專利名稱：抑制腫瘤生長(zhǎng)的新抗體、其衍生物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗人癌蛋白HER2(erbB2)的單克隆抗體及生產(chǎn)其的雜交瘤細(xì)胞。本發(fā)明還涉及該單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，及應(yīng)用所述基因產(chǎn)生的一族抗體衍生物，及所述抗體及衍生物的應(yīng)用。
HER2又稱c-erbB2，是一種原癌基因，編碼一分子量為185KD的具有酪氨酸激酶活性的細(xì)胞跨膜蛋白，定義為p185，屬表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)受體家族的成員，但其特性不同于EGFR。1981年Shih等首先發(fā)現(xiàn)在乙基硝脲誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤中存在一種有轉(zhuǎn)化活性的癌基因，并命名為neu，此后Sohechter進(jìn)一步證實(shí)了neu癌基因的存在，在人類腫瘤中也發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的基因，命名為HER2或c-erbB2。人HER2的產(chǎn)物p185磷酸蛋白由三部分組成，即胞外區(qū)，跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)，HER2基因位于人17號(hào)染色體q21帶上。
眾多的研究資料證明，人類多種上皮來源的惡性腫瘤都有HER2的擴(kuò)增或過度表達(dá)，而正常組織或良性腫瘤組織極少有HER2表達(dá)或低表達(dá)，Clark報(bào)道30-60％的乳癌有HER2的過度表達(dá)或擴(kuò)增，20-30％卵巢癌、30-55％胃癌、27-56％的非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、40％腎癌、36％膀胱癌等均有HER2的過量表達(dá)或擴(kuò)增，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)癌旁組織HER2表達(dá)顯著低于癌組織、轉(zhuǎn)移灶HER2明顯地高表達(dá)，這些資料表明HER2在腫瘤發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，是腫瘤進(jìn)展中的一個(gè)重要步驟，因此HER2是治療惡性腫瘤的一個(gè)重要的特異性強(qiáng)的靶分子。有實(shí)驗(yàn)證明HER2拮抗劑，如抗體、反義寡核苷酸均能抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移并與病人的預(yù)后及存活期密切相關(guān)。Slamon等報(bào)道HER2表達(dá)水平越高的乳癌病人易于復(fù)發(fā)，預(yù)后差，存活期越短。HER2高表達(dá)的卵巢癌病人平均存活期只有0.67年，而HER2低表達(dá)的病人平均存活期為5年，類似的資料還見于小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤病人。目前臨床上常規(guī)治療腫瘤的三大措施為手術(shù)、放射治療(放療)、化學(xué)藥物治療(化療)，對(duì)早期腫瘤病人及尚未發(fā)生轉(zhuǎn)移的病人有較好的療效，但對(duì)已發(fā)生轉(zhuǎn)移或手術(shù)后又發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的病人則無濟(jì)于事，這些病人治愈率低、死亡率高，盡管化療也能用于治療已發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的腫瘤病人，但因化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也殺傷正常細(xì)胞，因此毒副作用大，許多病人常因嚴(yán)重副作用而無法完成常規(guī)的治療療程。同時(shí)目前腫瘤死亡率居高不下(占疾病死亡的第一、二位)，其主要原因之一是目前三大常規(guī)治療后的各種腫瘤病人復(fù)發(fā)率高，一般可達(dá)40-50％，有的腫瘤高達(dá)60-70％，因此尋找和開發(fā)新的特異性殺傷腫瘤細(xì)胞、解決腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的治療劑是腫瘤治療急待解決的重要問題，也是降低腫瘤病人死亡率的關(guān)鍵問題，目前正在研制開發(fā)的各種生物治療劑中，如基因治療、繼承性免疫治療(如LAK細(xì)胞、TIL細(xì)胞)、各種因子及抗體導(dǎo)向治療等尚未找到一類有效的治療劑。HER2在多種腫瘤的特異性高表達(dá)且與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，因此為開發(fā)以HER2為靶分子的特異性地殺傷HER2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的新治療劑提供了重要依據(jù)。HER2是在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的大分子蛋白，具有免疫原性，能在異種動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗人HER2的抗體，這種抗體能特異地識(shí)別HER2蛋白分子(抗原)，并與之結(jié)合，這種識(shí)別的特異性非常專一，因此抗人HER2的抗體只能與人HER2抗原結(jié)合，決不會(huì)與任何其它分子結(jié)合。利用小鼠，采用雜交瘤技術(shù)可以制備抗人HER2的單克隆抗體，將這種抗體偶聯(lián)上能有效殺傷腫瘤細(xì)胞的放射核素、化療藥物及其它有效生物制劑，注入人體內(nèi)，由于HER2抗體能專一地識(shí)別HER2蛋白分子，這些抗體的偶聯(lián)物，將由抗HER2抗體特異地帶到細(xì)胞表面表達(dá)有HER2蛋白分子的腫瘤細(xì)胞上，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而無HER2表達(dá)的正常細(xì)胞因?yàn)檫@些帶有偶聯(lián)物的抗體不可能與它們結(jié)合而不致被損害，這不僅克服了放、化療在殺傷腫瘤細(xì)胞同時(shí)殺傷正常細(xì)胞的毒副作用，而且放射核素或藥物直接到達(dá)腫瘤細(xì)胞所在部位提高了局部放射強(qiáng)度及藥物劑量，因此療效更好，尤其對(duì)于那些用現(xiàn)有設(shè)備不能檢出的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的微小腫瘤灶及散在的癌細(xì)胞均能有效地識(shí)別殺傷，因此能有效地治療腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的即在于提供一種雜交瘤細(xì)胞系，其能分泌特異于抗人癌蛋白HER2的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一目的在于提供由所述雜交瘤細(xì)胞系分泌的單克隆抗體，本發(fā)明的HER2抗體在不偶聯(lián)任何放射核素、化療藥物的情況下也能阻止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)從而達(dá)到治療的目的。
本發(fā)明的再一目的在于提供本發(fā)明的單克隆抗體的可變區(qū)基因，以及由該基因構(gòu)建的一系列衍生抗體或融合蛋白的基因以表達(dá)所述衍生抗體或融合蛋白。
本發(fā)明的又一目的在于提供本發(fā)明的單克隆抗體及其衍生物在診斷腫瘤、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及判斷腫瘤預(yù)后中的應(yīng)用以及在分離、純化或分析HER2癌蛋白或HER2癌蛋白配體中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞系，其命名為HER2-McAB-YFC10C25(以下稱為YFC10C25)，其能分泌抗人癌蛋白HER2的單克隆抗體。所述雜交瘤細(xì)胞系于2000年6月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO 0457。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種新的抗人HER2單克隆抗體，其能抑制HER2陽性腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了所述單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。所述重鏈可變區(qū)基因具有SEQ ID NO1所示的序列，所述輕鏈可變區(qū)基因具有SEQ ID NO2所示的序列。本發(fā)明還包括含有所述基因的表達(dá)載體及宿主細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了所述單克隆抗體的一系列衍生物，它們能夠特異性地殺傷HER2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞及抑制其生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性，所述衍生物包括嵌合抗體、全人源化抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、胞內(nèi)抗體、單鏈抗體嵌合受體、Fab及Fab表達(dá)庫產(chǎn)生的肽段等。本發(fā)明的抗人HER2單克隆抗體及衍生物可與各種放射核素、生物毒素、化療藥物、酶前體物偶聯(lián)制成特定的生物制劑。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗人HER2單克隆抗體及其衍生物在體內(nèi)外診斷腫瘤、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及判斷腫瘤預(yù)后中的用途，以及在分離、純化或分析HER2癌蛋白或其配體中的應(yīng)用。
如上所述HER2蛋白分子只特異地高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，正常細(xì)胞極少表達(dá)，抗人HER2的抗體也只與表面有HER2蛋白分子高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，同時(shí)腫瘤細(xì)胞HER2蛋白分子是否陽性表達(dá)與腫瘤病人的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)，因此通過檢測(cè)HER2蛋白分子的存在能輔助診斷腫瘤，預(yù)示病人的預(yù)后，為臨床確定治療方案提供重要依據(jù)，是一個(gè)有用的生物標(biāo)志物。本發(fā)明的HER2抗體可用于制備檢測(cè)病人腫瘤組織、體液中的HER2抗原的制劑。目前能夠有效、特異地檢測(cè)診斷腫瘤和判斷預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志甚少。鑒于HER2在腫瘤細(xì)胞表面特異的高表達(dá)，正常組織低表達(dá)或不表達(dá)，因此抗人HER2的抗體標(biāo)記放射核素后能用于制備體內(nèi)放射免疫顯像診斷腫瘤的顯像劑。這種放射免疫顯像劑，不僅能用于診斷腫瘤的部位、大小、以及微小轉(zhuǎn)移病灶，而且其特異性較目前臨床應(yīng)用B超、CT、核磁等診斷方法更高，因?yàn)楹髱追N診斷手段只能提示體內(nèi)某器官或部位，有占位性病變(腫塊)，但不能完全確定是癌腫。此外這種HER2放射免疫顯像劑還能檢出較小的腫瘤(小于1cm)，從而可彌補(bǔ)B超、CT、核磁診斷方法的不足。
在目前用于腫瘤治療的三種手段之一的化學(xué)藥物治療(化療)，在臨床治療中應(yīng)用非常廣泛，但在臨床治療中發(fā)現(xiàn)相當(dāng)多的腫瘤對(duì)化療產(chǎn)生耐藥，有的是原發(fā)耐藥，有的是在治療過程中產(chǎn)生的繼發(fā)耐藥，從而導(dǎo)致沒有療效，這類病人常常是無法手術(shù)的晚期病人，或放療后再度復(fù)發(fā)不能再放療，對(duì)于這樣一些病人目前幾乎沒有任何可用的治療措施，因此解決腫瘤耐藥的問題是降低腫瘤病人死亡率的重要問題。已有的研究表明腫瘤耐藥的產(chǎn)生是由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因的改變，其中HER2基因的擴(kuò)增和高表達(dá)與腫瘤耐藥性有關(guān)。Wright等發(fā)現(xiàn)用三苯氧胺化療藥治療無效的乳癌有HER2高表達(dá)，有療效的乳癌HER2表達(dá)低或者陰性。Gusterson等報(bào)道高表達(dá)HER2的乳癌對(duì)CTX、MTX、5-Fu、順鉑等化療藥的敏感性顯著低于HER2低表達(dá)的乳癌，類似的資料也見于卵巢癌、肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤。Haucock等用抗HER2的抗體處理卵巢癌細(xì)胞，可增加其對(duì)順鉑等化療藥的敏感性，提高該藥殺傷癌細(xì)胞的效力。本發(fā)明的抗人HER2的抗體能增加順鉑、氨甲喋呤、泰素及長(zhǎng)春新堿等化療藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用，提高這些藥物的療效，這表明抗HER2抗體與腫瘤細(xì)胞的HER2蛋白結(jié)合可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，因此，在目前尚無任何能克服或解決腫瘤耐藥的措施和手段的情況下，抗人HER2抗體對(duì)那些晚期病人、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的病人以及對(duì)化療藥不敏感的腫瘤病人無疑是一個(gè)福音。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明人采用雜交瘤技術(shù)制備出抗人HER2單抗。用于免疫動(dòng)物的抗原和用于篩選產(chǎn)生單抗的陽性雜交瘤克隆的抗原分別采用了不同的制備方法。用于免疫宿主包括但不限于小鼠的抗原來源于HER2高表達(dá)的細(xì)胞如SKBR3細(xì)胞，當(dāng)然也可使用其它細(xì)胞。根據(jù)宿主的種類，使用各種佐劑增強(qiáng)免疫反應(yīng)，這些佐劑包括但不限于完全和不完全弗氏佐劑、無機(jī)凝膠、氫氧化鋁、表面活性劑、油乳劑、鑰孔嘁血蘭蛋白、卡介苗等等。免疫途徑可以是腹腔注射、皮下注射、脾臟、淋巴結(jié)或尾靜脈注射等，免疫次數(shù)以免疫動(dòng)物血清中抗體滴度超過1∶320為宜。在篩選融合后產(chǎn)生抗人HER2單抗的雜交瘤克隆時(shí)，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)重組DNA技術(shù)表達(dá)的HER2蛋白作為抗原，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行篩選測(cè)定。即將克隆獲得的HER2基因用目前公開的DNA重組技術(shù)克隆到原核、真核、或昆蟲表達(dá)載體中構(gòu)建重組表達(dá)載體，再用此重組載體轉(zhuǎn)染原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞表達(dá)人的HER2蛋白抗原。采用PAGE膠凝膠電泳、ELISA、Western Blot技術(shù)鑒定表達(dá)的HER2蛋白的生物活性及各種特性。以此具有生物學(xué)活性的人HER2蛋白作為抗原包被96孔酶標(biāo)板，采用間接ELISA方法篩選產(chǎn)生抗人HER2單抗的陽性克隆細(xì)胞株。篩選獲得的產(chǎn)生抗人HER2單抗的雜交瘤克隆擴(kuò)大培養(yǎng)凍存于液氮，并對(duì)獲得的單抗用高表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞和不表達(dá)HER2抗原的非腫瘤細(xì)胞，采用免疫熒光、細(xì)胞ELISA、免疫組化、流式細(xì)胞儀和放射免疫等方法分析、鑒定抗體與人HER2結(jié)合的特異性、親和性、敏感性及在人體的組織分布。采用MTT法分析所獲HER2抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的抑制作用。采用腫瘤細(xì)胞藥物敏感試驗(yàn)測(cè)定HER2抗體增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性作用及提高化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。將那些能與人HER2抗原特異結(jié)合、親和力和敏感性高、能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、提高化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用、體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的HER2單抗的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)凍存于液氮。
