專利名稱：天然人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種天然人源IgGFab噬菌體抗體庫(kù)的 構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
基因工程抗體庫(kù)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的體外制備人源單克隆抗體的新方法，通 過(guò)構(gòu)建和篩選噬菌體抗體庫(kù)，為科研和治療用抗體的生產(chǎn)提供了一種新穎而有效的途徑。 噬菌體抗體庫(kù)就是將抗體分子的多樣性可變區(qū)基因組裝到表達(dá)載體內(nèi)，表達(dá)到噬菌體表面 得到多樣性噬菌體抗體的集合。通過(guò)“吸附_洗脫_擴(kuò)增”的富集過(guò)程，可極為有效的從噬 菌體抗體庫(kù)中篩選出特異性抗體的可變區(qū)基因。目前噬菌體抗體庫(kù)主要應(yīng)用于表達(dá)篩選 Fab 禾口單鏈抗體(single chain Fv, ScFv)。ScFv可通過(guò)PCR直接將輕鏈和重鏈可變區(qū)基因組合在一起，減少一次重組過(guò)程， 因此噬菌體單鏈抗體庫(kù)構(gòu)建操作較為簡(jiǎn)單。ScFv具有分子小，腫瘤穿透力高的優(yōu)點(diǎn)，但也 具有體內(nèi)半衰期短、腫瘤攝取率低的缺點(diǎn)，是用于抗體靶向治療的不利因素。此外，實(shí)驗(yàn)證 明ScFv雖然具有良好的結(jié)合活性，但往往比親本抗體的親和力明顯降低，同時(shí)其穩(wěn)定性也 較差。因而ScFv抗體的應(yīng)用有一定的局限性。Fab是由重鏈Fd段和完整輕鏈組成，是完整 抗體分子的三分之一，在體內(nèi)的穩(wěn)定性要遠(yuǎn)高于單鏈抗體，并且易于進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造且細(xì)菌 內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物多為有功能的抗體片段等優(yōu)點(diǎn)，因此Fab在研究抗體可變區(qū)的功能活性以及臨 床應(yīng)用有著不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。目前構(gòu)建Fab噬菌體抗體庫(kù)的策略有兩種。一種為應(yīng)用雙載體，分別構(gòu)建輕鏈?zhǔn)?菌體抗體庫(kù)和重鏈Fd段噬菌體抗體載體庫(kù)，在表達(dá)Fab時(shí)，經(jīng)過(guò)輕重鏈的重組配對(duì)，在同一 個(gè)大腸桿菌內(nèi)表達(dá)。該方法構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)雖然操作簡(jiǎn)單，但由于同一細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入兩個(gè) 載體，要求轉(zhuǎn)入的兩個(gè)載體具有相容性。因此，這種策略構(gòu)建的抗體庫(kù)實(shí)際效率并不高。另 一種方法為應(yīng)用單載體，即將輕鏈基因和重鏈Fd段的基因重組在一個(gè)表達(dá)載體上，這樣避 免了雙載體的相容性缺點(diǎn)，并可以大大提高抗體庫(kù)多樣性和庫(kù)容量，在抗體庫(kù)的實(shí)際應(yīng)用 中有著顯著的優(yōu)越性。建立噬菌體抗體庫(kù)的目的就是為了有效的獲得針對(duì)各種抗原的人源抗體。天然噬 菌體抗體庫(kù)的抗體基因來(lái)自未經(jīng)免疫的個(gè)體，理論上只要這種抗體庫(kù)容量足夠大、多樣性 好，就可以篩選到針對(duì)任何抗原分子甚至包括自身抗原的單抗。因而為了滿足高通量篩選 臨床治療用的低抗原性、高親和性抗體，建具有高度多樣性、通用性好、無(wú)抗原偏向性的大 容量天然人源Ig Fab噬菌體抗體庫(kù)有著極其重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種構(gòu)建高度多樣性、無(wú)抗原偏向性的大容量天然人源 IgFab噬菌體抗體庫(kù)的方法，以用于高通量篩選臨床治療用的低抗原性、高親和性人源抗 體。
本發(fā)明提出的天然人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建方法，包括如下步驟
(1)健康人外周血淋巴細(xì)胞分離及總RNA提取，通過(guò)RT-PCR合成cDNA；
(2)以cDNA為模板，用一組幾乎覆蓋人免疫球蛋白G(IgG)全部輕鏈可變區(qū)編碼序列 的特異性引物分別擴(kuò)增人免疫球蛋白的輕鏈基因，得到幾乎覆蓋人免疫球蛋白G (IgG)的 完整K和λ輕鏈基因；
(3)以cDNA為模板，用一組幾乎覆蓋人免疫球蛋白G(IgG)全部重鏈可變區(qū)編碼序列 的特異性引物分別擴(kuò)增人免疫球蛋白的Fd重鏈基因，得到幾乎覆蓋人免疫球蛋白G (IgG) 的Y重鏈Fd片段基因；
(4)將獲得的人免疫球蛋白G(IgG)的輕鏈基因與噬菌體載體連接，構(gòu)建輕鏈抗體庫(kù)；
