專利名稱：：一種預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和抑制腫瘤生長的寡聚核酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抑制腫瘤起始和生長的微小RNA制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：MicroRNAs(miRNAs)是一類分布廣泛的非編碼的小RNAs，通過與靶向序列的3'UTR(非翻譯區(qū))發(fā)生部分互補(bǔ)來調(diào)控基因表達(dá)。近年來，miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默與腫瘤形成的相關(guān)性已成為關(guān)注的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞間miRNA表達(dá)譜具有明顯差異，且多數(shù)miRNA基因都位于腫瘤形成相關(guān)性脆弱基因位點(diǎn)，miRNA基因高頻率地出現(xiàn)在這些和腫瘤密切相關(guān)的易變基因組環(huán)境中，提示miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后存在著密切的聯(lián)系。事實(shí)上，有越來越多地miRNA作為原癌基因和腫瘤抑制基因被鑒定出來，運(yùn)用miRNA抑癌基因的功能，可能會對腫瘤的基因治療產(chǎn)生很大的影響，或可能模擬這一分子進(jìn)行新藥研發(fā)。腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境，有某些miRNA表達(dá)出現(xiàn)差異。通過對鼻咽癌細(xì)胞芯片分析，鑒定了幾條低氧調(diào)節(jié)下表達(dá)有明顯變化的miRNA，其中mir-210是表達(dá)量變化最為明顯的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和抑制腫瘤生長的寡聚核酸。本發(fā)明所提供的預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和抑制腫瘤生長的寡聚核酸，包括正義鏈和反義鏈，其特征在于所述正義鏈具有5’-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA-3’序列，所述反義鏈具有5’-GACACGCACACUCGCCGACU-3’或5，-AGCCGCU⑶CACACGCACA⑶U-3，序列。所述寡聚核酸為化學(xué)合成，可以進(jìn)行2'氟代(2'_F)、2'甲氧基(2'-OMe)、硫代(PS)和2'脫氧(2'-deoxy)化學(xué)修飾，修飾的寡聚核酸分子分別表示如下所述寡聚核酸-2'-F、所述寡聚核酸-PS、所述寡聚核酸-2'-OMe和所述寡聚核酸-2'-deoxy。所述寡聚核酸分子作用的靶序列具有序列表中SEQIDNo6和SEQIDNo7的核苷酸序列。用化學(xué)合成并修飾的上述寡聚核酸分子轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株(CNE)、宮頸癌細(xì)胞株Hela、肝癌細(xì)胞株H印G2、乳腺癌細(xì)胞株MCF7、腸癌細(xì)胞株HCT116等腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所述寡聚核酸能有效抑制上述腫瘤細(xì)胞的增殖。生物效應(yīng)半衰期的測試結(jié)果表明，與未修飾的寡聚核酸分子相比，化學(xué)修飾的寡聚核酸分子抑制E2F3表達(dá)的效應(yīng)半衰期由未修飾前的2天延長到修飾后的5天。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和抑制腫瘤生長的藥物組合物。該藥物組合物包含上述寡聚核酸分子中的至少一種以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體。本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體”應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明藥物組合物中的雙鏈RNA分子相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低藥物組合物在抑制基因表達(dá)方面的效果。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述“藥學(xué)上可接受的載體”是指體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑，如mPEG-PCL-PPEEA，脂質(zhì)體，聚乙烯亞胺(PEI)等?？