進(jìn)抗原消除的效率(參見圖1B)。圖1A中顯示了通過與常規(guī)抗體相比在中性pH下與FcRn的結(jié)合親和力改進(jìn)的pH依賴性抗原結(jié)合抗體從血衆(zhòng)中消除抗原的機(jī)制。
[0361 ] 本發(fā)明提供FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的新的氨基酸取代，其提高抗原結(jié)合分子在酸性和中性pH范圍內(nèi)的FcRn結(jié)合活性，其中在中性pH范圍內(nèi)的FcRn結(jié)合活性強(qiáng)于完整IgG或包含完整FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子的FcRn結(jié)合活性(例如強(qiáng)于3200nM)。修飾的抗原結(jié)合分子在給予后可降低血漿總抗原濃度超過包含除完整人IgGFcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域以外相同抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的對(duì)照抗原結(jié)合分子。
[0362]Fe受體是免疫細(xì)胞(例如天然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞)表面上的蛋白質(zhì)。它們與抗體的Fe (可結(jié)晶片段)區(qū)結(jié)合，所述Fe區(qū)與被感染細(xì)胞或侵入性病原體連接，并通過抗體介導(dǎo)的吞噬作用或依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)毒性，刺激吞噬細(xì)胞或細(xì)胞毒性細(xì)胞消滅微生物或感染細(xì)胞。
[0363]有幾種不同類型的Fe受體，根據(jù)它們識(shí)別的抗體的類型對(duì)其分類。本文的術(shù)語“FcRn”是指結(jié)合IgG的新生兒Fe受體，在構(gòu)上與MHCI類蛋白類似，在人中由FCGRT基因編碼。
[0364]本文所用術(shù)語“FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指直接或間接與FcRn結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選FcRn為哺乳動(dòng)物FcRn，更優(yōu)選為人FcRn。與FcRn直接結(jié)合的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗體Fe區(qū)。同時(shí)，能夠與具有人FcRn結(jié)合活性的多肽(例如白蛋白或IgG)結(jié)合的區(qū)域，可通過白蛋白、IgG等與人FcRn間接結(jié)合。因此,這類人FcRn結(jié)合區(qū)可以是與具有人FcRn結(jié)合活性的多肽結(jié)合的區(qū)域。
[0365]本文所用術(shù)語“Fe區(qū)”或“抗原結(jié)合分子的Fe區(qū)”是指與FcRn、優(yōu)選與哺乳動(dòng)物FcRn、更優(yōu)選與人FcRn直接結(jié)合的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。具體地講,Fe區(qū)是抗體的Fe區(qū)。優(yōu)選Fe區(qū)是哺乳動(dòng)物Fe區(qū)，更優(yōu)選是人Fe區(qū)。具體地講，本發(fā)明的Fe區(qū)是包含人免疫球蛋白的第2和第3恒定結(jié)構(gòu)域(CH2和CH3)，更優(yōu)選包含鉸鏈、CH2和CH3的Fe區(qū)。優(yōu)選免疫球蛋白是IgG。優(yōu)選F e區(qū)是人IgGl的Fe區(qū)。
[0366]本發(fā)明提供具有修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其中與具有完整FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子相比，所述抗原結(jié)合分子在中性PH范圍內(nèi)的FcRn結(jié)合活性提聞。
[0367]具體地講，本發(fā)明提供具有修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上在FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中具有氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434和EU436。本發(fā)明的抗原結(jié)合分子還可在另外的位置上包含取代。例如，除上述提及的一個(gè)或多個(gè)位置上的取代以外，抗原結(jié)合分子可包含EU256位上的取代。優(yōu)選EU256位上的氨基酸被谷氨酸取代。
[0368]術(shù)語“結(jié)合親和力”或“結(jié)合活性”是指兩種物質(zhì)間非共價(jià)相互作用的強(qiáng)度，通過兩種物質(zhì)所形成的復(fù)合物的解離常數(shù)(KD)測(cè)量，除非另有明確定義。對(duì)特定靶分子(例如FcRn)，結(jié)合蛋白(或“配體”)可具有例如小于lO'lO'lO—7或KT8M的KD。在第一 pH范圍內(nèi)結(jié)合靶的數(shù)值KD小于在第二 pH范圍內(nèi)結(jié)合靶的數(shù)值KD可表明相對(duì)于在第二 pH范圍內(nèi)配體與靶的結(jié)合，在第一 pH范圍內(nèi)結(jié)合配體與靶的結(jié)合親和力較高。結(jié)合親和力的差異可為至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、50、70、80、100、500或1000倍。結(jié)合親和力可通過各種方法測(cè)定，包括表面等離子體共振、平衡透析、平衡結(jié)合、凝膠過濾、ELISA或光譜法(例如采用熒光測(cè)定法)。
[0369]在某一 pH范圍內(nèi)FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)cRn的結(jié)合親和力提高相當(dāng)于與針對(duì)完整FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域所測(cè)量的FcRn結(jié)合親和力相比，所測(cè)量的FcRn結(jié)合親和力提高。KD (完整)的結(jié)合親和力/KD(變體)的結(jié)合親和力的差異為至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、50、70、80、100、500或1000倍。FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)cRn的結(jié)合親和力的提高可在酸性或中性pH范圍內(nèi)。