(5)將獲得的人免疫球蛋白G(IgG)的Fd重鏈基因與輕鏈抗體庫(kù)DNA連接，構(gòu)建完整 的人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)；
(6)經(jīng)過(guò)多輪的抗原親和吸附一洗脫一擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆，然后轉(zhuǎn) 化宿主使目標(biāo)抗體表達(dá)；
(7)對(duì)純化的抗體進(jìn)行生物活性與功能鑒定。在上述方法中，步驟(1)所分離及總RNA提取來(lái)源于2 300名健康人的外周血 分離的淋巴細(xì)胞，健康人選擇方法為近1 6個(gè)月未患有感冒等感染性疾病，年齡分布為 20 40歲。在上述方法中，步驟(2)所述一組幾乎覆蓋人免疫球蛋白G (IgG)全部輕鏈可變 區(qū)編碼序列的特異性引物，可以擴(kuò)增得到幾乎覆蓋人免疫球蛋白G (IgG)的輕鏈基因。所 述引物如下所示
擴(kuò)增κ輕鏈基因的上游引物為VKl:CCGCTAGCGMCATYCAGWTGACCCAGTCTCC(SEQIDNO.1)VK2aCCGCTAGCGATRTTGTGATGACYCAGWCTCC(SEQIDNO 2)VK3aCCGCTAGCGAAATTGTGWTGACGCAGTCTCC(SEQIDNO 3)VK4:CCGCTAGCGACATCGWGHTGACCCAGTCTCC(SEQIDNO 4)擴(kuò)增κ輕鏈基因的下游引物為VKC:TTGGCGCGCCACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTl(SEQ ID NO. 5)擴(kuò)增λ輕鏈基因的上游引物為VLlaCCGCTAGCCAGTCTGYSCTGACTCAGCCW(SEQIDNO.6)VLlbCCGCTAGCCAGTCTGTGYTGACGCAGCCG(SEQIDNO.7)VL2aCCGCTAGCMACKTTATAYTGACTCAACCG(SEQIDNO.8)VL2bCCGCTAGCCAGACTGTGGTAACYCAGGAG(SEQIDNO.9)VL3aCCGCTAGCTCCTATGWGCTGACTCAGCCA(SEQIDNO.10)VL3bCCGCTAGCTCTTCTGAGCTGACTCAGGAC(SEQIDNO.11)擴(kuò)增λ輕鏈基因的下游引物為VLC TTGGCGCGCCTGAAMATKCTGTAGSGGCCACTGT(SEQ ID NO
在上述方法中，步驟(3)中所述一組幾乎覆蓋人免疫球蛋白G (IgG)全部重鏈可變區(qū) 編碼序列的特異性引物，可以擴(kuò)增得到幾乎覆蓋人免疫球蛋白G (IgG)的、重鏈Fd片段 基因。所述引物如下所示擴(kuò)增Y重鏈Fd片段基因的上游引物為
VHla:AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG(SEQIDNO.13)VHlb:AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGRTYCAGCTGGTGCAGTCTGG(SEQIDNO.14)VH2a:AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGSTRCAGCTGCAGSAGTCRGG(SEQIDNO.15)VH3a:AAGGCCCAACCGGCCATGGCCSARGTGCAGKTGGTGGAGTCTGG(SEQIDNO.16)VH3b:AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGG(SEQIDNO.17)VH4c:AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGSAGTGGGG(SEQIDNO.18)
擴(kuò)增Y重鏈Fd片段基因的下游引物為
FDGl CCGCGGCCGCTGTGTGAGTTTTGTCACAAGATTT (SEQ ID NO. 19) FDG2: CCGCGGCCGCTTTGCGCTCAACTGTCTTGTCCAC (SEQ ID NO. 20) FDG3: CCGCGGCCGCTGTGTGAGTTGTGTCACCAAGTGG (SEQ ID NO.21) FDG4: CCGCGGCCGCTGGGGGACCATATTTGGACTCAAC (SEQ ID NO. 22) 在上述方法中，步驟(4)中所述構(gòu)建輕鏈抗體庫(kù)的方法為將純化定量后完整的κ和 λ輕鏈基因以Me I和Asc I內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切消化；純化定量后與同樣酶切的噬菌體載 體進(jìn)行連接，電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞后將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于含50 μ 1氨芐青霉素的LB平板，收 集所有克隆的質(zhì)粒DNA，即構(gòu)建得輕鏈抗體庫(kù)。在上述方法中，步驟(5)中所述構(gòu)建完整的人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)的方法為 將純化定量后Y重鏈Fd片段基因以I ,Not I酶切，純化后與輕鏈抗體庫(kù)DNA連接， 同法電轉(zhuǎn)化獲得所有克隆的質(zhì)粒DNA，即構(gòu)建得人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)。