目前國內(nèi)外研制抗腫瘤抗原或相關(guān)抗原的單抗，包括HER2單抗是采用高表達(dá)某一抗原的腫瘤細(xì)胞免疫動(dòng)物，并用這一高表達(dá)同一抗原的腫瘤細(xì)胞篩選產(chǎn)生單抗的雜交瘤克隆，這種技術(shù)很難獲得只與HER2抗原表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞結(jié)合的單抗，所獲得單抗特異性較差，易與不表達(dá)HER2抗原的細(xì)胞(如正常人體細(xì)胞)發(fā)生非特異交叉反應(yīng)，這樣的單抗既不能用于臨床診斷疾病，也不能用于治療疾病，無明顯的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)這樣獲得的單抗有時(shí)只能用于免疫組化法檢測(cè)腫瘤抗原的存在，不能用于ELISA、Western Blot法檢測(cè)腫瘤抗原，在應(yīng)用上受到極大的限制。也有人采用分子生物技術(shù)在原核細(xì)胞表達(dá)的抗原免疫動(dòng)物和篩選產(chǎn)生抗體的陽性克隆，這種方法所獲的單抗通常只與表達(dá)的抗原反應(yīng)，而不能與腫瘤細(xì)胞表面的天然抗原結(jié)合，這樣的抗體不能用于臨床診斷和治療疾病，只能用于純化可溶性抗原，針對(duì)這些問題，本研究采用了兩種不同技術(shù)制備免疫動(dòng)物的抗原和用于篩選產(chǎn)生抗體的陽性克隆的抗原，本研究采用的這種技術(shù)操作簡(jiǎn)便，所獲單抗特異性、親和性、敏感性高，只識(shí)別HER2抗原陽性的腫瘤細(xì)胞并與之結(jié)合，與HER2陰性的非腫瘤細(xì)胞不反應(yīng)，可用于腫瘤的體內(nèi)外診斷和治療，并能用于多種檢測(cè)技術(shù)中，如免疫組化、流式細(xì)胞、免疫熒光、ELISA、Western Blot等等。同時(shí)這樣獲得的單抗也能與可溶性HER2抗原結(jié)合，用于抗原蛋白的純化。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的單克隆抗體的可變區(qū)基因的獲得是通過首先采用Trizol一步法從產(chǎn)YF10C25單抗的雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA并用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增YF10C25輕重鏈可變區(qū)基因的PCR引物，即設(shè)計(jì)并合成了基因5′端的簡(jiǎn)并引物，基因3′端引物選擇了部分小鼠免疫球蛋白(Ig)恒定區(qū)基因序列，從而提高PCR擴(kuò)增目的基因的特異性和有效性從而有利于目的基因的分離克隆。用上面合成的cDNA為模板，采用上面合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，分別獲得了YF10C25單抗輕重鏈可變區(qū)基因?；厥誔CR擴(kuò)增獲得的單抗可變區(qū)基因，經(jīng)限制性內(nèi)切酶切后，插入克隆載體的質(zhì)粒DNA中(如pUC18、pUC19、pGEM等載體，但不限于這些載體)，構(gòu)建重組克隆載體。將這些重組克隆載體轉(zhuǎn)染宿主菌，如大腸桿菌DH5α(但不限于DH5α)中經(jīng)酶切法篩選鑒定正確的陽性重組克隆后，從篩選出的輕重鏈可變區(qū)重組克隆中隨機(jī)挑選2個(gè)以上克隆，采用熒光標(biāo)記Sanger雙脫氧末端終止端法，進(jìn)行單抗可變區(qū)基因的核苷酸序列測(cè)定，測(cè)的結(jié)果根據(jù)Kabat等總結(jié)的小鼠單抗可變區(qū)亞群共有序列分析，確定正確重排的有功能性的單抗可變區(qū)基因，YF10C25單抗重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列分別見SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示，所述基因分別稱為HER2單抗輕鏈可變區(qū)基因YF10C25VL基因和HER2單抗重鏈可變區(qū)基因YF10C25VH基因。
該HER2單抗可變區(qū)基因編碼序列采用DNA重組技術(shù)可克隆到多種克隆載體包括但不限于pUC18、pUC19、pGEM等中保存，也可轉(zhuǎn)染原核細(xì)胞，包括但不限于大腸桿菌中保存，也可克隆到多種表達(dá)載體，包括但不限于原核、真核、酵母、昆蟲等多種載體中保存，并可轉(zhuǎn)染多種宿主細(xì)胞包括但不限于各種大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母菌、昆蟲細(xì)胞中表達(dá)HER2單抗或肽段。
本發(fā)明的HER2單抗可變區(qū)基因編碼序列可用于分離克隆HER2單抗的全長(zhǎng)基因。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，將編碼序列YF10C25VL和YF10C25VH用放射核素標(biāo)記或用地高辛標(biāo)記后作為篩選HER2單抗的噬菌體cDNA文庫和基因組DNA文庫的探針篩選分離抗人HER2單抗的全長(zhǎng)cDNA和DNA序列，包括抗體的可變區(qū)、恒定區(qū)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子及信號(hào)肽序列的全長(zhǎng)基因。
本發(fā)明的HER2單抗可變區(qū)基因編碼序列還可用于制備HER2單抗基因的突變物、類似物。例如，采用DNA定點(diǎn)突變技術(shù)或PCR誘導(dǎo)突變技術(shù)和DNA重組技術(shù)改變或修飾YF10C25VL和YF10C25VH基因或YF10C25的cDNA、DNA全長(zhǎng)的核苷酸序列，但不限于采用不同核苷酸的缺失、添加或取代而產(chǎn)生YF10C25單抗的突變物、類似物或修飾物，它們具有與YF10C25單抗相同或類似的功能活性及特征。
另外，根據(jù)本發(fā)明的單抗可變區(qū)基因可用于提高HER2單抗的活性和多樣性。根據(jù)YF10C25VL和YF10C25VH基因的編碼序列可設(shè)計(jì)出并連接各種末端的肽段或編碼序列，在上述基因上包括但不限于采用定點(diǎn)突變、引入突變序列、插入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、改變糖基化模式、磷酸化等修飾序列，以提高單抗的親和力及多樣性，也可在引入異源序列，包括但不限于His、GST等序列以表達(dá)出融合蛋白，以便用于篩選肽庫，也可引入具有治療意義的基因編碼序列，包括但不限于抑癌基因、反義癌基因序列，通過抗體的特異性將這些治療的目的基因帶到特定的目的病灶，實(shí)現(xiàn)定向基因治療。
本發(fā)明的單抗可變區(qū)基因還可用于合成HER2單抗的類似物。采用現(xiàn)有技術(shù)中已公開的化學(xué)合成方法，可全部或部分地合成YF10C25VL和YF10C25VH基因或其它突變物、類似物、修飾物的氨基酸編碼序列，并用序列分析證實(shí)這些合成肽的序列，表達(dá)出相同或類似HER2單抗及其類似物、突變物功能的蛋白和多肽。
本發(fā)明還涉及HER2單抗的衍生物，本發(fā)明人采用基因工程方法及免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、以HER2單抗基因?yàn)榛A(chǔ)還可以制備一系列HER2單抗的衍生物，它們包括但不限于嵌合抗體，改形抗體、全人源化抗體、小分子抗體、雙特異性抗體、胞內(nèi)抗體及單鏈抗體嵌合受體等。
1、HER2嵌合抗體采用DNA重組技術(shù)將HER2單抗的可變區(qū)基因YF10C25VL和YF10C25VH基因或用這兩個(gè)基因?yàn)樘结槒腍ER2單抗cDNA或DNA文庫篩選分離的可變區(qū)基因與抗人抗體IgG1或IgG2、IgG3、IgG4的恒定區(qū)基因拼接在一起，構(gòu)建一種可變區(qū)為鼠單抗可變區(qū)基因、恒定區(qū)為人抗體恒定區(qū)基因的鼠/人嵌和抗體基因。再將該嵌合抗體基因采用DNA重組技術(shù)克隆到表達(dá)載體中構(gòu)建重組表達(dá)載體。表達(dá)載體應(yīng)含有調(diào)節(jié)嵌合基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，如啟動(dòng)子、終止基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列和多聚腺苷酸信號(hào)肽序列，增強(qiáng)基因表達(dá)的增強(qiáng)子序列，能實(shí)現(xiàn)抗體分泌表達(dá)的前導(dǎo)肽序列，以及能區(qū)別表達(dá)嵌合抗體基因的細(xì)胞與不表達(dá)嵌合抗體基因細(xì)胞的選擇標(biāo)志基因序列包括neo基因、gpt基因、dhfr基因、his基因等選擇標(biāo)志基因序列。重組表達(dá)載體構(gòu)建成功后采用DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，包括但不限于原核的大腸桿菌(如DH5α、JM109、BL21)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如sp2/0、CHO、YB10、COS)昆蟲細(xì)胞(sf9、sf21、high5等)，酵母細(xì)胞(如Pichia pastoris、Schizosaccharomyces pombe)等表達(dá)嵌合抗體，采用ELISA、Western Blot、RT-PCR、免疫組化、腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、腫瘤細(xì)胞藥敏測(cè)定以及裸鼠移植瘤試驗(yàn)等技術(shù)，分析、鑒定表達(dá)嵌合抗體的產(chǎn)量、特異性、生物活性等。這樣制備的抗人HER2嵌合抗體較鼠源HER2單抗免疫原性低，在人體內(nèi)應(yīng)用可降低毒副作用，并能增加該抗體在人體內(nèi)的半衰期，用于治療疾病可提高療效。
2、改形抗體盡管HER2嵌合抗體的恒定區(qū)是人源的，但嵌合抗體中仍有35％序列來源于鼠HER2單抗，仍能在人體內(nèi)引起毒副作用，可將HER2鼠單抗可變區(qū)基因中能與HER2結(jié)合的超變區(qū)序列移植到人抗體可變區(qū)基因的骨架區(qū)FR中，在用人抗體的恒定區(qū)拼接構(gòu)建HER2改形抗體基因。該改形抗體基因采用如嵌合抗體所述的技術(shù)克隆到表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞表達(dá)改形抗體，該改形抗體中90％以上的成分均為人源性，大大降低毒副作用，更有利于用于人體內(nèi)治療。
3、全人源化抗體研制HER2全人源化抗體，可采用噬菌體抗體庫技術(shù)、表位印模選擇技術(shù)及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)等。噬菌體抗體庫技術(shù)是首先從人外周血分離淋巴細(xì)胞，提取淋巴細(xì)胞中RNA、反轉(zhuǎn)合成cDNA，設(shè)計(jì)并合成一組RT-PCR引物，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增淋巴細(xì)胞cDNA中的人抗體可變區(qū)基因。將擴(kuò)增獲得的抗體輕重鏈可變區(qū)基因分別克隆到噬菌體表達(dá)載體，構(gòu)建人抗體輕重鏈?zhǔn)删w表達(dá)庫，用HER2抗原從噬菌體抗體表達(dá)庫中篩選人源化抗體。篩選獲得的人抗體輕重鏈可變區(qū)基因，再采用如嵌合抗體表達(dá)所述的技術(shù)表達(dá)HER2全人源化抗體。表位印模選擇技術(shù)是在噬菌體抗體庫技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的方法，首先是建立從淋巴細(xì)胞來源的人抗體噬菌體庫，用鼠HER2抗體的輕鏈可變區(qū)基因與人抗體的噬菌體抗體庫重組構(gòu)建鼠-人雜合抗體庫，用HER2抗原篩選有結(jié)合抗原活性的克隆，從而獲得人抗體重鏈基因(VH)。用獲得的人VH基因與人抗體的噬菌體抗體庫重組構(gòu)建成人抗體庫，再用HER2抗原篩選抗體庫，獲得人抗體輕鏈基因(VL)。這樣獲得人抗體可變區(qū)基因，再用人抗體恒定區(qū)基因拼接后建成全人源化抗體基因，按嵌合抗體所述的技術(shù)可表達(dá)全人源化抗體。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)是將人完整的抗體基因組替代動(dòng)物的抗體基因組，再免疫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物而獲得完全人源化的抗體，如利用轉(zhuǎn)基因小鼠、轉(zhuǎn)基因雞等，經(jīng)免疫而直接獲得全人源化的HER2抗體。這樣研制的全人源化抗體有更好的特異性，與改形抗體相比沒有任何鼠源的序列，是全人源化抗體，完全克服了鼠單抗用于人體可能產(chǎn)的毒副作用。
4、小分子抗體根據(jù)抗體分子的結(jié)構(gòu)可知，抗體分子的抗原結(jié)合部位局限在可變區(qū)的FV段，從而可以研制構(gòu)建分子量較小的只有與HER2抗原結(jié)合功能的分子片段，成為小分子抗體。小分子抗體具有以下特點(diǎn)①分子量小，易于穿透血管壁和組織屏障進(jìn)入病灶部位。②不含抗體恒定區(qū)Fc，可降低免疫原性，不與Fc受體結(jié)合，減少非特異分布。③易于進(jìn)行基因工程改造。④可在原核細(xì)胞如大腸桿菌中表達(dá)，降低成本。⑤分子小，排出體外快，適合用于體內(nèi)顯像診斷。小分子抗體包括Fab單鏈抗體、scFv及Fv等幾種。Fab抗體可采用木瓜蛋白酶對(duì)完整的HRE2單抗進(jìn)行酶解，再進(jìn)行分離純化即可獲得，也可將抗體重鏈Fd基因與輕鏈基因5′端接上細(xì)菌蛋白的信號(hào)肽序列，包括但不限于來自細(xì)菌外膜蛋白堿性磷酸酶，果膠酸鹽裂解酶的信號(hào)肽序列，再在大腸桿菌中表達(dá)，可表達(dá)Fab、Fv等小分子抗體。單鏈抗體(scFv)是將HER2抗體的輕重鏈可變區(qū)基因用設(shè)計(jì)的一段寡聚核苷酸序列連起來，再在宿主細(xì)胞中表達(dá)為一條單一肽鏈的抗體，即單鏈抗體。
5、雙特異性抗體根據(jù)抗體的分子結(jié)構(gòu)，抗體分子有兩個(gè)與特異抗原結(jié)合的臂，每一臂均有二硫鍵將抗體輕重鏈連接固定在一起形成特定的空間結(jié)構(gòu)，一種單抗的兩個(gè)臂結(jié)合相同的抗原分子。將HER2單抗分子的一臂用另一種單抗如抗人T細(xì)胞表面抗原CD3的抗體代替，這樣構(gòu)建的抗體分子的一臂能與HER2抗原結(jié)合，而另一臂又能與另一種抗原CD3結(jié)合，并同時(shí)具有兩種結(jié)合特異性，兩種功能。故稱這種抗體為雙特異性抗體。雙特異性抗體可采用雜交瘤技術(shù)獲得，也可采用DNA重組技術(shù)，用一種抗體的輕重鏈可變區(qū)基因取代另一種抗體分子一個(gè)臂的輕重鏈可變區(qū)基因，構(gòu)建雙特異抗體基因在轉(zhuǎn)染大腸桿菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)雙特異性抗體，這樣的抗體具有更廣泛的臨床應(yīng)用范圍。