[0370]術(shù)語“包含完整FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子”是指包含未修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子。本文所用術(shù)語“完整IgGFcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指人IgG的未修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。具體地講,FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域是完整人IgG的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選完整FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域是完整Fe區(qū)。術(shù)語“包含完整Fe區(qū)的抗體”是指包含未修飾的Fe區(qū)的抗體。未修飾的Fe區(qū)來源于其中的抗體優(yōu)選為IgG。更優(yōu)選其為人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4，還更優(yōu)選為人IgGl。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含完整Fe區(qū)的抗體是包含未修飾的Fe區(qū)的抗體。包含完整Fe區(qū)的抗體可以是完整人IgG。
[0371]本文所用術(shù)語“完整IgG”是指未修飾的IgG，并且不限于IgG的特定類別。這意味著人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4或其同種異型變體可用作“完整人IgG”，只要它可在酸性pH范圍內(nèi)與人FcRn結(jié)合。優(yōu)選“完整IgG”是人IgGl。優(yōu)選完整IgG是包含野生型Fe區(qū)的IgG0 [0372]在本發(fā)明的情況下，在中性pH范圍內(nèi)抗原結(jié)合分子提高的FcRn結(jié)合活性優(yōu)選強(qiáng)于KD3.2微摩爾。優(yōu)選在中性pH范圍內(nèi)提高的FcRn結(jié)合活性強(qiáng)于700納摩爾，更優(yōu)選強(qiáng)于500納摩爾，最優(yōu)選強(qiáng)于150納摩爾。
[0373]在酸性pH范圍內(nèi)提高的本發(fā)明抗原結(jié)合分子的FcRn結(jié)合活性一般是完整IgG的FcRn結(jié)合活性約2倍-約100倍范圍的FcRn結(jié)合活性。優(yōu)選在酸性pH范圍內(nèi)提高的抗原結(jié)合分子的FcRn結(jié)合活性為完整IgG的FcRn結(jié)合活性的至少10倍。更優(yōu)選在酸性pH范圍內(nèi)提高的本發(fā)明抗原結(jié)合分子的FcRn結(jié)合活性是完整IgG的FcRn結(jié)合活性的至少20倍。
[0374]本文所用術(shù)語“中性pH范圍”和“中性pH”通常是指ρΗ6.7-ρΗΙΟ.0，優(yōu)選ρΗ7.0-ρΗ8.0 內(nèi)的任何 pH 值，其實(shí)例包括 ρΗ7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0。特別優(yōu)選的酸性pH值為pH7.4，其接近體內(nèi)血漿(血液)pH。
[0375]本文所用術(shù)語“酸性pH范圍”和“酸性pH”通常是指pH4.0_pH6.5，優(yōu)選ρΗ5.5-ρΗ6.5 內(nèi)的任何 pH 值，其實(shí)例包括 ρΗ5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4和6.5。特別優(yōu)選的酸性pH值的范圍為ρΗ5.8-ρΗ6.0，其接近體內(nèi)早期內(nèi)體的pH。
[0376]有關(guān)本申請(qǐng)的氨基酸位置例如“EU387”或“位置387”，除非另有說明，否則按照稱為 EU 編號(hào)系統(tǒng)(Kabat, E.A.，T.T.Wu, H.M.Perry, K.S.Gottesman, C.Foeler.1991.Sequences of Proteins of Immunological Interest.N0.91-3242U.S.Public HealthServices, National Institutes of Health, Bethesda)的方案編號(hào)，并且是指FcRn 結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，特別是Fe區(qū)中的位置。以類似方式，取代用例如“EU387R”或“EU440E”表示，其中在“EU”之后給出的數(shù)字表明按照EU編號(hào)的取代的位置，數(shù)字后的字母是以一字母代碼給出的取代的氨基酸。取代也可寫為(氨基酸I)-位置_(氨基酸2)，其中第一氨基酸是被取代的氨基酸，第二氨基酸是在規(guī)定位置上的取代氨基酸。
[0377]本文所用術(shù)語“取代”和“氨基酸的取代”是指氨基酸序列中的氨基酸被另一個(gè)氨基酸置換，其中后者不同于被置換的氨基酸。用于置換氨基酸的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括但不限于編碼氨基酸序列的核苷酸序列的突變。
[0378]更具體地講，F(xiàn)cRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中氨基酸的取代是指關(guān)于親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的氨基酸置換。本發(fā)明的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域還包括已具有所需取代的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0379]親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有以下位置的氨基酸和在中性pH下對(duì)FcRn無親和力或親和力低(弱于3200nM)的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU238位上的脯氨酸、EU250位上的蘇氨酸、EU252位上的甲硫氨酸、EU254位上的絲氨酸、EU255位上的精氨酸、EU256位上的蘇氨酸、EU258位上的谷氨酸、EU286位上的天冬酰胺、EU307位上的蘇氨酸、EU308位上的纈氨酸、EU309位上的亮氨酸、EU311位上的谷氨酰胺、EU315位上的天冬酰胺、EU387位上脯氨酸、EU422位上的纈氨酸、EU424位上的絲氨酸、EU426位上的絲氨酸、EU428位上的甲硫氨酸、EU433位上的組氨酸、EU434位上的天冬酰胺、EU436位上的酪氨酸、EU438位上的谷氨酰胺和EU440位上的絲氨酸。親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包含其它位置的取代，但優(yōu)選親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域是未修飾的。優(yōu)選親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域是Fe區(qū)(親本Fe區(qū))。優(yōu)選親本Fe區(qū)來源于哺乳動(dòng)物抗體；更優(yōu)選親本Fe區(qū)是人抗體的Fe區(qū)。人抗體的Fe區(qū)在本文稱為人Fe區(qū)。