本發(fā)明中，所用載體不限于特定的載體，只要它能夠與所述基因重組，形成適宜表 達(dá)質(zhì)粒即可。優(yōu)選載體為噬菌體載體。實(shí)施例中，本發(fā)明采用一種噬菌體質(zhì)粒載體pFablCN， 可以插入編碼人免疫球蛋白的輕鏈基因和重鏈Fd段的基因。本發(fā)明的宿主細(xì)胞不受特別的限制，可選自大腸桿菌、酵母或真核細(xì)胞，優(yōu)選大腸 桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明以DNA重組技術(shù)從300名健康 志愿者的外周血淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增出全套人抗體輕鏈及重鏈Fd基因，分別插入噬菌體載體 PFabICN相應(yīng)位置，構(gòu)建高容量、高多樣性的天然人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)。該方法建立 的噬菌體抗體庫(kù)是一種應(yīng)用單載體建立天然人源IgFab噬菌體抗體庫(kù)。與其他噬菌體抗體 庫(kù)構(gòu)建方法相比，該方法構(gòu)建的抗體庫(kù)具有高容量和高多樣性的特點(diǎn)，可用于高通量篩選 臨床治療用的低抗原性、高親和性人源抗體。


圖1重鏈和輕鏈基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。其中，M為IOObp Ladder DNA Marker ；1為 Y重鏈基因Fd片段(690bp) ；2為K輕鏈基因(660bp) ；3為λ輕鏈基因(660bp)。圖2pFablCN質(zhì)粒載體圖。圖3天然人源IgG輕鏈?zhǔn)删w抗體庫(kù)。圖4天然人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)。圖5天然人源噬菌體抗體庫(kù)中重鏈基因家族分布圖。圖6天然人源噬菌體抗體庫(kù)中輕鏈基因家族分布圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1人外周血淋巴細(xì)胞分離及總RNA提取
分批采集2 300份近1 6個(gè)月未患有感冒等感染性疾病，年齡分布為20 40歲的 健康志愿者抗凝外周血各2 ml，分別以淋巴細(xì)胞分離液分離獲得外周血淋巴細(xì)胞后混合， 以滅菌PBS洗滌后重懸細(xì)胞，共獲得約8 X 108個(gè)細(xì)胞，總RNA提純?cè)噭┖刑崛⊥庵苎馨?細(xì)胞總RNA。 實(shí)施例2人免疫球蛋白Fd重鏈及輕鏈基因的擴(kuò)增
以Gene Amp RNA PCR Kit進(jìn)行RT-PCR 先將淋巴細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以 一組幾乎覆蓋人免疫球蛋白G (IgG)全部輕鏈或重聯(lián)可變區(qū)編碼序列的特異性引物，對(duì)上 述反應(yīng)產(chǎn)物行PCR以分別擴(kuò)增免疫球蛋白κ、λ輕鏈和γ重鏈Fd片段。擴(kuò)增條件為 940C 2min,然后 94°C 1 2min，50^60°C 廣2min，72°C 1 2min，共 30 個(gè)循環(huán)，最終延長(zhǎng) 為72°C 1 lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)2. 0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，顯示重鏈Fd基因長(zhǎng)度約為690 bp，輕鏈k、l基因長(zhǎng)度約為660 bp (圖1)。實(shí)施例3天然人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建
輕鏈基因κ、λ分別以限制性內(nèi)切酶Asc I.Nhe I酶切，純化后以κ λ輕鏈基因7:1 混合后與噬菌體載體pFabICN[1]連接(圖2)，連接產(chǎn)物提純后溶于4 μ 1蒸餾水中，分2次電 轉(zhuǎn)JM109感受態(tài)細(xì)胞后將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于含50 μ 1氨芐青霉素的LB平板，收集所有克隆 的質(zhì)粒DNA，即為輕鏈抗體庫(kù)。經(jīng)HindIII單酶切鑒定，輕鏈抗體庫(kù)DNA基因大小為5060bp (圖 3)。γ重鏈Fd片段基因PCR產(chǎn)物以Sfi I、Not I酶切，純化后與輕鏈庫(kù)DNA連接， 同法電轉(zhuǎn)化獲得所有克隆的質(zhì)粒DNA，即為抗體庫(kù)DNA。經(jīng)HindIII單酶切鑒定，抗體庫(kù)的 DNA基因的長(zhǎng)度約為5700bp (圖4)。同時(shí)，將轉(zhuǎn)化菌梯度稀釋后，涂板計(jì)數(shù)菌落數(shù)目，經(jīng)計(jì) 算最終獲得非依賴性克隆滴度(即庫(kù)容量)為4X108，符合大容量噬菌體抗體庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例4天然人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)的鑒定及多樣性分析
