一種用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微生物油氣勘探技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，油氣微生物勘探技術(shù)已成功應(yīng)用于非常規(guī)油氣藏和深部油氣藏中。微生物油氣勘探技術(shù)主要由三部分組成，分別為:(I)確定勘探區(qū)取樣點(diǎn)并采集樣品；(2)對(duì)取回的樣品進(jìn)行指示菌測(cè)試分析；(3)通過數(shù)據(jù)分析預(yù)測(cè)油氣藏分布。指示菌數(shù)量的測(cè)定是油氣微生物勘探技術(shù)的核心內(nèi)容，該數(shù)據(jù)是反映測(cè)試區(qū)塊是否存在油氣藏的核心分析指標(biāo)。目前，油氣微生物勘探領(lǐng)域已經(jīng)形成了一套較為完整的技術(shù)系統(tǒng)，但現(xiàn)有技術(shù)對(duì)指示菌的分析采用培養(yǎng)法，存在工作量大，自動(dòng)化程度低，耗時(shí)長(zhǎng)等不足。
[0003]本發(fā)明將為研究油藏環(huán)境微生物群落組成、結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)等提供一種快速、準(zhǔn)確、高通量的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于所提供一種用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，通過分析烴氧化菌種類，并針對(duì)其16S核糖體RNA設(shè)計(jì)種、屬特異性探針，以待檢測(cè)樣品的基因組DNA為模板，用標(biāo)記的引物組進(jìn)行擴(kuò)增，然后將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與生物芯片上的探針進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果確定微生物勘探指示菌的種類及相對(duì)含量。本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定可靠及適于批量樣本檢測(cè)的特點(diǎn)。
[0005]一種用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，具體包括以下步驟:
[0006]( I)設(shè)計(jì)微生物勘探指示菌特異性探針
[0007]利用軟件收集分析上述微生物的特異性序列，設(shè)計(jì)油藏微生物勘探指示菌屬特異性探針。芯片上的條碼序列探針序列結(jié)構(gòu)通式為:NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-條碼序列。即探針的5'端氨基修飾，氨基旁邊連接poly-T15。
[0008](2)制備芯片
[0009]使用點(diǎn)樣儀將探針以設(shè)定的順序固定到醛基化修飾的玻片上。芯片是由微生物勘探指示菌探針、QC (點(diǎn)樣的陽(yáng)性質(zhì)控)、BC (點(diǎn)樣的陰性質(zhì)控)、NC (雜交的陰性質(zhì)控)和PC(雜交的陽(yáng)性質(zhì)控)組成的陣列。所有的條碼序列探針用50%DMS0溶解，終濃度為ΙΟμΜ，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)三次點(diǎn)制到玻片上。封閉芯片上未與寡核苷酸結(jié)合的醛基。
[0010]QC是一端帶有Hex標(biāo)記，另一端氨基修飾的寡核苷酸探針，用于觀察芯片點(diǎn)樣和固定的效率，其序列為 NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAGAGTGCTTGGTGCCATAAC-HEX ；BC 為 50 % 的DMS0，用于質(zhì)控點(diǎn)樣過程中有無樣品殘留污染；NC是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，與雜交液中的所有待檢測(cè)序列不會(huì)雜交，用于觀察有無非特異雜交，其序列為NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGCAACCACCACCGGAGG;PC是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，可以與雜交液中添加的熒光標(biāo)記的互補(bǔ)序列(c-PC)雜交，用于雜交過程的質(zhì)控，其序列為NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGGTATCGCGACCGCATCCCAATCT。
[0011](3)核酸擴(kuò)增
[0012]分別以油藏樣品基因組DNA為模板，用上游引物和下游引物PCR擴(kuò)增；
[0013]擴(kuò)增體系如下，包括0.1-0.3mM dNTPs, I X Qiagen PCR buffer,添加 MgCl2 至l-3mM, ρΗ8.7，05.-2 單位 DNA Polymerase，和 0.05-0.3ng 模版 DNA,上下游引物。25 μ I 擴(kuò)增體系中，引物的濃度為0.01-0.04 μ M0
[0014]擴(kuò)增參數(shù)為:
[0015]先95 V 15 分鐘；然后 94°C 30 秒，50-65 °C I 分鐘，72 °C 30-90 秒，30-40 個(gè)循環(huán)；
[0016]最后72°C 6-15 分鐘；4°C保存。
[0017](4)基因芯片雜交
[0018]取5_20μ I PCR產(chǎn)物加到兩倍體積雜交緩沖液中(6XSSC, 5XDenhardt ' sreagent, 25 %甲酰胺，0.1%SDS, 5nM c-PC (與芯片PC互補(bǔ)的序列，5 '端TAMRA標(biāo)記)。95-98°C變性3-10分鐘，冰浴，雜交混合物加入到點(diǎn)陣中反應(yīng)。然后將芯片放置36-45°C水浴中雜交0.5-3小時(shí)。取出玻片分別在兩種洗液中36-45°C各洗l_5min，洗液1:0.1-0.5XSSC/0.05-02%SDS，洗液 I1:0.01-0.1XSSCo 最后，玻片稍離心甩干。
[0019](5)數(shù)據(jù)分析
[0020]使用芯片掃描儀掃描芯片，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度及掃描圖像分析目的油藏古菌群落結(jié)構(gòu)。
[0021 ] 所述的探針序列為DNA、RNA、PNA (肽核酸)或LNA (鎖定核酸)序列。
[0022]所述的探針可以引入人工錯(cuò)配堿基，所述人工錯(cuò)配堿基是天然的A、T、C、G四種堿基或其類似物，所述類似物包括尿嘧啶，肽核酸和鎖定核酸。
[0023]所述的引物序列帶有熒光分子或可通過化學(xué)發(fā)光或固體微粒進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)的分子。
[0024]所述的基因芯片是目前所知的任一種生物芯片，包括固相生物芯片、膜生物芯片、過濾器生物芯片、針生物芯片和微珠生物芯片。