[0380]親本Fe區(qū)優(yōu)選為完整Fe區(qū)，更優(yōu)選人完整Fe區(qū)。優(yōu)選親本Fe區(qū)為IgG的Fe區(qū)，更優(yōu)選為人IgG的Fe區(qū)。甚至更優(yōu)選親本Fe區(qū)為包含野生型鉸鏈、野生型CH2和野生型CH3結(jié)構(gòu)域的人Fe區(qū)。在本發(fā)明的情況下，術(shù)語親本抗體是指包含親本Fe區(qū)的抗體。
[0381]親本抗原結(jié)合分子包括但不限于受體蛋白(膜結(jié)合受體和可溶性受體)、識(shí)別膜抗原(例如細(xì)胞表面標(biāo)志物)的抗體和識(shí)別可溶性抗原(例如細(xì)胞因子)的抗體。 [0382]本文所用術(shù)語“親本抗原結(jié)合分子”是指具有親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子。“親本抗原結(jié)合分子”的來源不受限制，可獲自非人動(dòng)物或人的任何生物。優(yōu)選生物選自小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、沙鼠(gerbil)、貓、兔、狗、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，“親本抗原結(jié)合分子”也可獲自食蟹猴(cynomologus monkey) >狨猴、獼猴、黑猩猩或人。親本IgG可以是天然存在的IgG或天然存在的IgG的變體或工程改造形式。親本IgG可指多肽本身、包含親本IgG的組合物或編碼親本IgG的氨基酸序列。要注意，“親本IgG”包括下文概述的已知市售的重組產(chǎn)生的IgG。優(yōu)選“親本IgG”獲自人IgGl,但不限于IgG的具體亞類。這意味著人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4可適當(dāng)?shù)赜米鳌坝H本IgG”。類似地，上述任何生物的IgG的任何亞類可優(yōu)選用作“親本IgG”。天然存在的IgG的變體或工程改造形式的實(shí)例描述于Curr Opin Biotechnol.2009年12月；20(6):685-91 ；Curr Opin Immunol.2008 年 8 月；20(4):460-70 ；Protein Eng Des Sel.2010 年 4 月；
23(4): 195-202 ;TO2009/086320、W02008/092117、W02007/041635 和 W02006/105338,但不限于這些。
[0383]本發(fā)明的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Fe區(qū)可在兩個(gè)或更多個(gè)位置包含取代，這在本文稱為取代的“組合”。例如由組合“EU424/EU434/EU436”限定的Fe區(qū)是包含在EU424、EU434和EU436位上的取代的Fe區(qū)。
[0384]取代氨基酸(親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的氨基酸被該氨基酸取代)可以是任何氨基酸，除非文中明確說明，包括但不限于:丙氨酸(Ala,A)、精氨酸(arg,R)、天冬酰胺(asn,N)、天冬氨酸(asp,D)、半胱氨酸(cys,C)、谷氨酸(glu,E)、谷氨酰胺(gln,Q)、甘氨酸(gly,G)、組氨酸(his，H)、異亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、賴氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，Μ)、苯丙氨酸(phe, F)、脯氨酸(pro, P)、絲氨酸(ser, S)、蘇氨酸(thr, T)、色氨酸(trp,W)、酪氨酸(tyr, Y)和纈氨酸(val, V)。優(yōu)選 EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438和EU440位中的任一個(gè)處的取代氨基酸選自:丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(arg，R)、谷氨酸(glu, E)、谷氨酰胺(gin, Q)、天冬氨酸(asp, D)、絲氨酸(ser, S)、蘇氨酸(thr, T)、酪氨酸(tyr, Y)和賴氨酸(lys, K)。
[0385]本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子具有修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含在以下位置上用不同于被取代氨基酸的氨基酸的氨基酸取代:
[0386]a)在 EU252 和 EU434 位上，和
[0387]b)在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
[0388]取代氨基酸可以是任何氨基酸，除非文中明確說明。EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 位上的優(yōu)選的取代氨基酸見表1。
[0389][表 I]
[0390]優(yōu)選的取代氨基酸
【權(quán)利要求】
1.一種包含修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上包含氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436，其中數(shù)字表明按照EU編號(hào)的取代的位置。
2.權(quán)利要求1的抗原結(jié)合分子，其中所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有 a)在EU252和EU434位上的氨基酸的氨基酸取代；和 b)在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上的氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU387、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434和 EU436。
3.權(quán)利要求1或2的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含: EU238位上的天冬氨酸， EU250位上的纈氨酸， EU252位上的酪氨酸， EU254位上的蘇氨酸， EU255位上的亮氨酸， EU256位上的谷氨酸， EU258位上的天冬氨酸或異亮氨酸， EU286位上的谷氨酸， EU307位上的谷氨酰胺， EU308位上的脯氨酸， EU309位上的谷氨酸， EU311位上的丙氨酸或組氨酸， EU315位上的天冬氨酸， EU428位上的異亮氨酸， EU433位上的丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸、精氨酸或絲氨酸， EU434位上的酪氨酸或色氨酸，和/或 EU436位上的異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸或苯丙氨酸。
4.權(quán)利要求2的抗原結(jié)合分子，其中所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置組合上的氨基酸的氨基酸取代:
a)EU252、EU434 和 EU436 ;
b)EU252、EU307、EU311和 EU434 ;
c)EU252、EU315 和 EU434 ;
d)EU252、EU308 和 EU434;
e)EU238、EU252 和 EU434 ;
f)EU252、EU434、EU307、EU311 和 EU436 ;和
g)EU252、EU387 和 EU434。
5.權(quán)利要求4的抗原結(jié)合分子，其中所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含: a)EU252位上的酪氨酸、EU315位上的天冬氨酸和EU434位上的酪氨酸；或 b)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的異亮氨酸；或c)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的亮氨酸；或 d)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或e)EU252位上的酪氨酸、EU254位上的蘇氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的異亮氨酸。
6.權(quán)利要求2的抗原結(jié)合分子，其中所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在3個(gè)或更多個(gè)位置上包含氨基酸取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)位置是選自以下的組合之一:
a)EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU286 ；
b)EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU286 / EU254 ；
c)EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU436 ；
d)EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU436 / EU254 ；
e)EU252 / EU434 / EU307 / EU311 / EU436 / EU250 ；
f)EU252 / EU434 / EU308 / EU250 ；
g)EU252 / EU434 / EU308 / EU250 / EU436 ;和
h)EU252 / EU434 / EU308 / EU250 / EU307 / EU311。
7.權(quán)利要求6的抗原結(jié)合分子，其中所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含: a)EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸和EU434位上的酪氨酸；或 b)EU252位上的酪氨酸、EU254位上的蘇氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸和EU434位上的酪氨酸；或 c)EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和436位上的異亮氨酸；或 d)EU252位上的酪氨酸、EU254位上的蘇氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的異亮氨酸；或 e)EU250位上的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU254位上的蘇氨酸、EU308位上的脯氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或 f)EU250位上的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或 g)EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或 h)EU250位上的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU308位上的脯氨酸和EU434位上的酪氨酸；或 i)EU250位上的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸和EU434的酪氨酸。
8.權(quán)利要求2的抗原結(jié)合分子，其中所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在3個(gè)或更多個(gè)位置上包含氨基酸取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)位置是選自以下的組合之一:
a)EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU286 ；
b)EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU250 和 EU308 ；
c)EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU250 和 EU286 和 EU308 ；d)EU252 和 EU434 和 EU307 和 EU311 和 EU436 和 EU250 和 EU286 和 EU308 和 EU428。
9.權(quán)利要求8的抗原結(jié)合分子，其中所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含: a) EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或 b)EU250位上的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或 c)EU250位上的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或 d)EU250位上的纈氨酸、EU252位上的酪氨酸、EU286位上的谷氨酸、EU307位上的谷氨酰胺、EU308位上的脯氨酸、EU311位上的丙氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸。
10.權(quán)利要求2的抗原結(jié)合分子，其中所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在3個(gè)或更多個(gè)位置上包含氨基酸取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)位置是選自以下的組合之一:
a)EU434 和 EU307 和 EU311 ;
b)EU434 和 EU307 和 EU309 和 EU311 ;或
c)EU434 和 EU250 和 EU252 和 EU436。