抗體庫(kù)DNA分三次轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑選克隆，提取質(zhì)粒DNA，首先以λ Hind III酶切初步鑒定，進(jìn)一步以Asc I.Nhe I或Sfi I、Not I雙酶切后，鑒定輕重鏈插 入片段酶切位點(diǎn)是否正確。對(duì)輕重鏈均插入正確的質(zhì)粒，以雙酶切分別獲得輕鏈、重鏈基 因片段，分別與測(cè)序載體CV-2、CV-I連接，送Invitrogen (英濰捷基貿(mào)易有限公司)以ABI 3730 DNA測(cè)序儀測(cè)定核苷酸序列并推算氨基酸序列，并利用IgBLAST數(shù)據(jù)庫(kù)(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/igblast/)分析抗體基因的同源家族信息。對(duì)三次隨機(jī)挑選克隆獲得的輕重鏈基因插入正確的32個(gè)克隆進(jìn)行輕重鏈基因測(cè) 序，以IgBLAST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核苷酸序列分析和氨基酸推算。在總共32條重鏈 核苷酸序列中，其中2條重鏈基因較正常明顯縮短，另1條不屬于人免疫球蛋白基因，其余 29條重鏈Fd基因片段均能正確翻譯，占所測(cè)序列的90. 6%。所有29條重鏈所對(duì)應(yīng)的輕鏈 基因序列大小正常并能正常翻譯。經(jīng)IgBLAST比對(duì)，29條重鏈基因的V，D，J片段所屬的基因家族分布見圖5所示，重 鏈可變區(qū)V片段分屬于VHlI基因家族，其中VH3基因家族有21條，占72%，VHl基因家族 3條(10. 3%)，VH4、VH5基因家族各2條(各6. 9%)，VH7基因家族1條(3. 4%)。屬于VH3基因家族的21條重鏈基因包括了 3-7、3-30 (各4條)，3-23、3-48、3-66 (各2條)，3-9，3-11， 3-15，3-20，3-21，3-43和3-74 (各1條)；重鏈可變區(qū)D片段分別屬于廣6基因家族，以 DH3家族最多(58. 6%);重鏈可變區(qū)J片段分別屬于廣6家族，以JH4家族最多(31. 0%)。29 條輕鏈基因可變區(qū)V片段分別屬于Vk 1 (13條，44.8%)、Vk 2 (4條，15. 4%)、V κ 3 (3條， 11.5%)、Vk 4 (6條，23. 1%)基因家族和νλ 1 (3條，11. 5%)基因家族；輕鏈基因可變區(qū)J 片段分別屬于Jk廣2，Jk4 Jk5和JX3 (圖6)。由此說(shuō)明，該天然人源IgGFab噬菌體 抗體庫(kù)具有高度的基因多樣性，從而有利于從中獲得任意抗原抗體。
參考文獻(xiàn)
1.Takekoshi M, Maeda F, Tachibana H, et al. Human monoclonal anti-HCMV neutralizing
antibody from phage display libraries. J Virol Methods, 1998； 74: 89 - 98
權(quán)利要求
一種天然人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于具體步驟如下(1)健康人外周血淋巴細(xì)胞分離及總RNA提取，通過(guò)RT PCR合成cDNA；(2)以cDNA為模板，用一組幾乎覆蓋人免疫球蛋白G(IgG)全部輕鏈可變區(qū)編碼序列的特異性引物分別擴(kuò)增人免疫球蛋白的輕鏈基因，得到幾乎覆蓋人免疫球蛋白G(IgG)的完整κ和λ輕鏈基因；(3)以cDNA為模板，用一組幾乎覆蓋人免疫球蛋白G(IgG)全部重鏈可變區(qū)編碼序列的特異性引物分別擴(kuò)增人免疫球蛋白的Fd重鏈基因，得到幾乎覆蓋人免疫球蛋白G(IgG)的γ重鏈Fd片段基因；(4)將獲得的人免疫球蛋白G(IgG)的輕鏈基因與噬菌體載體連接，構(gòu)建輕鏈抗體庫(kù)；(5)將獲得的人免疫球蛋白G(IgG)的Fd重鏈基因與輕鏈抗體庫(kù)DNA連接，構(gòu)建完整的人源IgG Fab噬菌體抗體庫(kù)；(6)經(jīng)過(guò)多輪的抗原親和吸附—洗脫—擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆，然后轉(zhuǎn)化宿主使目標(biāo)抗體表達(dá)；(7)對(duì)純化的抗體進(jìn)行生物活性與功能鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述健康人的選擇方法為近1 6個(gè)月未 患有感染性疾病，年齡分布為20 40歲，人數(shù)為2 300名。