專利名稱：可抑制腫瘤的化合物的篩選方法和含有這些化合物的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可用作選擇性治療哺乳動物癌前期和癌癥病灶的化合物的鑒定方法，以及含有這些化合物的藥物組合物。
多年來，人們一直在致力于研究可選擇性地治療腫瘤細胞，而對正常細胞基本上又沒有抑制其生長的副作用的化合物。不管需要治療的癌癥是何種類型，通常的化療方法有一共同特征常用的組合物(例如herceptin、紫杉醇、順鉑、他莫昔芬等)對腫瘤細胞具有基本的作用-事實上對正常組織常常有很大的副作用。很多副作用使人衰弱不困難危及生命。因此，常用的化療方法只是在腫瘤病程快速發(fā)展至藥物的副作用顯然大于不進行化療的危險性的階段之后才使用。
典型的是，常用的化療方法也用來治療某些特定類型的腫瘤。例如亮丙瑞林常常被用來治療前期的前列腺癌，但是不用于治療結腸或肺癌。理想的是組合物對腫瘤具有較寬的活性。
Parnukcu等人在U.S.5,401,774中公開了現在已知的抗腫瘤化合物exisulind。與常用的化療方法不同的是，相對于正常細胞而言，該化合物對腫瘤細胞有很好的選擇性。因此，這些化合物可給慢性患者使用，而不會出現常用化療方法通常所以的副作用。此外，因為它們的安全性，這些化合物也可以對早期的患者進行治療。另外，還認識到這些新化合物是新一類的，被稱為選擇性編程性細胞死亡類的抗腫瘤藥物(“SAANDs”)。
相對于常用的化療方法而言，除了顯著的安全性能以外，與常用的化療方法相比SAANDs還有較寬范圍的治療應用。例如，已有報告說第一種SAAND藥物可用于治療結腸、乳腺、肺、前列腺、腎和黑色素瘤的腫瘤，并且對其他腫瘤也有作用。
相對于可腫瘤劑NSAIDS(如舒林酸)而言，SAANDs還具有其他優(yōu)點，與NSAIDS不同的是SAANDs不能抑制COXⅠ/Ⅱ酶。在慢性用藥時，COXⅠ和/或COXⅡ酶的抑制(例如通過indornethacin,celecoxib和其它的NSAIDs)會導致顯著的副作用。此外，對抗腫瘤作用而言不需要COX的抑制作用。并不令人意外的是，許多這類COXⅠ和COXⅡ抑制劑也沒有顯示出顯著的抗腫瘤活性，COXⅠ和COXⅡ抑制劑的副作用包括可能導致嚴重胃潰瘍的胃刺激和腎毒。用SAANDs進行抗腫瘤治療隨慢性或長期用藥而增加，相對于所顯示出的抗腫瘤性能而言，因為少數患者確實慢性或長期的使用了COX，只是由于安全方面的考慮，COX抑制劑的不適當的。對炎癥而言，COX抑制劑通常只是短期或在急性期用藥。
知道最近SAANDs為什么可在沒有COX抑制劑的副作用(或者甚至是在常用化療的更嚴重的副作用)的情況下使用一直是個秘密。如U.S.5,858,694所述，SAANDs的作用部分是通過抑制劑PDE5，由此說明了SAANDs在腫瘤中如何誘導編程性細胞死亡(細胞死亡的形式)，但是在正常細胞中不會發(fā)生。在上述694的專利中同時還發(fā)現在腫瘤中SAANDs通過提高cGMP和減少cAMP而起作用。
但是，后者發(fā)現某些PDE5抑制劑不能誘導編程性細胞死亡(例如參見U.S．申請09/173,375,1998.10.15)。在375的專利申請中，首次公開了在腫瘤細胞中發(fā)現的新的cGMP-特異性PDE。觀察到的一種結果是，與非活性的PDE5分離的抗腫瘤PDE5抑制劑是能抑制新的cGMP-特異性PDE的抗腫瘤PDE5抑制劑，而非活性的PDE5抑制劑(如sildenafil)只是相對較小的作用。如375申請所公開的結果導致了更準確的藥物篩選方法以鑒定抗腫瘤PDE5抑制劑的活性(即另外的SAANDs)。
但是，仍然需要更準確的評價和鑒定化合物用途的其它方法。
在研究為什么某些PDE5抑制劑會誘導編程性細胞死亡時，我們發(fā)現它們誘導編程性細胞死亡基本上是通過激活JNK激酶活性實現的。JNK是MAP激酶大家族中的脯氨酸定向激酶。如U.S.5,858,694(Piazza等人)的教導，可以確信的是，這種作用是在JNK編程性細胞死亡途徑的下游，通過使用編程性細胞死亡前期PDE5抑制劑調節(jié)cGMP和cAMP所引起的。cGMP和cAMP調節(jié)和JNK1活性之間的聯系是奇怪的，并且形成了確定cGMP抑制劑是不是SAANDs的應用途徑。與JNK激酶的此作用相反的是，試驗用的SAANDs只使ERK2激酶活性略有激活，通常報道的相對，但是分離的信號轉導途徑具有刺激細胞增殖的作用。
本發(fā)明涉及評價化合物是不是能夠引起腫瘤細胞中cGMP-依賴蛋白激酶G(“PKG”)活性提高和活化JNK1激酶的方法。如上所述，我們確信PKG活性的提高至少部分是由適當的PDEs的SAANDs抑制作用引起的cGMP的增加。SAANDs的其它特征是(1)如上述694專利中所報道的PDE5的抑制作用；(2)新的cGMP-特異性PDE構形；(3)PDE2的抑制作用；(4)在腫瘤細胞內，SAANDs可提高細胞內cGMP的事實；和(5)在某些種類的腫瘤細胞中，可減少cAMP水平的事實。
因此，本發(fā)明新方法的一個實施方案是評價化合物是不是能夠激活JNK，引起腫瘤細胞中PKG活性的提高，以及化合物是不是可以抑制PDE5。本發(fā)明新的篩選方法的另一實施方案是評價化合物是不是能夠激活JNK，引起腫瘤細胞中PKG活性的提高，以及化合物是不是可以抑制如上所述的新的cGMP-特異性PDE和/或PDE5。第三個實施方案是評價化合物是不是能夠激活JNK，引起腫瘤細胞中PKG活性的提高，以及化合物是不是可以使腫瘤細胞中的cGMP提高和/或cGMP水平下降。以這種方式可以成功地評價言語SAANDs的化合物。
在這些方面，本發(fā)明還涉及新的在體內或體外選擇化合物治療和預防腫瘤的能力的方法，特別是可安全的用于癌前期損傷的方法。具體地說，本發(fā)明是選擇可治療和預防腫瘤，包括治療和預防癌前期損傷的化合物的方法。如此鑒定的化合物對COX抑制作用以及與常規(guī)化療方法有關的其它非特異性交互作用有最小的副作用?？梢詫Ω信d趣的化合物進行試驗，試驗方法是將腫瘤細胞與抑制cGMP PDE的化合物進行接觸，如這些化合物能夠激活細胞中的JNK，然后再對該化合物進行進一步的評價(例如，動物或人的體內或體外模型或試驗)其抗腫瘤的其它性能(例如，在體內或體外誘導編程性細胞死亡的能力)。
所以，本發(fā)明的一方面是涉及鑒定化合物是否有效地治療腫瘤化合物的篩選方法，這包括確定化合物對PDE5和/或PDE2的抑制作用，以及對COX的抑制作用。優(yōu)選的，本發(fā)明的篩選或選擇方法進一步的包括測定化合物是不是能夠在體內或體外抑制腫瘤細胞的生長。
通過以此方式選擇化合物，很有效地改進了治療腫瘤的化合物的鑒定工作，與過去研制的藥物組合物和治療向的處理腫瘤的方法相比，使之更加快速，精度更高。更多的好處將在下文詳細說明。
本發(fā)明還包括含有這些化合物的藥物組合物，以及涉及這些化合物的治療方法。
附圖的詳細說明

圖1A-C說明了JNK1和caspase-3在SW480結腸癌細胞中的活性，該細胞與舒林酸硫化物和幾種SAANDs進行接觸。
圖1A:SW480細胞用DMSO(-)或指定濃度的舒林酸硫化物、exisulind、化合物A或化合物B處理1小時。溶解細胞，用抗JNK1抗體進行JNK1免疫沉淀，用免疫沉淀物(＂CF＂)進行體外激酶活性試驗，以GST-c-Jun(1-79)為基質。該試驗以類似的結果重復三次。以磷圖象測定活性的倍數。
圖1B:SW480細胞用化合物A(1μM)在指定的時間期間內進行體外試驗，如上所述測定JNK1激酶急忙活性圖1C:SW480細胞用舒林酸硫化物(200μM)、exisulind(600μM)、化合物A(1μM)或化合物B(10μM)處理24小時。溶解細胞，用提取物進行caspase-3活性，以Ac-DEVD-AFC作為基質，試驗在有或沒有caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO存在的情況下進行。Caspase-3活性以沒有AC-DEVD-CHO存在時的ARC熒光值減去AC-DEVD-CHO存在時的熒光值(激發(fā)，400nm，放射，505nm)。
圖2A-B說明了由cGMP調節(jié)和PKG作用的JNK1活性。
圖2A SW480細胞用DMSO(-)或化合物A,0.1μM；dbcGMP,500μM；YC-1,50μM；MY5445,50μM；潘生丁，10μM或dbcAMP,500μM處理1小時。溶解細胞，JNK1免疫沉淀，如圖1A所述進行體外激酶活性的IP試驗。
圖2B SW480細胞用DMSO、KT5720(2μM)或Rp8-pCPT-cGMPS(2μM)預處理2小時，然后用化合物B(0.1或10μM)處理1小時。溶解細胞，如上所述進行JNK1活性的IP試驗。
圖3A-C說明了SAAND處理的MEKK1-SEK1途徑的活性。
圖3A:SW480細胞用化合物A(1μM)處理，在指定的時間收集，溶解進行SEK1試驗的細胞，試驗用免疫印跡法，以抗-磷酸化-SEK1(Thr223)抗體進行。通過密度測定法測定磷酸化增加的倍數。該試驗以類似的結果重復三次。
圖3B:SW480細胞用化合物A(1μM)處理，1天或2天后收集細胞，溶解進行MEKK1裂解試驗的細胞，試驗用免疫印跡法，以MEKK1抗體進行。(-)是指DMSO處理對照組細胞。
圖4說明了化合物A-誘導的由Rp-8-pCPT-cGMPS產生的PARP裂解。SW480細胞用DMSO(-)或Rp-8-pCPT-cGMPS(2μM)處理2小時，然后用DMSO(-)或化合物A(1μM)處理。2天后收集漂浮和附著的細胞，溶解進行PARP裂解試驗的細胞，試驗用免疫印跡法，以抗-PARP抗體進行。PARP裂解倍數的增加以85kD碎片進行密度測定法測定。
圖5說明了被SAANDs激活的編程性細胞死亡信號轉導途徑。通過抑制PDE2/5,SAANDs誘導了細胞內cGMP水平的提高。因此而激活了PKG，它可以導致MEKK-1/SEK1/JNK1途徑的活化。然后，在caspases活化、PARP裂解和其它介導編程性細胞死亡的事件中，JNK1的活化發(fā)揮作用，可能會伴隨其它信號。
圖6指出時間與組蛋白有關的DNA片段數量增加之間的依賴關系，所述的DNA是用50μM化合物Ⅰ處理后的LNCaP細胞培養(yǎng)物。
圖7是說明環(huán)核苷酸類似物和選擇的PDE5抑制劑中，PDE5的非催化cGMP結合位點的特異性結合的棒狀圖。
圖8A是SW480細胞溶解物的SDS(X-射線膜暴露)蛋白質凝膠PKG試驗，該溶解物是在沒有cGMP存在的情況下，用藥物處理后的細胞溶解物，是把細胞用DMSO(0.03％,1和2道)、exisulind(200,400和600μM；3,4,5道)和E4021(0.1,1和10μM,6,7,8道)培養(yǎng)48小時后得到的。
圖8B是SW480細胞溶解物的SDS(X-射線膜暴露)蛋白質凝膠PKG試驗，該溶解物是在有cGMP存在的情況下，用藥物處理后的細胞溶解物，是把細胞用DMSO(0.03％,1和2道)、exisulind(200,400和600μM；3,4,5道)和E4021(0.1,1和10μM,6,7,8道)培養(yǎng)48小時后得到的。
圖9是說明了相對于對照組，exisulind對腫瘤細胞中β-catemin和PKG水平的作用的棒狀圖。
優(yōu)選實施方案的詳細描述Ⅰ.SAANDs的特征A．一般的c-Jun和JNKc-Jun是轉錄因子AP-1的一種組分，它可被很多細胞外的刺激物活化。c-Jun的調節(jié)是很復雜的，并且確信其涉及c-Jun蛋白水平的增加和特異性絲氨酸(63和73)被JunN-端基的激酶(JNK)磷酸化兩個方面。
