一種噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)的構(gòu)建方法
【專利摘要】一種噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)的構(gòu)建方法，所述方法采用NNK編碼方式，將編碼隨機(jī)肽庫(kù)的兩條鏈經(jīng)退火、延伸補(bǔ)平、雙酶切后，與經(jīng)同樣雙酶切的5’去磷酸化載體連接，電轉(zhuǎn)TG1感受態(tài)細(xì)胞。擴(kuò)增菌液后進(jìn)行庫(kù)容和多樣性檢驗(yàn)。利用該肽庫(kù)篩選獲得的肽段序列，通過測(cè)序分析即可得到與藥物特異性結(jié)合的外源蛋白或多肽。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于抗原表位的模擬和蛋白、核酸結(jié)合特性的研究，同時(shí)在藥物篩選和疫苗研制方面也有廣泛的應(yīng)用。
【專利說明】一種噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及生物制藥技術(shù)范疇，特別涉及一種噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]卩遼菌體展不技術(shù)(phagedisplay technology)是由Smith于1985年創(chuàng)建，于20世紀(jì)90年代發(fā)展起來并得到廣泛應(yīng)用的新技術(shù)。基本原理是噬菌體作為一種表達(dá)載體，可以將外源蛋白或多肽呈現(xiàn)在噬菌體表面，利用外源蛋白或多肽與待篩選藥物的特異性親和作用，通過吸附-洗脫-擴(kuò)增的篩選富集過程，將表達(dá)與藥物特異性結(jié)合的外源蛋白或多肽的噬菌體大量富集，然后通過測(cè)序分析即可得到與藥物特異性結(jié)合的外源蛋白或多肽。目前該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抗原表位的模擬和蛋白、核酸結(jié)合特性的研究，同時(shí)在藥物篩選和疫苗研制方面也有廣泛的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)的構(gòu)建方法。其特征在于，所述噬菌體展示隨機(jī)十五肽庫(kù)的構(gòu)建方法為:
[0004]I 載體(圖1)
[0005]采用噬菌粒pCANTAB5E (見圖1)，pCANTAB5E含有SfiI和NotI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，可以將外源目的基因通過酶連反應(yīng)重組進(jìn)入噬菌粒載體。
[0006]2文庫(kù)構(gòu)建
`[0007]構(gòu)建文庫(kù)多為6~16肽，我們選擇構(gòu)建15肽庫(kù)，采用NNK編碼方式，N代表任意核苷酸，K代表G或T，可指導(dǎo)合成全部20種氨基酸。將編碼隨機(jī)肽庫(kù)的兩條鏈經(jīng)退火、延伸補(bǔ)平、雙酶切后，與經(jīng)同樣雙酶切的5’去磷酸化載體連接，電轉(zhuǎn)TGl感受態(tài)細(xì)胞。
[0008]3隨機(jī)肽庫(kù)庫(kù)容和多樣性檢驗(yàn)
[0009]取I μ I從平板上刮下來的TGl肽庫(kù)菌液，梯度稀釋后涂布SOB平板，計(jì)算庫(kù)容。隨機(jī)挑取20個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，對(duì)其多樣性進(jìn)行檢驗(yàn)。
[0010]本發(fā)明的有益效果是所構(gòu)建的肽庫(kù)為噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)，噬菌體展示技術(shù)研發(fā)模式更高效，耗成本更低，并能定向設(shè)計(jì)出結(jié)構(gòu)更優(yōu)化的新藥。對(duì)于藥物與蛋白作用的研究，在病理學(xué)、藥理學(xué)等諸多方面具有重要意義。利用噬菌體表面展示技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽文庫(kù)，以此導(dǎo)向、跟蹤，從復(fù)雜提取物中找出有效部位或成分，再進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，可收到事半功倍的效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為PCANTAB5E載體的限制圖譜和多克隆位點(diǎn)。
[0012]圖2為PCR擴(kuò)增的編碼15肽的雙鏈DNA片段，圖中M為DL2000，I為目的DNA片段。[0013]圖3為PCR擴(kuò)增的重組載體中的目的片段，圖中M為DL2000，I~10為PCR擴(kuò)增
的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0014]本發(fā)明提供一種噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)的構(gòu)建方法，所述肽庫(kù)的構(gòu)建方法結(jié)合附圖和實(shí)施過程以說明。