11.權(quán)利要求10的抗原結(jié)合分子，其中所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含: a)EU307位上的谷氨酰胺、EU311位上的組氨酸和EU434位上的酪氨酸；或 b)EU307位上的谷氨酰胺、EU309位上的谷氨酸、EU311位上的丙氨酸和EU434位上的酪氨酸；或 c)EU307位上的谷氨酰胺、EU309位上的谷氨酸、EU311位上的組氨酸和EU434位上的酪氨酸；或 d)EU250位上的纈氨酸；EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中高分子量物類的比率小于2%。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合分子包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其具有: a)在pH5.5-6.5下比在pH 7-8下對(duì)抗原的結(jié)合活性低，或 b)對(duì)抗原的“鈣濃度依賴性結(jié)合”活性。
14.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子,其中所述結(jié)合分子在pH7下對(duì)FcRn的結(jié)合活性為50-150nM，Tm高于63.0°C，Epibase評(píng)分小于250。
15.權(quán)利要求1-3和權(quán)利要求6-7中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子在pH7下對(duì)FcRn的結(jié)合活性為15-50nM，Tm高于60°C，Epibase評(píng)分小于500。
16.權(quán)利要求1-3和權(quán)利要求8-9中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子在pH7下對(duì)FcRn的結(jié)合活性強(qiáng)于15nM，Tm高于57.5°C, Epibase評(píng)分小于500。
17.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含以下氨基酸取代: a)在EU238、EU255和/或EU258位上的氨基酸取代，和 b)在3個(gè)或更多個(gè)位置上的氨基酸取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)位置是表4-7提供的組合之一。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中 a)在FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的EU257位上，氨基酸不是選自以下的氨基酸:丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和蘇氨酸，和/或 b)在FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的EU252位上，氨基酸不是色氨酸。
19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合分子具有與包含完整FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的對(duì)照抗體的結(jié)合親和力相比不顯著提高的對(duì)預(yù)存抗藥抗體的結(jié)合活性。
20.權(quán)利要求19的抗原結(jié)合分子，其中所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域還在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上包含氨基酸取代:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
21.權(quán)利要求20的抗原結(jié)合分子，其中所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)選自以下的氨基酸取代: EU387位上的精氨酸； EU422位上的谷氨酸、精氨酸、或絲氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、蘇氨酸或谷氨酰胺； EU424位上的谷氨酸或精氨酸、賴氨酸或天冬酰胺； EU426位上的天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸或酪氨酸； EU433位上的天冬氨酸； EU436位上的蘇氨酸； EU438位上的谷氨酸、精氨酸、絲氨酸或賴氨酸；和 EU440位上的谷氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺。
22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)或更多個(gè)取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)取代是表12-13提供的組合之一。
23.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)或更多個(gè)取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)取代是表14-15提供的組合之一。
24.權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含: a)EU252位上的酪氨酸、EU387位上的精氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或 b)EU252位上的酪氨酸、EU422位上的谷氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或 c)EU252位上的酪氨酸、EU422位上的精氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或 d)EU252位上的酪氨酸、EU422位上的絲氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或 e)EU252位上的酪氨酸、EU424位上的谷氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或 f)EU252位上的酪氨酸、EU424位上的精氨酸、EU434位上的酪氨酸和EU436位上的纈氨酸；或 g)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的纈氨酸和EU438位上的谷氨酸；或h)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的纈氨酸和EU438位上的精氨酸；或 i)EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的纈氨酸和EU438位上的絲氨酸；或 j) EU252位上的酪氨酸、EU434位上的酪氨酸、EU436位上的纈氨酸和EU440位上的谷氨酸。
25.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合分子是抗體。
26.權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子介導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)抗原的攝入的用途。