由前述可知，JNK的活性與編程性細胞死亡有關。例如，Gajate等人，Mol.Pharmacol.,1998年4月，53:4,602-12中指出醚磷脂化的1-O-十八烷基-2-O-甲基-rac-甘油-3-磷酸膽堿(“ET-18-OCH3”)-是人體腫瘤細胞中編程性細胞死亡的有效誘導物一以與JNK信號活性有關的方式誘導編程性細胞死亡。他們還特別指出，給不同人體的白血病細胞(HL-60,U937，和Jurkat)加入ET-18-OCH3可誘導c-jun mRNA水平發(fā)生引人注目的和可以承受的增加，該水平與活化劑蛋白-1轉錄因子的活性有關，所述的白血病細胞在用ET-18-OCH3治療的過程中會出現快速的編程性細胞死亡。他們還發(fā)現在HL-60細胞中，ET-18-OCH3可誘導JNK(在編程性細胞死亡開始之前可以對其進行測定)的持續(xù)活化，后者可由DNA碎片進行評價，也可以用在質膜的外部小葉上出現磷脂酰絲氨酸來評價。在HL-60單核細胞/巨噬細胞分化和ET-18-OCH3調節(jié)編程性細胞死亡之后，由于不同的活化方式，分別是短暫與持續(xù)的，因此JNK的誘導作用也不同。由于不能活化JNK,ET-18-OCH3的類似物不能誘導編程性細胞死亡。在K-562細胞中測不出ET-18-OCH3和JNK的依賴關系，在用ET-18-OCH3治療的過程中不會出現編程性細胞死亡。佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯可抑制ET-18-OCH3誘導的編程性細胞死亡和JNK持續(xù)不變的活性；因此，ET-18-OCH3誘導的JNK持續(xù)活性與醚磷脂誘導編程性細胞死亡的能力有關。再有，反義的低聚核苷酸可直接地使c-Jun不能阻斷ET-18-OCH3誘導的編程性細胞死亡，說明了ET-18-OCH3引起的編程性細胞死亡中c-Jun的作用。
類似地，Li Y等人，Mol.Cell Biol.,1998年8月，18:8,4719-31報道了UV刺激的JNKl活性被UV-誘導的SCLC編程性細胞死亡所促進。
這些和其它的一些報道指出JNK活性和c-Jun可以誘導編程性細胞死亡方式存在。B．關于JNK途徑中確認SAANDs的作用實驗的概述如上所述，非甾體抗炎藥物舒林酸，SAANDs如exisulind(Aptosyn)可引起退化作用，并抑制患有家族性腺性息肉(FAP)的患者再次出現息肉。Exisulind也可抑制嚙齒動物的致癌作用，并和引起生長抑制和在人體各類癌細胞系中的編程性細胞死亡。但是，exisulind不能抑制環(huán)氧化酶CQX-1或2。美國專利申請序列號09/046,739,09/173,375和09/414,626(這里引用作為參考)中公開了exisulind和其它的SAANDs在腫瘤細胞中抑制cGMP-水解磷酸二酯酶(PDE2/5)的作用，從而使腫瘤細胞中的蛋白激酶G(＂PKG＂)增加。
本發(fā)明中，我們發(fā)現了一種出人意料的作用，這就是在腫瘤細胞中SAANDs誘導的cGMP增加是JNK途徑信號轉導的作用。為了進一步確認上述結論，我們發(fā)現舒林酸硫化物、exisulind和兩種另外的SAANDS、化合物A([(Z)-5-氟-2-甲基-(3,4,5-三甲基-氧代亞芐基)-茚基乙酰胺])和化合物B((Z)-5-氟-2-甲基-(4-亞吡啶基)-(3,4,5-三甲基-氧代亞芐基)-茚基乙酰胺鹽酸鹽)能夠導致c-Jun氨基-端基的激酶(“JNK1”)的快速活化，所述激酶是與這些藥物接觸的SW480結腸癌細胞和與上述藥物接觸的其它類型的癌細胞。
由于SAANDs對腫瘤細胞的一種作用是提高這些細胞中的cGMP水平，因此為了確認SAANDs的上述新特性，我們還發(fā)現其它能提高GMP水平的已知藥物也能活化腫瘤細胞中的JNK1。另外，由于SAANDs治療的一種作用是提高PKG活性，我們發(fā)現抑制劑PKG,Rp-8-pCPT-cGMPS可以抑制腫瘤細胞中的JNK1活性，所述的JNK1與PKG抑制劑和抗腫瘤的cGMP特異性PDE抑制劑如舒林酸硫化物和SAANDs接觸。
當腫瘤細胞與SAANDs接觸時也可以觀察到JNK1上游的SEK1和MEKK1被活化。PKG拮抗劑Rp-8-Pcpt-Cgmps也可抑制舒林酸誘導的PARP裂解，它是編程性細胞死亡的標記。因此，由exisulind和SAANDs誘導的編程性細胞死亡可引起cGMP水平提高，至少是部分地提高，通過PKG的活化再形成MEKK1-SEK1-JNK1活化的級串。這些研究還第一次涉及cGMP在JNK途徑中的作用。
如在上述專利申請中所報道的，最近的研究指出SAANDs是cGMP-特異性磷酸二酯酶2和5(PDE2/5)的特異性抑制劑。以上述發(fā)現為基礎，已經發(fā)現兩種有效的SAANDs，化合物A和B是PDE5/2的特異性抑制劑。如美國專利申請序列號09/046,739和09/414,626中所述，.SAANDs對PDE5/2的抑制作用可誘導細胞內cGMP水平的提高。這些發(fā)現說明細胞內cGMP水平的提高可能是觸發(fā)編程性細胞死亡重要機制，但是沒有對所有的下游信號途徑做出鑒定。
在本文所報道的實驗中，我們發(fā)現SAANDs可引起JNK1快速和持續(xù)的活化，并確信其可受cGMP刺激的PKG活性介導。這些研究也是第一次涉及PKG對JNK1活性的作用。C．JNK活性的試驗方法和試驗結果將SW480人體結腸癌細胞氧溶劑DMSO或cGMP-特異性PDE抑制劑(即舒林酸硫化物，50-500μM；exisulind,100-600μM；化合物A，0.1-5μM；和化合物B,1-50μM)處理1小時，并對JNK1的活化進行試驗。這些濃度可根據對編程性細胞死亡的最佳誘導進行選擇。用抗-JNK1的抗體使內源性的JNK1免疫沉淀，以GST-c-Jun(1-79)作為基質進行體外激酶試驗。如圖1A所示，舒林酸硫化物，exisulind，化合物A和化合物B可活化JNK1。通過磷圖象分析對誘導的倍數定量，見圖1A。即使在很低的劑量時SAANDs、化合物A和化合物B對JNK1的活化也比舒林酸硫化物和exisulind的作用更強。在其它結腸細胞系，包括HCT 116和HT29中也觀察到類似的效果(數據未顯示)。
時間進程研究表明當SW480細胞用化合物A(1μM)處理時，JNK1的活性至少可持續(xù)24小時(圖1B)。在SW480細胞用類似濃度的舒林酸硫化物，exisulind，化合物A和化合物B處理24小時后，通過測定caspase-3的活性可確認這些化合物引起編程性細胞死亡的活性。然后，制備蛋白質提取物，以Ac-DEVD-APC為基質，在有或沒有caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO的存在下，測定caspase-3的活性。圖1C指出用所有這些化合物處理SW480細胞可引起caspase-3的活化。用HCT 116和HT29中也可觀察到類似的效果(數據未顯示)。
本發(fā)明還測定了SW480細胞中，cGMP水平的提高對JNK1的影響。如前述美國專利申請8和9所指出的，細胞內的cGMP水平可由鳥苷酸環(huán)化酶正向調節(jié)，由磷酸二酯酶2和5(PDE2/5)進行反向調節(jié)。用各種cGMP調節(jié)劑處理SW480細胞1小時，然后收集蛋白質提取物進行JNK1試驗(圖2A)。二丁酰基鳥苷3′:5′-環(huán)狀單磷酸酯(＂dbcGMP＂；500μM)，可細胞滲透的cGMP類似物，可活化SW細胞中的JNK1，但是可細胞滲透的cGMP類似物，二丁?；佘?′:5′-環(huán)狀單磷酸酯(＂dbcAMP＂；500μM)是非活性的。YC-1(50μM)，鳥苷酸環(huán)化酶活化劑也可以活化JNK1。MY-5445(50μM)和雙嘧達莫(10μM),PDES-特異性抑制劑，也活化SW細胞中的JNK1。由這些cGMP調節(jié)劑導致的JNK1的類似活性HCT116和HT29中也可觀察到(數據未顯示)。這些結果說明通過各種手段使cGMP水平提高，從而導致了結腸癌細胞中JNK1的活化。該信息對cGMP是特異性的，對cAMP不是特異性的，因為是dbcGMP，而不是dbcAMP活化細胞中的JNK1。
PKG是cGMP的一種主要細胞靶，可與cGMP或上述類似物結合，可在體內和體外激活PKG活性。但是，在信號轉導中PKG的確切作用是未知的。導致本發(fā)明的上述試驗結果指出cGMP的增加使JNK1活化，我們檢測了PKG-特異性抑制劑Rp-8-pCPT-cGMP是否有抑制SAANDs誘導JNK1活性作用的能力。作為對照，將KT5720用作蛋白質激酶A(“PKA”)特異性抑制劑。將SW480細胞用DMSO、KT5720(2μM)或Rp-8-pCPT-cGMPS(2μM)處理2小時，然后用DMSO或化合物B(1或10μM)處理1小時，收集細胞提取物，并測試JNK1活性，KT5720沒有抑制活性。綜合起來，這些結果表明SAALNDs通過cGMP/PKG途徑活化JNK1。
為了將涉及上述JNK1活性的信號轉導途徑特征化，我們測試了SEK1,JNK1上游最接近的蛋白激酶是否也能夠被SAANDs活化。SEK1的活化是通過此類蛋白質的兩種殘基Ser219和Thr223的由蛋白激酶MEKK1磷酸化實現的。將SW480細胞用化合物A(1μM)多次處理，直到6個小時，提取物用磷酸化的-Thr223-特異性SEK1抗體進行蛋白質印跡分析。在15-30分鐘內，用化合物A處理可誘導SEK1磷酸化的增加，但沒有改變內源性SEK1蛋白的總細胞水平(見圖3A)。1小時可有9倍誘導值，這種作用至少會持續(xù)6小時(圖3A)。僅用溶劑DMSO處理的細胞不會誘導SEK1的磷酸化(未給出數據)。
然后，我們測試了SAANDs對MEKK1(SEK1上游最接近的蛋白激酶)的作用。對MEKK1蛋白的蛋白質印跡分析說明SW480細胞用化合物A處理1或2天后，此蛋白質發(fā)生了裂解，但是，當細胞用DMSO處理時沒有出現裂解(圖3B)。以前的研究指出當MEKK1被caspases(19)活化時會發(fā)生裂解。如對GST-SEK1的MWKK1自動磷酸化和磷酸化作用進行的測定一樣，我們也發(fā)現化合物A對MEKK1有強和短暫的活化。這些數據說明SAANDs是通過MEKK1-SEK1途徑活化JNK1。但是，被PKG活化的cGMP是否能夠直接活化MEKK1，或MEKK1的裂解和活化是否直接影響編程性細胞死亡的過程還是不清楚的。
最后，我們研究了SAANDs誘導編程性細胞死亡是否需要PKG的活化的途徑。將SW480細胞用DMSO或PKG抑制劑Rp-8-pCPT-cGMPS(2μM)處理2小時，然后，細胞用DMSO和化合物A(1μM)處理2天。收集漂浮和附著的細胞，分析細胞溶解物中的多(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的裂解，用免疫印跡法進行分析，以抗-PARP抗體進行。PARP的116kD的核酶，它使NAD轉化為煙酰胺和連接蛋白質ADP-核糖的聚合物，這對DNA修復和基因組的維持是非常重要的。在經歷了編程性細胞死亡的細胞中，116kD的PARP蛋白被caspase-3裂解成為85和25kD的碎片，從而喪失了正常的PARP功能。PARP的這種非活性顯然可以防止NAD和ATP細胞水平的損失，雖然在編程性細胞死亡中需要后一種作用。如圖4所示，化合物A誘導PARP的裂解，但這種裂解不會由于細胞用PKG抑制劑Rp-3-pCPT-cGMPS預孵化而受到顯著的抑制。我們還觀察到在SW480細胞中，優(yōu)勢的陰性JNK1蛋白的表達強烈地抑制化合物A誘導的PARP裂解。這些數據證明在SW480細胞中cGMP/PKG/JNK1途徑對SAAND誘導的編程性細胞死亡起著重要的作用。
因此，在這些試驗中，我們首次指出SAANDs和其它cGMP誘導劑可活化信號轉導的JNK1途徑，并證明此途徑對這些化合物誘導的編程性細胞死亡起著重要的作用。上述結果見圖5。
美國專利申請序列號09/414,626和09/216,070中指出exisulind(Aptosyn)和其兩種有效的衍生物-化合物A和B可抑制SW480細胞和其它引起癌癥的細胞系中的cGMP-特異性磷酸二酯酶2和5，因此會導致cGMP細胞水平的提高。如美國專利申請序列號09/414,628所指出的，它可以導致PKG的活化。在30-60分鐘內，PKG的活化可以依次導致SEK1的持續(xù)磷酸化和活化，然后，會導致JNK1的持續(xù)活化，如圖5所示。如上文對其它可活化JNK1的非SAANDs編程性細胞死亡試劑所描述的，我們確信JNK1的活化會導致caspases的活化，PARP的裂解和基因的轉錄，也會造成編程性細胞死亡的程序。有研究者報道JNK1與各種試劑觸發(fā)的編程性細胞死亡信號途徑有關，這些觸發(fā)途徑包括UV和γ-射線、芐基異硫氰酸酯和DNA拓撲異構酶抑制劑β-拉帕醇。報道中沒有涉及cGMP或PKG的方法。
JNK1活化AP-Ⅰ轉錄因子，因此可誘導某些與t編程性細胞死亡有關的基因，同時使bc1-2磷酸化和使抗編程性細胞死亡的活性失活。好象PKG的活性也影響可造成生長抑制和SAANDs的編程性細胞死亡作用的其它途徑。這些研究首次證明了JNK1信號轉導途徑涉及PKG，因此而擴大了這種酶體系在信號轉導和控制基因表達中的作用。D．進一步確認腫瘤細胞中SAANDs提高PKG活性的作用應用下述的PKG試驗，進行下述試驗以確定SAANDs提高PKG活性的作用，在用SAAND處理的腫瘤細胞中該作用或者是因為提高PKG表達，或者提高cGMP水平(或兩者)。
