專利名稱：一種使疏水性納米顆粒同時實現(xiàn)水相轉(zhuǎn)移與細胞核靶向性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明介紹了ー種使疏水性納米顆粒同時實現(xiàn)水相轉(zhuǎn)移與細胞核靶向性的方法，屬于納米材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
當(dāng)今世界飛速發(fā)展的納米技術(shù)使得在復(fù)雜生物體內(nèi)精確控制納米顆粒在特定器官、特定細胞甚至特定細胞器中的定位成為可能 。這其中，在亞細胞水平上，設(shè)計具有特定細胞器靶向性的新型功能納米材料雖具有挑戰(zhàn)性，但卻具有深遠的意義。細胞核是細胞中最重要的細胞器，同時也是許多抗癌藥物(如阿霉素、順鉬等)的作用靶點。制備具有細胞核靶向性的功能納米材料將會對深入研究發(fā)生在細胞核中的重大生命活動以及開發(fā)針對細胞核的新型診斷以及治療策略等具有極其重要的作用。然而實現(xiàn)納米顆粒在亞細胞水平的靶向輸送并非易事。因為納米顆粒要想靶向定位到特定的細胞器，則必須穿越細胞膜等多重障礙，同時在到達特定的細胞器之前，還需要避免被細胞內(nèi)的清除系統(tǒng)所清除。迄今為止，納米顆粒的細胞核祀向性大多是通過在顆粒表面修飾細胞核定位信號肽(nuclearlocalization signal peptides,簡稱NLS)實現(xiàn)的,這一方法要求顆粒表面可以與NLS結(jié)合，因而該方法通常僅適用于金或銀等可以直接與含巰基的NLS結(jié)合的納米顆粒的細胞核革巴向性。納米材料的合成大致可以分成油相合成與水相合成兩條路線。迄今為止，大多數(shù)高質(zhì)量(如高的結(jié)晶度，高的分散性，高的光學(xué)、磁學(xué)性能等)的納米材料都是通過油相合成得到的。這些油相中得到的納米顆粒通常表面都具有疏水性的側(cè)鏈，不易分散于水相中，所以必須經(jīng)過轉(zhuǎn)水相處理之后，才可以用于生物體系。利用巰基試劑或者表面活性劑等對納米顆粒表面進行修飾是實現(xiàn)納米顆粒轉(zhuǎn)水相的常用方法之一。然而，這些方法都未能在實現(xiàn)轉(zhuǎn)水相的同吋，賦予顆粒細胞核靶向性。季銨鹽表面活性劑是ー種常用的陽離子表面活性剤，它是銨鹽的4個氫原子被有機基團代替而形成的，具有R4N+X-的結(jié)構(gòu)(其中四個烴基R可以相同，也可不同。X多是鹵素負離子(F、Cl、Br、I)，也可是酸根(如HS04、RCOO等))。常用的季銨鹽表面活性劑為C12、C14, C16以及C18的單長碳鏈型季銨鹽，主要包括十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基ニ甲基芐基氯化銨、十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨、十八烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基氯化銨、十八烷基ニ甲基羥こ基過氯酸銨等。2006年RichardW. Horobin等人研究了包括季銨鹽表面活性劑在內(nèi)的陽離子探針具有細胞核靶向性的原因(參考文獻=Histochem Cell Biol (2006) 126 :165-175)，并指出陽離子表面活性劑與具有電負性的核酸物質(zhì)之間高的親和カ是陽離子表面活性劑趨核性的主要驅(qū)動力。同時，季銨鹽結(jié)構(gòu)的存在可減少該表面活性劑在非核部位的聚集，進而增強該表面活性劑的細胞核靶向選擇性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中無法實現(xiàn)轉(zhuǎn)水相的同時，賦予顆粒細胞核靶向性；以及在顆粒表面修飾細胞核定位信號肽エ藝復(fù)雜的問題，提供了ー種使疏水性納米顆粒同時實現(xiàn)水相轉(zhuǎn)移與細胞核靶向性的方法。本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。本發(fā)明的ー種使疏水性納米顆粒同時實現(xiàn)水相轉(zhuǎn)移與細胞核靶向性的方法，具體步驟如下向含有季銨鹽型表面活性劑的水溶液中加入含有疏水性納米顆粒的有機溶液，并攪拌；所用季銨鹽型表面活性劑與疏水性納米顆粒的摩爾比為1:1 IO6 : 1，所用有機溶液與水溶液的體積比為1:1 1:1O3;然后分離除去多余的表面活性劑分子，最后將轉(zhuǎn)水相后的顆粒與細胞共孵育，發(fā)現(xiàn)顆粒能夠穿越細胞膜進入細胞質(zhì)，最終定位到細胞核中。
