專利名稱：Kit信號(hào)相關(guān)基因qpcr芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于KIT信號(hào)相關(guān)基因檢測(cè)的QPCR芯片。
背景技術(shù)：
人KIT原癌基因起源于HZ4貓肉瘤病毒，位于人染色體4ql2，在4號(hào)染色體長(zhǎng)臂中心體周圍區(qū)域，是白色斑點(diǎn)顯性基因的等位基因。在小鼠中該基因位于第5號(hào)染色體距著絲粒約42cM處。人類KIT基因組DNA全長(zhǎng)大約891Λ，包括21個(gè)外顯子。KIT基因編碼的蛋白質(zhì)被稱為KIT或c-kit受體，是一個(gè)分子量為145kD的I型跨膜性糖蛋白，屬于III 型蛋白酪氨酸激酶受體超家族成員，分布于細(xì)胞膜表面。其結(jié)構(gòu)類似于巨噬細(xì)胞集落刺激因子和血小板源生長(zhǎng)因子受體，由胞外結(jié)構(gòu)域、單一跨膜區(qū)及胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域三部分組成。胞外區(qū)包含5個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，開始的3個(gè)是SCF(干細(xì)胞因子)結(jié)合區(qū)，第 4、5個(gè)結(jié)構(gòu)域在穩(wěn)定SCF及誘導(dǎo)KIT受體二聚化方面起重要作用。Broudy等研究發(fā)現(xiàn)第5 個(gè)結(jié)構(gòu)域還與KIT受體從細(xì)胞膜上的溶蛋白性裂解有關(guān)。胞內(nèi)部分則包含了由ATP結(jié)合區(qū)和磷酸轉(zhuǎn)移酶區(qū)組成的具有酪氨酸激酶活性的結(jié)構(gòu)域。其配體為肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、steel因子等，以分泌型和膜結(jié)合型兩種方式與KIT受體結(jié)合。分泌型可使 KIT受體激活、內(nèi)化、降解；膜結(jié)合型則能維持KIT受體較長(zhǎng)的激活狀態(tài)。KIT受體與配體特異性結(jié)合可觸發(fā)其同源二聚化和細(xì)胞膜內(nèi)酪氨酸殘基的磷酸化，產(chǎn)生停泊位點(diǎn)，捕獲含SH2 結(jié)構(gòu)域的信號(hào)分子，還能直接激活蛋白激酶C、MAP激酶、Racl.JNK, Raf-I、JAK2等，通過多種信號(hào)因子的參與將細(xì)胞外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部，引發(fā)某些基因的特異性表達(dá)。SCF/KIT 共同參與多種細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，如Jak/STAT信號(hào)途徑、PII途徑、Src家族激酶途徑、Ras/ Raf/MEK/ERK信號(hào)途徑等，是各種底物激酶的酪氨酸磷酸化和絲/蘇氨酸激酶磷酸化的整合步驟，并且存在著多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的交互作用(cross-talking)，從而精確地調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化。Kit基因突變不僅僅影響黑素細(xì)胞的遷徙與分化而導(dǎo)致斑駁病的產(chǎn)生， 也會(huì)影響原始生殖細(xì)胞的發(fā)育而導(dǎo)致不孕不育，以及影響造血細(xì)胞生成而導(dǎo)致貧血及肥大細(xì)胞缺乏等，嚴(yán)重的Kit基因突變還會(huì)導(dǎo)致純合致死，同時(shí)，Kit基因是一個(gè)重要的原癌基因，Kit基因高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致粒細(xì)胞白血病、精原細(xì)胞瘤及消化系統(tǒng)間質(zhì)腫瘤。SCF/KIT共同參與的多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與上述病變密切相關(guān)，這些疾病病理發(fā)育過程中相關(guān)信號(hào)過程的變化是近年來kit信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的熱點(diǎn)問題。