[0025]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0026](I)根據(jù)本發(fā)明雜交結(jié)果不僅能知道微生物勘探指示菌的種類，還知道微生物勘探指示菌相對(duì)含量；
[0027](2)本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定可靠及適于批量樣本的檢測(cè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，具體包括以下步驟: (1)設(shè)計(jì)微生物勘探指示菌特異性探針 利用軟件收集分析上述微生物的特異性序列，設(shè)計(jì)油藏微生物勘探指示菌屬特異性探針，芯片上的條碼序列探針序列結(jié)構(gòu)通式為:NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-條碼序列，即探針的51端氨基修飾，氨基旁邊連接poly-T15。 (2)制備芯片 使用點(diǎn)樣儀將探針以設(shè)定的順序固定到醛基化修飾的玻片上，芯片是由微生物勘探指示菌探針、QC (點(diǎn)樣的陽(yáng)性質(zhì)控)、BC (點(diǎn)樣的陰性質(zhì)控)、NC (雜交的陰性質(zhì)控)和PC (雜交的陽(yáng)性質(zhì)控)組成的陣列。所有的條碼序列探針用50%DMS0溶解，終濃度為10 μ Μ，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)三次點(diǎn)制到玻片上，封閉芯片上未與寡核苷酸結(jié)合的醛基，QC為一端帶有Hex標(biāo)記，另一端氨基修飾的寡核苷酸探針，用于觀察芯片點(diǎn)樣和固定的效率，其序列為NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAGAGTGCTTGGTGCCATAAC-HEX ；BC為50%的DMSO，用于質(zhì)控點(diǎn)樣過程中有無樣品殘留污染；NC是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，與雜交液中的所有待檢測(cè)序列不會(huì)雜交，用于觀察有無非特異雜交，其序列為NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGCAACCACCACCGGAGG ；PC是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，可以與雜交液中添加的熒光標(biāo)記的互補(bǔ)序列(c-PC)雜交，用于雜交過程的質(zhì)控，其序列為 NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGGTATCGCGACCGCATCCCAATCT。 (3)核酸擴(kuò)增 分別以油藏樣品基因組DNA為模板，用上游引物和下游引物PCR擴(kuò)增； 擴(kuò)增體系如下，包括 0.1-0.3mM dNTPs, IXQiagen PCR buffer,添加 MgCl2 至l-3mM, ρΗ8.7，05.-2 單位 DNA Polymerase，和 0.05-0.3ng 模版 DNA,上下游引物，25 μ I 擴(kuò)增體系中，引物的濃度為0.01-0.04 μ M0 擴(kuò)增參數(shù)為:先950C 15分鐘；然后940C 30秒，50-65°C I分鐘，72°C 30-90秒，30-40個(gè)循環(huán)；最后72°C 6-15分鐘；4°C保存。 (4)基因芯片雜交 取5-20 μ I PCR產(chǎn)物加到兩倍體積雜交緩沖液中(6 X SSC, 5 X Denhardt 1 sreagent，25%甲酰胺，0.l%SDS，5nM c-PC (與芯片PC互補(bǔ)的序列，5 '端TAMRA標(biāo)記)，95-98°C變性3-10分鐘，冰浴，雜交混合物加入到點(diǎn)陣中反應(yīng)，然后將芯片放置36-45°C水浴中雜交0.5-3小時(shí)，取出玻片分別在兩種洗液中36-45 V各洗l_5min，洗液1:0.1-0.5XSSC/0.05-02%SDS，洗液 I1:0.01-0.1 X SSC，最后，玻片稍離心甩干。 (5)數(shù)據(jù)分析 使用芯片掃描儀掃描芯片，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度及掃描圖像分析目的油藏古菌群落結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，其特征在于所述探針序列為DNA、RNA、PNA (肽核酸)或LNA (鎖定核酸)序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，其特征在于所述探針可以引入人工錯(cuò)配堿基，所述人工錯(cuò)配堿基是天然的A、T、C、G四種堿基或其類似物，所述類似物包括尿嘧啶，肽核酸和鎖定核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，其特征在于所述引物序列帶有熒光分子或可通過化學(xué)發(fā)光或固體微粒進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)的分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，其特征在于所述的基因芯片是目前所知的任一種生物芯片，包括固相生物芯片、膜生物芯片、過濾器生物芯片、針生物芯片和微珠生物芯片。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，屬于微生物勘探技術(shù)領(lǐng)域，包括以下步驟：取目標(biāo)區(qū)塊土樣，利用自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行基因組DNA提取，以該基因組為模板，用標(biāo)記的引物組進(jìn)行擴(kuò)增，然后將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片上的探針進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果確定指示菌的種類及相對(duì)含量，從而區(qū)分背景區(qū)及異常區(qū)。本發(fā)明能夠準(zhǔn)確地判定背景區(qū)及異常區(qū)，并可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，大大提高了檢測(cè)速度，減輕了人員工作量。
【IPC分類】C40B40-06, C12Q1-04, C12Q1-68, C40B50-18
【公開號(hào)】CN104630336
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310573741
【發(fā)明人】郝濱, 李彩風(fēng), 曹功澤, 杜春安, 王靜, 宋欣, 吳曉玲, 段傳慧, 曹嫣鑌, 宋永亭, 張守獻(xiàn)
【申請(qǐng)人】中國(guó)石油化工股份有限公司, 中國(guó)石油化工股份有限公司勝利油田分公司采油工藝研究院
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2013年11月15日