對兩種不同類型的PDE抑制劑在腫瘤細胞中的作用進行評價。對抗腫瘤劑SAANDs和exisulind進行評價。對非SAANDs類型的PDE5抑制劑E4021也進行評價，以確定PKG水平的提高只是由于典型的PDE5抑制作用，或者PKG水平的提高與PDE5和美國專利申請序列號09/173,375(Liu等人，1998.10.15申請)公開的新的PDE的SAANDs抑制作用的前-編程性細胞死亡作用有關。
為了檢測cGMP-特異性PDE對含有APC突變體的腫瘤的抑制作用，使用SW480結腸癌細胞。已知SW480含有APC突變體。在RPMI5％血清中含有大約5百萬SW480細胞，將其加入8個盤中的每個盤2-10cm盤…30μL DMSO載體對照(沒有藥物)，3-10cm盤…200μM,400μM,600μM exisulind的DMSO溶液，和3-10cm盤…E4021；0.1μM,1μM和10μM,DMSO溶液。
這些盤在5％CO2的孵化器中于37℃孵化48小時。
液體介質在盤中吸氣(細胞本身會附著在盤上)。每個盤上附著的細胞通過將冷的PRS和200μL細胞溶解緩沖液即50mM Tris-HCl,1％NP-40,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM Na3VO4,1mM NaF,500μMIBMX與蛋白酶抑制劑)加入各盤中進行洗滌。在細胞緩沖液加入后用刮的方法立刻收集各盤中溶解的細胞。取自各盤的細胞溶解物轉移至微型取出管，該管在4℃孵化15分鐘，同時緩慢搖動以使細胞完全溶解。完全溶劑外后，將該管全速(14,000 r.p.m.)離心15分鐘。將取自各管的上清液轉移至新的微型取出管。
然后對各管中的內容物進行蛋白質試驗，如果藥物抑制細胞的生長，對照組的總蛋白質量大于藥物處理后的樣品。顯然，如果藥物不起作用，藥物處理樣品中的總蛋白質量應該與對照組基本相同。在上述情況下，對照組和E-4021的微型取出管需要進行稀釋，以使其與高劑量exisulind處理樣品一樣標準化(較低劑量exisulind樣品也必須與高劑量exisulind處理樣品一樣標準化)。因此，在蛋白質試驗之后，各種樣品的蛋白質濃度必須是標準化的(例如通過稀釋)。
如下文所述，對各種藥物濃度和對照組進行兩種PKG試驗，一種加入cGMP，另一種不加。需要進行兩種不同PKG試驗的原因是cGMP可特異性低活化PKG。在用本發(fā)明新的PKG試驗進行PKG活性試驗時，人們不能確定PKG活性的任何提高是不是由于細胞中cGMP的增加(它可能是由于cGMP-特異性PDE抑制劑而引起的)，或者PKG活性水平提高是不是由于提高了PKG蛋白的表達。通過在同一樣品中加或者不加cGMP，如果PKG活性有提高上，人們可以確定PKG活性的提高是由于PKG表達的提高。因此，如果相對于對照組，抗腫瘤藥物提高了PKG活性，人們就可以確定在下述情況下藥物處理組中藥物誘導的提高是由于PKG蛋白表達的提高(與活化相反)(1)與有外加cGMP的對照樣品相比，有外加cGMP的藥物處理樣品顯示出較高的PKG活性，和(2)相對于對照樣品，沒有外加cGMP的藥物處理樣品顯示出較高的PKG活性。
然后，將加或者不加cGMP的平行樣品進行比較，把50μL各種細胞溶解物加入上述20μL PDE5/GST固相基質的漿液中。對各個對照或藥物細胞溶解液樣品進行評價，在各混合物中加入含有10μLCi32P-ATP溶液的磷酸化緩沖液(200μM ATP,4.5mM MgCl；5mMKH2PO4；5mM K2HPO4；)使反應開始。得到的混合物在30℃孵化30分鐘。然后將混合物離心分離出固相，棄去上清液。每管中的固體相用700μL冷的PBS洗滌。在固相中加入Lammli樣品緩沖液(Bio-Rad)(30μL)。使混合物沸騰5分鐘，并負載于7.5％SDS-PAGE。該凝膠在150V運行1小時。得到的數條帶用commassie藍染色，如果存在85 Kd GST-PDE5融合蛋白帶，染色后可看到85 Kd GST-PDE5融合蛋白帶。干燥凝膠，將凝膠放置于X-射線膜上，如果PDF5被磷酸化，則膜會顯示出相對發(fā)暗的帶狀。各個帶的暗度和磷酸化的程度有關。
如圖8A和8B所示，SAAND exisulind引起PKG活性提高以劑量-依賴關系的方式表示，結果是將加或者不加cGMP的兩種樣品與加或者不加cGMP的對照樣品進行比較而完成的。結果由各個藥物處理樣品中85 Kd的帶更暗來證明。此外，試驗中，用exisulind處理的，加了cGMP的SW480細胞樣品比只用exisulind處理的(即不加cGMP)顯示出更高的PKG磷酸化活性。因此，藥物處理樣品中PKG活性的提高不僅僅是由于PKG被細胞cGMP提高(當SAAND抑制cGMP特異性PDE時)而活化的，在腫瘤中隱藏的APC突變體之中，PKG活性的增加也是由于PKG表達是增加。
相對于對照樣品而言，E4021處理的SW480樣品沒有顯示出PKG活性(見圖8A和8B)，上述事實說明在含有APC突變體的腫瘤中由SAANDs引起的PKG活性的提高不僅僅是因為典型的PDE5抑制作用。
作為評價PKG活性的分析技術，除了如上所述的X-射線膜暴露方法外，通過由凝膠上把帶切割下來，也可以用SDS頁的85 Kd帶來評價磷酸化的程度，任何結合于移出的帶上的32P都可以閃爍(beta)計數器在32P窗口計數。
為了對含有β-鏈蛋白突變體的腫瘤進行的cGMP-特異性PDE抑制作用進行試驗，使用HCT 116結腸癌細胞。已知HCT 116含有β-鏈蛋白突變體，但不含有APC突變體。
使HCT 116細胞生長時采用與上述SW480相同的方法。在此試驗中，只用exisulind和對照。Exisulind處理的細胞產生PKG，它比相應的對照組磷酸化的程度更高，這些說明在藥物處理組中出現的PKG活性依賴于APC突變。
因此，為了達到本發(fā)明的目的，在權利要求書中我們所用的“減少β-鏈蛋白”是指野生型蛋白質和/或蛋白質的突變形式。E．用蛋白質印跡法確認SW480細胞中PKG表達的增加和β-鏈蛋白的減少如上所述，SAANDs引起PKG表達的增加和cGMP水平的提高，兩者都回造成SAANDs處理的腫瘤細胞中的PKG活性的提高。PKG蛋白表達的此種提高可由如上所述的蛋白質印跡法定量鑒定。
通過用PBS洗出由微型取出管中收獲如上所述用exisulind處理的SW480細胞。該細胞在振動下用改性的RIPA緩沖液溶解15分鐘。將細胞溶解物在冷的室內旋轉。在旋轉后立即把上清液轉移至新的微型取出管中。進行BioRad DC蛋白試驗(Temecula,CA)，以測定樣品中的蛋白質濃度。如上所述對蛋白質濃度進行標準化。
將50μL的各種樣品負載于10％SDS凝膠，進行SDS-PAGE。然后將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上，有印跡的硝酸纖維素膜用新制備的，含有5％脫脂干牛奶的TBST阻斷，在常規(guī)的振動下于室溫進行1小時。
將羊的抗-初級抗體以含有5％脫脂干牛奶的TBST稀釋至推薦的濃度。把硝酸纖維素膜放在初級抗體溶液中，并在振動下于室溫孵化1小時。硝酸纖維素膜各自用TBST洗滌3次。硝酸纖維素膜在含有二級POD結合的兔抗-羊抗體于室溫孵化1小時。硝酸纖維素膜各自用TBST洗滌3次，每次10分鐘。用Boehringer Maunheim EM藍POD基質測定。
如圖9以圖示說明，exisulind引起β-鏈蛋白滴和貧苦感到提高，這些數據由蛋白印跡法獲得。將SW480細胞用exisulind或載體(0.1％DMSO)處理48小時。將50μL每種細胞溶解物負載于10％SDS凝膠，使硝酸纖維素膜產生印跡，將膜用兔子的β-鏈蛋白和兔子的抗PKG抗體探測。F．在腫瘤細胞中SAANDs減少β-鏈蛋白水平此觀察按照下述方法進行用200,400或600μM exisulind或載體(0.1％DMSO)培養(yǎng)SW480細胞。在處理后48小時收獲細胞，并進行免疫印跡法測定。用免疫印跡法測定免疫活性蛋白。免疫印跡法分析說明與對照組相比，用exisutind處理的細胞其β-鏈蛋白表達減少了50％。這些結果指出β-鏈蛋白的減少是由于SAANDs處理引起的。將上述結果歸納起來說明這種處理使PKG活性提高，然后造成β-鏈蛋白被PKG磷酸化，這些結果表明腫瘤細胞中β-鏈蛋白的減少是由于PKG的活化引起的。因此，用腫瘤細胞中PKG的活性作為抗腫瘤劑化合物的篩選方法是很有用的。G．β-鏈蛋白被PKG磷酸化在體外PKG可使β-鏈蛋白磷酸化。按照下文所述“β-鏈蛋白免疫沉淀法”的方法，試驗涉及SW480細胞(不用任何藥物處理)中含有復合物的β-鏈蛋白的免疫沉淀。使復合物免疫沉淀，收集固體相(即珠串)，與32P-γ-ATP和純的PKG(100單位)混合。相應的對照組不加PKG。
通過SDS緩沖液使蛋白質由固體相釋放出來，含有蛋白質的混合物在7.5％SDS-page凝膠中反應，混合物在凝膠上的反應由混合物中移出了過量的32P-γ-ATP。因此，在93Kd β-鏈蛋白帶上測得的32P-γ-ATP都是由于β-鏈蛋白磷酸化得到的。相對于沒有加入過量PKG的對照組，用過量PKG處理的93Kd β-鏈蛋白帶上測得的32P-γ-ATP的任何增加都是由于過量PKG處理使β-鏈蛋白磷酸化而得到的。
應該注意到，所得到的結果是用PKG處理的帶上比對照組磷酸化增加，事實上對照組的磷酸化最小，基本上測不出來。此結果說明β-鏈蛋白可以被PKG磷酸化。H．β-鏈蛋白突變體被PKG磷酸化用與上一部分所述相同的方法，用HCT116細胞進行試驗，其中不含有APC突變體，但是含有β-鏈蛋白突變體。試驗結果也說明突變的β-鏈蛋白可被PKG磷酸化。
因此，為了實現本發(fā)明的目的，在權利要求書所提到的β-鏈蛋白磷酸化是指野生型蛋白質和/或蛋白質的突變形式。Ⅰ．用PKG沉淀β-鏈蛋白按與免疫印跡法相同的方法，制備SW480和HCT116細胞溶解物的上清液。每500μg細胞溶解物中加入150μL蛋白質A瓊脂糖珠漿液(50％)以使細胞溶解物預澄清，在管子的震蕩器上于4℃孵化10分鐘。通過在14,000xg，于4℃離心10分鐘除去蛋白質A珠。把上清液轉移至新的離心管中，在500μg細胞溶解物中加入10μg兔子的多克隆抗β-鏈蛋白抗體(Upstate Biotechnology,Lake Placid,NewYork)。細胞溶解物/抗體混合物于4℃在震蕩器上緩慢混合2小時。加入150μL蛋白質A瓊脂糖珠漿液(75μl填充的珠)，以及管在震蕩器上緩慢搖動，并于4℃過夜。通過離心收集瓊脂糖珠(在微型離心器中以14,000rpm離心5秒)。放棄上清液，珠子用800μl冰冷卻的PBS緩沖液洗滌3次。將瓊脂糖珠懸浮于150μL2倍樣品緩沖液，緩慢混合。使瓊脂糖珠沸騰5分鐘，以便由瓊脂糖珠中分離出免疫復合物。離心收集瓊脂糖珠，用上清液進行SDS-PAGE。
用上清液進行蛋白質印跡測定，以兔子的抗蛋白質印跡作為探針對膜進行探測。然后將膜用TBST洗滌3次，每次10分鐘，以除去過量的抗β-鏈蛋白抗體。加入與辣根過氧化物酶結合的羊，抗兔抗體，接著于室溫孵化1小時。之后，可以看見帶有HRPO基質的β-鏈蛋白的存在。在此試驗中，可以清楚地看到β-鏈蛋白的存在。
在同一膜上測定PKG,用含有2％SDS和100mM 2β-巰基乙醇62mM tris-HCl緩沖液(pH7.6)，于55□C，在水浴中進行0.5小時，使β-鏈蛋白抗體的結合體首先在膜上形成條紋。條紋狀的膜在TBST中用5％脫脂干牛奶阻斷，反應于室溫進行1小時，同時將膜振動。然后，用兔的多克隆抗PKG抗體(Calbiochem,LaJolla,CA)，對阻斷的、條紋狀的膜進行探測，該體由和URPO結合的羊的抗兔二級抗體檢測。有印跡的膜上存在的PKG在HRPO基質中是可見的。在此試驗中，事實上PKG是可見的。在膜上僅有的蛋白質是與細胞上清液中的β-鏈蛋白一起免疫沉淀的，結果清楚地表明PKG與含有細胞上清液中的β-鏈蛋白的蛋白質復合物以物理形式相連接上是類似的。
在用抗GSK3-β-抗體形成條紋之后，對同一免疫印跡膜進行探測，以確定其是否與β-鏈蛋白共沉淀。在該試驗中，還檢測了膜上的GSK3-β-抗體，指出了用GSK3-β和PKG沉淀的GSK3-β，說明三種蛋白質可能都是同一復合物的一部分。因為APC復合物的GSK3-β和β-鏈蛋白形式部分是正常細胞，因此PKG可能是同一復合物的一部分，并且可能與作為復合物一部分的β-鏈蛋白的磷酸化有關。Ⅱ．利用本發(fā)明篩選藥用組合物A．概述JNK與PGK結合或PDE2s與或不與PDE5結合用來鑒定可用于治療或預防腫瘤而又沒有各種副作用的化合物。