[0015]I實(shí)驗(yàn)材料:
[0016]E.coli TGl:由中國(guó)藥科大學(xué)生物制藥教研室保存，Ε.coli TGl:supEhsdΔ5thiΔ (lac-proAB)F， [traD36proAB+lacIq IacZΔΜ15]。
[0017]噬菌粒PCANTAB5E，由中國(guó)藥科大學(xué)生物制藥教研室保存。
[0018]DNA聚合酶、T4DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司；堿性磷酸酶CIAP購(gòu)自TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶Sfi1、NotI購(gòu)自NEB公司。
[0019]Plasmid Miniprep kit I, Gel/PCR Extraction kit 購(gòu)自 Biomiga 公司。
[0020]2噬菌體展示隨機(jī)十五肽庫(kù)的構(gòu)建
[0021]2.1線性化載體的制備
[0022]提取pCANTAN5E質(zhì)粒，Sfi1、NotI進(jìn)行雙酶切，利用Biomiga膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，CIAP酶進(jìn)行去磷酸化處理。在Eppendorf管中加入適量酶切產(chǎn)物，緩沖液及CIAP酶，去離子水補(bǔ)充至50 μ 1，`混勻后37°C水浴30min，再50°C水浴30min，去磷酸化產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行純化，去離子水洗脫后，-200C。
[0023]2.2編碼15肽的隨機(jī)DNA片段的制備
[0024]根據(jù)載體上Sfil、NotI酶切位點(diǎn)情況及構(gòu)建隨機(jī)肽庫(kù)的要求，設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸片段，
[0025]鏈1:5, -GCTGGCCCAGCCGGCC(SfiI)(NNK) 15TAAGCGGCCGC
[0026](NotI)AGGTGCATT-3丨，其中N代表A、T、C、G四種堿基，K代表T、G兩種堿基。在Y和:V端引入Sf i 1、NotI酶切位點(diǎn)，用下劃線表示。鏈2:5' -AATGCACCTGCGGCCGCTTA-3'與鏈I的3'端互補(bǔ)，寡核苷酸鏈由上海生工生物工程有限公司合成。
[0027]在一Eppendorf 管中加入 10X 退火 Buffer5 μ I, 20mmol/ml 的 DNA 單鏈各 2 μ I,
2.5mmol/ml 的 dNTPl μ 1，Taq 酶 I μ 1，ddH20 加至 50 μ I。
[0028]PCR擴(kuò)增條件:94°C預(yù)變性 4min ；94°C,lmin ；55°C,30s ;72°C，lmin，共 30 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0029]將退火延伸的隨機(jī)片段經(jīng)Sfil、NotI雙酶切，用PCR回收試劑盒回收目的條帶。
[0030]2.3連接及連接產(chǎn)物的回收處理
[0031]對(duì)酶切回收的載體與插入片段進(jìn)行紫外定量，線性化載體與插入片段按1: 3，I: 5,1: 7,1: 10進(jìn)行連接，確定最佳連接比例為1: 7。用不同濃度的連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化以確定最佳轉(zhuǎn)化產(chǎn)物量為0.1 μ g(5 μ I)。利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化連接產(chǎn)物以除去連接酶和離子。
[0032]2.4電轉(zhuǎn)化
[0033]有關(guān)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，取5 μ I精制的連接產(chǎn)物與50 μ I電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞輕柔混勻，冰浴I~2min，置于預(yù)冷的孔隙為0.1cm的電轉(zhuǎn)杯，進(jìn)行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)儀參數(shù)為1.3KV，25yF，200Q。電擊后，加入Iml SOC培養(yǎng)基，37°C，200rpm振搖45~50min。取少量菌體適量稀釋后涂布SOB (含50 μ g/ml Amp)小平板(直徑IOcm)，其余8000rpm離心3min后涂布SOB (含100 μ g/ml Amp)大平板(直徑15cm)，37°C倒置培養(yǎng)12~16h，以小平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，大平板上的菌落用LB培養(yǎng)基溶解，并用涂布棒均勻刮下來，加甘油至終濃度20%，分裝成小管，-70°C凍存。
[0034]2.5序列測(cè)定及分析