6、胞內(nèi)抗體胞內(nèi)抗體是指將抗體基因?qū)敕橇馨图?xì)胞的細(xì)胞內(nèi)并定位，滯留在細(xì)胞內(nèi)特定部位，從而特異地干擾定位于該部位的生物大分子的生物活性或其加工、分泌過程，從而干擾細(xì)胞的生長(zhǎng)及代謝達(dá)到治療的目的，胞內(nèi)抗體的制備是在單鏈抗體基因的N端加入細(xì)胞定位信號(hào)肽序列，以便將單鏈抗體引導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)有關(guān)部位，如加入定位于核的、定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)肽等使單鏈抗體定位于細(xì)胞核或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。同時(shí)在單鏈抗體的C端加入滯留信號(hào)肽序列，則可使單鏈抗體滯留在細(xì)胞內(nèi)的特定部位。構(gòu)建好胞內(nèi)抗體基因，再克隆到病毒表達(dá)載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，再轉(zhuǎn)染需導(dǎo)入胞內(nèi)抗體基因的細(xì)胞，胞內(nèi)抗體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)干擾細(xì)胞的生物學(xué)功能。
7、融合蛋白HER2抗體的融合蛋白是指將HER2抗體的某條肽鏈后融合上其它效應(yīng)分子的肽鏈，從而利用HER2抗體的特異識(shí)別HER2抗原的能力，將效應(yīng)分子帶到并密集于靶部位，發(fā)揮其特殊的效應(yīng)功能，通常采用在抗體基因后以合適的編碼框直接連接效應(yīng)分子基因的方法構(gòu)建而成。通常使用的效應(yīng)分子包括細(xì)胞因子、毒素、催化前藥的酶等，抗體形式包括全分子抗體、Fab抗體、F(ab’)2抗體、單鏈抗體等。
單鏈抗體嵌合受體也是一種融合蛋白，是通過構(gòu)建單鏈抗體與T細(xì)胞受體(TCR)或肥大細(xì)胞Fc受體(Fc(ε)RI)的某亞基的嵌合分子，如單鏈抗體與TCR/CD3復(fù)合體的ζ鏈、β鏈；Fc(ε)RI的γ鏈構(gòu)建成的嵌合分子，然后轉(zhuǎn)染CTL使嵌合分子在CTL細(xì)胞表面表達(dá)，從而將抗體的特異性移植給CTL使其能夠特異性地殺傷HER2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還涉及HER2單抗及衍生物在制備腫瘤診斷制劑中的應(yīng)用。
如前所述人類多種上皮來源的腫瘤細(xì)胞表面都有HER2抗原的高表達(dá)，而正常組織極少表達(dá)或表達(dá)很低，而且腫瘤HER2的表達(dá)高低與腫瘤病人的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后以及對(duì)化療藥物是否耐藥密切相關(guān)，因此可以通過檢測(cè)腫瘤病人血清、體液、腫瘤組織中HER2抗原的表達(dá)情況，為臨床診斷多種腫瘤，判斷病人預(yù)后，為設(shè)計(jì)化療方案提供依據(jù)。因此HER2單抗及其衍生物可用于制備檢測(cè)HER2抗原的制劑中及其系列衍生物，在制備檢測(cè)體液中HER2抗原或腫瘤組織勻漿中的HER2抗原的ELISA制劑中HER2單抗及衍生物可用于作為捕獲抗原的第一抗體，在制備檢測(cè)腫瘤組織中的HER2抗原的免疫組化制劑時(shí)，HER2單抗及衍生物可用作識(shí)別抗原的第一抗體，同樣也可用于流式細(xì)胞儀測(cè)定及免疫熒光測(cè)定中作為識(shí)別抗原的第一抗體。此外小分子HER2抗體在制備體內(nèi)放射顯像診斷多種腫瘤及判斷腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的制劑中廣泛應(yīng)用，HER2小分子抗體標(biāo)記放射核素后，用于體內(nèi)顯像診斷能診斷小于0.5cm的微小病灶，而且較CT、B超、核磁等診斷手段更特異。
本發(fā)明還涉及HER2單抗及衍生物在制備腫瘤治療劑中的應(yīng)用。HER2在多種腫瘤的特異高表達(dá)，在正常組織不表達(dá)，使其成為治療多種腫瘤的重要的靶分子，而且還由于HER2抗原本身的特點(diǎn)，決定了它是腫瘤治療的最佳的靶分子，其特點(diǎn)是①HER2抗原分子量大，含有1255個(gè)氨基酸，并含有合適的抗原表位和MHC識(shí)別位點(diǎn)，易被抗體識(shí)別，干擾腫瘤細(xì)胞生物代謝活性。②HER2在多種腫瘤高表達(dá)，正常組織低表達(dá)或不表達(dá)。③HER2表達(dá)在腫瘤細(xì)胞膜上，而不是在胞內(nèi)，抗體能盡快識(shí)別和結(jié)合。④對(duì)一種特定腫瘤HER2抗原表達(dá)的密度基本均一，因此用HER2抗體治療時(shí)，抗體能分布于腫瘤的所有區(qū)域。⑤腫瘤的原發(fā)病灶、轉(zhuǎn)移病灶或復(fù)發(fā)病灶HER2抗原表達(dá)水平一致。因此抗HER2抗體可用于腫瘤原發(fā)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)病灶的治療。⑥HER2在腫瘤表面的高表達(dá)是向腫瘤傳遞一種生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的信號(hào)，因此應(yīng)用HER2拮抗劑如HER2單抗及衍生物可直接干擾抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，可以不用標(biāo)記或偶聯(lián)殺傷腫瘤細(xì)胞的彈頭。⑦HER2的表達(dá)參與腫瘤對(duì)化療藥物形成耐藥的機(jī)制。因此HER2抗體能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的療效，因此，HER2單抗及衍生物在制備腫瘤治療劑中具有廣闊的應(yīng)用范圍和應(yīng)用價(jià)值。
HER2單抗及衍生物，尤其是嵌合抗體，改形抗體及全人源化抗體，應(yīng)用氯氨T法或氯甘脲法可標(biāo)記放射性核素，制備放射免疫治療劑，包括但不限于I131、I125、I111、I123等放射核素標(biāo)記上述抗體，這種HER2放射免疫治療劑能將放射核素特異地帶到HER2高表達(dá)的腫瘤，直接殺傷腫瘤細(xì)胞達(dá)到治療目的。此外也可將對(duì)腫瘤有效的化療藥物與HER2抗體及衍生物偶聯(lián)制備抗體化療藥物偶聯(lián)劑用于治療腫瘤，也可將生物毒素、前體酶以及有治療意義的基因包括但不限于各種細(xì)胞因子基因、抑癌基因、反義癌基因與HER2抗體及衍生物偶聯(lián)制備相應(yīng)的治療劑用于多種腫瘤治療，為腫瘤的治療開辟一條新的治療途徑。
鑒于HER2在腫瘤細(xì)胞的高表達(dá)還參與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，降低阻斷HER2在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)及生物活性，可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞作用，因此將HER2抗體及衍生物與各種化療藥聯(lián)合應(yīng)用，可大大提高化療藥物的療效，本研究研制的YF10C25單抗及衍生物已證明能顯著提高順鉑、氨甲喋呤、泰素、長(zhǎng)春新堿等多種化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的療效。
HER2抗體及衍生物還能用于從腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)庫中篩選分離HER2蛋白或多肽抗原，應(yīng)用該抗原可以制備出HER2蛋白、多肽、DNA或負(fù)載HER2抗原(肽)的樹突狀細(xì)胞等多種腫瘤疫苗，這種疫苗應(yīng)用于人體可調(diào)動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤的免疫反應(yīng)，即激活機(jī)體內(nèi)殺傷腫瘤細(xì)胞的CTL使之更有效殺傷腫瘤細(xì)胞達(dá)到治療腫瘤及阻止腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的目的。
以下將參照附圖和實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，其中，

圖1示出HER2單抗YF10C25對(duì)人乳腺癌SKBR3細(xì)胞和人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制曲線。
圖2示出YF10C25單抗對(duì)順鉑(CDDP)殺傷SKBR3細(xì)胞的增敏作用。
圖3示出YF10C25單抗對(duì)裸鼠體內(nèi)人乳腺癌SKBR3細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。
圖4示出YF10C25單抗對(duì)裸鼠體內(nèi)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。
圖5為抗體輕、重鏈可變區(qū)基因克隆載體pRGWL/VL和pRUWH/VH的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中P鼠抗體基因啟動(dòng)子，L前導(dǎo)肽序列，S剪切位點(diǎn)。
實(shí)施例1HER2單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性分析一、雜交瘤的制備以高表達(dá)HER2的人乳腺癌細(xì)胞系SKBR3細(xì)胞免疫BABL/c小鼠，每次用4～5×107個(gè)細(xì)胞加50％福氏佐劑進(jìn)行免疫，間隔3周一次。期間構(gòu)建含有人HER2胞外區(qū)基因的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后用親合層析柱純化。用所得到的HER2胞外區(qū)蛋白作為包被抗原，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，采用間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中抗體滴度。3個(gè)月以后當(dāng)抗體滴度達(dá)1∶2500左右時(shí)加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞1～1.5×108個(gè)與1.25～2×107個(gè)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0用50％的PEG4000進(jìn)行融合，以大約2～5×104個(gè)細(xì)胞的數(shù)目接種入96孔板。融合7天后用含HAT的培養(yǎng)液半量換液，以后每2～3天半量換液一次，兩周后改用HT培養(yǎng)液半量換液。待出現(xiàn)雜交瘤細(xì)胞克隆后計(jì)數(shù)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至1/2孔左右時(shí)，用HER2胞外區(qū)抗原包被，采用上述間接ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清中HER2抗體。選陽性孔進(jìn)行亞克隆，同樣方法進(jìn)行4～5輪亞克隆，選抗體滴度高者擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存，篩選出10株分泌抗HER2胞外區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞株，ELISA測(cè)定各株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體效價(jià)在1∶2500～12500之間，后經(jīng)3～6個(gè)月傳代及反復(fù)凍存、復(fù)蘇后仍穩(wěn)定地分泌抗體。其中的一株雜交瘤細(xì)胞，稱為HER2-McAb-YFC10C25，于2000年6月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO.0457。二、HER2單克隆抗體的制備、純化及基本特性1、腹水的制備及抗體的純化選雌性BABL/c小鼠腹腔注射石蠟油0.5ml/只，致敏3天后，腹腔接種3×106雜交瘤細(xì)胞，大約一周后開始產(chǎn)腹水。收集腹水經(jīng)離心去除油脂和細(xì)胞后供純化之用。屬于IgG類的單抗用飽和硫酸銨沉淀，PBS溶解沉淀后用親合層析法經(jīng)Protein A Sepharose-4B Fast Flow柱純化。屬于IgM類的單抗用簡(jiǎn)易正辛酸法純化。首先用2倍體積0.06M、PH＝4.0的醋酸緩沖液調(diào)腹水至PH＝4.8，然后滴加1％的正辛酸室溫放置30分鐘，經(jīng)離心后取上清進(jìn)行PBS透析。再經(jīng)飽和硫酸銨沉淀、PBS溶解沉淀并透析。純化后的單抗經(jīng)SDS-PAGE膠電泳鑒定純度。
2、HER2抗體的基本特性2.1 HER2單抗的亞類分析取培養(yǎng)上清用IsoDetectTM單抗表位試劑盒(Stratagene公司)對(duì)篩選出的10株單抗的類及亞類進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果表明其中4株(YE2C12、YE5C23、YF10C25、YG12C41)屬于IgG1、κ型輕鏈；1株(YF6A26)屬于IgG3、κ型輕鏈；5株(YF11A5、YD8A36、YC9B14、YE4D24、YE2D33)屬于IgM、κ型輕鏈。
2.2抗體的標(biāo)記用氯胺-T法以125I標(biāo)記純化的HER2胞外區(qū)單抗。取50μg抗體用0.25M、PH＝7.4的PB稀釋至100μl，加入1mci Na125I及25μl濃度為1mg/ml的氯胺-T，室溫反應(yīng)3～5分鐘。加入濃度為2mg/ml的偏重亞硫酸鈉25μl終止反應(yīng)3～5分鐘。用Sephadex G50柱層析分離純化標(biāo)記抗體后立即加入0.5～1倍體積的1％BSA保存于4℃。
2.3單抗的親和常數(shù)測(cè)定及識(shí)別抗原表位分析以固相競(jìng)爭(zhēng)放射免疫法進(jìn)行抗體的親和常數(shù)測(cè)定和表位分析。在放免專用管中加入100μl用PH＝9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋為10μg/ml的HER2胞外區(qū)抗原，4℃包被24小時(shí)。用1％的BSA4℃封閉12小時(shí)，經(jīng)洗滌后分別加入50μl/管稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg/ml的未標(biāo)記抗體，然后加入50μl/106cpm/管同種標(biāo)記抗體4℃反應(yīng)24小時(shí)，經(jīng)洗滌后用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)cpm值。以僅加標(biāo)記抗體的對(duì)照管cpm值為分母，以各管cpm值為分子，求取不同管結(jié)合標(biāo)記抗體的百分?jǐn)?shù)，以此百分?jǐn)?shù)的對(duì)數(shù)為縱座標(biāo)，以未標(biāo)記抗體濃度(mg/ml)的負(fù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖。50％(log10＝1.7)結(jié)合時(shí)的未標(biāo)記單抗?jié)舛鹊牡箶?shù)即為該單抗的親和常數(shù)。表位分析是在包被抗原、封閉、洗滌后分別加入標(biāo)記抗體量200倍的各種未標(biāo)記抗體50μl/管，然后加入50μl/106cpm/管某種標(biāo)記抗體。經(jīng)洗滌后用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)cpm值，求取不同管結(jié)合標(biāo)記抗體的百分?jǐn)?shù)，大于90％被認(rèn)為表位不同，反之則與該標(biāo)記單抗識(shí)別相同或相近表位。
HER2抗體的基本特征見表1。
表1抗HER2胞外區(qū)單抗的基本特性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng) 單抗的亞類單抗 上清中的抗體滴單抗的親合常數(shù) 單抗的表位度 重鏈 輕鏈YE2C121∶6250 IgG1κ2×108M-1IYE5C231∶6250 IgG1κ 1.63×108M-1IYF10C25 1∶6250 IgG1κ2×108M-1IYG12C41 1∶6250 IgG1κ2.3×108M-1IYF6A261∶6250 IgG3κ 4.57×106M-1IIYF11A51∶12500 IgM κNDIIIYD8A361∶12500 IgM κNDIIIYC9B141∶6250 IgM κNDIIIYE4D241∶6250 IgM κNDIIIYE2D331∶6250 IgM κNDIIIL87 NDIgG1κNDIV注ND未檢測(cè)三、HER2單克隆抗體生物學(xué)特性1、單抗識(shí)別抗原特性分析分別以變性和復(fù)性形式的HER2胞外區(qū)蛋白包被，常規(guī)間接ELISA法測(cè)定自制單抗與這兩種抗原的反應(yīng)能力。Western Blot是用復(fù)性后的HER2胞外區(qū)蛋白在PAGE膠中分別進(jìn)行非還原和還原電泳，采用半干式電轉(zhuǎn)移法進(jìn)行。ELISA結(jié)果顯示自制單抗與復(fù)性后HER2抗原結(jié)合而與變性形式HER2抗原結(jié)合能力很弱，這與用YF10C25單抗進(jìn)行Western Blot結(jié)果相吻合，該單抗與還原電泳中HER2胞外區(qū)抗原反應(yīng)能力很弱(免疫染色帶很淺)，而與復(fù)性后非還原電泳中HER2胞外區(qū)抗原反應(yīng)出現(xiàn)單一免疫染色帶。