癌或前期癌被認為是涉及不正常細胞生長的疾病。細胞生長涉及各種不同的因素。一個因素是細胞是怎樣快速增殖的，另一個因素則涉及細胞是怎樣快速死亡的。依環(huán)境刺激類型的不同，細胞的死亡可以是通過壞死，也可以是通過編程性細胞死亡。細胞分化也是影響腫瘤增長動力學的另一個因素。弄清由一個化合物所影響的細胞增長的各個方面，對于發(fā)現藥物治療的有關目標是重要的?；谶@種方法學的篩選試驗可與其他試驗結合，以便選擇具有增長抑制作用或前編程性細胞活性的化合物。
本發(fā)明基于以下這樣的發(fā)現，即對腫瘤細胞增長所希望的抑制劑，通過編程性細胞死亡誘導癌細胞的提前死亡(參閱Piazza,G.A.,eta1.,CancerResearch.55(14),3110-16,1995)。此外，我們還意外地發(fā)現，某些化合物選擇性地誘導編程性細胞死亡而無持續(xù)的COX抑制作用，它們也抑制PDE5/2。特別是，與引導科學研究相反，治療腫瘤疾病所希望的化合物抑制PDE5(EC3.1.4.17)。PDE5至少是10個磷酸二酯酶基因譜系中的一個。PDE5和本發(fā)明新的PDE在以下方面是獨特的，即它們選擇性地降解環(huán)GMP，而不選擇性地降解環(huán)cAMP，而PDE的其他譜系選擇性地降解或水解環(huán)cAMP，而不選擇性地降解環(huán)cGMP，或不選擇性地降解環(huán)cGMP和cAMP。B．JNK篩選如上說明，利用上面描述的方法能夠對化合物活化在腫瘤細胞中JNK的能力進行評價。C．PKG篩選有一種新的試驗用來評價PGK的活性，它也用于本發(fā)明的篩選方法中。為說明其見，在說明PGK活性如何能用于藥物評價以確定某化合物是否可潛在地用于腫瘤治療以前，首先描述PGK試驗是有益的。
新的PGK試驗涉及結合到固相復合氨基酸序列，每一個這樣的序列至今包含有cGMP結合的結構域和磷酸二酯酶型5(PDE5)的磷酸化位點。這個序列是已知的，并在下面的文獻中作了描述。如下述，結合的PDE5序列并不包括PDE5的催化結構域。PDE5序列結合到固相的一種方法，是把這些序列表達為PDE5序列的融合蛋白和氨基酸結合對的一肢，氨基酸結合對的另一肢化學鍵合到固相上(如球)?？梢允褂玫囊粋€結合對是谷胱甘肽S-轉移酶(GST)和谷胱甘肽(GSH)，如上所述，GST與PDE5序列一起被表達融合蛋白，而GST以共價鍵的形式結合到固相上。如下所述，在這個方法中，PDE5序列/GST融合蛋白可由包含該融合蛋白的溶液在固相上通過的方法結合到固相上。
用RT-PCR方法來獲得由牛的PDE5A cDNA序列(McAllister-Lucas L.M.et al,J,Bio1.Chem.268,22863-22873,1993)設計的具有正向引物和逆向引物的PDE5的cGB結構域，并在PDE1-10系譜中選擇。5’-3’公司的總RNA試劑盒，通過mRNA的微動(dT)柱純化后同HTt-29細胞一起使用。正向引物(GAA-TTC-TGT-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G,203-227)和逆向引物(CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG,1664-1686)被用來合成磷酸化位點的以及人的PDE5A(203-1686bp,cGB-PDE5)低和高親合力cGMP結合位點的1484bp片斷編碼。合成的cGB-PDE5核苷肽片斷編碼成同牛的PDE5A有97％相似性的494氨基酸。而后將其克隆到具有tac啟動子的pGEX-5X-3谷胱甘肽S-轉移酶(GST)融合載體(Pharmacia Biotech)上以及EcoRⅠ和XhoⅠ半裂位點上。將這種融合載體轉移到E.Coli BL21(DE3)菌(Invitrogen)上。轉移的BL21菌生長到對數期，而后將IPDG作為誘導劑加入。使誘導作用在20℃進行24小時。收集該菌并溶解?？扇苄缘募毎馨a物用GSH接合的瓊脂糖4B(GSH-瓊脂糖4B)孵化。GST-cGB-PDE5融合蛋白可結合到GSH-瓊脂糖球上，其他的蛋白用過量的冷PBS從瓊脂糖球上洗掉。
表達的GST-cGB-PDE5融合蛋白作為85Kd蛋白顯示在7.5％SDS-PAGE凝膠上。它以cGMP結合和由蛋白激酶G和A磷酸化為特征。它有兩個cGMP結合點，Kd是1.6±0.2μM，這接近于土著牛PDE5的Kd=1.3μM。GSH接合的瓊脂糖球上的GST-cGB-PDE5可由cGMP依賴蛋白激酶和cAPM依賴蛋白激酶A在體外磷酸化。由PKG對GST-cGB-PDE5磷酸化的Km是2.7μM,Vmax是2.8μM，而BPDE肽磷酸化的Km是68μM。由PKG的磷酸化顯示有按1∶1的比率并合到GST-cGB-PDE5蛋白上的分子磷酸鹽。
液體樣品用上述PDE5結合的固相，確定其含有PKG，為了對此液體樣品進行檢測，使同一樣品和固相與含有32P-γ-ATP的磷酸緩沖液混合。該溶液于30℃孵化30分鐘，如果存在PKG，可通過PKG使PDE5序列磷酸化。然后由溶液中分離固相(例如通過離心或過濾)，并用磷酸鹽緩沖液鹽水(“PBS”)洗滌。以除去任何殘留的溶液，以及除去沒有反應的32P-γ-ATP。
將固相直接進行試驗(例如通過液體閃爍計數器)，以確定32P是否已經結合。如果已經結合，這說明含有PKG的樣品中的PKG使PDE5磷酸化。如果如上所述，PDE5通過融合蛋白質結合，含有融合蛋白質的PDE5可由固相中用SDS緩沖液洗出來，然后用洗出液進行32P結合試驗。此方法特別的優(yōu)點是，在可能存在其它蛋白質的情況下，因為可以將洗出液加工(例如凝膠分離)，以便將各種蛋白質相互分離，這樣就可以對融合蛋白質部分進行32P結合試驗。磷酸化的融合蛋白質可由固相中用SDS緩沖液洗出，并可進一步地用電泳分離。如果進行凝膠分離，可以進行蛋白質的染色以便看到蛋白質的位置，以及融合蛋白的PDE5蛋白被PKG進行的32P磷酸化可以通過X-射線膜與凝膠的結腸檢測。如果32P在X-射線膜上是可見的，這說明在含有PKG的原始樣品中存在著PKG，它使由固相洗出的融合蛋白中的PDE5部分磷酸化。
在試驗中，優(yōu)選在緩沖液中加入過量(例如100倍)的蛋白酶抑制劑(“RKT”)，它可以特異性的，有效的抑制蛋白激酶A(“PKA”)，而不會抑制PKG。抑制PKA的需要的，因為它可能造成PKG基質(例如PDE5)的磷酸化。通過加入PKI，可以消除PKA的磷酸化，任何可檢出的磷酸化與單獨存在PKG的情況高度相似。
可以制備成PKG試驗用的藥盒，該藥盒包括預裝在各自分開的容器中的下述藥劑1、細胞溶解緩沖液50mM Tris-HCl,1％NP-40,150mM NaCl,lmM EDTA,lmM Na3VO4,1mM NaF,500μM IBMX，蛋白酶抑制劑。
2、蛋白激酶C固相基質重組體GST-cGB-PDE5結合的瓊脂糖凝膠4B(50％漿液)。
3、2X磷酸緩沖液32P-γ-ATP(3000 mCi/mmol,5～10μCi/試驗)，10mM KH2PO4,10mM K2HPO4,200μM ATP,5mM MgCl2。
4、PKA蛋白激酶抑制劑。
進行上述反應所需要的一次性使用的容器也可以裝在藥盒中。
分析領域技術人員由上述內容可以很容易地想象出適合于上述試驗的各種變化形式。簡言之，用標記的磷酸化試劑，至少使用一部分PDE5(或任何其它可被PKG選擇地磷酸化的蛋白質)，通過評價可磷酸化的蛋白質的磷酸化可以確定，存在PKG和有相對量(與對照組比較)的PKG。D．COX篩選本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式涉及測定給定化合物對環(huán)氧化酶的抑制活性，涉及測定化合物對cGMP PDE的抑制活性。通過把這些化合物與已知的可用于治療腫瘤組織的化合物比較而評估它們直接或間接地治療腫瘤組織的能力。已知一種能有效地治療腫瘤組織而引起胃過敏的標準化合物是5-氟-2-甲基-1-(對甲基磺?；絹喖谆?-3-茚基乙酸(“exisulind”)。其它可用于比較目的的化合物包括已知的能抑制COX的化合物，例如吲哚美辛和蘇林大的硫化物代謝物5-氟-2-甲基-1-(對甲基亞磺?；絹喖谆?-3-茚基乙酸(“硫化sulindac”)。其它可用于比較目的的化合物包括已知的能抑制cGMP-特異性PDEs的化合物，例如1-(3-氯苯胺基)-4-苯基-2,3-二氮雜萘(“MY5445”)。
這里所用的術語“能發(fā)展成腫瘤的組織”包括非正常腫瘤所代表的綜合癥包括發(fā)育不良、組織的變化。例如結腸、乳腺、前列腺或肺組織的惡性生長或者病變例如惡性神經綜合癥、皮膚惡性黑素瘤前體，除惡性神經綜合癥之外，這樣的例子還包括多孔性綜合癥、結腸polyps、頸部癌前組織(即頸部惡性腫瘤)、食道癌前組織、肺部癌前組織、前列腺惡性腫瘤、前列腺內新生腫瘤、乳腺和/或皮膚及相關組織病變(例如光化角化病)，不論腫瘤能否在臨床上分辨出來。
這里所用的術語“腫瘤”或“癌癥”是指腫瘤組織。例子包括惡性黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌和結腸癌。這里所用的術語“新生腫瘤”和“新瘤”都是指癌組織和癌前組織。
這里所用的縮寫PG代表前列腺素；PS代表前列腺素合成酶；PGE2代表前列腺素E2；PDE代表磷酸二酯酶；COX代表環(huán)氧化酶；環(huán)狀核苷酸，RIA代表放射免疫試驗。
由化合物引起的COX抑制可以通過兩種方法測定。一種方法涉及暴露于被篩選化合物后測定完整的HL-60細胞的PGE2分泌。另一種方法涉及在化合物存在下測定純化的環(huán)氧化酶(COXs)的活性。兩種方法都涉及文獻中以前描述的程序，但是下面提出優(yōu)選的程序。
通過測定PGE2可以評價化合物能否抑制前列腺素E2(“PGE2”)。使用PGE2酶免疫試驗(EIA)試劑盒例如從Amersham,ArlingtonHeights,IL USA購買。合適的細胞包括能制造大量PG的細胞，例如HL-60細胞。HL-60細胞是人類前髓細胞，用DMSO可把它分化成成熟的粒細胞(參見Collins,S.J.,Ruscetti,F.W.,Gallagher,R.E.andGallo,R.C.,“Normal Functional Characteristics of Cultured HumanPromyelocytic Leukemia Cells(HL-60)After Induction of differentiationBy Dimethylsulfoxide”,J.Exp.Med.,149:969-974,1979)。在用鈣離子團A23187激發(fā)后，這些分化的細胞能生產PGE2(參見Kargman,S.,Prasit,P.and Evans,J.F.,“Translocation of HL-60 Cell 5-Lipoxygenase”,J.Bio1.Chem.,266:23745-23752,1991)。HL-60可從ATCC(ATCC:CCL240得到)。它們可以在添加有20％熱去活的小牛血清、50U/mL的青霉素和50μg/ml的鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中在含5％CO2的大氣中在37℃生長。為了誘導骨髓細胞分化，讓細胞接觸DMSO9天，然后洗滌，懸浮于濃度為3×106細胞/ml的Dulbecco磷酸緩沖的鹽水中。
在37℃下在所要濃度的試驗化合物存在下，培養(yǎng)分化的HL-60細胞(3×106)15分鐘。然后用A23187(5×10-6M)激發(fā)細胞15分鐘。按照下述方法測定分泌到外部培養(yǎng)基中的PGE2。
如上所述，評估化合物抑制COX的第二種方法就是要在試驗化合物的存在下測定COX的活性。文獻中已經報道了用于調節(jié)前列腺素合成的兩種不同形式的環(huán)氧化酶(COX-1和COX-2)。COX-2代表COX的可誘導形式而COX-1代表COX的結構形式。使用從Boopathy&Balasubramanian在“Purification And Characterization Of SheepPlatelet Cyclooxygenase”(Biochem.J.,239:371-377,1988，在此通過參考文獻引入)中描述的隨機半載體純化得到的COX-1，按照Mitchell等人描述的方法可以測定COX-1的活性(“Selectivity of NonsteroidalAntiinflammatory Drugs as Inhibitors of Constitutive and InducibleCyclooxygenase.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,90:11693-11697,1993，在此通過參考文獻引入)。COX-2的活性可以使用從綿羊胎盤純化得到的COX-2按照Mitchell等人于1993在上述期刊中描述的方法測定。