勺鳛樗帉W(xué)上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的其他例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等，其中較佳的載體選自生理鹽水、甘油和磷酸鹽緩沖鹽水。本發(fā)明的藥物組合物可以制成各種醫(yī)學(xué)上可接受的劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進(jìn)行施用。本發(fā)明所述制劑是指口服液、注射齊U、舌下含服劑等多種液體劑型，或通過加以適當(dāng)?shù)馁x形劑制備成片劑、膠囊劑等多種其他劑型。較佳的是，所述藥物組合物的劑型選自注射劑、膠囊、舌下含服劑、口服液、氣霧劑或貼劑。在本發(fā)明中還提供了一種制備上述藥物組合物的方法，該方法包括將上述寡聚核酸分子中的至少一種與至少一種藥學(xué)上可接受的載體相混合，從而獲得所述藥物組合物。寡聚核酸分子以及藥學(xué)上可接受的載體之間的混合次序沒有特別的限制。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述寡聚核酸與聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯(mPEG-PCL-PPEEA)的質(zhì)量比為12030，該藥物組合物中還可以包括葡萄糖、生理鹽水或者緩沖液等。所述寡聚核酸通過抑制鼻咽癌、宮頸癌、肝癌、乳腺癌、腸癌等腫瘤細(xì)胞的E2F3的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤起始和生長的作用。將腫瘤細(xì)胞接種裸鼠，隨后用所述寡聚核酸治療的實(shí)驗(yàn)證明所述寡聚核酸能在體內(nèi)有效抑制腫瘤的起始和生長。本發(fā)明還提供了所述寡聚核酸作用的靶序列，所述靶序列包含5，-GACACGCAAATCTGTTAAACAAA-3，或5，-GTCACGTAAAGGTCATCCGTGA-3，所示的序列。作為一種新型小核酸類的抗腫瘤藥物，化學(xué)合成并修飾的所述寡聚核酸不易被降解，有較長的半衰期，能用于體外實(shí)驗(yàn)，更能用于體內(nèi)治療。由于化學(xué)合成并修飾的所述寡聚核酸能有效抑制腫瘤細(xì)胞E2F3的表達(dá)而阻止腫瘤起始和生長，所以該小核酸制劑既能用于預(yù)防腫瘤摘除術(shù)或放化療后殘余腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致的腫瘤復(fù)發(fā)，又能抑制成體腫瘤的生長。圖1為MTT方法檢測2'-F寡聚核酸抑制腫瘤細(xì)胞增殖的柱形圖。圖1中，空白對照、2'-F寡聚核酸、2'-F寡聚核酸陰性對照分別表示未轉(zhuǎn)染任何寡聚核酸、轉(zhuǎn)染2'-F寡聚核酸及轉(zhuǎn)染的細(xì)胞2'-F寡聚核酸陰性對照的細(xì)胞增殖情況。圖2為RT-PCR檢測化學(xué)修飾對寡聚核酸效應(yīng)半衰期的影響。圖2中1、2、3、4、5、6分別表示轉(zhuǎn)染所述2'-F寡聚核酸(正義鏈為SEQIDNol，反義鏈為SEQIDNo2)、2'-F寡聚核酸-Star(正義鏈為SEQIDNol，反義鏈為SEQIDNo3)、2'-F寡聚核酸陰性對照、未修飾寡聚核酸陰性對照、未修飾的寡聚核酸和未經(jīng)處理的空白對照。圖3為2'-F寡聚核酸治療鼻咽癌的瘤體積折線圖。圖4為2'-F寡聚核酸-治療鼻咽癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A為所述2'-F寡聚核酸治療鼻咽癌的裸鼠效果圖，B:為所述2'-F寡聚核酸治療鼻咽癌的腫瘤效果圖，圖中所示分別為2'-F寡聚核酸陰性對照治療和2'-F寡聚核酸治療的裸鼠及取自裸鼠的腫瘤。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、寡聚核酸的制備本發(fā)明中所述寡聚核酸序列正義鏈為5’-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA-3’(SEQIDNo.1)；反義鏈為5，-GACACGCACACUCGCCGACU-3，(SEQIDNo.2)或5，-AGCCGCUGUCACACGCACAGUU-3’(SEQIDNo.3)。選用一條隨機(jī)序列作為陰性對照(NC)，NC的正義鏈序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQIDNo.4)，反義鏈序列為5，-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3，(SEQIDNo.5)。所述寡聚核酸和陰性對照序列中的A、G、C、U表示腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脫氧核苷酸。所述寡聚核酸和陰性對照委托上海吉瑪(GenePharma)制藥技術(shù)有限公司合成并進(jìn)行2'氟代(2'-F)、2'甲氧基(2'-OMe)、硫代(PS)和2'脫氧(2'-deoxy)化學(xué)修飾。