2、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)按1×104個(gè)SKBR3或人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞/孔加入96孔板中，次日棄培養(yǎng)液加入含抗體(終濃度20μg/ml)培養(yǎng)液維持5天后，吸棄培養(yǎng)液加入含MTT的培養(yǎng)液培養(yǎng)4～6小時(shí)，以含10％SDS的0.01M HCl裂解細(xì)胞，測(cè)OD570/630。依下列公式計(jì)算抑制率抑制率＝(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100％。結(jié)果表明單抗YE2C12、YE5C23、YF10C25、YG12C41對(duì)SKBR3或SKOV3細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，抑制率分別達(dá)到SKBR356.3％、52.7％、60.63％、52.7％；SKOV335.1％、32.5％、35.1％、31.6％。其余單抗對(duì)SKBR3或SKOV3細(xì)胞的增殖抑制不明顯，抑制率在9.5％～14％之間。各單抗對(duì)HER2陰性的NIH/3T3細(xì)胞的增殖無影響。其中不同稀釋度的YF10C25單抗對(duì)SKBR3和SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用見圖1。
3、免疫組化將SKBR3或SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)在蓋玻片上，丙酮固定、H2O2-甲醇液處理、封閉后加HER2單抗，以羊抗鼠IgG-HRP為二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，經(jīng)脫水、透明后封片。用自制單抗YF10C25進(jìn)行SKBR3培養(yǎng)細(xì)胞的免疫組化染色可見特異性膜陽性染色，而相同條件下NIH/3T3細(xì)胞和人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(HFCL)染色均為陰性。用商品抗體L87進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果SKBR3細(xì)胞膜染色較弱。選用YF10C25單抗以SP法對(duì)乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、食管癌、胃癌的石蠟切片標(biāo)本進(jìn)行染色，其中乳腺癌陽性率為37％。陽性細(xì)胞可見特異性細(xì)胞膜染色，有些細(xì)胞可見胞漿著色。
4、YF10C25單抗對(duì)化療藥物的增敏作用本實(shí)驗(yàn)選用臨床常用的幾種化療藥物順鉑(CDDP)、泰素(TAX)、氨甲喋呤(MTX)、長(zhǎng)春新堿(VCR)、5-氟尿嘧啶(5-FU)。將1×104個(gè)/孔SKBR3細(xì)胞加入96孔板中，24小時(shí)后棄培養(yǎng)液加入含一系列按二倍梯度稀釋的抗體的培養(yǎng)液和陰性對(duì)照培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24小時(shí)后按比例加入一系列二倍梯度稀釋的化療藥物(濃度見表2)和陰性對(duì)照(PBS)，每個(gè)梯度三個(gè)復(fù)孔?？贵w及化療藥物的劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中IC50的結(jié)果確定。繼續(xù)孵育72小時(shí)后加入終濃度為0.5mg/ml的MTT再培養(yǎng)4～6小時(shí)，以含10％SDS的0.01M HCl裂解細(xì)胞，測(cè)OD570/630。依公式(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100％計(jì)算各梯度的抑制率；按公式q＝E(A＋B)/EA＋(1－EA)×EB計(jì)算抗體與化療藥聯(lián)合應(yīng)用效果，其中E(A＋B)表示兩藥合用的抑制率，EA、EB分別表示兩單藥的抑制率，q＞1.15時(shí)兩藥具協(xié)同作用，q＝0.85～1.15時(shí)兩藥具相加作用，q＜0.85時(shí)兩藥具拮抗作用。
表2 YF10C25單抗與化療藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人乳腺癌SKBR3細(xì)胞的殺傷作用藥物 YF10C25/藥物 藥物劑量范圍q值相互作用 P值摩爾比 (μM) (Mean±SD)CDDP3.125×10-33.1×10-1～80 1.21±0.04協(xié)同作用 ＝0.002(q＞1.15)MTX 5×10-21.95×10-2～5.0 1.01±0.08相加作用 ＝0.001(q＝0.85～1.15)TAX 1.25×10-27.8×102～201.00±0.02相加作用 ＜0.001(q＝0.85～1.15)VCR 8.3×10-21.17×10-2～3.0 1.02±0.07相加作用 ＜0.001(q＝0.85～1.15)5-Fu2.5×10-43.9～1.0×1030.83±0.03拮抗作用 ＜0.001(q＜0.85)P值表示與q＝1.15或q＝0.85比的差異顯著性結(jié)果表明YF10C25單抗與CDDP具協(xié)同作用(如圖2所示)。目前順鉑(CDDP)是乳腺癌、卵巢癌等癌癥化療的一線藥物，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示YF10C25單抗可能成為順鉑治療HER2高表達(dá)腫瘤的增敏劑。YF10C25單抗與TAX、MTX、VCR具相加作用，與5-FU具拮抗作用。
5、YF10C25單抗的體內(nèi)抑瘤作用選6周齡雌性CD-1裸鼠(nu/nu)，分4組，每組5只。于側(cè)肋處皮下注射2×106個(gè)人乳腺癌SKBR3細(xì)胞或人卵巢癌SKOV3細(xì)胞各2組，注射細(xì)胞前所有裸鼠皮下注射雌二醇以啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。從接種細(xì)胞的0～9天，每種細(xì)胞組每天靜脈注射YF10C25單抗100 μg/只或PBS對(duì)照。6天后開始測(cè)量腫瘤體積并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，10天里與對(duì)照組相比注射抗體組SKBR3或SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)被顯著抑制，這種抑制持續(xù)到第14天，以后腫瘤才開始生長(zhǎng)。說明YF10C25單抗可明顯抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)(圖3、4)。
6、YF10C25單抗與化療藥物聯(lián)合的體內(nèi)抑瘤作用選6周齡雌性CD-1裸鼠(nu/nu)，分18組，每組5只。于側(cè)肋處皮下注射5×106個(gè)SKBR3或SKOV3細(xì)胞各2組，注射細(xì)胞前所有裸鼠皮下注射雌二醇以啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。從接種細(xì)胞的14天腫瘤體積約為50～100mm3時(shí)，每種細(xì)胞組每天靜脈注射YF10C25單抗100μg/只或鼠IgG1對(duì)照，同時(shí)選用4種化療藥物腹腔注射進(jìn)行聯(lián)合組(8組)及單獨(dú)用藥(8組)或單獨(dú)用抗體組(2組)?；熕幬飫┝繛榄h(huán)磷酰胺(80mg/kg，0、4、8天)、氨甲喋呤(2mg/kg，1～5天)、5氟尿嘧啶(16mg/kg，1～4天)、泰素(15mg/kg，1～3天)。21天后開始測(cè)量腫瘤體積并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺、氨甲喋呤與抗體聯(lián)合組的腫瘤體積顯著小于單藥組和單獨(dú)抗體組(P＜0.05)、5-氟尿嘧啶與抗體聯(lián)合組的腫瘤體積與單藥組相比無明顯差別、泰素與抗體聯(lián)合組的腫瘤體積小于單藥組和單獨(dú)抗體組但無顯著性差異。實(shí)施例2YF10C25單抗可變區(qū)基因克隆及序列分析根據(jù)HER2單抗生物學(xué)特性鑒定結(jié)果，選YF10C25單抗進(jìn)行可變區(qū)基因克隆及序列分析為進(jìn)一步構(gòu)建人鼠嵌合抗體奠定基礎(chǔ)。一、細(xì)胞總RNA提取收集1×107個(gè)YF10C25雜交瘤細(xì)胞，10000rpm離心1分鐘，吸棄上清，按TrizolTM試劑(Gibco BRL公司)說明書采用一步法提取細(xì)胞總RNA。即加入1ml Trizol充分溶解細(xì)胞，室溫靜置3-5分鐘后加入0.2ml氯仿，顛倒混勻，4℃下12000rpm離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清約0.6ml在新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置5-10分鐘，4C下12000rpm離心10分鐘。棄上清，75％乙醇洗滌一次，空氣干燥。加入50μl ddH2O溶解沉淀，取1μl用0.7％非變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，可見18S RNA和28S RNA大小正確，亮度比約1∶2，泳道清晰，說明所提總RNA比較完整。用紫外分光光度法測(cè)定總RNA濃度。二、cDNA第一條鏈的合成按M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL公司)說明書進(jìn)行。簡(jiǎn)要的步驟如下在20μl的體系中加入5×緩沖液4μl，10mM DDT，10μg總RNA，終濃度0.5mM的dNTP，終濃度10μg/ml的Oligo d(T)15，40u RNasin，200u M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，混勻。37C水浴1小時(shí)，沸水浴5分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶。三、YF10C25可變區(qū)基因的PCR擴(kuò)增以cDNA第一條鏈為模板，用Taq PlusI DNA聚合酶(生工公司)進(jìn)行可變區(qū)基因的擴(kuò)增，選用Winter等設(shè)計(jì)的引物，序列如下輕鏈可變區(qū)VL55′-GACAT TCAGC TGACC CAGTC TCCA-3′
VL35′-GTTAG ATCTC CAGCT TGGTC CC-3′重鏈可變區(qū)VH55′-AGGTS MARCT GCAGS AGTCW GG-3′(S＝C/G，M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T)VH35′-TGAGG AGACG GTGAC CGTGG TCCCT TGGCCCCAG-3′在100μl的反應(yīng)體系中含有10×緩沖液10μl，10mM dNTP 2μl，cDNA 20μl，擴(kuò)增引物各50pmol，混勻后表面覆蓋石蠟油。95℃水浴5分鐘后，透過石蠟油加入1-2u的Taq PlusI DNA聚合酶，開始以下循環(huán)，94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72℃10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.2％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。采用重鏈引物VH5、VH3進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出370bp大小左右的重鏈可變區(qū)基因片段；采用輕鏈引物VL5、VL3進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出330bp大小左右的輕鏈可變區(qū)基因片段；未加模板的空白對(duì)照無擴(kuò)增帶。擴(kuò)增出的可變區(qū)基因片段大小與一般抗體可變區(qū)基因的大小相符，初步說明擴(kuò)增片段為抗體輕、重鏈可變區(qū)基因片段。四、YF10C25單抗可變區(qū)基因的克隆1、感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化將凍存的DH5α菌種接種于100ml LB培養(yǎng)基中，37℃、300rpm震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6，將菌液置冰上預(yù)冷10分鐘，4℃、4000rpm離心10分鐘，棄上清。以20ml預(yù)冷的0.1M CaCL2/100ml菌液重懸細(xì)菌，冰上靜置10分鐘，4℃、4000rpm離心10分鐘，棄上清。以4ml預(yù)冷的0.1M CaCL2/100ml菌液重懸細(xì)菌放置于冰上，4℃放置12小時(shí)后即可用于轉(zhuǎn)化。將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA(＜50ng)加入到200μl感受態(tài)細(xì)菌中，旋轉(zhuǎn)混勻，冰上靜置30分鐘，42℃水浴90秒后立即置冰上2分鐘。加入0.8ml37℃預(yù)溫的LB培養(yǎng)基，37℃、200rpm震蕩培養(yǎng)45分鐘后，以200μl感受態(tài)細(xì)菌/90mm板鋪于含抗生素的平板上，37℃倒置培養(yǎng)16小時(shí)以上。
2、YF10C25單抗輕、重鏈可變區(qū)基因克隆載體構(gòu)建將YF10C25單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用NucleoTrap DNA purification試劑盒(Clontech公司)回收。以限制性內(nèi)切酶(BoehringerMennheim公司產(chǎn)品)PvuII和BglII對(duì)質(zhì)粒pRGWL及輕鏈擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行完全酶解，以PstI和BstEII對(duì)質(zhì)粒pRUWH及重鏈擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行完全酶解?；厥障鄳?yīng)片段后，用T4 DNA連接酶(Boehringer Mennheim公司)分別定向連接輕鏈片段和pRGWL、重鏈片段和pRUWH，分別命名為pRGWL/VL和pRUWH/VH(見圖5)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌。采用含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板篩選轉(zhuǎn)化菌。輕鏈共得111個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，隨機(jī)挑取10個(gè)克隆經(jīng)質(zhì)粒小量快提后進(jìn)行PvuII、BglII雙酶切及HindIII單酶切鑒定，其中7個(gè)克隆為正確重組克隆。重鏈共得133個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，隨機(jī)挑取10個(gè)克隆進(jìn)行PstI、BstEII雙酶切及EcoRI、HindIII雙酶切鑒定，其中8個(gè)克隆為正確重組克隆。