藥物對環(huán)氧化酶的抑制活性可以按照本領域已知的方法測定，例如Boopathy&Balasubramanian于1988在上述期刊中描述了已知方法，其中在37℃把前列腺素H合成酶1(Cayman Chemical,Ann Arbor,Michigan)與100μM花生四烯酸(Sigma Chemical Co.)、輔因子(例如1.0mM谷胱甘肽、1.0mM氫醌、0.625μM血紅蛋白和1.25mM CaCl2的100mM Tris-HCl,pH7.4溶液)和試驗藥物一起培養(yǎng)20分鐘。培養(yǎng)后，用三氯乙酸終止反應。在通過加入硫代巴比妥酸和丙二醛停止反應后，在530nm處通過測定光度來測定酶活性。
顯然，相對于那些具有更大的綜合PDE5/新的PDE/PDE2抑制活性的化合物，具有更低COX-1或COX-2抑制活性得到化合物或許是所要的化合物。
通過比較在有或沒有試驗化合物存在下環(huán)氧化酶的活性，可以確定COX的抑制量。在大約100μM濃度下殘留的活性(即少于大約25％)或沒有COX抑制活性表明，應當進一步評價化合物治療腫瘤的用途。E．確定磷酸二酯酶的抑制活性使用按照上述方法分離的重組酶或者使用新的PDE和/或PDE2和PDE5，可以篩選化合物對本發(fā)明的新的磷酸二酯酶活性的抑制作用。另外，通過RIA并且與未經處理的和用zaprinast處理的細胞比較，測定了完整細胞中環(huán)狀核苷酸的水平。
可以使用本領域已知的方法測定磷酸二酯酶的活性，例如使用放射活性的3H環(huán)狀GMP(cGMP)(環(huán)3’,5’-鳥苷單磷酸酯)作為PDE酶的底物的一種方法(Thompson,W.J.,Teraski,W.L.,Epstein,P.M.,Strada,S.J.,Advances in Cyclic Nucleotide Research,10:69-92,1979，在此通過參考文獻引入)。簡單地說，把具有確定的底物3H-cGMP特異性活性的溶液(0.2μM,100,000cpm,含有40mM Tris-HCl(pH8.0),5mMMgCl2和1mg/mL BSA)與試驗藥物按照400μl的總體積混合。在30℃把混合物與本發(fā)明分離出的PDE一起溫育10分鐘。終止反應，例如通過煮沸反應混合物75秒來終止反應。在冰上冷卻后，加入100μl0.5mg/ml蛇毒(O.Hannah蛇毒從Sigma得到)，在30℃溫育10分鐘。然后通過加入醇例如1ml 100％的甲醇來終止該反應。把試驗樣品放在1mL的Dowex 1-X8柱上純化，用1mL 100％甲醇洗滌。合并柱子餾出液和洗滌液，用閃爍計數器測定放射活性的數量。通過計算經過藥物處理的反應液中放射活性的數量并且與對照樣品(不含有試驗化合物但含有藥物溶劑的反應混合物)比較，確定磷酸二酯酶的抑制度。
另外，所要化合物抑制本發(fā)明磷酸二酯酶的能力反映在暴露于所篩選化合物的腫瘤細胞中cGMP的增加上。PDE的活化度可以通過測定用放射免疫試驗(RIA)處理的細胞萃取液中環(huán)GMP的數量而確定。在該方法中，把HT-29或SW-480細胞置于培養(yǎng)板中并生長到融合。如上所述，SW-480同時含有PDE5和PDE2s，因此，當以這種方式評價PDE活性時，也就同時分析了總的cGMP的水解活性。然后把試驗化合物與細胞培養(yǎng)基一起在大約200μM-200pM的化合物濃度下培養(yǎng)。大約24-48小時以后，從細胞中除去培養(yǎng)基，并且把細胞溶解。用0.2N HCl/50％MeOH停止反應。取出樣品進行蛋白質分析。使用陰離子交換色譜例如Dowex柱從細胞的酸/醇萃取液中純化環(huán)GMP。干燥環(huán)cGMP，按照公開的方法，例如使用乙酸酐的三乙胺溶液進行乙酰化(Steiner,A.L.,Parker,C.W.,kipnis,D.M.,J.Biol.Chem.,247(4):1106-13,1971，在此通過參考文獻引入)。使用放射免疫分析方法(Harper,J.,Brooker,G.,Advances in Nucleotide Research,10:1-33,1979，在此通過參考文獻引入)定量測定乙酰化的cGMP。把從環(huán)GMP衍生得到的碘代配體(酪氨酸甲基酯)與標準或未知化合物在抗血清和適當的緩沖液存在下一起培養(yǎng)?？寡蹇梢允褂铆h(huán)狀核苷酸-半抗原定向技術來生產?？寡鍙淖⑸淞硕《；?cGMP-白蛋白結合物的綿羊得到，并且稀釋到1/20,000。按照前人描述的方法(Seibert,A.F.,Thompson,W.J.,Taylor,A.,Wilbourn,W.H.,Barnard,J.and Haynes,J.,J.Applied Physiol.,72:389-395,1992，在此通過參考文獻引入)，從標準曲線進行劑量內推和誤差分析。
另外，可以把培養(yǎng)基酸化、冷凍(-70℃)，也可以進行cGMP和cAMP分析。
除了觀察由所要化合物引起的腫瘤細胞中cGMP含量的增加外，還觀察了cAMP含量的減少。發(fā)現，具體的所要化合物(即能選擇性地引起腫瘤細胞編程性細胞死亡但是基本上不會引起正常細胞編程性細胞死亡)遵守與cGMP-特異性PDE抑制一致的時間進度，如同在幾分鐘內引起cGMP含量增加的初始作用一樣。其次，用所要的抗腫瘤化合物治療腫瘤細胞導致24小時內cAMP含量的減少。進一步研究了藥物作用的胞內目標，但是現有的數據支持這樣的概念cGMP含量的初始增加和后來cAMP含量的降低導致了暴露于所要化合物的腫瘤細胞的編程性細胞死亡。
與僅僅測定cGMP的絕對值、僅僅測定cGMP-特異性磷酸二酯酶的抑制活性或者僅僅測定cGMP的水解的水平相比，測定兩種環(huán)核昔酸比例的變化或許是一個評價所要的試驗化合物對cGMP-特異性磷酸二酯酶的抑制活性的一個更為準確的工具。在沒有用抗腫瘤化合物處理的腫瘤細胞中，cGMP含量/cAMP含量的比率在0.03-0.05的范圍內(即300-500fmol/mg蛋白質的cGMP含量對6000-8000fmol/mg蛋白質的cAMP含量)。暴露于所要的抗腫瘤化合物后，由于cGMP含量的初始增加和后來cAMP含量的降低，該比率增大了好幾倍(優(yōu)選至少增大3倍)。
特別地，已經觀察到具體的所要化合物引起了接受處理的腫瘤細胞中cGMP含量的初始增加，使得cGMP的水平高于大約500fmol/mg蛋白質。另外，具體的所要化合物引起了接受處理的腫瘤細胞中cAMP含量的降低到低于大約4000fmol/mg蛋白質。
為了測定環(huán)AMP的含量，使用了與上述測定cGMP水平相似的放射免疫技術。基本上按照文獻方法，使用陰離子交換色譜從細胞的酸/醇萃取液把環(huán)核苷酸純化，干燥，乙酰化，并且使用放射免疫分析方法定量測定。把從環(huán)AMP和環(huán)GMP衍生得到的碘代配體與標準或未知化合物一起在特異性抗血清和適當的緩沖液存在下培養(yǎng)。
通過測定完整的細胞中環(huán)核苷酸的轉變或積累，可以核實環(huán)核苷酸的含量。為了測定完整細胞的cAMP，按照文獻的方法(Whalin,M.E.,Garrett Jr.,R.L.,Thompson,W.J.,and Strada,S.J.“Correlationof cell-free brain cyclic nucleotide phosphodiesterase activities to cyclicAMP decay in intact brain slices”,Sec.Mess.and Phos.ProteinResearch,12:311-325,1989，在此通過參考文獻引入)預先進行3H-腺嘌呤標記。該方法測定標記的ATP轉變?yōu)榄h(huán)AMP，根據特定的程序，可用于估測完整細胞的腺苷酸環(huán)化酶或環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的活性。環(huán)GMP積累太低，不能按照文獻方法通過對完整細胞進行預先標記來進行研究(Reynolds,P.E.,S.J.Strada and W.J.Thompson,“CyclicGMP Accumulation In Pulmonary Microvascular Endothelial CellsMeasured By Intact Cell Prelabeling,”Life Sci.,60:909-918,1997，在此通過參考文獻引入)。
也可以從組織樣品測定化合物對PDE活性的抑制作用。從暴露于試驗化合物的主體采集人的組織活切片或者麻醉動物的組織。簡要地說，在500μl 6％的TCA中均化組織樣品。取出已知量的勻漿進行蛋白質分析。把剩余的勻漿坐在冰上20分鐘，使蛋白質沉淀。其次，在15,000g和4℃下離心勻漿30分鐘?；厥丈锨逡海厥招⊥?。用5倍體積的飽含水的乙醚洗滌上面的乙醚層4次。在每次洗滌中，扔棄上面的乙醚層?？焖僬婵崭稍锖囊颐演腿∫?，干燥后，可以把樣品冷凍以備將來使用或立刻使用。把干燥的萃取液溶于500μl分析緩沖液中。通過使用上述的RIA方法分析環(huán)核苷酸的數量來測定cGMP-特異性抑制的數量。
通過比較在有或沒有化合物存在的情況下PDE的活性來確定抑制的數量。對上述cGMP PDEs的抑制表明，本發(fā)明的化合物可用于治療腫瘤。與benchmark、exisulid相比，本發(fā)明的化合物具有顯著的更大的抑制活性，尤其是在10μM或更低的濃度下，具有大于50％的抑制活性，這表明，應當進一步評價化合物的抗腫瘤性能。優(yōu)選地，對于進一步考慮可能使用的化合物來說，針對新的PDE抑制的IC50值應當低于50μM。F.測定化合物是否減少了腫瘤細胞的生長在另一種實施方式，本發(fā)明的方法還涉及測定化合物是否減少了腫瘤細胞的生長。根據試驗組織的不同，可以在樣品中使用各種細胞系。例如，這些細胞系包括SW-480-結腸腺癌、HT-29-結腸腺癌、A-27-肺腺癌、MCF-27乳腺癌、UACC-375黑素瘤和DUl45-前列腺癌。使用這些細胞系得到的細胞毒性數據表明，對腫瘤組織具有抑制作用。這些細胞系已經被很好地表征，并且被美國國家癌癥研究所在他們的篩選項目中用作新的抗癌藥物。
化合物抑制腫瘤細胞生長的能力可以用從ATCC得到的HT-29人結腸癌細胞系測定。前人已經把HT-29細胞表征為相關的結腸腫瘤細胞培養(yǎng)基模型(Fogh,J.,and Trempe,G.,Human Tumor Cells inVitro,J.Fogh(eds.),Plenum Press,New York,PP.115-159,1975)。把HT-29細胞放在添加有5％小牛血清(Gemini Bioproducts,Inc.,Carlsbad,CA)和2mm谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌素的培養(yǎng)基中，在37℃下在含有95％空氣和5％CO2的潮濕的大氣中培養(yǎng)。簡單地說，以500個細胞/孔的密度把HT-29細胞放在96孔微量滴定板中，并且在37℃培養(yǎng)24小時，然后加入化合物。每次測定細胞數目都重復6次。細胞在培養(yǎng)基中放置6天后，通過加入冷的三氯乙酸到最終濃度為10％而固定細胞，按照前人Skehan,P.,Storeng,R.,Scudiero,D.,Monks,A.,McMahon,J.,Vistica,D.,Warren,J.T.,Bokesch,H.Kenney,S.，和Boyd,M.R.，在“New Colorimetric Assay For Anticancer-DrugScreening,”J.Natl.CancerInst.82:1107-1112,1990中描述的方法(在此通過參考文獻引入)，使用磺基羅丹明B(SRB)進行蛋白質種比色分析。