27.權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子用于降低血漿特定抗原濃度的用途，其中所述抗原結(jié)合分子包含可結(jié)合所述抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
28.一種用于改進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動(dòng)力學(xué)方法，所述方法包括在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上將氨基酸取代引入所述抗原結(jié)合分子的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的步驟:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
29.一種用于延遲消除受試者中的抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上將氨基酸取代引入所述抗原結(jié)合分子的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的步驟:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
30.一種延長(zhǎng)抗原結(jié)合分子的血漿滯留時(shí)間的方法，所述方法包括在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上將氨基酸取代引入所述抗原結(jié)合分子的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的步驟:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
31.一種用于提高抗原結(jié)合分子的血漿抗原消除速率的方法，所述方法包括在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上將氨基酸取代引入所述抗原結(jié)合分子的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的步驟:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
32.一種用于提高抗原結(jié)合分子消除血漿抗原的能力的方法，所述方法包括在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上將氨基酸取代引入所述抗原結(jié)合分子的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的步驟:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
33.權(quán)利要求28-32中任一項(xiàng)的方法，其中將另外的氨基酸取代在EU256位上引入FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中。
34.權(quán)利要求28-33中任一項(xiàng)的方法,其中所述方法還包括在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上將氨基酸取代引入FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的步驟:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
35.一種用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子的方法，所述方法包括以下步驟: (a)選擇親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上引入氨基酸取代來改變所述親本 FcRn:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ； (b)選擇抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且改變抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸以得到PH依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或鈣離子依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域； (c)獲得編碼其中將(a)和(b)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接的抗原結(jié)合分子的基因，和 (d)使用(C)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子。
36.權(quán)利要求35的方法，其中在步驟a)中將另外的氨基酸取代在EU256位上引入FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中。
37.權(quán)利要求35-36中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包括在FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上引入氨基酸取代的步驟:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
38.一種包含修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上包含氨基酸取代:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438和EU440，其中與包含完整FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子的結(jié)合親和力相t匕，所述抗原結(jié)合分子在中性PH下對(duì)預(yù)存抗藥抗體(ADA)的結(jié)合親和力不顯著提高。
39.權(quán)利要求38的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合分子另外在中性或酸性pH范圍內(nèi)對(duì)FcRn的結(jié)合親和力提高。
40.權(quán)利要求38或39的抗原結(jié)合分子，其中取代一個(gè)或多個(gè)選自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440 的位置的氨基酸選自 a)EU387位上的精氨酸； b)EU422位上的谷氨酸、精氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、或谷氨酰胺； c)EU424位上的谷氨酸、精氨酸、賴氨酸或天冬酰胺； d)EU426位上的天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸或酪氨酸； e)EU433位上的天冬氨酸 f)EU436位上的蘇氨酸 g)EU438位上的谷氨酸、精氨酸、絲氨酸或賴氨酸；和 h)EU440位上的谷氨酸、天冬氨酸或谷氨酰胺。