上述步驟中所用表面活性劑為季銨鹽型表面活性剤，其疏水端為含12 18個碳原子的單長碳鏈，包括十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基ニ甲基芐基氯化銨、十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨、十八烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基氯化銨、十八烷基ニ甲基羥こ基過氯酸銨等。所選用的疏水性納米顆?？梢赃x擇磁性納米顆粒，金納米顆粒，銀納米顆?；蛘吡孔狱c等，但要求顆粒的粒徑需小于lOOnm，顆粒分散且顆粒表面含油酸等疏水性側(cè)鏈。有益效果1、本發(fā)明的ー種使疏水性納米顆粒同時實現(xiàn)水相轉(zhuǎn)移與細胞核靶向性的方法，可以實現(xiàn)疏水性納米顆粒的水相轉(zhuǎn)移。并且相轉(zhuǎn)移之后的納米顆粒分散性好，水相穩(wěn)定。相轉(zhuǎn)移后的顆粒的水溶液在4°c下避光存放半年之后，溶液中無沉淀或渾濁出現(xiàn)。更重要的是，相轉(zhuǎn)移前后，納米顆粒本身的光學(xué)及磁學(xué)性質(zhì)均不會有明顯的改變。2、本發(fā)明的ー種使疏水性納米顆粒同時實現(xiàn)水相轉(zhuǎn)移與細胞核靶向性的方法，在實現(xiàn)顆粒轉(zhuǎn)水相的同時，還可以賦予顆粒細胞核靶向性。即利用表面活性劑(如十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基ニ甲基芐基氯化銨、十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨、十八烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基氯化銨、十八烷基ニ甲基羥こ基過氯酸銨等)修飾后，所得納米顆粒不必再經(jīng)任何其他修飾或處理，就具有顯著的細胞核靶向功能，能夠穿過細胞膜進入細胞，并選擇性的定位到細胞核中。3、本發(fā)明的ー種使疏水性納米顆粒同時實現(xiàn)水相轉(zhuǎn)移與細胞核靶向性的方法，無需在顆粒表面修飾細胞核定位信號肽就可以實現(xiàn)納米顆粒的細胞核靶向性，本發(fā)明エ藝簡單，容易操作。4、本發(fā)明的ー種使疏水性納米顆粒同時實現(xiàn)水相轉(zhuǎn)移與細胞核靶向性的方法，納米顆粒的成功水相轉(zhuǎn)移使得納米顆粒在生物體系中的應(yīng)用成為可能。而轉(zhuǎn)水相后納米顆粒的細胞核靶向性則使該納米顆?？梢杂糜诩毎税邢虺上?，以及靶向細胞核的藥物輸送。正如背景技術(shù)中所談到的，細胞核是細胞中最重要的細胞器。具有細胞核靶向性的熒光探針必將會在重大疾病的診斷、檢測以及治療等方面發(fā)揮重要作用。對于本發(fā)明而言，更重要的一點是轉(zhuǎn)水相與細胞核靶向這兩個過程僅僅是通過ー步簡單的表面活性劑修飾就能同時實現(xiàn)。這ー簡單但有效的方法將進ー步增強這類具有細胞核靶向性的納米材料的生物應(yīng)用前景。


圖1為實施例1中的CdS納米顆粒在十六烷基三甲基溴化銨修飾之前(a圖)和之后(b圖)的透射電子顯微鏡照片；圖2為實施例4制備的十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨修飾的CuInS2-ZnS納米顆粒在HeLa細胞中的核靶向定位的明場(Bright field)照片，共聚焦(CLSM)照片以及兩者疊加(Merged)后的照片。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進ー步的描述，但本發(fā)明并不僅僅限制于如下所述的·實施例。實施例1、十六烷基三甲基溴化銨修飾的CdS納米顆粒的制備。