除了SRB分析法之外，可以使用許多其它方法來測定生長抑制，并且可以替代SRB分析法。這些方法包括在用錐蟲蘭染色后計數活的細胞，用BrdU或放射性標記的胸苷標記能進行DNA合成的細胞，用中性紅給活細胞染色，或者用MTT給活細胞染色。
100μM或以下劑量的化合物能顯著地抑制大約50％以上的腫瘤細胞的生長，這進一步表明這些化合物可用于治療腫瘤。優(yōu)選地，確定IC50值，該值可用于比較。這個值是與對照相比，抑制50％的腫瘤細胞生長所需要的藥物濃度。優(yōu)選地，對于考慮進一步可能用于治療腫瘤的化合物，其IC50值應當小于100μM。G．確定化合物是否引起編程性細胞死亡在另外一種實施方式中，本發(fā)明的篩選方法還涉及確定化合物是否引起了培養(yǎng)基中腫瘤細胞的編程性細胞死亡。
可以用形態(tài)和生化標準來描述兩種不同形式的細胞死亡壞死和編程性細胞死亡。壞死伴隨著原生質膜滲透性的增大、細胞膨脹和原生質膜在幾分鐘之內破裂。編程性細胞死亡的特征在于膜起皰、細胞質濃縮和內源性核酸內切酶的活化。
自然編程性細胞死亡發(fā)生在正常組織更新和器官及肢體的胚胎發(fā)育期間。編程性細胞死亡還由對細胞有毒的T-淋巴細胞和天然的細胞殺手、電離輻射和某些化療藥物引起。對編程性細胞死亡的不當調控被認為在包括癌癥、艾滋病或早老性癡呆癥等在內的多種病理中起著重要作用。使用上述條件下培養(yǎng)腫瘤細胞的培養(yǎng)基可以篩選出用于誘導編程性細胞死亡的化合物。用試驗化合物處理細胞涉及融合前或融合后的培養(yǎng)以及在各種濃度下處理2-7天。在培養(yǎng)基的黏附的和“飄浮”的隔室中測定編程性細胞死亡的細胞。通過除去上清液、用胰蛋白酶作用于黏附的細胞，并且在離心洗滌步驟(10分鐘，2000rpm)之后合并兩種制備液。文獻中已經描述了用sulindac和相關化合物處理腫瘤細胞培養(yǎng)液的方法(參見Piazza,GA.，等人，Cancer Research,55:3110-16,1995，在此通過參考文獻引入)。新的特征包括收集飄浮的和黏附的細胞，鑒定出觀察編程性細胞死亡的最佳處理次數和劑量范圍，并且鑒定出最佳的細胞培養(yǎng)條件。
在用化合物處理之后，可以在用吖啶橙和溴錠標記后通過熒光顯微分析培養(yǎng)物的編程性細胞死亡。測定編程性細胞死亡的細胞數目的方法已經被前人Duke&Cohen在“Morphological And BiochemicalAssays Of Apoptosis,”Current Protocols In Immunology,Coligan eta1.,eds.,3.17.1-3.17.16,1992中描述過，在此通過參考文獻引入。
例如，漂浮和附著細胞可通過胰蛋白酶消化和在PBS中洗滌三次來收集。對細胞的等分試樣進行離心。而后將沉淀重新懸浮在介質中，包含有吖啶橙和溴化乙錠的染料混合物在PBS制備并慢慢混合。將該混合物放置在顯微鏡的載玻片上，考察編程性細胞死亡的形態(tài)特征。
編程性細胞死亡還可通過測定用實驗化合物已經處理過的細胞中DNA斷裂的增加來定量化。市場上用于定量的光度EIA，在體外測定胞質組蛋白聯結的DNA片斷(單和寡核粒)是可能的(CeU DeathDetection ELISAOKYS,Cat.No.1,774,425,Boehringer Mannheim)。Boehringer Mannheim試驗是基于多層酶的免疫測定原則，分別利用抗DNA和組蛋白的小鼠單克隆抗體。這就能具體測定細胞溶胞產物的胞質部分中的單和寡核粒。
按照賣主的指示，由下面的方法測定編程性細胞死亡。樣品(細胞的溶胞產物)被放置在鏈霉抗生物素涂抹的微量滴定板(MTP)上。接著加入抗組蛋白生物素和抗DNA過氧化酶偶聯物的混合物，并孵化兩小時。在孵化期間，抗組蛋白的抗體結合到該核粒的組蛋白組分上，同時通過生物素化，免疫復合物固定在鏈霉抗生物素涂抹的微量滴定板(MTP)上。另外，抗DNA過氧化酶抗體同核粒的DNA組分反應。通過洗滌除去未結合的抗體后，核粒的量由在免疫復合物中阻留的過氧化酶來定量化。過氧化酶用ABTS7(2,2’-疊氮基-[3-乙基苯基噻唑啉磺酸酯])作為培養(yǎng)基進行光度法測定。
例如，將SW-480結腸腺癌細胞，以每孔10,000細胞的密度放置在96孔MTP上。而后用試驗化合物處理這些細胞，并使其在37℃孵化48小時。在孵化后，離心MTP，排除上清液。將每個孔中的細胞沉淀轉移到溶胞緩沖液中30分鐘。離心溶胞產物，將上清液的等分試樣(胞質部分)轉移到鏈霉抗生物素涂抹的MTP。注意不要振動在MTP上溶解的沉淀(即包含高分子量的細胞核，未斷裂的DNA)。而后對樣品進行分析。
折疊刺激(FS=ODmax/ODveh)，一種編程性細胞響應的指標，在一定的濃度對每個試驗化合物都進行測定。EC50值也可通過評價一系列試驗化合物的濃度來測定。
編程性細胞死亡在統計上顯著增加(即在100μM濃度大于2折疊刺激)是該化合物可用來治療瘤形成病灶的進一步指示。編程性細胞活性的EC50值，對進一步考慮作為潛在用于治療瘤形成病灶的化合物，應低于100μM。EC50在這里被定義為相對于賦形劑處理引起50％編程性細胞死亡誘導的濃度。H．乳腺器官培養(yǎng)模型試驗由上面的方法鑒定的試驗化合物，可由它們抑制在乳腺器官培養(yǎng)系統中預腫瘤病灶發(fā)病率的能力用來試驗抗腫瘤活性。這種小鼠乳腺器官培養(yǎng)技術已由其他研究者，為研究已有抗癌劑，如某些NSAIDs、視黃酸、三苯氧胺、硒和某些天然產品的影響而成功使用，它可用來證實本發(fā)明所篩選的方法。
例如，雌性BALB/c小鼠可每天用雌二醇和孕酮結合處理，以便在體外使乳腺對激素產生響應。把這些動物殺死，無菌切開胸乳腺，在補充有胰島素、催乳激素、氫化可的松和醛甾酮的增長介質中孵化10天。將DMBA(7,12-二甲基苯并蒽)加入到介質中，以誘導癌前期病灶的形成。最后使增大的乳腺脫離催乳激素、氫化可的松和醛甾酮，導致乳腺的退化，但并無癌前期病灶。
將試驗化合物溶解在DMSO中，并在全程培養(yǎng)期加入到培養(yǎng)介質中。在培養(yǎng)期終了，將乳腺放在10％的富馬啉中，用明礬洋紅染色，放置在玻片上。形成乳腺病灶的發(fā)生率是具有乳腺病灶的腺體同無病灶腺體的比率。試驗化合物處理的腺體乳腺病灶的發(fā)生率與未處理的腺體病灶的發(fā)生率是可相比較的。
乳腺病灶所占據的區(qū)域范圍可通過把腺體象投影在指狀突墊上來定量化。由腺體覆蓋的區(qū)域被掃描在墊上，看作是區(qū)域的100％。由每個非退化的結構覆蓋的區(qū)域也描繪在指狀突墊上，由計算機進行定量分析。Ⅲ．包含cGMP PED抑制劑/JNK1活化劑化合物的抗腫瘤藥用組合物如上所述，exisulind是一種具有所希望的抗腫瘤性能的化合物。在人們認識到該化合物通過抑制cGMP特異性PED活性和活化腫瘤細胞中的JNKI而起作用的以前，就發(fā)現了它可用作抗腫瘤劑及其效能。
其中，本發(fā)明選用的方法在患者的人體腫瘤疾病的臨床試驗中，可用于選擇治療人體疾病的化合物的鑒定。可以理解的是，就exisulind可作為抗腫瘤劑(體外)而言，能夠滿足本發(fā)明選擇標準理想化合物的方法，所述化合物在兩種人體臨床試驗中是成功的，由此確定它也可以用來選擇能夠滿足本發(fā)明選擇標準的其他化合物。
如上文所指出的，一些腫瘤形成中存在APC突變。其中，通過在患者中進行的的人體腫瘤疾病的臨床試驗，可以在腫瘤中存在APC突變確定本發(fā)明的選用方法。
在有遺傳性腫瘤的患者中首次發(fā)現了腺瘤結腸息肉病APC[adenomatous polyposis coli(“APC”)]突變。APC疾病是以在十年里在結腸中出現成百至成千的息肉為特征，通常的治療方法是在20歲之前手術切除結腸。
第一種臨床試驗包括給患有APC疾病的患者施用exisulind。在此研究中每個患者(他/她)已經切除了結腸，只是保留了與直腸相鄰的一小部分結腸(與小腸連接的部分)，以維持直腸的功能。但是，這些患者通常回在保留的一小部分結腸中形成息肉，這些息肉需要定期切除(例如，通過electrocautery)。
在該試驗中，選擇exisulind進行預防試驗以評價藥物的抗腫瘤特性，評價是將藥物組和安慰劑組在十二個月內形成新的息肉的累計數目進行比較而進行的。合適的患者是每年形成9-44個息肉的患者。在可是試驗前，在6個月結束時和在12個月結束時，需要將患者進行完全清除(將所有的息肉除去)。該項研究征用了四分之三的患者。以APC患者在一年中形成的息肉的平均數為基礎，這些患者有每年產生9-44個息肉的病史，將exisulind用于臨床，在息肉形成速率減少方面其統計學意義顯然高于安慰劑組。以研究的前6個月產生的息肉的中值為基礎，用exisulind治療的患者所產生的息肉數目是安慰劑組的三分之一左右(其著值分別是9個息肉/年，和26個息肉/年，p=0.013)。以整個研究的12個月產生的息肉的中值為基礎，用exisulind治療的患者所產生的息肉數目是安慰劑組的一半左右(其著值分別是18個息肉/年，和38個息肉/年，p=0.020)。
對前列腺癌男性患者還進行了獨立的臨床試驗，其結果他們的前列腺被切除了。還對前列腺完全切除后可檢測的PSA(前列腺特有抗原)水平上升的患者進行了這種研究，表明前列腺癌復發(fā)了。
96位患者被登記進行前列腺癌評價雙盲、安慰劑對照、多中心試驗涉及把exisulind以500mg/天給予受藥患者。如下所述，試驗數據表明，exisulind處理組與安慰劑處理組之間的PSA水平在統計上有明顯的差異。exisulind處理組的PSA水平與安慰劑處理組的PSA水平相比明顯下降。雖然PSA水平上升本身并不是疾病狀態(tài)，但在醫(yī)學界被廣泛認為是這些病人的前列腺癌存在復發(fā)的替代性指標。
除了在總體上根據exisulind組和安慰劑組男性PSA水平的差異進行評價外，還進行了階段分析，包括亞組分析。將研究的患者依照其產生癌轉移的危險性分成高、中、低危險組。這種分類是利用Journalof American Medical Association(JAMA May 5,1999,pp.1591-97)中發(fā)表的方法進行的。為確定那些受試患者分在那個危險組，將病史提供給研究人員，而他并不知道哪些病人是用藥的，哪些病人是用安慰劑的；他按照上述可參考的公開的方法，將受試患者標記為適當的危險組。統計分析表明，在高和中危險組中，exisulind組和安慰劑組患者的平均PSA水平，在統計上有明顯的差異。
由前列腺研究的數據如下表1
在這些exisulind試驗和涉及該藥其它指標的某些另外的試驗中，通過監(jiān)測副作用(AEs)、臨床實驗室實驗(血漿學、血清化學、尿分析)、生命信號(血壓、脈率、呼吸率、體溫和體重)、體力考察和上內窺鏡對安全進行了評價。
到目前對超過400個患者用exisulind進行的臨床試驗中，已證明沒有明顯的安全問題。exisulind并不顯示任何血液性的體液不調、劑量限制性嘔吐或與常規(guī)化學治療相關的神經毒性或腎毒性。它也并不引起任何生命信號的臨床重要變化。事實上，在APC病人的息肉和正常結腸組織的成對活性組織檢查中，已經發(fā)現，exisulind增加息肉的編程性細胞死亡速率，而在正常結腸組織中并不增加，這說明對正常組織的影響小。
在最大允許劑量(MDT=600mg，亞整體結腸切除的病人400mg，具有完整結腸的病人；350mg，兒科病人)以上的劑量下，所發(fā)現的唯一的劑量限制副作用是治療初期看到的肝功(LFTs)上升。實驗時LFT升高迅速逆轉，劑量降下時也不再重復。其它副作用(如偶爾的腹痛)一般持續(xù)的時間很短，也相當溫和，因而沒有必要終止給藥或降低劑量。
簡言之，這些試驗表明，exisulind是一種對瘤形成臨床控制有效的、耐性好的慢性治療方法。這些結果說明，選擇特別抑制cGMP特異性PDE活性(以及滿足本發(fā)明的其它選擇標準)的另外化合物可產生體內治療的有效藥。在其作用機理被發(fā)現涉及cGMP抑制和知道它滿足本發(fā)明的選擇標準以前發(fā)明的第二個藥是化合物B。體外和體內的實驗已證明它可作為具有抗廣泛腫瘤形成活性的抗腫瘤劑。在對動物的研究中和對人的單一逐步上升的劑量研究中，它也是安全的。
作為本領域內的一位專業(yè)技術人員將從下面提供的數據認識到，化合物B可在大大高出常規(guī)化學治療中或抗腫瘤劑NSAIDs的允許(在許多情況下是有毒的)劑量安全地給予動物。例如，在大鼠的急性毒性研究中，化合物B的單一口服劑量(在0.5％的羧基甲基纖維素賦形劑中)可高達2000mg/kg，不會導致明顯的毒性信號。在4000mg/kg，體重略有下降。單一劑量1000mg/kg經腹膜內注射給藥，導致體重減輕，這一組的某些動物經尸體剖檢發(fā)現腸糸膜粘連。