實(shí)施例2、2'-F-寡聚核酸對腫瘤細(xì)胞增殖的影響具體步驟為將實(shí)施例1得到的2'-F寡聚核酸(正義鏈為SEQIDNol，反義鏈為SEQIDNo2)和2'-F寡聚核酸陰性對照粉末分別溶解于無RNA酶的無菌水中，配成終濃度為20ymol/L的溶液。收集對數(shù)期腫瘤細(xì)胞細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分種于96孔板，每孔150μ1共5000個(gè)細(xì)胞；置于37°C，含5%CO2的孵箱中使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)6_24小時(shí)。轉(zhuǎn)染時(shí)，分別將0.25μ1寡聚核酸溶液(上述2'-F寡聚核酸或2'-F寡聚核酸陰性對照)和0.25μ1的Iipofectamine2000(Invitrogen)分別稀釋于25μ1無血清培養(yǎng)培養(yǎng)液(Opti-MEM)中，并在室溫下孵育5分鐘，然后將上述寡聚核酸溶液與lipofectamine2000溶液混合，復(fù)合物于室溫靜置20分鐘后，把50μ1的寡聚核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物加到細(xì)胞培養(yǎng)板中(細(xì)胞生長融合率為50-70%)，為使細(xì)胞同步，在轉(zhuǎn)染的同時(shí)將細(xì)胞血清饑餓12小時(shí)，之后分三組分別培養(yǎng)24，48和72小時(shí)；小心吸去上清120ul，使孔中生育培養(yǎng)液為80μ1，再加入20μlMTT(5mg/ml)，即0.5%的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)；吸去上清加入100μ1的二甲基亞砜DMS0，在酶聯(lián)免疫檢測儀492nm處測量各孔的吸光值；同時(shí)設(shè)置調(diào)0孔(培養(yǎng)基，MTT，二甲基亞砜)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；結(jié)果如圖1所示，圖1表明轉(zhuǎn)染NC-2'-F的細(xì)胞增殖抑制，在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)，2'-F寡聚核酸轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞OD值明顯降低，說明所述寡聚核酸-2'-F能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。圖1中，空白對照、2'-F寡聚核酸、2'-F寡聚核酸陰性對照分別表示未轉(zhuǎn)染任何寡聚核酸、轉(zhuǎn)染2'-F寡聚核酸及轉(zhuǎn)染的細(xì)胞2'-F寡聚核酸陰性對照的細(xì)胞增殖情況。實(shí)施例3、2‘-F-寡聚核酸抑制腫瘤細(xì)胞表達(dá)E2F3的半衰期測試檢測使用Invitrogen的lipofeCtamineTM2000脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，所有操作均按Invitrogen提供的操作規(guī)程。將腫瘤細(xì)胞接種到6孔板中(300，000個(gè)細(xì)胞/孔)，用含10%胎牛血清的RPMI1640或DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)16-24小時(shí)后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成含無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染時(shí)，分別將5μ1寡聚核酸溶液和5μ1的lipofectamine2000分別稀釋于250μ1無血清培養(yǎng)培養(yǎng)液(Opti-MEM)中，并在室溫下孵育5分鐘，然后將上述寡聚核酸溶液與lipofectamine2000溶液混合，復(fù)合物于室溫靜置20分鐘后，把500μ1的寡聚核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物加到細(xì)胞培養(yǎng)板中(細(xì)胞生長融合率為50-70%)，然后30、54、78和102h收集細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測。RT-PCR檢測的步驟為用ImlTRIzol(invitrogen)裂解轉(zhuǎn)染所述2'-F寡聚核酸或2'-F寡聚核酸陰性對照的CNE細(xì)胞，并按TRIzoI產(chǎn)品說明的操作規(guī)程提取總RNA。由于RNA干擾的效果可能被潛在的少量的基因組DNA影響，實(shí)驗(yàn)采用DNaseI(RNase-free)(TaKaRa)來進(jìn)一步消化降解總RNA中殘留的DNA。