QPCR(Real-Time Quantitative PCR)在基因表達(dá)水平、病原體及產(chǎn)前診斷等方面得到廣泛運(yùn)用。其原理是在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，常用的兩種方法為STOR Green (熒光染料摻入法)和iTaqman probe (探針法)。SYBR Green熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)。熒光染料的優(yōu)勢(shì)在于它能監(jiān)測(cè)任何dsDNA序列的擴(kuò)增，不需要探針的設(shè)計(jì)，使檢測(cè)方法變得簡(jiǎn)便，同時(shí)也降低了檢測(cè)的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA(如引物二聚體)結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽性信號(hào)。引物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線(melting curve)分析的軟件加以解決。相關(guān)論文最早發(fā)表于1996年，隨后在實(shí)驗(yàn)方法、儀器設(shè)備上進(jìn)行了一系列改善，已經(jīng)在科研和臨床診斷領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。近年來，對(duì)于熒光定量PCR的要求越來越規(guī)范化。從 RNA的提取一RNA完整性和純度的鑒定一逆轉(zhuǎn)錄一反應(yīng)體系的優(yōu)化一最后的數(shù)據(jù)分析都有一套嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，從而增加了熒光定量PCR結(jié)果的可靠程度，也使實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性得到提高。QPCR芯片是在儀器設(shè)備更新的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，將近百個(gè)或數(shù)百個(gè)QPCR反應(yīng)設(shè)計(jì)在一塊板子上同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)豐度?；蛐酒恰案咄俊爆F(xiàn)代生物技術(shù)的標(biāo)志，其原理是基于核酸分子雜交，用熒光染料標(biāo)記樣本DNA或cDNA，與基因芯片雜交，經(jīng)激光共聚焦熒光顯微鏡檢出雜交信號(hào)，通過計(jì)算機(jī)處理、分析，得到所需信息。突出特點(diǎn)在于高通量、微型化和自動(dòng)化。但它存在三個(gè)方面的缺點(diǎn)1、費(fèi)用高；2、難以檢測(cè)低豐度表達(dá)的基因；3、偏重高通量(一次檢測(cè)上萬個(gè)甚至幾萬個(gè)基因)，缺少針對(duì)如皮膚、海馬組織或某種腫瘤等特定組織類型的表達(dá)“芯片”。與基因芯片相比，QPCR芯片的通量顯著減低，一次至多檢測(cè)96個(gè)或384個(gè)基因， 基本相當(dāng)于基因芯片通量的1%，但是QPCR芯片的擴(kuò)增對(duì)象經(jīng)過仔細(xì)選擇，是某一組織或病變類型高度相關(guān)的基因，更便于數(shù)據(jù)的分析處理，檢測(cè)基因還可以隨研究需要加以改動(dòng)， 便于操作，而且價(jià)格低廉?；蛐酒蚎PCR芯片的原理不同，但對(duì)于基因表達(dá)譜而言，他們的檢測(cè)對(duì)象(mRNA或cDNA)到實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表達(dá)豐度)，QPCR芯片與基因芯片都高度一致，許多研究者都把這兩種方法作為互相印證的手段，而對(duì)于幾十個(gè)甚至幾百個(gè)基因的表達(dá)豐度檢測(cè)，QPCR技術(shù)完全可以取代基因芯片。計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)是將基因表達(dá)水平的數(shù)據(jù)與分子信號(hào)過程進(jìn)行聯(lián)系的關(guān)鍵步驟，廣泛運(yùn)用的軟件是I^attiwa於tudio。根據(jù)基因表達(dá)量的變化，計(jì)算機(jī)結(jié)合已知信號(hào)通路的信息，將“宏觀表型”與分子信號(hào)過程結(jié)合。