3、核苷酸序列測(cè)定采用熒光標(biāo)記雙脫氧末端鏈終止法，使用載體克隆位點(diǎn)兩端的測(cè)序引物，按DyeDeoxyTM Terminator DNA測(cè)序試劑盒(Perkin Elmer公司)說明書對(duì)2個(gè)經(jīng)鑒定的重鏈可變區(qū)基因的重組克隆和2個(gè)經(jīng)鑒定的輕鏈可變區(qū)基因的重組克隆進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。結(jié)果2個(gè)重鏈可變區(qū)基因(366bp)的重組克隆的序列完全相同，2個(gè)輕鏈可變區(qū)基因(327bp)的重組克隆的序列完全相同。測(cè)序結(jié)果根據(jù)Kabat等總結(jié)的小鼠單抗可變區(qū)亞群共有序列分析，確定克隆的YF10C25單抗輕、重鏈可變區(qū)基因?yàn)檎_重排的有功能性的單抗可變區(qū)基因。輕、重鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列見SEQ IDNO1和SEQ ID NO2。實(shí)施例3 HER2人/鼠嵌合抗體的構(gòu)建及表達(dá)一、HER2人/鼠嵌合抗體表達(dá)載體的構(gòu)建以pRGWL/VL和pRUWH/VH為模板，采用PCR技術(shù)，擴(kuò)增帶有引導(dǎo)肽和5′-端剪切位點(diǎn)的YF10C25單抗輕、重鏈可變區(qū)基因。產(chǎn)物用NucleoTrap DNApurification試劑盒(Clontech公司)回收，BamHI和NotI酶切后，分別克隆入本室構(gòu)建的帶有人抗體κ鏈恒定區(qū)基因的表達(dá)載體pSRNC-Cκ和帶有人抗體IgG1恒定區(qū)基因的pSRDC-Cγ1中的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建成完整的HER2嵌合抗體基因的真核表達(dá)載體。
1、pRGWL/VL和pRUWH/VH質(zhì)粒的提取取已轉(zhuǎn)有質(zhì)粒的DH5α菌，接種單個(gè)菌落于2ml含100μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。按1∶100的體積比接種過夜培養(yǎng)物于100ml含100μg/ml Amp的TB培養(yǎng)基(1.3％tryptone，2.7％yeast extract，0.4％glycerol，0.17mol/L KH2PO4，0.72mol/L K2HPO4)中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)22小時(shí)使OD600達(dá)到1.0以上。冰浴預(yù)冷，4℃、10000rpm離心10分鐘，棄上清，用40ml的洗滌液(0.15mol/LNaCL，10mmol/L Tris·HCL，1mmol/L EDTA，pH8.0)洗滌，4℃、10000rpm離心10分鐘，棄上清。加入4ml溶液I(25mmol/L Tris·HCL，50mmol/L glucose，10mmol/L EDTA，4mg/ml溶菌酶，pH8.0)吹勻，室溫放置10分鐘。加入8ml溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)混勻，室溫放置10分鐘。加入6ml溶液III(3mol/LKAc＋2mol/L HAc)混勻，冰浴10分鐘。4℃、10000rpm離心20分鐘，轉(zhuǎn)移上清，加入RNase至終濃度為100μg/ml，55℃溫育1小時(shí)。飽和酚抽提一次，4℃、10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清，再繼續(xù)以酚∶氯仿和氯仿各抽提一次。加入2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀2小時(shí)，4℃、12000rpm離心30分鐘。棄上清，70％乙醇洗滌一次，4℃、12000rpm離心10分鐘。棄上清，空氣干燥，加入2ml TE溶解沉淀，再加入5mol/L NaCL 0.6ml、30％PEG6000 0.78ml，混勻沉淀30分鐘。4℃、12000rpm離心30分鐘。棄上清，加入2ml TE溶解沉淀，再加入50μl20％SDS和60μl蛋白酶K(20mg/ml)混勻，37℃溫育1小時(shí)。飽和酚抽提一次，4℃、10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清，再繼續(xù)以酚∶氯仿和氯仿各抽提一次。加入2倍體積無水乙醇、0.1倍體積3mol/L NaAc(pH5.2)混勻，-20℃沉淀2小時(shí)，4℃、12000rpm離心30分鐘。棄上清，70％乙醇洗滌一次，4℃、12000rpm離心10分鐘。棄上清，空氣干燥，加入200μl ddH2O溶解沉淀。
2、PCR擴(kuò)增帶有引導(dǎo)肽和5′-端剪切位點(diǎn)的YF10C25單抗輕、重鏈可變區(qū)基因方法同實(shí)施例2中PCR方法，擴(kuò)增帶有引導(dǎo)肽和5’剪接位點(diǎn)的輕、重可變區(qū)基因的引物序列如下5′引物PVNP5′-GCTCG GAAGC TTGAA TTCGG ATCCA TGAATATGCA AATCC TCTG-3′3′引物PVLS5′-GGGTC CAAGC TTGCG GCCGC AACTG AGGAAGCAAA GTTTA AATTC TACTC ACGTT TGATCACCA-3′PVHS5′-GGGTC CGAAT TCGCG GCCGC TATAA ATCTCTGGCC ATGAA G-3′所用模板為pRGWL/VL和pRUWH/VH各0.5μg，循環(huán)次數(shù)改為20次。PCR反應(yīng)結(jié)果擴(kuò)增出帶有引導(dǎo)肽的YF10C25的VL片段，大小約500bp；和帶有引導(dǎo)肽的VH片段，大小約710bp。
3、HER2人/鼠嵌合抗體高效表達(dá)載體構(gòu)建回收帶有引導(dǎo)肽的VL片段與本室構(gòu)建的具人抗體κ鏈恒定區(qū)的真核表達(dá)載體pSRNC-Cκ同時(shí)經(jīng)BamHI和NotI酶切后，定向克隆入載體。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌并快提質(zhì)粒后經(jīng)BamHI和NotI酶切篩選重組克隆，10個(gè)克隆中篩選到7個(gè)正確的重組克隆，命名為pSRNC-Cκ-YF10C25，此即HER2人/鼠嵌合抗體的輕鏈表達(dá)載體。
回收帶有引導(dǎo)肽的VH片段與本室構(gòu)建的具人抗體IgG1恒定區(qū)的真核表達(dá)載體pSRDC-Cγ1同時(shí)經(jīng)BamHI和NotI酶切后，定向克隆載體。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌并快提質(zhì)粒后經(jīng)BamHI和NotI酶切篩選重組克隆，10個(gè)克隆中篩選到6個(gè)正確的重組克隆命名為pSRDC-Cγ1-YF10C25，此即HER2人/鼠嵌合抗體的重鏈表達(dá)載體。二、HER2人/鼠嵌合抗體在真核細(xì)胞CHO/dhfr-中的高效表達(dá)1、HER2人/鼠嵌合抗體輕、重鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞CHO-dhfr-細(xì)胞在含10％FBS、0.03mmol/l次黃嘌呤(H)、0.003mmol/l胸腺嘧啶脫氧核苷(T)、0.1mmol/l脯氨酸(Pro)、0.1mmol/l甘氨酸(Gly)、100u/ml青鏈霉素、2mmol/l谷氨酰胺的DMEM＋F12完全培養(yǎng)液中，5％CO2、37℃的條件下培養(yǎng)。
使用LipofectAMINE(GibcoBRL公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。接種1×106CHO-dhfr-細(xì)胞于25cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)至60～80％滿時(shí)，取輕、重鏈表達(dá)載體各4μg稀釋于250μl無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，取40μl LipofectAMINE試劑，稀釋于250μl無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基中。輕輕混合，室溫放置30分鐘。在靜置期間，以每次5ml的無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，最后加2ml無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基于細(xì)胞中。將0.5mlLipofectAMINE和DNA的混合物滴加于細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，邊滴邊混勻。5％CO2、37℃培養(yǎng)4小時(shí)。吸棄上清，加入5ml含血清的DMEM＋F12完全培養(yǎng)液5％CO2、37℃培養(yǎng)72小時(shí)。
2、HER2人/鼠嵌合抗體在CHO/dhfi-細(xì)胞中的表達(dá)取培養(yǎng)72小時(shí)的上清，采用羊抗人Ig多抗包被、HRP標(biāo)記的羊抗人IgG-Fc為二抗的夾心ELISA測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HER2人/鼠嵌合抗體的瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果上清中瞬時(shí)表達(dá)的嵌合抗體含量約為1μg/ml。
72小時(shí)后將25cm2培養(yǎng)瓶中細(xì)胞經(jīng)消化后接種10塊96孔板，培養(yǎng)三天后采用含200μg/ml G418并撤除H、T、Gly的DMEM＋F12選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到neo+、dhfr+雙表型陽性的細(xì)胞克隆，10天后可見克隆生長(zhǎng)，共得到neo+、dhfr+雙表型陽性的細(xì)胞克隆420個(gè)。三周后，采用夾心ELISA篩選嵌合抗體高表達(dá)的克隆，按1.5個(gè)細(xì)胞/孔的數(shù)量進(jìn)行亞克隆。亞克隆篩選時(shí)，96孔板細(xì)胞基本長(zhǎng)滿后，換液繼續(xù)培養(yǎng)2天，取上清測(cè)定其嵌合抗體含量。同前法，用夾心ELISA挑選嵌合抗體表達(dá)最高的細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，按1∶5傳代后換含1×10-8mol/L氨甲喋呤(MTX)的DMEM＋F12選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞適應(yīng)了1×10-8mol/L MTX后，繼續(xù)進(jìn)行亞克隆，篩選嵌合抗體表達(dá)最高的細(xì)胞克隆。篩選出的嵌合抗體表達(dá)最高的克隆，在25cm2培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，換液繼續(xù)培養(yǎng)3天，取上清測(cè)定其嵌合抗體含量，并以此次測(cè)得的抗體含量值為準(zhǔn)，挑選嵌合抗體表達(dá)最高的細(xì)胞克隆。按同樣方法相繼換含5×10-8mol/LMTX、2.5×10-7mol/LMTX、1.25×10-6mol/LMTX的DMEM＋F12選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、亞克隆，篩選嵌合抗體表達(dá)最高的細(xì)胞克隆。三、HER2人/鼠嵌合抗體的鑒定1、HER2人/鼠嵌合抗體的人源性及特異性1.1 RT-PCR檢測(cè)嵌合抗體在mRNA水平上的人源性及特異性取轉(zhuǎn)染并經(jīng)G418篩選后的neo+、dhfr+雙表型陽性的細(xì)胞，一步法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，采用擴(kuò)增原鼠單抗可變區(qū)基因的引物(VL5、VL3及VH5、VH3)，可擴(kuò)增出特異的327bp的VL和366bp的VH片段；采用人Cκ輕鏈(HCκ3)或Cγ1重鏈(HCγ13)3′-端引物和相應(yīng)的原鼠單抗可變區(qū)5′端引物(VL5及VH5)，均可擴(kuò)增出700bp左右的含有鼠單抗輕、重鏈可變區(qū)和人Cκ或Cγ1恒定區(qū)基因的輕、重鏈鏈嵌合基因片段。說明所表達(dá)的HER2嵌合抗體在mRNA水平上含有人Cκ輕鏈和人Cγ1重鏈基因，同時(shí)含有YF10C25單抗的可變區(qū)基因。因此所表達(dá)的抗體應(yīng)是含有鼠單抗可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)的人/鼠嵌合抗體并且具有與親本鼠單抗相同的抗原特異性。
HCγ135′-GCATG TACTA GTTTT GTCAC AAGA-3′HCκ3 5′-GCGCC GTCTA GAACT AACAC TCTCC CCTGT TGAAGCTCTT TGTGA CGGGC AAG-3′1.2間接ELISA檢測(cè)嵌合抗體的人源性以羊抗人Ig多抗包被酶標(biāo)板，用HRP標(biāo)記的羊抗人IgG-Fc為二抗，進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，以未轉(zhuǎn)染抗體基因的細(xì)胞上清及鼠單抗為對(duì)照。結(jié)果顯示，培養(yǎng)上清中含有約1μg/ml的人IgG成分，說明上清中所測(cè)得的抗體含有人抗體的恒定區(qū)片段，所表達(dá)的嵌合抗體的恒定區(qū)為人IgG的恒定區(qū)。
1.3嵌合抗體的抗原結(jié)合特異性1.3.1 Western Blot分析用復(fù)性后的HER2胞外區(qū)蛋白在PAGE膠中進(jìn)行非還原電泳，采用半干式電轉(zhuǎn)移法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用HRP標(biāo)記的羊抗人IgG-Fc為二抗。結(jié)果顯示，HER2嵌合抗體與用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗的YF10C25單抗相同能和復(fù)性后非還原電泳中HER2胞外區(qū)抗原反應(yīng)出現(xiàn)單一免疫染色帶，說明HER2嵌合抗體與原鼠單抗具相同的抗原特異性。
1.3.2、細(xì)胞ELISA檢測(cè)嵌合抗體的抗原結(jié)合特異性接種轉(zhuǎn)染了人HER2基因的NIH/3T3細(xì)胞(NIH/3T3/HER2)于96孔板，10000個(gè)細(xì)胞/孔，以NIH/3T3細(xì)胞為陰性細(xì)胞對(duì)照。以高表達(dá)HER2嵌合抗體的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗、CHO/dhfr-細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照。HRP標(biāo)記的羊抗人IgG為二抗。結(jié)果顯示，HER2嵌合抗體可特異性的識(shí)別NIH/3T3/HER2細(xì)胞而與NIH/3T3細(xì)胞不反應(yīng)，說明HER2嵌合抗體可特異性的識(shí)別細(xì)胞表面的HER2抗原。
2、HER2嵌合抗體在CHO/dhfr-細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)量的測(cè)定用靜態(tài)耗盡培養(yǎng)法，已生長(zhǎng)至100％匯合的細(xì)胞按0.2ml培養(yǎng)液/cm2細(xì)胞換含10％FBS的新鮮培養(yǎng)液后4天收集上清，夾心ELISA測(cè)定上清中嵌合抗體含量，結(jié)果表明靜態(tài)耗盡培養(yǎng)方式的嵌合抗體產(chǎn)量為40～60μg/ml。
至此已成功制備HER2人源化嵌合抗體，并對(duì)其所有生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。實(shí)施例4HER2改形抗體的構(gòu)建及表達(dá)根據(jù)HER2單抗生物學(xué)特性鑒定結(jié)果，選YF10C25單抗可變區(qū)基因構(gòu)建HER2改形抗體。一、HER2改形抗體基因核苷酸序列的確定將實(shí)施例2獲得的HER2單抗YF10C25輕、重鏈可變區(qū)基因序列與Kabat(Kabat，E.A.et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，3.sup.thedition)的人抗體輕、重鏈亞群的共有序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)HER2單抗YF10C25輕鏈可變區(qū)基因與Kabat的人抗體κ輕鏈亞群IV共有序列同源性最高，YF10C25重鏈可變區(qū)基因與Kabat的人抗體重鏈亞群III共有序列同源性最高。以Kabat的人抗體κ輕鏈亞群IV共有序列和Kabat的人抗體重鏈亞群III共有序列的框架區(qū)(FR)作為改形抗體的FR，將YF10C25輕、重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)代入FR中，并考慮可能影響抗原與抗體結(jié)合的位點(diǎn)應(yīng)保留原鼠單抗的序列，決定在輕鏈FR的第3位、第4位、第85位以及重鏈FR的第1位、第5位、第24位、第30位、第73位、第75位、第94位保留YF10C25的序列。根據(jù)由此獲得的改形抗體氨基酸序列，推導(dǎo)出該改形抗體核苷酸序列如SEQ ID NO3和4所示。二、HER2改形抗體的構(gòu)建設(shè)計(jì)并合成以下引物PL15’-GAC ATC CAG CTG ACC CA-3’PL25’-GCATGAGATGGTGGCCCTCTCCCCCAGAGATACAGCTAAGGAGTCTGGAGACTGGGTCAGCTGGATGTC-3’