在用DNaseI37°C消化30分鐘后，按照DNaseI產(chǎn)品說明重新提純總RNA并對RNA進(jìn)行定量和質(zhì)量鑒定。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是使用TaKaRa公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系，將Iug的總RNA與0.5ug的OligodT混合，加熱5分鐘，迅速冷卻至0°C。按產(chǎn)品說明加入緩沖液，42°C孵育1小時(shí)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后的cDNA，作為PCR反應(yīng)的模板檢測靶基因E2F3的表達(dá)，上游引物為5’-GGACTAGTTTCCTACCTTCTTCCTCCAA-3，，下游引物為5，-GCTCTAGATCTACAGCCCATCCGTCA-3，。PCR反應(yīng)體系為，94度5分鐘，94度1分鐘，55度30秒，72度20秒，共28個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并利用軟件對其濃度進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果如圖2所示，圖2表明轉(zhuǎn)染2'-F寡聚核酸陰性對照的細(xì)胞的PCR產(chǎn)物比未轉(zhuǎn)染寡聚核酸的空白對照組沒有明顯降低，而轉(zhuǎn)染所述2'-F寡聚核酸和2'-F寡聚核酸-Star轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞PCR產(chǎn)物明顯降低，并且在102h，轉(zhuǎn)染2'-F寡聚核酸比未經(jīng)過氟代修飾的所述寡聚核酸對E2F3的抑制仍然明顯。說明化學(xué)修飾使所述2'-F寡聚核酸對E2F3的效應(yīng)半衰期從54h延長到102h。圖2中1、2、3、4、5、6分別表示轉(zhuǎn)染所述2'-F寡聚核酸(正義鏈為SEQIDNol，反義鏈為SEQIDNo2)、2'-F寡聚核酸-Star(正義鏈為SEQIDNol，反義鏈為SEQIDNo3)、2'-F寡聚核酸陰性對照、未修飾寡聚核酸陰性對照、未修飾的寡聚核酸和未經(jīng)處理的空白對照。實(shí)施例4、2'-F寡聚核酸對腫瘤生長的抑制作用用含10%胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)液培養(yǎng)鼻咽癌CNE細(xì)胞，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度7XIO7個(gè)細(xì)胞/ml。在5周齡的雄性裸鼠的背側(cè)翼部皮下注射0.1ml細(xì)胞懸液。在注射腫瘤細(xì)胞的第二天，開始用所述2'-F寡聚核酸(正義鏈為SEQIDNol，反義鏈為SEQIDNo2)處理。將裸鼠分為兩組，一組為2‘-F寡聚核酸處理組，一組為2'-F寡聚核酸陰性對照組。具體方法為用不含RNA酶的無菌水分別溶解2'-F寡聚核酸、2'-F寡聚核酸陰性對照和一種體內(nèi)轉(zhuǎn)染劑聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯(mPEG-PCL-PPEEA)，所述2'-F寡聚核酸和2'-F寡聚核酸陰性對照的濃度均為0.8μg/μ1，而轉(zhuǎn)染試劑的濃度為3.8μg/μ1，室溫孵育15分鐘后，將20ug//25ul2'-F寡聚核酸或2'-F寡聚核酸陰性對照，589ug/155ul轉(zhuǎn)染試劑和20ul，10X葡萄糖溶液混合起來，總體積200ul，再室溫孵育15分鐘進(jìn)行尾靜脈注射，每隔一天注射一次，共治療5次。2'-F寡聚核酸陰性對照組接種腫瘤細(xì)胞3天后的出瘤率為90%，5天為100%。而2'-F寡聚核酸處理組3天后的出瘤率為僅為45%，5天為85%(表1)。接種后3天每隔一天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最長徑(L)和橫徑(S)，計(jì)算腫瘤的近似體積。計(jì)算公式為V(mm3)=0.5XLXS2。給藥5次后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，處死裸鼠，取出腫瘤稱重。圖3所示為治療組和對照組的腫瘤體積對照的折線圖，從開始進(jìn)行第一次治療后，腫瘤體積明顯比對照組小，對照組腫瘤體積呈明顯上升趨勢。圖4所示，表明在鼻咽癌移植腫瘤裸鼠模型上，2'-F寡聚核酸治療的裸鼠腫瘤明顯比陰性對照處理組小，說明所述2'-F寡聚核酸能明顯抑制腫瘤的生長。圖3中為腫瘤體積的折線圖；圖4A:為所述2'-F寡聚核酸治療鼻咽癌的裸鼠效果圖，B:為所述2'-F寡聚核酸治療鼻咽癌的腫瘤效果圖，圖中所示分別為2'-F寡聚核酸陰性對照治療和2'-F寡聚核酸治療的裸鼠及取自裸鼠的腫瘤。