[0035]隨機(jī)挑取若干原始細(xì)菌克隆，各提取重組質(zhì)粒，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證，設(shè)計(jì)PCR 驗(yàn)證引物:上游引物 5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3' (M13R)，下游引物 5' -GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3丨(S6)(上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司)。PCR陽性的重組質(zhì)粒，將其測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)，并對(duì)構(gòu)建的隨機(jī)肽庫(kù)的寡核苷酸的隨機(jī)性、庫(kù)容及豐度進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0036]3文庫(kù)的庫(kù)容及多樣性評(píng)價(jià)
[0037]載體與插入片段摩爾比為1: 7，取5μ1精制的連接產(chǎn)物進(jìn)行電轉(zhuǎn)，原庫(kù)容為1*106,轉(zhuǎn)化效率為l*107cfu/y g DNA。將多次轉(zhuǎn)化合并后,庫(kù)容為5*108,滿足用于篩選的需要。
[0038]從肽庫(kù)中隨機(jī)挑取20個(gè)克隆，進(jìn)行序列測(cè)定(表1)。結(jié)果顯示(表2)，四種核苷酸的出現(xiàn)情況與預(yù)先設(shè)計(jì)的NNK相符，第一、第二核苷酸分別為A/T/G/C中的任一種，其中每一種核苷酸和出現(xiàn)的頻率的理論值為25%，第三位核苷酸為G/T中的任一種，G或T的出現(xiàn)頻率為50%。實(shí)際值與理論值存在一定的偏差，可能是由于樣本較小的緣故，隨著測(cè)序樣本的增加，這種差異將逐漸減小。
[0039]上述結(jié)果表明，所構(gòu)建的噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)不論從基本框架，還是從庫(kù)容及多樣性方面均滿足設(shè)計(jì)要求。
[0040]表1 15肽庫(kù)隨機(jī)挑選克隆核苷酸的插入與對(duì)應(yīng)的氨基酸序
[0041]序號(hào)序列
【權(quán)利要求】
1.一種曬菌體展不隨機(jī)肽庫(kù)的構(gòu)建方法,包括: (1)采用NNK編碼方式，其中N代表任意核苷酸，K代表G或T，可指導(dǎo)合成全部20種氨基酸。將編碼隨機(jī)肽庫(kù)的兩條鏈經(jīng)退火、延伸后進(jìn)行雙酶切； (2)將載體經(jīng)與(I)同樣的雙酶切后，進(jìn)行5’去磷酸化； (3)將(I)獲得的隨機(jī)序列與(2)獲得的脫磷酸載體進(jìn)行連接，電轉(zhuǎn)TGl感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建隨機(jī)肽庫(kù)； (4)取擴(kuò)增后的TGl肽庫(kù)菌液，梯度稀釋后涂布SOB平板，計(jì)算庫(kù)容。隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行測(cè)序，對(duì)其多樣性進(jìn)行檢驗(yàn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述文庫(kù)構(gòu)建為噬菌體展示隨機(jī)6-16肽庫(kù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于步驟(1)中所采用的載體為噬菌粒PCANTAB5E。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述方法構(gòu)建的噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)。
5.權(quán)利要求4所述噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)的用途，其特征在于:利用該肽庫(kù)篩選獲得的肽段序列，通過測(cè)序分析即可得到與藥物特異性結(jié)合的外源蛋白或多肽。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于抗原表位的模擬 和蛋白、核酸結(jié)合特性的研究，同時(shí)在藥物篩選和疫苗研制方面也有廣泛的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C40B50/06GK103806112SQ201310244662
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2013年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月9日
【發(fā)明者】張芳, 王筱蒙, 邱鄭, 王旻, 徐春蕾 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)