PL35’-GCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAA-3’PL45’-TTGTAGGTTGGATGCAAGATAGATGAGGAGTTTGGGTGGCTGTCCTGGTTTCTGTTGGTACCAGTGCAT-3’PL55’-GCATCCAACCTACAATCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTC-3’PL65’-GAGGGTGAAGTCTGTATAGGTTGCGACATCCTCTGCTTGGAGACTACTGATGGTGAGGGTGAAGTCTGT-3’PL75’-TACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTTCCCACGTTCGGACAGGGGACCAAGGTGGAGATC-3’PL85’-GATCTCCACCTTGGTCCCCTG-3’PH15’-CAGGTCCAACTGCAGGA-3’PH25’-TGCACAGGAGAGTCTCAGAGAACCCCCAGGCTGTACCAAGCCTCCTCCAGACTCCTGCAGTTGGACCTG-3’PH35’-AGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCACTGATTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCA-3’PH45’-TGTGTAACCATTAGCTTTGTTTCTAATAAAACCCAACCACTCAAGTCCCTTTCCTGGAGCCTGGCGGAC-3’PH55’-GCTAATGGTTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCC-3’PH65’-GACGGCAGTGTCCTCAGCTCTCAGGGAGTTCATTTGAAGATAGAGGGTATTTTGGGAATTATCTCTGGA-3’PH75’-GAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCAAGCCTCTACTATGGTTACAACTATGCTATGGACTACTGGGGC-3’PH85’-TGAGGAGACGGTGACCAGGGTCCCTTGGCCCCAGTAGTCCAT-3’改形抗體輕鏈可變區(qū)基因的Overlap PCR合成以PL1、PL2、PL3、PL4為引物，不加模板，使用TaqplusI酶，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分半，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，補(bǔ)加一輪延伸7分鐘的循環(huán)?；厥誔CR產(chǎn)物。以PL5、PL6、PL7、PL8為引物，不加模板，使用Taq plusI酶，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分半，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，補(bǔ)加一輪延伸7分鐘的循環(huán)。回收PCR產(chǎn)物。將上述兩種PCR產(chǎn)物等量混合，不加模板，使用Taq plusI酶，94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘，72℃延伸1分半，擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，再94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分半，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，補(bǔ)加一輪延伸7分鐘的循環(huán)?；厥誔CR產(chǎn)物。即為改形抗體輕鏈可變區(qū)基因。
改形抗體重鏈可變區(qū)基因的Overlap PCR合成以PH1、PH2、PH3、PH4為引物，不加模板，使用TaqplusI酶，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分半，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，補(bǔ)加一輪延伸7分鐘的循環(huán)。回收PCR產(chǎn)物。以PH5、PH6、PH7、PH8為引物，不加模板，使用Taq plusI酶，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分半，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，補(bǔ)加一輪延伸7分鐘的循環(huán)?；厥誔CR產(chǎn)物。將上述兩種PCR產(chǎn)物等量混合，不加模板，使用Taq plusI酶，94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘，72℃延伸1分半，擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，再94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分半，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，補(bǔ)加一輪延伸7分鐘的循環(huán)?；厥誔CR產(chǎn)物。即為改形抗體重鏈可變區(qū)基因。
將改形抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用NucleoTrap DNApurification試劑盒(Clontech公司)回收。以限制性內(nèi)切酶(Boehringer Mennheim公司產(chǎn)品)PvuII和BglII對(duì)質(zhì)粒pRGWL及輕鏈擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行完全酶解，以PstI和BstEII對(duì)質(zhì)粒pRUWH及重鏈擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行完全酶解?；厥障鄳?yīng)片段后，用T4 DNA連接酶(Boehringer Mennheim公司)分別定向連接輕鏈片段和pRGWL、重鏈片段和pRUWH，分別命名為pRGWL/VLR和pRUWH/VHR，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌。輕鏈進(jìn)行PvuII、BglII雙酶切及HindIII單酶切鑒定，篩選正確重組克隆。重鏈進(jìn)行PstI、BstEII雙酶切及EcoRI、HindIII雙酶切鑒定，篩選正確重組克隆。輕重鏈克隆進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，驗(yàn)證合成的基因的正確性。
PCR擴(kuò)增帶有引導(dǎo)肽和5′-端剪切位點(diǎn)的改形抗體輕、重鏈可變區(qū)基因方法同實(shí)施例2中PCR方法，擴(kuò)增帶有引導(dǎo)肽和5’剪接位點(diǎn)的輕、重可變區(qū)基因的引物序列如下5′引物PVNP5′-GCTCG GAAGC TTGAA TTCGG ATCCA TGAAT ATGCAAATCC TCTG-3 ′3′引物PVLS5′-GGGTC CAAGC TTGCG GCCGC AACTG AGGAA GCAAAGTTTA AATTC TACTC ACGTT TGATC ACCA-3′PVHS5′-GGGTC CGAAT TCGCG GCCGC TATAA ATCTC TGGCCATGAA G-3′所用模板為pRGWL/VLR和pRUWH/VHR各0.5μg，循環(huán)次數(shù)改為20次。PCR反應(yīng)結(jié)果擴(kuò)增出帶有引導(dǎo)肽的改形抗體的VL片段，大小約500bp；和帶有引導(dǎo)肽的VH片段，大小約710bp。
HER2改形抗體高效表達(dá)載體構(gòu)建回收帶有引導(dǎo)肽的VL片段與本室構(gòu)建的具人抗體κ鏈恒定區(qū)的真核表達(dá)載體pSRNC-Cκ同時(shí)經(jīng)BamHI和NotI酶切后，定向克隆入載體。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌并快提質(zhì)粒后經(jīng)BamHI和NotI酶切篩選正確的重組克隆，命名為pSRNC-Cκ-RHER2，此即HER2改形抗體的輕鏈表達(dá)載體。
回收帶有引導(dǎo)肽的VH片段與本室構(gòu)建的具人抗體IgG1恒定區(qū)的真核表達(dá)載體pSRDC-Cγ1同時(shí)經(jīng)BamHI和NotI酶切后，定向克隆載體。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌并快提質(zhì)粒后經(jīng)BamHI和NotI酶切篩選正確的重組克隆，命名為pSRDC-Cγ1-RHER2，此即HER2改形抗體的重鏈表達(dá)載體。三、HER2改形抗體在真核細(xì)胞CHO/dhfr-中的高效表達(dá)使用LipofectAMINE(Gibco BRL公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。接種1×106CHO-dhfr-細(xì)胞于25cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)至60～80％滿時(shí)，取上述輕、重鏈表達(dá)載體各4μg稀釋于250μl無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，取40μl LipofectAMINE試劑，稀釋于250μl無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基中。輕輕混合，室溫放置30分鐘。在靜置期間，以每次5ml的無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，最后加2ml無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基于細(xì)胞中。將0.5mlLipofectAMINE和DNA的混合物滴加于細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，邊滴邊混勻。5％CO2、37℃培養(yǎng)4小時(shí)。吸棄上清，加入5ml含血清的DMEM＋F12完全培養(yǎng)液5％CO2、37℃培養(yǎng)72小時(shí)。
72小時(shí)后采用含200μg/ml G418并撤除H、T、Gly的DMEM＋F12選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到neo+、dhfr+雙表型陽性的細(xì)胞克隆。四、HER2改形抗體的鑒定間接ELISA檢測(cè)嵌合抗體的人源性以羊抗人Ig多抗包被酶標(biāo)板，用HRP標(biāo)記的羊抗人IgG-Fc為二抗，進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，以未轉(zhuǎn)染抗體基因的細(xì)胞上清及鼠單抗為對(duì)照。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有約1μg/ml的人IgG成分，說明轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中所測(cè)得的抗體含有人抗體的恒定區(qū)片段，所表達(dá)的改形抗體的恒定區(qū)為人IgG的恒定區(qū)。
Western印跡分析用復(fù)性后的HER2胞外區(qū)蛋白在PAGE膠中進(jìn)行非還原電泳，采用半干式電轉(zhuǎn)移法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，以轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗人IgG-Fc為二抗。結(jié)果顯示，HER2改形抗體與用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗的YF10C25單抗相同能和復(fù)性后非還原電泳中HER2胞外區(qū)抗原反應(yīng)出現(xiàn)單一免疫染色帶，說明HER2改形抗體與原鼠單抗具相同的抗原特異性。
細(xì)胞ELISA檢測(cè)嵌合抗體的抗原結(jié)合特異性接種轉(zhuǎn)染了人HER2基因的NIH/3T3細(xì)胞(NIH/3T3/HER2)于96孔板，10000個(gè)細(xì)胞/孔，以NIH/3T3細(xì)胞為陰性細(xì)胞對(duì)照。以表達(dá)HER2改形抗體的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗、CHO-dhfr-細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照。HRP標(biāo)記的羊抗人IgG為二抗。結(jié)果顯示，HER2改形抗體可特異性的識(shí)別NIH/3T3/HER2細(xì)胞而與NIH/3T3細(xì)胞不反應(yīng)，說明HER2改形抗體可特異性的識(shí)別細(xì)胞表面的HER2抗原。實(shí)施例5HER2單鏈抗體的構(gòu)建及表達(dá)根據(jù)HER2單抗生物學(xué)特性鑒定結(jié)果，選YF10C25單抗可變區(qū)基因構(gòu)建HER2單鏈抗體。一、HER2單鏈抗體基因的構(gòu)建設(shè)計(jì)并合成以下引物P35｀＞GACATCCAGCTGACCCAGTC＜3｀P45｀＞CCACCAGAGCCACCGCCACCGCTGCCACCGCCACCACGTTTGATCACCACCTTGGTC＜3｀P55｀＞GGCAGCGGTGGCGGTGGCTCTGGTGGAGGTGGCTCTCAGGTCCAAACTGCAGCAGTCTG＜3｀P65｀＞GATGAGATCTAGTGGATGCTGCGGCTGAGGAGACGGTGACCGTGG＜3｀P75｀＞ACTGACAAGCTTAATGGTGATGATGGTGATGAGATCTAGTGGATGCG＜3｀HER2單鏈抗體可變區(qū)基因VL的擴(kuò)增以P3，P4為引物，實(shí)例二中的pRGWL/VL為模板，使用Taq plusI酶，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸1分半，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，補(bǔ)加一輪延伸7分鐘的循環(huán)。
重鏈可變區(qū)基因VH的擴(kuò)增以P5，P6為引物，實(shí)例二中的pRUWH/VH為模板，擴(kuò)增條件與VL相同。
重疊PCR將VL，VH的產(chǎn)物稀釋10倍，各取2μl混合，加入10×緩沖液，dNTP.ddH2O及Taq plusI酶，條件同上進(jìn)行7個(gè)循環(huán)后，加入P3，P6，再按上述條件進(jìn)行25輪擴(kuò)增。再以重疊PCR產(chǎn)物為模板，P3，P7為引物，條件同VL擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)。