41.權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含表10提供的一個(gè)或多個(gè)位置或組合之一的氨基酸取代。
42.權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含表11提供的氨基酸取代或取代組合的任一個(gè)。
43.權(quán)利要求39-42中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域還包含選自以下的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)位置上的氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU434 和EU436，其中所述取代使得FcRn結(jié)合活性在中性pH或酸性pH范圍內(nèi)增加。
44.權(quán)利要求39-43中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在以下的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域位置上包含氨基酸取代:
i)a) EU438 / EU440 或b) EU424 ;和ii)a) EU434, b) EU252/EU254/EU256 ；c) EU428/EU434 ;或 d) EU250/EU428。
45.權(quán)利要求44的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含以下氨基酸取代:
i)a) EU438R/EU440E 或 b) EU424N ;和
ii)a) M434H ；b) M252Y/S254T/T256E ；c) M428L/N434S ;或d) T250Q和M428L (EU編號(hào))。
46.權(quán)利要求45的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)取代是表13和15中提供的組合之一。
47.權(quán)利要求39-42中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含以下位置的取代: a)在選自EU387、EU422、EU424、EU438、EU440、EU433的一個(gè)或多個(gè)位置上或其中兩個(gè)位置是選自EU422/EU424和EU438/EU440的組合之一的兩個(gè)或更多個(gè)位置；和 b)其中兩個(gè)位置是表9提供的組合之一的兩個(gè)或更多個(gè)位置。
48.權(quán)利要求47的抗原結(jié)合分子，其中所述修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代，其中所述3個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代是表12或14提供的組合之一。
49.權(quán)利要求39-48中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合分子包含pH依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或鈣離子依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
50.一種用于降低包含F(xiàn)cRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性的方法,所述FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在中性或酸性pH下對(duì)FcRn的結(jié)合活性提高且在中性pH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性提高，所述方法包括以下步驟: a)提供具有在中性或酸性pH下對(duì)FcRn的結(jié)合活性提高且在中性pH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性提高的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子；和 b)在選自EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440 的一個(gè)或多個(gè)位置上取代FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的氨基酸，得到具有修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子。
51.權(quán)利要求50的方法，其中步驟b)包括在3個(gè)或更多個(gè)位置上取代氨基酸，其中所述3個(gè)或更多個(gè)位置為表10提供的組合之一。
52.權(quán)利要求50的方法，其中步驟b)包括將3個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代引入FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，其中所述3個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代為表11提供的組合之一。
53.一種用于增加單個(gè)抗原結(jié)合分子可結(jié)合的抗原總數(shù)而與親本抗體相比又不顯著提高在中性PH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性的方法，所述方法包括以下步驟: a)提供包含親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子， b)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變步驟a)的親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ;和 c)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變步驟b)的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
54.一種用于促進(jìn)以抗原結(jié)合的形式攝入細(xì)胞中的不含抗原的抗原結(jié)合分子在胞外釋放而與親本抗體相比又不顯著提高所述抗原結(jié)合分子在中性PH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性的方法，所述方法包括以下步驟: a)提供包含親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子， b)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變親本 FcRn 結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 和 EU428 ;和 c)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變步驟b)的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