表12'-F寡聚核酸抑制腫瘤起始生長腫瘤腫瘤接種數(shù)(個(gè))第3天腫瘤出現(xiàn)數(shù)第5天腫瘤出現(xiàn)數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求一種預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和抑制腫瘤生長的寡聚核酸，為雙鏈結(jié)構(gòu)，包括正義鏈和反義鏈，其特征在于所述正義鏈具有5’-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA-3’序列，所述反義鏈具有5’-GACACGCACACUCGCCGACU-3’或5’-AGCCGCUGUCACACGCACAGUU-3’序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡聚核酸，其特征在于所述核酸經(jīng)過如下修飾中的至少一種(1)對所述寡聚核酸的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；(2)對所述寡聚核酸的核苷酸序列中的核糖的2’-0H的修飾；(3)對所述寡聚核酸的核苷酸序列中的堿基的修飾。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡聚核酸，其特征在于所述寡聚核酸的核苷酸序列中的核糖的2’-0H經(jīng)過甲氧基取代、氟取代或者脫氧修飾。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡聚核酸，其特征在于所述寡聚核酸的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵中的氧被硫取代。5.包含權(quán)利要求1所述寡聚核酸的核酸構(gòu)建體。6.一種預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和抑制腫瘤生長的藥物組合物，包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的寡聚核酸及藥學(xué)上可接受的載體。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于所述藥學(xué)上可接受的載體選自聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯或其它體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于所述寡聚核酸與聚乙二醇單甲醚-聚己內(nèi)酯-聚磷酸酯的質(zhì)量比為12030。9.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的寡聚核酸在制備用于預(yù)防腫瘤摘除術(shù)或放化療后殘余腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致的腫瘤復(fù)發(fā)及成體腫瘤生長的藥物中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，所述腫瘤為鼻咽癌、宮頸癌、肝癌、乳腺癌或腸癌。11.權(quán)利要求1所述寡聚核酸作用的靶序列，選自包含5，-GACACGCAAATCTGTTAAACAAA-3，或5，-GTCACGTAAAGGTCATCCGTGA-3，的序列。全文摘要本發(fā)明提供了一種預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和抑制腫瘤生長的寡聚核酸及其應(yīng)用。所述寡聚核酸為雙鏈結(jié)構(gòu)，包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈具有5’-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA-3’序列，所述反義鏈具有5’-GACACGCACACUCGCCGACU-3’或5’-AGCCGCUGUCACACGCACAGUU-3’序列，上述序列可以經(jīng)過化學(xué)修飾。本發(fā)明還提供了包含上述序列的藥物組合物以及上述序列在制備用于預(yù)防腫瘤摘除術(shù)或放化療后殘余腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致的腫瘤復(fù)發(fā)及成體腫瘤生長的藥物中的應(yīng)用。文檔編號A61K48/00GK101831427SQ20101013785公開日2010年9月15日申請日期2010年4月1日優(yōu)先權(quán)日2010年4月1日發(fā)明者何杰,張佩琢,張佳榮,張雅鷗,李建娜,王均,胡祥,謝偉東申請人:清華大學(xué)深圳研究生院;深圳市北科生物科技有限公司;上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司