原核表達(dá)載體pKpL-3a(北京醫(yī)科大學(xué)馬大龍惠贈(zèng))經(jīng)StyI酶切后，Klenow補(bǔ)平，再用HindIII酶切，上述的PCR產(chǎn)物經(jīng)Klenow補(bǔ)平，用HindIII部分酶切，與經(jīng)酶切的表達(dá)載體pKpL-3a連接，構(gòu)建出HER2單鏈抗體表達(dá)載體pKpL-3a-HER2。二、HER2單鏈抗體在大腸桿菌中的表達(dá)將構(gòu)建出的HER2單鏈抗體表達(dá)載體采用CaCI2的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取在氨芐平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化單個(gè)菌落，堿裂解小量提取DNA，HindIII單酶切鑒定重組克隆，再將經(jīng)鑒定的重組克隆接種氨芐平板。接種含有重組質(zhì)粒的單個(gè)菌落至50ml LB中，30℃培養(yǎng)至OD600為1.0時(shí)，加入50ml 50℃預(yù)熱的LB，42℃誘導(dǎo)6小時(shí)。收集細(xì)菌，超聲破碎后離心獲得包涵體，用SDS-PAGE分析及Western Blot檢測(cè)。包涵體用洗滌液(2mMol/l EDTA，10mMol/l TrisCl，1％Triton-x-100，PH8.0)洗滌三次后，加入變性液(6Mol/l鹽酸胍，100mMol/l TrisCl，2mMol/l EDTA，PH8.0)室溫變性4小時(shí)以上，離心留上清，用TEA緩沖液稀釋，4℃放置16小時(shí)復(fù)性，再用TEA緩沖液透析去除鹽酸胍。獲得在大腸桿菌中的表達(dá)的HER2單鏈抗體。三、HER2單鏈抗體的鑒定接種轉(zhuǎn)染了人HER2基因的NIH/3T3細(xì)胞(NIH/3T3/HER2)于96孔板，10000個(gè)細(xì)胞/孔，以NIH/3T3細(xì)胞為陰性細(xì)胞對(duì)照。以上述獲得的HER2單鏈抗體為一抗、空菌誘導(dǎo)提取物為陰性對(duì)照。HRP標(biāo)記的鼠抗His6為二抗。結(jié)果顯示，HER2單鏈抗體可特異性的識(shí)別NIH/3T3/HER2細(xì)胞而與NIH/3T3細(xì)胞不反應(yīng)，說明HER2單鏈抗體可特異性的識(shí)別細(xì)胞表面的HER2抗原。實(shí)施例6HER2胞內(nèi)抗體的構(gòu)建及表達(dá)以YF10C25單抗可變區(qū)基因構(gòu)建的HER2單鏈抗體來構(gòu)建HER2胞內(nèi)抗體。一、HER2胞內(nèi)抗體基因的構(gòu)建設(shè)計(jì)并合成以下引物P15’-CTGTAGTCTAGAGACATCCAGCTGACC-3’P25’-CTGTAGTCTAGATGAGGAGACGGTGACCGTGG-3’
以P1，P2為引物，實(shí)例五中的pKpL-3a-HER2(含HER2單鏈抗體基因)為模板，使用Taq plusI酶，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，補(bǔ)加一輪延伸7分鐘的循環(huán)。
以上PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離純化后，采用XbaI酶切，并克隆入表達(dá)載體pScFvexpress-er(美國Bradbury惠贈(zèng))。轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101后篩選重組克隆。二、HER2胞內(nèi)抗體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞SKOV3使用LipofectAMINE(Gibco BRL公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。接種1×106SKOV3細(xì)胞于25cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)至60～80％滿時(shí)，取上述表達(dá)載體各8μg稀釋于250μl無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，取40μl LipofectAMINE試劑，稀釋于250μl無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基中。輕輕混合，室溫放置30分鐘。在靜置期間，以每次5ml的無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，最后加2ml無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基于細(xì)胞中。將0.5mlLipofectAMINE和DNA的混合物滴加于細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，邊滴邊混勻。5％CO2、37℃培養(yǎng)4小時(shí)。吸棄上清，加入5ml含血清的DMEM＋F12完全培養(yǎng)液5％CO2、37℃培養(yǎng)72小時(shí)。
采用含200μg/mlG3418的DMEM＋F12選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到neo+表型陽性的細(xì)胞克隆。三、HER2胞內(nèi)抗體的鑒定接種HER2胞內(nèi)抗體轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞SKOV3于96孔板，10000個(gè)細(xì)胞/孔，以未轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞SKOV3為對(duì)照。以YF10C25單抗為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠為二抗進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)。結(jié)果顯示，HER2胞內(nèi)抗體可特異性的識(shí)別腫瘤細(xì)胞SKOV3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的HER2，降低了細(xì)胞膜上HER2的數(shù)量，HER2胞內(nèi)抗體轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞SKOV3熒光較對(duì)照未轉(zhuǎn)染的SKOV3弱。說明HER2胞內(nèi)抗體可特異性的識(shí)別細(xì)胞中的HER2抗原。實(shí)施例7HER2Fab抗體的構(gòu)建及表達(dá)根據(jù)HER2單抗生物學(xué)特性鑒定結(jié)果，選YF10C25單抗可變區(qū)基因構(gòu)建HER2Fab抗體。一、HER2 Fab抗體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)設(shè)計(jì)并合成以下引物
P15’-GCTACAAACGCGTACGCTCAGGTCCAACTG-3’P25’-GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGT-3’P35’-GCTACAAACGCGTACGCTGACATCCAGCTC-3’P45’-TTTGATCTCCACCTTGGTCC-3’使用PCR反應(yīng)，以實(shí)例二中的pRUWH/VH為模板，采用P1、P2擴(kuò)增YF10C25單抗重鏈可變區(qū)基因，使用Taq plusI酶，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，補(bǔ)加一輪延伸7分鐘的循環(huán)。
使用PCR反應(yīng)，以實(shí)例二中的pRGWL/VL為模板，采用P3、P4擴(kuò)增YF10C25單抗輕鏈可變區(qū)基因，使用Taq plusI酶，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，補(bǔ)加一輪延伸7分鐘的循環(huán)。
以上PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離純化后，重鏈產(chǎn)物采用MluI＋ApaI酶切，并克隆入中間載體pRH(本室構(gòu)建，含有MluI及人重鏈CH1 cDNA序列)；輕鏈產(chǎn)物采用MluI＋StyI酶切，并克隆入中間載體pRL(本室構(gòu)建，含有MluI及人輕鏈CκcDNA序列)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌16C9后篩選重組克隆。重鏈重組克隆采用MluI＋NheI酶切，輕鏈重組克隆采用SpeI＋SphI酶切，表達(dá)載體pRHL(本室構(gòu)建，含原核啟動(dòng)子及分泌信號(hào)肽phoA)采用MluI＋SphI酶切，瓊脂糖電泳分離純化以上3個(gè)片段，連接，構(gòu)建成HER2 Fab抗體分泌型表達(dá)載體pRHL-HER2。
將pRHL-HER2采用CaCI2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌16C9，挑取單菌落接種5ml含氨芐的2×YT培養(yǎng)基，37度200rpm培養(yǎng)6小時(shí)，離心收集菌體，重懸于20ml含氨芐的AP5培養(yǎng)基，30度250rpm培養(yǎng)20小時(shí)，離心收集菌體。-20度凍融1次，加入1ml細(xì)菌周質(zhì)腔提取液/20ml培養(yǎng)物，混勻，4度輕搖1小時(shí)，12000rpm離心20分鐘，取上清，PBS透析過夜，獲得HER2 Fab抗體。二、HER2Fab抗體的鑒定接種轉(zhuǎn)染了人HER2基因的NIH/3T3細(xì)胞(NIH/3T3/HER2)于96孔板，10000個(gè)細(xì)胞/孔，以NIH/3T3細(xì)胞為陰性細(xì)胞對(duì)照。以上述獲得的HER2 Fab抗體為一抗、空菌誘導(dǎo)提取物為陰性對(duì)照。HRP標(biāo)記的羊抗人κ鏈為二抗。結(jié)果顯示，HER2 Fab抗體可特異性的識(shí)別NIH/3T3/HER2細(xì)胞而與NIH/3T3細(xì)胞不反應(yīng)，說明HER2 Fab抗體可特異性的識(shí)別細(xì)胞表面的HER2抗原。實(shí)施例8HER2雙特異性抗體的構(gòu)建及表達(dá)以由YF10C25單抗可變區(qū)基因得到的HER2嵌合抗體以及抗CD3嵌和抗體基因構(gòu)建HER2雙特異性抗體。一、HER2雙特異性抗體基因的構(gòu)建如實(shí)施例3所述，獲得含HER2嵌合抗體基因的表達(dá)載體pSRNC-Cκ-YF10C25和pSRDC-Cγ1-YF10C25。表達(dá)載體pBDLH-CD3為本室構(gòu)建，同時(shí)含有CD3嵌和抗體的輕重鏈基因，標(biāo)志基因?yàn)閔yg。二、HER2雙特異性抗體在真核細(xì)胞中的表達(dá)使用LipofectAMINE(Gibco BRL公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。接種1×106CHO-dhfr-細(xì)胞于25cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)至60～80％滿時(shí)，取上述三種表達(dá)載體各3μg稀釋于250μl無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，取40μl LipofectAMINE試劑，稀釋于250μl無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基中。輕輕混合，室溫放置30分鐘。在靜置期間，以每次5ml的無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，最后加2ml無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基于細(xì)胞中。將0.5mlLipofectAMINE和DNA的混合物滴加于細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，邊滴邊混勻。5％CO2、37℃培養(yǎng)4小時(shí)。吸棄上清，加入5ml含血清的DMEM＋F12完全培養(yǎng)液5％CO2、37℃培養(yǎng)72小時(shí)。
培養(yǎng)三天后采用含200μg/ml G418、潮霉素、并且撤除H、T、Gly的DMEM＋F12選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到neo+、hyg+、dhfr+三表型陽性的細(xì)胞克隆。三、HER2雙特異性抗體的鑒定消化轉(zhuǎn)染了人HER2基因的NIH/3T3細(xì)胞(NIH/3T3/HER2)，與表達(dá)CD3的Jurkat細(xì)胞等量混合，以NIH/3T3細(xì)胞為陰性細(xì)胞對(duì)照。加入上述三表型陽性的細(xì)胞克隆培養(yǎng)上清、CHO/dhfr-細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照。37度孵育30分鐘。結(jié)果顯示，HER2雙特異性抗體可特異性的識(shí)別NIH/3T3/HER2細(xì)胞而與NIH/3T3細(xì)胞不反應(yīng)，并同時(shí)與Jurkat細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致在顯微鏡下觀察到兩種細(xì)胞相互粘連的橋聯(lián)現(xiàn)象，說明HER2雙特異性抗體可同時(shí)特異性的識(shí)別細(xì)胞表面的HER2抗原和CD3抗原。實(shí)施例9HER2單鏈抗體免疫毒素(融合蛋白)的構(gòu)建及表達(dá)以YF10C25單抗可變區(qū)基因構(gòu)建的HER2單鏈抗體和毒素構(gòu)建HER2單鏈抗體免疫毒素。一、HER2單鏈抗體免疫毒素基因的構(gòu)建及表達(dá)設(shè)計(jì)并合成以下引物P1GGCGCCGCCATATGGACATCCAGCTGACCCAGTCP2CGCCCAAGCTTTAGTACTTGAGGAGACGGTGACCGA使用PCR反應(yīng)，以實(shí)例五中的HER2單鏈抗體表達(dá)載體pKpL-3a-HER2為模板，采用P1、P2擴(kuò)增HER2單鏈抗體基因，使用Taq plusI酶，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，補(bǔ)加一輪延伸7分鐘的循環(huán)。
以上PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離純化后，產(chǎn)物采用NdeI＋HindIII酶切，并克隆入表達(dá)載體pRK78(美國Pastan惠贈(zèng)，含有NdeI＋HindIII克隆位點(diǎn)和HindIII位點(diǎn)后的假單胞菌毒素-PE40的基因)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后篩選重組克隆。
接種含有重組質(zhì)粒的單個(gè)菌落至50ml LB中，30℃培養(yǎng)至OD600為1.0時(shí)，加入50ml50℃預(yù)熱的LB，42℃誘導(dǎo)6小時(shí)。收集細(xì)菌，超聲破碎后離心獲得包涵體，用SDS-PAGE分析及Western Blot檢測(cè)。包涵體用洗滌液(2mMol/l EDTA，10mMol/l TrisCl，1％Triton-x-100，PH8.0)洗滌三次后，加入變性液(6Mol/l鹽酸胍，100mMol/l TrisCl，2mMol/l EDTA，PH8.0)室溫變性4小時(shí)以上，離心留上清，用TEA buffer稀釋，4℃放置16小時(shí)復(fù)性，再用TEA buffer透析去除鹽酸胍。獲得在大腸桿菌中的表達(dá)的HER2單鏈抗體免疫毒素。二、HER2單鏈抗體免疫毒素的鑒定接種HER2高表達(dá)的SKBR3于96孔板，1.6×104細(xì)胞/孔。24小時(shí)后換液，加入含1000ng/ml的HER2單鏈抗體免疫毒素、PE40或BSA的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。換液，每孔加入含1μCi的3H-Leu的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，收獲進(jìn)行β記數(shù)，計(jì)算殺傷率。結(jié)果表明，BSA與未加任何物質(zhì)的對(duì)照相比未見明顯差別。而加HER2單鏈抗體免疫毒素的組記數(shù)值僅為正常對(duì)照的93％，殺傷作用非常明顯。同時(shí)單純加PE40的組記數(shù)值為正常對(duì)照的54％。這說明表達(dá)的HER2單鏈抗體免疫毒素既識(shí)別HER2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，其所帶的PE40毒素對(duì)細(xì)胞又具有顯著的殺傷作用。實(shí)施例10HER2F(ab’)2抗體的構(gòu)建及表達(dá)根據(jù)HER2單抗生物學(xué)特性鑒定結(jié)果，選YF10C25單抗可變區(qū)基因構(gòu)建HER2 F(ab’)2抗體。一、HER2 F(ab’)2抗體的構(gòu)建及其在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)設(shè)計(jì)并合成以下引物Vleader5′-GAATCGGGATCCATGGGATGGAGCTGTATCACκdown5′-AGTTGAGAATTCGGATCCTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCCγ1down5′-AGTTGAGAATTCTTAGAGGGTGTCCTTGGGTTTTG用Trizol試劑提取實(shí)例三中表達(dá)抗HER2嵌合抗體的細(xì)胞株的總RNA，分別以Cκdown和Cγ1down為引物反轉(zhuǎn)錄，再都以VLeader為上游引物，各自進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增出的輕鏈基因和Fd基因分別克隆入pGEM-3Zf(+)，用ABI377型自動(dòng)測(cè)序儀雙向測(cè)序后，再先將輕鏈基因克隆入載體pAcUW51的polyhedrin啟動(dòng)子下游，然后將Fd基因克隆入pAcUW51的p10啟動(dòng)子下游。用Qiagen Plasmid Midi Kit純化重組的質(zhì)粒后，利用Cellfectin將其與BaculoGoldDNA共轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，4天后收獲第一代病毒，進(jìn)行擴(kuò)增后，繼續(xù)感染sf9細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞上清中抗HER2F(ab’)2抗體的表達(dá)。二、HER2F(ab’)2抗體的鑒定接種轉(zhuǎn)染了人HER2基因的NIH/3T3細(xì)胞(NIH/3T3/HER2)于96孔板，10000個(gè)細(xì)胞/孔，以NIH/3T3細(xì)胞為陰性細(xì)胞對(duì)照。以上述獲得的HER2F(ab’)2抗體細(xì)胞上清為一抗、sf9細(xì)胞上清為陰性對(duì)照。HRP標(biāo)記的羊抗人κ鏈為二抗。結(jié)果顯示，HER2F(ab’)2抗體可特異性的識(shí)別NIH/3T3/HER2細(xì)胞而與NIH/3T3細(xì)胞不反應(yīng)，說明HER2F(ab’)2抗體可特異性的識(shí)別細(xì)胞表面的HER2抗原。