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述一組幾乎覆蓋人免疫球蛋 白G (IgG)全部輕鏈可變區(qū)編碼序列的特異性引物如下所示擴(kuò)增κ輕鏈基因的上游引物為 VKl CCGCTAGCGMCATYCAGWTGACCCAGTCTCC VK2a: CCGCTAGCGATRTTGTGATGACYCAGffCTCC VK3a: CCGCTAGCGAAATTGTGffTGACGCAGTCTCC VK4: CCGCTAGCGACATCGffGHTGACCCAGTCTCC 擴(kuò)增κ輕鏈基因的下游引物為 VKC: TTGGCGCGCCACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT 擴(kuò)增λ輕鏈基因的上游引物為 VLla: CCGCTAGCCAGTCTGYSCTGACTCAGCCff VLlb: CCGCTAGCCAGTCTGTGYTGACGCAGCCG VL2a: CCGCTAGCMACKTTATAYTGACTCAACCG VL2b CCGCTAGCCAGACTGTGGTAACYCAGGAG VL3a: CCGCTAGCTCCTATGffGCTGACTCAGCCA VL3b CCGCTAGCTCTTCTGAGCTGACTCAGGAC 擴(kuò)增λ輕鏈基因的下游引物為 VLC: TTGGCGCGCCTGAAMATKCTGTAGSGGCCACTGTo
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述一組幾乎覆蓋人免疫球蛋 白G (IgG)全部重鏈可變區(qū)編碼序列的特異性引物如下所示擴(kuò)增重鏈Fd段基因的上游引物為VHla: AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG VHlb AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGRTYCAGCTGGTGCAGTCTGGVH2a AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGSTRCAGCTGCAGSAGTCRGGVH3a AAGGCCCAACCGGCCATGGCCSARGTGCAGKTGGTGGAGTCTGGVH3b AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGVH4c AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGSAGTGGGG擴(kuò)增重鏈Fd段基因的下游引物為FDGl CCGCGGCCGCTGTGTGAGTTTTGTCACAAGATTTFDG2 CCGCGGCCGCTTTGCGCTCAACTGTCTTGTCCACFDG3 CCGCGGCCGCTGTGTGAGTTGTGTCACCAAGTGGFDG4 CCGCGGCCGCTGGGGGACCATATTTGGACTCAAC。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中所述構(gòu)建輕鏈抗體庫(kù)的方法為 將純化定量后完整的κ和λ輕鏈基因以Me I和Asc I內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切消化；純化定量 后與同樣酶切的噬菌體載體進(jìn)行連接，電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞后將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于含50 μ 1 氨芐青霉素的LB平板，收集所有克隆的質(zhì)粒DNA，即構(gòu)建得輕鏈抗體庫(kù)。
全文摘要
本發(fā)明基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種天然人源IgGFab噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建方法。本發(fā)明以DNA重組技術(shù)從健康志愿者的外周血淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增出全套人抗體輕鏈及重鏈Fd基因，分別插入噬菌體載體pFabICN相應(yīng)位置，構(gòu)建高容量、高多樣性的天然人源IgGFab噬菌體抗體庫(kù)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該方法建立的噬菌體抗體庫(kù)的庫(kù)容可高達(dá)4×108，符合大容量抗體庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)，且包含全套人抗體輕鏈及重鏈Fd基因，具有高度的多樣性。與其他噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建方法相比，該方法構(gòu)建的抗體庫(kù)具有高容量和高多樣性的優(yōu)點(diǎn)，可用于高通量篩選臨床治療用的低抗原性、高親和性人源抗體。
文檔編號(hào)C40B50/06GK101892525SQ201010228709
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者付永峰, 橘裕司, 程訓(xùn)佳 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)