取油酸包覆的CdS納米晶(平均粒徑為3. 2nm，如附圖1a所示)的氯仿溶液Iml (其中含有的CdS的濃度為0. 5mg/ml)，在磁力攪拌下，緩緩加入到30ml十六烷基三甲基溴化銨的水溶液中(該溶液中十六烷基三甲基溴化銨的濃度為0. 05M)，然后繼續(xù)磁力攪拌48小時。48小時后，利用截留分子量為IOKDa的超濾離心管多次離心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十六烷基三甲基溴化銨。最終所得十六烷基三甲基溴化銨修飾的CdS納米顆粒在水中分散性很好，平均尺寸約為4.1nm(如附圖1b所示)。將十六烷基三甲基溴化銨修飾的CdS納米顆粒與人肝癌HepG2細胞共同培養(yǎng)3小時后，發(fā)現(xiàn)該納米顆粒主要存在于H印G2細胞的細胞核中。實施例2、十二烷基ニ甲基芐基氯化銨修飾CdS納米顆粒的制備.取油酸包覆的CdS納米晶(平均粒徑為3. 2nm)的氯仿溶液Iml (其中含有的CdS的濃度為0. 5mg/ml)，在磁力攪拌下，緩緩加入到40ml十二烷基ニ甲基芐基氯化銨的水溶液中(該溶液中十二烷基ニ甲基芐基氯化銨的濃度為0. 2M)，然后繼續(xù)磁力攪拌24小吋。24小時后，利用截留分子量為IOKDa的超濾離心管多次離心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十二烷基ニ甲基芐基氯化銨。最終所得十二烷基ニ甲基芐基氯化銨修飾的CdS納米顆粒在水中分散性很好，平均尺寸約為5. 4nm。將十二烷基ニ甲基芐基氯化銨修飾的CdS納米顆粒與人肝癌HepG2細胞共同培養(yǎng)3小時后，發(fā)現(xiàn)該納米顆粒主要存在于HepG2細胞的細胞核中。實施例3、十二烷基ニ甲基芐基氯化銨修飾的磁性Fe3O4納米顆粒的制備。取油酸包覆的磁性Fe3O4納米顆粒(平均粒徑為5nm)的氯仿溶液Iml (其中含有的磁性Fe3O4的濃度為5mg/ml),在機械攪拌下,緩緩加入到40ml十二燒基ニ甲基節(jié)基氯化銨的水溶液中(該溶液中十二烷基ニ甲基芐基氯化銨的濃度為0. 2M)，然后繼續(xù)機械攪拌24小吋。24小時后，利用截留分子量為IOKDa的超濾離心管多次離心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十二烷基ニ甲基芐基氯化銨。最終所得十二烷基ニ甲基芐基氯化銨修飾的磁性Fe3O4納米顆粒在水中分散性很好，平均尺寸約為7. 6nm。并且將十二烷基ニ甲基芐基氯化銨修飾的磁性Fe3O4納米顆粒與人結(jié)直腸癌Caco-2細胞共培養(yǎng)3小時后，發(fā)現(xiàn)該納米顆粒主要存在于Caco-2細胞的細胞核中。實施例4、十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨修飾的CuInS2-ZnS納米顆粒的制備。
取油酸包覆的CuInS2-ZnS納米顆粒(平均粒徑為4nm)的氯仿溶液Iml (其中含有的CuInS2-ZnS的濃度為0. 3mg/ml)，在機械攪拌下，緩緩加入到30ml十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨的水溶液中(該溶液中十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨的濃度為0. 3M)，然后繼續(xù)機械攪拌12小吋。12小時后，利用截留分子量為IOKDa的超濾離心管多次離心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨。最終所得十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨修飾的CuInS2-ZnS納米顆粒在水中分散性很好，平均尺寸約為6. 6nm。并且將十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨修飾的CuInS2-ZnS納米顆粒與人宮頸癌HeLa細胞共培養(yǎng)3小時后，發(fā)現(xiàn)該納米顆粒主要存在于HeLa細胞的細胞核中，如圖2所示。實施例5、十八烷基三甲基溴化銨修飾的Au納米顆粒的制備。