對狗，化合物B以膠囊的形式給藥，劑量為1000mg/kg，對兩個雄性狗和兩個雌性狗的單一組沒有導致毒性信號。由于化合物B膠囊的性質，這個劑量對每個動物至少需13個膠囊，這是對動物不致于造成威脅的最大數，因而，這些狗被接著連續(xù)7次給藥，劑量為1000mg/kg/天。在這兩種劑量形式下沒有發(fā)現與藥物相關的任何明顯信號。
這樣，根據單一劑量，化合物B不是急性毒性的。根據這些研究的發(fā)現，化合物B口服的LD50，對狗被認為高于1000mg/kg，對大鼠被認為高于4000mg/kg，對大鼠腹膜內注射的LD50被認為高于1000mg/kg。
大鼠的7天劑量發(fā)現研究中，對化合物B的評價是通過在0,50,500或2000mg/kg/天的劑量給藥而進行的，在50mg/kg/天的劑量沒有明顯的毒性信號。在500mg/kg/天，與治療相關的影響僅限于雌性大鼠絕對和相對肝重的增加。在2000mg/kg/天的劑量，其影響包括雄性大鼠的用力呼吸和/或不正常的呼吸聲、體重和進食減少和雌性大鼠的肝重增加。在任一劑量水平均未看到血液學或血壓化學的變化。
對大鼠也在0,50,500，和2000mg/kg/天劑量進行了28天的研究。沒有起因于化合物B的不正常臨床觀察，體重變化、眼底鏡檢查、血液學和血壓化學值以及尿分析檢查均不明顯。剖尸檢查未發(fā)現顯微組織變化。器官重量數據顯示在2000mg/kg/天劑量肝重在統計上顯著增加，在2000mg/kg/天組甲狀腺重統計上顯著增加。在低劑量的稍微增加沒有統計上的產意義。組織病理學評價表明，在甲狀腺中存在有濾泡細胞過度增長的痕跡，增加了有絲分裂象數(說明可能有細胞感染)，在肝中有溫和的過度增長。這些變化一般被限制在2000mg/kg/天劑量下的少數動物，雖然有一個雌性的在500mg/kg/天劑量下增加了甲狀腺的絲分裂象數。肝臟中的發(fā)現或許是非常溫和刺激微體粒酶類的指示，并導致增加甲狀腺激素的新陳代謝，繼而導致對甲狀腺的刺激。本領域的專業(yè)科技人員將認識到，這些影響與相同劑量的常規(guī)化學治療法或NSAIDs的預期影響相比，是非常小的。
為進一步確定化合物B的安全范圍，進行了評價化合物B誘導的前列腺瘤細胞系的編程性細胞死亡是否同來自正常組織的它對前列腺上皮細胞的影響是可相比的研究。雄激素靈敏的前列腺瘤細胞系LNCaP(來自ATCC(Rockville,MD))在標準條件下莉包含5％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI 160介質繁殖。來自正常前列腺(來自Clonetics Inc,(SanDiego,CA))的初步的前列腺上皮細胞培養(yǎng)物(PrEC)在與瘤細胞系相同的條件下生長，不同的是使用無血清的介質(CloneticsInc)以便這些培養(yǎng)物生長的最好。對于這個實驗，是把LNCaP或PrEC以每孔10000細胞的密度放置在96孔板上。24小時后，這些細胞用賦形劑(0.1％DSMO)或在DSMO中溶解的50μM化合物B中處理。在不同的藥物處理時間(4,24,48,72或99小時)后，將這些細胞溶解加工，測定作為編程性細胞死亡指示的組蛋白聯結的DNA。(參閱Piazza eta1.,Cancer Rsearch 57:2452-2459,1997)圖6表明在LNCaP培養(yǎng)物中組蛋白聯結的斷裂的DNA量在用50μM化合物B處理后的時間依賴性增加。在處理24小時后，檢測到斷裂的DNA顯著增加，誘導作用持續(xù)到連續(xù)處理的4天。相反，用化合物B(50μM)處理PrEC(“正?！鼻傲邢?，在處理的4天時間內，并未影響DNA的斷裂。這些結果表明，在瘤形成細胞中選擇性誘導了編程性細胞死亡。這是同常規(guī)化學治療法明顯的不同，后者使快速增長的正常細胞或瘤形成細胞編程性細胞死亡或壞死。
最后就安全而言，在單一的逐步升高劑量的人的臨床試驗中，在病人、人的安全研究中藥采用口服，化合物B在任何劑量都不產生副作用，包括高于產生抗癌作用所需的預知水平。
如上面指出的那樣，化合物B還表現有潛在的抗腫瘤形成性能。在SW-480細胞系中，由化合物B得到的增長抑制IC50值是0.7μM。這些結果已經在嚙齒類動物中利用異常隱窩病灶(ACF)作為致癌作用的指示通過評價化合物B得到證實(參閱Bird,Cancer Lett.37:147-151,1987)。這樣所建立的氧化偶氮甲烷(AOM)誘導致癌作用的嚙齒類動物模型可用來在實驗室評價化合物B(游離堿和鹽)對結腸癌產生的影響。ACF是結腸癌的前體，ACF抑制作用化學保護效能的指出。
在大鼠的這個實驗中，ACF引發(fā)作用是通過連續(xù)兩周注射抗癌劑來實現的。在ACF引發(fā)作用前一周服用化合物B，在處理5周后記錄ACFs。將化合物B口服給雄性的Fisher344大鼠，在整個實驗過程中每天食物的消耗(mg/公斤體重)是變化的，化合物B劑量表示為克/公斤食品，以提供不同劑量間可相比較的基礎。為確定化合物B是否對生長和/或飼養(yǎng)行為有不利影響，在實驗的整個過程中都測定體重。實驗組獲得了比對照組較低的體重，這是生物利用率的指示。但是，體重差小于10％，不認為影響ACF的形成。
化合物B抑制了ACF的形成，這由每個結腸的隱窩減少來測定。這些數據歸納于表2。除低劑量組(僅0.5g/kg食品)外，處理組與對照組之間的差異是明顯的，在1.0和2.0g/kg食品的情況下，統計上有明顯差異。
表2化合物B對異常隱窩病灶的抑制作用化合物劑量 n 平均ACF/結腸 ％對照 p(t-實驗)g/kg 與對照(+SE)食品對照10 149±9 --0.5 7 149±14 100 0.9921 10 111±9 75 0.0081.5 10 132±4 89 0.1012.0 10 107±1572 0.029還有，化合物B滿足本發(fā)明的選擇標準，是用來確定這個選擇標準正確性的化合物之一。例如，利用前面描述的協議，利用來自HT29細胞提取物的cGMP特異性PDE，化合物B具有cGMP特異性PDE IC50值0.68μM。它的COXⅠ抑制作用(在100μM)小于25％。
至于原編程性死亡細胞，化合物B的DNA斷裂EC50是15μM。此外，在SW-480中對于化合物B來說在各種藥量濃度下編程性細胞死亡的百分數列于表3。
表3由形態(tài)學測定的化合物B對SW-480結腸腺癌細胞的HT-29細胞的編程性細胞死亡誘導作用處理劑量 ％編程性細胞死亡賦形劑(0.1％DSMO) - 1化合物B0.35μM 16化合物B 0.7μM 27化合物B 1.5μM 88化合物B的活性不限于抗結腸癌細胞系的活性或結腸癌的動物模型。在各種瘤形成細胞系中，它具有廣泛的抗瘤形成作用。各種類型的人癌細胞系在無菌條件下，在含10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和碳酸氫納的RPMI 1640介質中增長。為測定化合物B的增長抑制作用這些細胞以每孔1000個細胞的密度放置在96孔板中。在平板接種后24小時，用溶解在DMSO中的各種濃度的化合物B游離堿(最后濃度為0.1％)調劑細胞。該藥對腫瘤細胞增長的影響，在連續(xù)處理5天后，利用中性紅細胞毒性試驗測定。中性紅是一種染料，通過ATP依賴傳輸機理由活細胞選擇性地吸收。
如表4所歸納的那樣，當對一系列來自不同組織的培養(yǎng)人細胞系進行評價時，化合物B(游離堿)顯示了有效的增長抑制活性。化合物B顯示了可相比較的增長抑制作用，不管細胞系來自瘤的組織發(fā)生是怎樣的。對所有細胞系計算的GI50值(相對于賦形劑對照，抑制50％增長的藥濃度)是1-2μM。
除下表中的數據外，我們還觀察到了人的白血病細胞系(CCRF-CEM,K562和Molt-4)、骨髓瘤細胞系(RPMl8226)、胰腺瘤細胞系(PAN-1)和卵巢瘤細胞系(OVCAR-3)同化合物B(鹽酸鹽)可相比較的靈敏性。
表4化合物B對各種人瘤細胞系的增長抑制作用細胞系 腫瘤起源 GI50μM GI90μMColo205結腸 1.6 2.4HCT-15 結腸 1.7 3.0HT-29 結腸 2.1 8.0SW-620 結腸 1.7 2.5DUl45 前列腺 1.6 2.8PC-3 前列腺 1.7 82.5NCI-H23 肺1.7 2.5NCI-H322M 肺2.1 13.2NCI-H460肺1.9 30.0NCI-H82 肺1.7 5.8MDA-MB-231 乳腺 1.8 77.6MDA-MB-435 乳腺 1.6 2.3UISO-BCA-1 乳腺 1.5 4.7Molt-4*白血病 1.6 NDCCRF-CEM*白血病 1.4 NDK-562*白血病 1.8 NDRPMI-8226*骨髓瘤 1.2 NDOVCAR*胰腺瘤 1.2 NDPANC-1*卵巢瘤 2.2 ND*未特別標記的實驗是用該化合物的游離堿進行的，用*標記的實驗是用鹽酸鹽進行的。
在給出了化合物B的動物和人的安全特性以及動物和非常寬的細胞培養(yǎng)效率之后，就可明白，滿足本發(fā)明選擇標準(包括cGMP-特異性PDE抑制作用)的化合物可用作抗腫瘤形成治療劑。
至于從結構上鑒定另外的作為抗腫瘤劑在治療上有效的cGMP-特異性PDE抑制化合物，本領域內的專業(yè)技術人員有許多本發(fā)明公開的有用的模型化合物(以及收編在這里供參考的它們的同類物)，可用作計算機模擬具有相同構象但不同化學性能的另外化合物的基礎。例如，由Molecular Simulation Inc．發(fā)行WebLabViewerProTM而出售的軟件包括分子顯示和化學通訊能力。這樣的軟件包括官能度，包括已知化合物的3D顯示，以證實草擬的或示意的化學結構的準確性。此外，根據使用者定義的細節(jié)，這個軟件還可使結構疊加，使用者可測定距離、夾角或二面角。
在這種情況下，因為其他活性化合物的結構上面已公開，所以人們就可由這樣的軟件利用聚類分析以及2D和3D相似的研究技術，去鑒定按照本發(fā)明的選擇標準可篩選和選擇潛在的新的另外的化合物。這些軟件法依據的原則是，化合物好象有或具有相似的性能，很有可能是具有相似的活性，利用本發(fā)明的選擇標準可證實這些化合物。
另外，這些另外的化合物被計算機模擬時，許多這樣的化合物及其變種可利用已知的藥學工業(yè)中普通的專業(yè)技術人員共同使用的合成化學技術來合成。某些雇用合成化學服務業(yè)務的例子包括由NewChemical Entities,Inc,of Bothell Washington,Protogene,Laboratories,Inc.,of Palo Alto,California,Axys,Inc,of South SanFrancisco,California,Nanosyn,Inc.of Tucson Arizoza,Trega,Inc,of SanDiego,California,RBI,Inc,of Natick,Mass．提供的服務。還有一些其他的雇用公司。如果不是特別超群的話，許多大的醫(yī)藥公司自身的能力相同。簡言之，本領域內的專業(yè)技術人員可容易地制備許多化合物，供從中篩選以選擇具有本發(fā)明公開化合物作用的用于治療腫瘤有前途的化合物。
為進一步支持鑒定利用本發(fā)明的標準可進行篩選和選擇的化合物，了解所選擇的抗腫瘤化合物結合到PDE5蛋白上是有意義的。按照下面討論的方法，可以發(fā)現，滿足本發(fā)明標準的優(yōu)選的有希望的化合物結合到PDE5的cGMP催化區(qū)域。
為了確定這一點，使用不包括催化結構域的PDE5序列。產生這種序列的一個方法是把這個序列表達為融合蛋白，優(yōu)選用谷胱甘肽S-轉移酶，其理由明顯的。