55.一種用于提高抗原結(jié)合分子消除血漿抗原的能力而與親本抗體相比又不顯著提高在中性PH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性的方法，所述方法包括以下步驟: a)提供包含親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子， b)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變親本 FcRn 結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 和 EU428 ;和 c)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變步驟b)的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
56.一種用于改 進(jìn)抗原結(jié)合分子的藥代動(dòng)力學(xué)而與親本抗體相比又不顯著提高在中性PH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性的方法，所述方法包括以下步驟: a)提供包含親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子， b)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變親本 FcRn 結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ;和 c)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變步驟b)的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
57.一種用于降低血漿總抗原濃度或血漿游離抗原濃度而與親本抗體相比又不顯著提高在中性PH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性的方法，所述方法包括以下步驟: a)提供包含親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合分子包含可結(jié)合所述抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域， b)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變親本 FcRn 結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436 ;和 c)通過在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代親本FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的氨基酸來改變步驟b)的修飾的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440。
58.一種用于產(chǎn)生抗原結(jié)合分子的方法，所述抗原結(jié)合分子包含在中性或酸性pH下對(duì)FcRn的結(jié)合活性提高且在中性pH下對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性降低的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述方法包括以下步驟:(a)提供在中性或酸性pH范圍內(nèi)對(duì)FcRn的結(jié)合活性提高且在中性pH范圍內(nèi)對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性提高的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域， (b)在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上取代氨基酸:EU387、EU422、EU424、EU426、EU433、EU436、EU438 和 EU440， (c)選擇抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且改變抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸以得到PH依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或選擇鈣離子依賴性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域； (d)獲得編碼其中將(a)和(b)中制備的人FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接的抗原結(jié)合分子的基因，和 (e)使用(c)中制備的基因產(chǎn)生抗原結(jié)合分子，其中與具有完整FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親本抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域相比，所產(chǎn)生的所述抗原結(jié)合分子在中性或酸性PH下對(duì)FcRn的結(jié)合活性提高且在 中性PH下對(duì)內(nèi)源ADA的結(jié)合活性降低。
59.權(quán)利要求58的方法，其中在中性或酸性pH范圍內(nèi)對(duì)FcRn和預(yù)存ADA的結(jié)合活性提高且在中性pH范圍內(nèi)對(duì)預(yù)存ADA的結(jié)合活性提高的FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域在選自以下的一個(gè)或多個(gè)位置上包含氨基酸取代:EU238、EU250、EU252、EU254、EU255、EU256、EU258、EU286、EU307、EU308、EU309、EU311、EU315、EU428、EU433、EU434 和 EU436。
60.權(quán)利要求53-57中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟a)中引入的氨基酸取代位于3個(gè)或更多個(gè)位置，其中所述3個(gè)或更多個(gè)位置是表4-7提供的組合之一。
61.權(quán)利要求53-60中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟b)中引入的氨基酸取代位于3個(gè)或更多個(gè)位置，其中所述3個(gè)或更多個(gè)位置為表10提供的組合之一。
【文檔編號(hào)】C07K16/28GK103958547SQ201280058760
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月30日
【發(fā)明者】井川智之, 前田敦彥, 味元風(fēng)太, 倉持太一 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社