取油酸包覆的Au納米顆粒(平均粒徑為4nm)的氯仿溶液Iml (其中含有的Au的濃度為0. lmg/ml)，在磁力攪拌下，緩緩加入到20ml十八烷基三甲基溴化銨的水溶液中(該溶液中十八烷基三甲基溴化銨的濃度為0. 05M)，然后繼續(xù)磁力攪拌48小吋。48小時后，利用截留分子量為IOKDa的超濾離心管多次離心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十八烷基三甲基溴化銨。最終所得十八烷基三甲基溴化銨修飾的Au納米顆粒在水中分散性很好，平均尺寸約為5. Onm。將十八烷基三甲基溴化銨修飾的Au納米顆粒與人臍靜脈血管內(nèi)皮HUVEC細胞共同培養(yǎng)3小時后，發(fā)現(xiàn)該納米顆粒主要存在于HUVEC細胞的細胞核中。實施例6、十四烷基三甲基溴化銨(十四烷基三甲基溴化銨)修飾的Cu2InCaSe4納米顆粒的制備。取油酸包覆的Cu2InCaSe4納米顆粒(平均粒徑為IOOnm)的氯仿溶液Iml (其中含有Cu2InCaSe4的濃度為10mg/ml)，在磁力攪拌下，緩緩加入到20ml十四烷基三甲基溴化銨的水溶液中(該溶液中十四烷基三甲基溴化銨的濃度為0. 5M)，然后繼續(xù)磁力攪拌48小吋。48小時后，利用截留分子量為IOKDa的超濾離心管多次離心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十四烷基三甲基溴化銨。最終所得十四烷基三甲基溴化銨修飾的Cu2InCaSe4納米顆粒在水中分散性很好，平均尺寸約為120nm。將十四烷基三甲基溴化銨修飾的Cu2InCaSe4納米顆粒與人宮頸癌HeLa細胞共同培養(yǎng)3小時后，發(fā)現(xiàn)該納米顆粒主要存在于HeLa細胞的細胞核中。實施例7、十六烷基三甲基溴化銨修飾的CuInS2-ZnS納米顆粒的制備 取油酸包覆的CuInS2-ZnS納米顆粒(平均粒徑為50nm)的氯仿溶液Iml (其中含有的CuInS2-ZnS的濃度為5mg/ml)，在磁力攪拌下，緩緩加入到30ml十六烷基三甲基溴化銨的水溶液中(該溶液中十六烷基三甲基溴化銨的濃度為0. 1M)，然后繼續(xù)磁力攪拌72小吋。72小時后，利用截留分子量為IOKDa的超濾離心管多次離心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十六烷基三甲基溴化銨。最終所得十六烷基三甲基溴化銨修飾的CuInS2-ZnS納米顆粒在水中分散性很好，平均尺寸約為62nm。將十六烷基三甲基溴化銨修飾的CuInS2-ZnS納米顆粒與人臍靜脈血管內(nèi)皮HUVEC細胞共同培養(yǎng)3小時后，發(fā)現(xiàn)該納米顆粒主要存在于HUVEC細胞的細胞核中。實施例8、十二烷基三甲基氯化銨修飾的PbS納米顆粒的制備。取油酸包覆的PbS納米顆粒(平均粒徑為IOnm)的氯仿溶液Iml (其中含有的PbS的濃度為0. lmg/ml)，在磁力攪拌下，緩緩加入到20ml十二烷基三甲基氯化銨的水溶液中(該溶液中十二烷基三甲基氯化銨的濃度為0. 3M)，然后繼續(xù)磁力攪拌24小吋。24小時后，利用截留分子量為IOKDa的超濾離心管多次離心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十二烷基三甲基氯化銨。最終所得十二烷基三甲基氯化銨修飾的PbS納米顆粒在水中分散性很好，平均尺寸約為14. 3nm。將十二烷基三甲基氯化銨修飾的PbS納米顆粒與人肝癌H印G2細胞共同培養(yǎng)3小時后，發(fā)現(xiàn)該納米顆粒主要存在于HepG2細胞的細胞核中。實施例9、十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨修飾的PbS納米顆粒的制備取油酸包覆的PbS納米顆粒(平均粒徑為IOnm)的氯仿溶液Iml (其中含有的PbS的濃度為0. lmg/ml)，在磁力攪拌下，緩緩加入到30ml十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨的水溶液中(該溶液中十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨的濃度為0. 2M)，然后繼續(xù)磁力攪拌48小吋。