用RT-PCR方法來獲得由牛的PDE5A cDNA序列(McAllister-Lucas L.M.et al,J,Biol.Chem.268,22863-22873,1993)設計的具有正向引物和逆向引物的PDE5的cGB結構域，并在PDEl-10系譜中選擇。5’-3’公司的總RNA試劑盒，通過mRNA的微動(dT)柱純化后同HT-29細胞一起使用。正向引物(GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G,203-227)和逆向引物(CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG,1664-1686)被用來合成磷酸化位點的以及人的PDE5A(203-1686bp,cGB-PDE5)低和高親合力cGMP結合位點的1484bp片斷編碼。合成的cGB-PDE5核苷肽片斷編碼成同牛的PDE5A有97％相似性的494氨基酸。而后將其克隆到具有tac啟動子的pGEX-5X-3谷胱甘肽S-轉移酶(GST)融合載體(Pharmacia Biotech)上以及EcoRⅠ和XhoⅠ半裂位點上。將這種融合載體轉移到E.ColiBL21(DE3)菌(Invitrogen)上。轉移的BL21菌生長到對數期，而后將IPTG作為誘導劑加入。使誘導作用在20℃進行24小時。收集該菌并溶解?？扇苄缘募毎馨a物用GSH接合的瓊脂糖4B(GSH-瓊脂糖4B)孵化。GST-cGB-PDE5融合蛋白可結合到GSH-瓊脂糖球上，其他的蛋白用過量的冷PBS從瓊脂糖球上洗掉。
表達的GST-cGB-PDE5融合蛋白作為85Kd蛋白顯示在7.5％SDS-PAGE凝膠上。它以cGMP結合和由蛋白激酶G和A磷酸化為特征。它有兩個cGMP結合點，Kd是1.6±0.2μM，這接近于土著牛PDE5的Kd=1.3μM。GSH接合的瓊脂糖球上的GST-cGB-PDE5可由cGMP依賴蛋白激酶和cAPM依賴蛋白激酶A在體外磷酸化。由PKG對GST-cGB-PDE5磷酸化的Km是2.7μM,Vmax是2.8μM，而BPDE肽磷酸化的Km是68μM。由PKG的磷酸化顯示有按1∶1的比率并合到GST-cGB-PDE5蛋白上的分子磷酸鹽。
對有興趣的(Francis S,H,et al,J.Biol.Chem.255,620-626,1980)化合物在總體和為100μL，包含有5mM磷酸鈉緩沖液(pH=6.8)、1mM的EDTA、0.25mg/mL的BSA、H3-cGMP(2μM,NEN)和GST-cGB-PDE5融合蛋白(30μg/試驗)的介質中進行。被實驗的舀一個化合物都在同時作為H3-cGMP培養(yǎng)基加入，該混合物在22℃孵化1小時。而后將該混合物用GF/B作為過濾器膜轉移到BrandelMB-24細胞收集器中，接著用l0mL冷5mM鉀緩沖液(pH=6.8)洗滌兩次。而后把膜切碎并轉入到閃爍小瓶中，接著向每個小瓶加入1mL水和6mL Ready SafeTM液體閃爍混合物。小瓶在Beckman LS6500閃爍計數器上計數。
為了計算，通過沸騰結合的蛋白5分鐘來制備對照樣品，與未沸騰的蛋白比較時結合計數小于1％。由過濾器膜淬火或對其他殘渣也進行校淮。
PDE5抑制劑、亞硫酸鹽、exisulind、化合物B、化合物A、E4021和zaprinast、和環(huán)核苷肽同系物、cAMP、環(huán)IMP、8-溴cGMP、環(huán)UMP、環(huán)CMP、8-溴cAMP、2’-O-丁基-cGMP和2’-O-丁基-cAMP被選定來試驗它們是否能相競爭地結合到GST-cGB-PDE5蛋白的cGMP結合點上。結果示于圖7。cGMP特別地結合GST-cGB-PDE5蛋白。環(huán)AMP、cUMP、cCMP、8-溴cAMP、2’-O-丁基-cGMP和2’-O-丁基-cAMP在結合中不與cGMP競爭。環(huán)IMP和8-溴cGMP在高濃度(100μM)與cGMP(2μM)結合有部分競爭。無PDE5抑制劑在GST-cGB-PDE5結合中同cGMP顯示任何的競爭。因而，它們不結合到PDE5的cGMP結合點。
但是，化合物A(同cGMP)競爭地結合到PDE5上(即峰A)(化合物A也(同cGMP)競爭地結合到PDE上，峰B)。知道了化合物A并不結合到PDE5的cGMP結合點上之后，化合物A和cGMP之間完全競爭的事實，就表示所希望的化合物如化合物A，結合到PDE5的cGMP催化點上，本領域內的專業(yè)技術人員易于得到的信息(用常規(guī)的競爭結合實驗)并不支持他們比較容易地模擬其他化合物。這樣，用本發(fā)明提出的希望化合物的化學結構和cGMP結合點信息，本領域內的專業(yè)技術人員可模擬、鑒定和選擇(利用本發(fā)明的選擇標準)用作治療劑的其他化合物。
按照本發(fā)明的方法選定的化合物可配制成藥用組合物，這從“藥用組合物”術語的含義是容易理解的，也就是說，為把化合物(如上面描述的固體)和藥用載體輸送給病人，可以固體或液體形式由口服給藥，以液體形式由藥，以形式由局部給藥，或以栓劑形式由直腸或局部給藥。口服給藥的載體是最被選的。
如本領域內所公認的那樣，口服給藥的藥用組合物中的藥用載體包括膠囊、片劑、丸劑、粉劑、錠劑和粒劑。在這些固體劑量形式中，載體可至少含有一種惰性稀釋劑，如蔗糖、乳糖或淀粉。這些固體還可包含稀釋劑以外的其他物質，正常操作也這樣，如硬脂酸鎂這樣的潤滑劑。在膠囊、片劑、丸劑、錠劑情況下，載體可包含有緩沖劑。像片劑、丸劑、粒劑這樣的載體，可在片劑、丸劑、粒劑的表面用腸道式涂抹的方法制備。另外，腸道式涂抹的化合物可壓制成片劑、丸劑、粒劑，使這樣的片劑、丸劑、粒劑給病人服用。優(yōu)選的腸道涂抹物包括在結腸的pH下能溶解或分解的涂抹物，如紫膠或Eudraget S。
藥用組合物中的藥用可接受的載體包括口服給藥的液體劑量形式，如藥用可接受的乳化液、溶液、懸浮液、糖漿和包含本領域內通用的惰性稀釋劑的酏劑。除這些惰性稀釋劑，組合物還可包含佐劑，如增濕劑、乳化劑和懸浮劑、溶脹劑、增香劑和加香劑。
IV或IP給藥的藥用組合物中藥用可接受的載體包括普通的藥用生理鹽水溶液。
局部給藥的藥用組合物中藥用可接受的載體包括DSMO、乙醇和丙二醇等，它們可同檔布或其他液體阻留材料一起使用，以便把藥保持在皮膚的某個地方，這樣藥就不會干掉。
直腸給藥的藥用組合物中藥用可接受的載體優(yōu)選栓劑，除了本發(fā)明的化合物外，它還可包含賦形劑，如可可奶油或栓劑蠟或凝膠。
藥用可接受的載體和本發(fā)明的化合物被配制成單一劑量形式的藥用組合物供病人服用。在單位劑量中有效組分(即依據本發(fā)明選乏的化合物)的劑量水平是可以變化的，以便按照所希望的服用方法(如口服或直腸服用)得到為消除瘤形成活性有效的活性組分量。因而所確定的劑量水平取決于所服用的活性化合物的性質(如它的IC50，很容易確定)、服用方式、所希望的治療時間和其他因素。一個單位劑量可以是每天對活性化合物需要量，或將其分成幾份劑量服用，如每天2-4次。對Ⅳ服用法，服用的起始劑量可根據在平均成年男性的血漿含量中(即大約4升)達到IC50的劑量來確定。按照本發(fā)明選定的活性化合物的最后劑量可在0.5-600mg范圍內變化。
本發(fā)明的藥用組合物優(yōu)選包裝在附有指標、使用說明等印刷材料(如包裝襯)的容器中(如盒或瓶或筒)。
很顯然，借助于上面的介紹，本發(fā)明的許多改進和變化都是可能的。因而應當認為在本發(fā)明權利要求范圍內，用這里具體說明以外的方法也可實施本發(fā)明。
權利要求
1．選擇用于治療要被治療腫瘤的化合物的方法，該方法包括(a)評價該化合物對要治療腫瘤的抗腫瘤活性；(b)評價該化合物是否在要治療的腫瘤中增加PKG活性；(c)評價該化合物是否在要治療的腫瘤中活化JNK活性；(d)選擇對要治療的腫瘤具有抗腫瘤活性、增加PKG活性和活化JNK活性的化合物。
2．權利要求1的方法，進一步包括評價該化合物是否抑制PDE5，并選擇抑制PDE5的化合物。
3．權利要求1的方法，進一步包括評價該化合物是否在要治療的腫瘤中減少β-鏈蛋白，并選擇減少β-鏈蛋白的化合物。
4．權利要求1的方法，進一步包括評價該化合物是否抑制cGMP特異性磷酸二酯酶(PDE)，并選擇抑制所說的PDE的化合物。
5．權利要求1的方法，進一步包括評價該化合物是否增加PKG表達，并選擇增加PKG表達的化合物。
6．權利要求1的方法，進一步包括評價該化合物是否增加PKG活性，并選擇增加PKG活性的化合物。
7．選擇能治療所需治療腫瘤的化合物的方法，該方法包括(a)評價該化合物是否能在要治療的腫瘤中提高PKG的活性；(b)評價該化合物是否能減少β-鏈蛋白；和(c)評價該化合物是否能在要治療的腫瘤中活化JNK活性；(d)選擇能提高PKG活性、減少β-鏈蛋白和活化腫瘤中的JNK的化合物。
8．鑒定能有效治療腫瘤的化合物的方法，該方法包括選擇能提高PKG活性和活化腫瘤中的JNK的化合物；和評價化合物對腫瘤生長的抑制活性，其中能提高PKG活性，活化腫瘤中的JNK的化合物具有腫瘤生長抑制活性，能夠有效的抑制腫瘤，但基本上不抑制正常細胞的生長。
9．鑒定能有效治療腫瘤的化合物的方法，該方法包括測定化合物的環(huán)氧酶(COX)抑制作用；和測定化合物是否能活化腫瘤細胞中的JNK；其中COX抑制活性降低和被活化的JNK說明該化合物可有效的治療腫瘤。
10．權利要求9的方法，該方法還包括測定化合物是否能抑制樣品中腫瘤細胞的生長；其中腫瘤細胞生長的抑制進一步說明該化合物可用于治療腫瘤。
11．選擇治療腫瘤化合物的方法，該方法包括測定化合物的腫瘤細胞生長抑制活性；測定該化合物是否能提高PKG活性和活化腫瘤細胞中JNK；和選擇顯示出腫瘤細胞生長抑制活性、能提高PKG活性和能活化腫瘤細胞中的JNK的化合物。
12．治療腫瘤的藥用組合物，包括藥用可接受的載體和由下述方法選擇的化合物評價該化合物對要治療腫瘤的抗腫瘤活性；評價該化合物是否在要治療的腫瘤中增加PKG活性和活化JNK；和選擇對要治療的腫瘤具有抗腫瘤活性和引起增加PKG活性和活化JNK的化合物。
13．權利要求12的藥用組合物，其中所說的化合物通過評價該化合物是否抑制PDE5來進一步選擇，并選擇抑制PDE5的化合物。
14．權利要求12的藥用組合物，其中所說的化合物通過評價該化合物是否在要治療的腫瘤中減少β-鏈蛋白來進一步選擇，并選擇減少β-鏈蛋白的化合物。
15．權利要求12的藥用組合物，其中所說的化合物通過評價該化合物是否抑制cGMP特異性磷酸二酯酶(PDE)，并選擇抑制所說PDE的化合物。
16．權利要求12的藥用組合物，其中所說的化合物通過評價該化合物是否增加PKG表達來進一步選擇，并選擇增加PKG表達的化合物。
17．權利要求12的藥用組合物，其中所說的化合物通過評價該化合物是否增加PKG活性來進一步選擇，并選擇增加PKG活性的化合物。
18．權利要求12的藥用組合物，其中所說的化合物通過評價該化合物是否抑制PDE2來進一步選擇，并選擇抑制PDE2的化合物。
19．治療腫瘤的藥用組合物，包括藥用可接受的載體和由下述方法選擇的化合物評價該化合物在要治療腫瘤的腫瘤細胞中是否增加PKG活性和活化JNK；評價該化合物是否減少腫瘤細胞中的β-鏈蛋白；和選擇在整體腫瘤細胞中引起增加PKG活性和活化JNK并在要治療的腫瘤中減少β-鏈蛋白化合物。
20．治療腫瘤的藥用組合物，包括藥用可接受的載體和由下述方法選擇的化合物選擇在腫瘤中增加PKG活性和活化JNK的化合物；評價該化合物的腫瘤增長抑制活性，其中提高PKG活性和具有抑制腫瘤增長活性的化合物具有抑制腫瘤的潛力，而對正常細胞不產生實質性的影響。
21．治療腫瘤的藥用組合物，該組合物包括藥用可接受的載體和由下述方法選擇的化合物測定化合物的環(huán)氧酶(COX)抑制作用；和測定化合物是否能提高PKG活性和活化腫瘤細胞中的JNK；選擇比其提高PKG活性和活化腫瘤細胞中的JNK能力更低的COX抑制活性的化合物用于治療腫瘤。
22．治療腫瘤的藥用組合物，該組合物包括藥用可接受的載體和由下述方法選擇的化合物測定化合物的腫瘤細胞生長抑制活性；測定化合物是否能提高PKG活性和活化腫瘤細胞中的JNK；選擇顯示出腫瘤細胞生長抑制活性，能提高PKG活性和活化腫瘤細胞中的JNK的化合物。
23．選擇治療腫瘤化合物的方法，該方法包括(a)評價該化合物是否能在所述腫瘤中提高PKG活性；(b)評價該化合物是否能減少所述腫瘤細胞中的β-鏈蛋白；(c)評價該化合物是否能活化所述腫瘤中的JNK活性；(d)選擇能提高PKG活性、活化所述腫瘤中JNK和減少β-鏈蛋白的化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了可治療預防哺乳動物腫瘤疾病的化合物的鑒定方法,測定化合物的磷酸二酯酶抑制活性,同時測定提高JNK激酶活性的能力。另外還需要測定培養(yǎng)的腫瘤細胞的生長抑制和誘導編程性細胞死亡的作用。顯示出磷酸二酯酶抑制活性,有提JNK激酶活性的能力,生長抑制和編程性細胞死亡誘導作用的化合物對于治療腫瘤而言是理想的。
文檔編號G01N33/15GK1319674SQ0110937
公開日2001年10月31日 申請日期2001年3月2日 優(yōu)先權日2000年3月3日
發(fā)明者I·伯納德·韋恩斯坦恩, W·約瑟夫·湯普森, 徐宰源, 劉莉, 李晗 申請人:細胞途徑公司