序列表VH(SEQ ID NO1)屬于小鼠IgG1第III(A)亞群9 18 27 36 45 545’CAG GTC CAA CTG CAG CAG TCT GGA GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGT TCT CTGGln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu63 72 81 90 99 108AGA CTC TCC TGT GCA ACT TCT GGG TTC ACC TTC ACT GAT TAC TAC ATG AGC TGGArg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser TrpCDR1117 126 135 144 153 162GTC CGC CAG CCT CCA GGA AAG GCA CTT GAG TGG TTG GGT TTT ATT AGA AAC AAAVal Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys171 180 189 198 207 216GCT AAT GGT TAC ACA ACA GAG TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATCAla Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr IleCDR2225 234 243 252 261 270TCC AGA GAT AAT TCC CAA AGC ATC CTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG AGA GCTSer Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr LeuArg Ala279 288 297 306 315 324GAG GAC AGT GCC ACT TAT TAC TGT GCA AGC CTC TAC TAT GGT TAC AAC TAT GCTGlu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Tyr AlaCDR3333 342 351 360ATG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC TCG GTC ACC GTC TCC TCA3’Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser SerVL(SEQ ID NO2)屬于小鼠κ輕鏈第III亞群9 18 27 36 45 545’GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT CCA GCT TCC TTA GCT GTA TCT CTG GGG CAG AGGAsp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg63 72 81 90 99 108GCC ACC ATC TCA TGC AGG GCC AGC AAA AGT GTC AGT ACA TCT GGC TAT AGT TATAla Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser TyrCDR1117 126 135 144 153 162ATG CAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT CTTMet His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu171 180 189 198 207 216GCA TCC AAC CTA CAA TCT GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGGAla Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyCDR2225 234 243 252 261 270ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TATThr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr279 288 297 306 315 324TAC TGT CAG CAC AGT AGG GAG CTT CCC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG GTG GAGTyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val GluCDR3ATC 3’IleVH(SEQ ID NO3)9 18 27 36 45 545’CAG GTC CAA CTG CAG GAG TCT GGA GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGT TCT CTGGln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
63 72 81 90 99 108AGA CTC TCC TGT GCA ACT TCT GGG TTC ACC TTC ACT GAT TAC TAC ATG AGC TGGArg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser TrpCDR1117 126 135 144 153162GTC CGC CAG GCT CCA GGA AAG GGA CTT GAG TGG TTG GGT TTT ATT AGA AAC AAAVal Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys171 180 189 198 207 216GCT AAT GGT TAC ACA ACA GAG TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATCAla Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr IleCDR2225 234 243 252 261 270TCC AGA GAT AAT TCC CAA AAT ACC CTC TAT CTT CAA ATG AAC TCC CTG AGA GCTSer Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala279 288 297 306 315 324GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCA AGC CTC TAC TAT GGT TAC AAC TAT GCTGlu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Tyr AlaCDR3333 342 351 360ATG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 3’Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerVL (SEQ ID NO 4) 9 18 27 36 45 545’ GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT CCA GAC TCC TTA GCT GTA TCT CTG GGG GAG AGGAsp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg63 72 81 90 99 108GCC ACC ATC TCA TGC AGG GCC AGC AAA AGT GTC AGT ACA TCT GGC TAT AGT TATAla Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser TyrCDR1117 126 135 144 153 162ATG CAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT CTTMet His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu171 180 189 198 207 216GCA TCC AAC CTA CAA TCT GGG GTC CCT GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGGAla Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyCDR2225 234 243 252 261 270ACA GAC TTC ACC CTC ACC ATC AGT AGT CTC CAA GCA GAG GAT GTC GCA ACC TATThr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr279 288 297 306 315324TAC TGT CAG CAC AGT AGG GAG CTT CCC ACG TTC GGA CAG GGG ACC AAG GTG GAGTyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val GluCDR3ATC 3’Ile
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞，其于2000年6月14日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC NO 0457。
2.由權(quán)利要求1的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，所述抗體為抗人癌蛋白HER2的單克隆抗體。
3.一種抗體重鏈可變區(qū)基因，其為權(quán)利要求2所述的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)基因，并具有SEQ ID NO1所示的序列。
4.一種抗體輕鏈可變區(qū)基因，其為權(quán)利要求2所述的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)基因，并具有SEQ ID NO2所示的序列。
5.由權(quán)利要求3和/或4所述的基因構(gòu)建的人—鼠嵌合抗體、改形人源化抗體、雙特異性抗體、胞內(nèi)抗體、Fab、Fab表達(dá)庫抗體或融合蛋白的基因。
6.含有權(quán)利要求3的抗體的重鏈可變區(qū)基因和/或的權(quán)利要求4的抗體的輕鏈可變區(qū)基因的表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求5所述的人—鼠嵌合抗體、改形人源化抗體、雙特異性抗體、胞內(nèi)抗體、Fab、Fab表達(dá)庫抗體或融合蛋白的基因的表達(dá)載體。
8.用權(quán)利要求6和/或7所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
9.由權(quán)利要求8所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體、抗體衍生物或融合蛋白。
10.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備用于體內(nèi)外診斷腫瘤、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及判斷腫瘤預(yù)后的試劑中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備用于治療腫瘤、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備用于分離、純化或分析HER2癌蛋白的制劑中的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備用于分離、純化或分析HER2癌蛋白配體的制劑中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求9所述的抗體、抗體衍生物或融合蛋白在制備用于體內(nèi)外診斷腫瘤、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及判斷腫瘤預(yù)后的試劑中的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求9所述的抗體、抗體衍生物或融合蛋白在制備用于治療腫瘤、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
16.權(quán)利要求9所述的抗體、抗體衍生物或融合蛋白在制備用于分離、純化或分析HER2癌蛋白的制劑中的應(yīng)用。
17.權(quán)利要求9所述的抗體、抗體衍生物或融合蛋白在制備用于分離、純化或分析HER2癌蛋白配體的制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗人癌蛋白HER2的單克隆抗體及生產(chǎn)其的雜交瘤細(xì)胞。本發(fā)明還涉及該單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,含有所述基因的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞及由所述細(xì)胞產(chǎn)生的抗體、抗體衍生物或融合蛋白。本發(fā)明還涉及所述單克隆抗體、抗體衍生物或融合蛋白在制備診斷腫瘤、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及判斷腫瘤預(yù)后的試劑中和制備治療腫瘤、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用,以及在分離、純化或分析HER2癌蛋白或HER2癌蛋白配體中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K16/30GK1334343SQ0012130
公開日2002年2月6日 申請(qǐng)日期2000年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月14日
發(fā)明者楊治華, 冉宇靚, 楊光 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所