由于這一軟件預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)是已知信號(hào)過程，并不能預(yù)測(cè)新的未知信號(hào)過程，所以對(duì)基因芯片的海量數(shù)據(jù)的利用率有限。而在QPCR芯片的設(shè)計(jì)過程中，研究者依據(jù)已知的信號(hào)過程選擇檢測(cè)對(duì)象，盡管選擇的基因總數(shù)不多，但可能都是預(yù)測(cè)軟件的參考基因，同樣會(huì)得到較好的結(jié)果。也就是說， 被檢測(cè)基因的“質(zhì)量”而不是基因信息的通量才是信號(hào)通路預(yù)測(cè)的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷及KIT信號(hào)研究的實(shí)際需求提供一種KIT信號(hào)相關(guān)基因QPCR芯片，該KIT信號(hào)相關(guān)基因QPCR芯片可以用于檢測(cè)KIT信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)豐度的變化，還可以根據(jù)不同信號(hào)通路的要求對(duì)個(gè)別基因加以修改，具有一定的靈活性，解決了現(xiàn)有的基因芯片針對(duì)性差、通量高而價(jià)格昂貴的技術(shù)缺陷。本發(fā)明的上述技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)施的一種KIT信號(hào)相關(guān)基因QPCR芯片，其特征在于所述芯片以Aktl、Bcl2、Cbl、 Ccnd3、Ccnd3_ps、Csf1、Crk、Ecml、Fes、Fyn、Grb7、Hrasl、Jakl、Kitl、Lyn、Map2k、Matk、Myb、 NrOb2> Ntrkl、Pdgfa、Pik3ca> Ppplrl3b、Prkcc> RafU Sh2b2、Shcl、Snai2> SoatU StatU 3^2基因?yàn)闄z測(cè)位點(diǎn)，以Actb為內(nèi)參，以以下32個(gè)基因的上游引物和下游引物為基礎(chǔ)檢測(cè)特定基因的表達(dá)水平
權(quán)利要求
1. 一種KIT信號(hào)相關(guān)基因QPCR芯片，其特征在于所述芯片以Aktl、Bcl2、Cbl、 Ccnd3、Ccnd3-ps、Csfl、Crk、Ecml、Fes、Fyn、Grb7、Hrasl、Jakl、Kitl、Lyn、Map2k、Matk、Myb、 NrOb2> Ntrkl、Pdgfa、Pik3ca> Ppplrl3b、Prkcc> RafU Sh2b2、Shcl、Snai2> SoatU StatU 3^2基因?yàn)闄z測(cè)位點(diǎn)，以Actb為內(nèi)參，以以下32個(gè)基因的上游引物和下游引物為基礎(chǔ)檢測(cè)特定基因的表達(dá)水平基因名稱上游引物下游引物ActbFAGATGACCCAGATCATGTTTGAGARAGATGACCCAGATCATGTTTGAGAAktlFTGAGGAGCGGGAAGAATGGRGGTGAGCCTGATCGGAAGTCBcl2FGAGGCTGGGATGCCTTTGTRCCAGGTATGCACCCAGAGTGACblFGAGCGCCGGCGGTGGTTGCRGGAATGGAGCCGGGCGAGAAGGACcnd3FTGCGTGCAAAAGGAGATCAARCACACACCTCCAGCATCCAGTACcnd3-psFCCTGTCTCTGCCCAGTGGTTRCCAAAAAGTCTGGGCATGCTCrkFCCAACCCAGCGTCAACACTRGCTCACCGACCTCCAAAGCCsflFGCAGCAGTTGATCGACAGTCARCGCATGGTCTCATCTATTATGTCTTGEcmlFTGCCGCAGCGACACAARCATTGCATCCTCCCACACAAGFesFAGCAAGGATCCTGAAACAGTACAARTGTGCAGACCCCGATGAGAFynFCCATACCCAGGCATGAACAACRGTGGGCAGGGCATCCTATAGGrb7FCTGGATGCACAAACAGGCATARTGCAGGAAGCCCTGGATCTHraslFCAAGCTGGCGTGGAGGATRCGCAATTTATGCTGCCGAATJaklFCCGCATGAGGTTCTACTTTACCARTGTCGCCATACAGACTGTTCGTKitlFGCACAGTGGCTGGTAACAGTTCRGAACAGGTAAGGATGAGGTCTGTCALynFCTACGTGGCCAAGGTCAACARCTGTCGCTCTGCATCTTTCCTMap2kFACAGAGATGTGAAGCCCTCCAARCCCCGAAGTCACACAGCTTAAMatkFGCAGTTTGCTCTTCATGTTGCTRCAAGTCCTCAGAGACCAGGATGTMybFCTGAACCCTGAACTCATCAAAGGRGACCAACGCTTCGGACCATANr0b2FGAGCTGGGTCCCAAGGAGTATRGCACATCTGGGTTGAAGAGGATNtrklFTCTGGGAGATCTTCACCTATGGARCGATCGCCTCAGTGTTGGAPdgfaFGTGCGACCTCCAACCTGAARGCTCATCTCACCTCACATCTGTCTPik3caFCGAGATATATGATGCAGCCATTGRAGATAAAGGTTGCCACGCAGTACPpplrl3bFTGCTGGACTTTGGTGTCAATGRGCAAGAGGCAGCACAATGCPrkccFAGCAACTGGGCAAGTTTAAGGARGAAGAAGAGGCCTATGGCGATTRaflFAGCTTCCCTACGCCCACATRACCCACGGCCTACCATGASerpinalcFCTGGACCAAGACACAGTTTTCGRGCTTCTTCCATTTGCCTTTAAAGASh2b2FTCCGCCTGGAGTTCTTCGTRGTGTTGTCCTTTTCAGGCATTTCShclFGCCGACTGCAAACAGATCATTRCCACCGGACGCGAAAGSnai2FCACACAGTTATTATTTCCCCATATCTCTRCGAGGTGAGGATCTCTGGTTTTSoatlFAGAATATCCCACGAGTACTAAATGCARGGTACTGGTTGACTGTGGGTAGTGStatlFTGAGCCCGACCCTATTACAAAARCCACGAAGGAGCTCTGAATGAZhx2FAACTCACAGCAGACACTGATAGGAARTCAGAAGGATTTCAGCACAGACA
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種KIT信號(hào)相關(guān)基因QPCR芯片，其特征在于所述32個(gè)基因的上游引物和下游引物分別放置在同一塊96孔板的各孔內(nèi)，每個(gè)基因做3個(gè)復(fù)孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種KIT信號(hào)相關(guān)基因QPCR芯片，其特征在于32個(gè)基因的上游引物和下游引物分別放置在同一塊384孔板的各孔內(nèi)，每個(gè)基因做3個(gè)復(fù)孔，每塊板檢測(cè)4個(gè)標(biāo)本。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于KIT信號(hào)相關(guān)基因檢測(cè)的QPCR芯片。一種KIT信號(hào)相關(guān)基因QPCR芯片，其特征在于所述芯片以Akt1、Bcl2、Cbl、Ccnd3、Ccnd3-ps、Csf1、Crk、Ecm1、Fes、Fyn、Grb7、Hras1、Jak1、Kitl、Lyn、Map2k、Matk、Myb、Nr0b2、Ntrk1、Pdgfa、Pik3ca、Ppp1r13b、Prkcc、Raf1、Sh2b2、Shc1、Snai2、Soat1、Stat1、Zhx2基因?yàn)闄z測(cè)位點(diǎn)，以Actb為內(nèi)參。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷及KIT信號(hào)研究的實(shí)際需求提供一種KIT信號(hào)相關(guān)基因QPCR芯片，該KIT信號(hào)相關(guān)基因QPCR芯片可以用于檢測(cè)KIT信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)豐度的變化，還可以根據(jù)不同信號(hào)通路的要求對(duì)個(gè)別基因加以修改，具有一定的靈活性，解決了現(xiàn)有的基因芯片針對(duì)性差、通量高而價(jià)格昂貴的技術(shù)缺陷。
文檔編號(hào)C40B40/06GK102296115SQ20111024250
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者吳寶金 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)