48小時后，利用截留分子量為IOKDa的超濾離心管多次離心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨。最終所得十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨修飾的PbS納米顆粒在水中分散性很好，平均尺寸約為13.6nm。將十八烷基ニ甲基羥こ基硝酸銨修飾的PbS納米顆粒與人肝癌HepG2細胞共同培養(yǎng)3小時后，發(fā)現(xiàn)該納米顆粒主要存在于 IfepG2細胞的細胞核中。實施例10、十八烷基ニ甲基羥こ基過氯酸銨修飾的ZnS納米顆粒的制備。取油酸包覆的ZnS納米顆粒(平均粒徑為18nm)的氯仿溶液Iml (其中含有的ZnS的濃度為0. 05mg/ml)，在磁力攪拌下，緩緩加入到20ml十八烷基ニ甲基羥こ基過氯酸銨的水溶液中(該溶液中十八烷基ニ甲基羥こ基過氯酸銨的濃度為0. 2M)，然后繼續(xù)磁力攪拌24小吋。24小時后，利用截留分子量為IOKDa的超濾離心管多次離心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十八烷基ニ甲基羥こ基過氯酸銨。最終所得十八烷基ニ甲基羥こ基過氯酸銨修飾的ZnS納米顆粒在水中分散性很好，平均尺寸約為23. 5nm。將十八烷基ニ甲基羥こ基過氯酸銨修飾的ZnS納米顆粒與人結(jié)直腸癌Caco-2細胞共同培養(yǎng)3小時后，發(fā)現(xiàn)該納米顆粒主要存在于Caco-2細胞的細胞核中。
權(quán)利要求
1.一種使疏水性納米顆粒同時實現(xiàn)水相轉(zhuǎn)移與細胞核靶向性的方法，其特征在于向含有季銨鹽型表面活性劑的水溶液中加入含有疏水性納米顆粒的有機溶液，并攪拌；所用季銨鹽型表面活性劑與疏水性納米顆粒的摩爾比為1:1 IO6 : 1，所用有機溶液與水溶液的體積比為1:1 1:1O3;然后分離除去多余的表面活性劑分子，最后將轉(zhuǎn)水相后的顆粒與細胞共孵育，發(fā)現(xiàn)顆粒能夠穿越細胞膜進入細胞質(zhì)，最終定位到細胞核中。
2.如權(quán)利要求1所述的一種使疏水性納米顆粒同時實現(xiàn)水相轉(zhuǎn)移與細胞核靶向性的方法，其特征在于所述表面活性劑為季銨鹽型表面活性劑，其疏水端為含12 18個碳原子的單長碳鏈。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種使疏水性納米顆粒同時實現(xiàn)水相轉(zhuǎn)移與細胞核靶向性的方法，其特征在于所述表面活性劑包括十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基二甲基芐基氯化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十八烷基二甲基羥乙基硝酸銨、十八烷基三甲基溴化銨、十二烷基三甲基氯化銨、十八烷基二甲基羥乙基過氯酸銨。
4.如權(quán)利要求1所述的一種使疏水性納米顆粒同時實現(xiàn)水相轉(zhuǎn)移與細胞核靶向性的方法，其特征在于所述疏水性納米顆粒包括磁性納米顆粒、金納米顆粒、銀納米顆?；蛘吡孔狱c；顆粒的粒徑需小于lOOnm，顆粒分散且顆粒表面含油酸等疏水性側(cè)鏈。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使疏水性納米顆粒同時實現(xiàn)水相轉(zhuǎn)移與細胞核靶向性的方法，屬于納米材料技術(shù)領(lǐng)域。其實施步驟簡單概括為向含有一定濃度表面活性劑的水溶液中加入適量含有疏水性納米顆粒的有機溶液，并攪拌適當(dāng)時間。然后分離除去多余的表面活性劑分子。本發(fā)明中所使用的表面活性劑分子其親水端含有季銨鹽。利用該類表面活性劑對疏水性納米顆粒進行修飾，不僅僅可以實現(xiàn)疏水性納米顆粒的水相轉(zhuǎn)移，而且轉(zhuǎn)水相之后，無需任何其他修飾或處理，這些納米顆粒就表現(xiàn)出很明顯的細胞核靶向效果。
文檔編號C01G9/08GK103011258SQ20121043660
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月5日
發(fā)明者曹傳寶, 王美娜, 王艷麗, 白駒 申請人:北京理工大學(xué)