專利名稱：衍生自黑眉蝮蛇的新型蛋白以及制備該蛋白的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及黑眉素(Saxatilin)(一種衍生自韓國黑眉蝮蛇(Agkistrodon saxatilis emelianov)的蛋白)、黑眉素制備方法以及黑眉素的藥物應(yīng)用，更特定地涉及作為抗血小板凝集劑和抗腫瘤劑的黑眉素(一種衍生自韓國黑眉蝮蛇毒液的蛋白)、黑眉素制備方法以及黑眉素的藥物應(yīng)用。
細(xì)胞和胞外基質(zhì)(ECM)的相互作用對(duì)腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移是需要的。在轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞死亡，導(dǎo)致基膜暴露，使得腫瘤細(xì)胞更容易粘附在外圍基質(zhì)中的ECM蛋白上(參見Hynes，R.O.，Cell，48549(1987))。這些底物蛋白通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合促進(jìn)了細(xì)胞粘著，受體包括整聯(lián)蛋白家族。
依據(jù)結(jié)構(gòu)，每個(gè)整聯(lián)蛋白都是一個(gè)由α亞基和β亞基通過非共價(jià)結(jié)合形成的異二聚體。有報(bào)道說β1亞族在細(xì)胞—細(xì)胞直接相互作用以及在作為主要接觸介質(zhì)的細(xì)胞-ECM底物粘附中發(fā)揮了作用(參見Larjava，H.等，J.Cell.Biol.，110803-815(1990))。分布在白細(xì)胞中的β2亞族包括細(xì)胞表面受體，其介導(dǎo)了細(xì)胞—細(xì)胞相互作用。β3亞族包括玻連蛋白受體以及血小板糖蛋白IIb/IIIa復(fù)合體，可能在腫瘤侵入和腫瘤由良性發(fā)展為惡性的過程中起作用(參見Albelda，S.M.等，Cancer Res.，506757-6764(1990))。
整聯(lián)蛋白受體復(fù)合體橫向跨越了細(xì)胞的細(xì)胞膜，在細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)與胞外基質(zhì)的連接中發(fā)揮作用。核心序列與細(xì)胞粘著分子樣纖維蛋白原相同，玻連蛋白和層粘連蛋白已知對(duì)細(xì)胞粘著、擴(kuò)散和整合負(fù)責(zé)。順便說一句，這還暗示著癌的啟動(dòng)和轉(zhuǎn)移與整聯(lián)蛋白的作用密切相關(guān)(參見Giancotti，F(xiàn).G.和Rouslahti，E.，Cell，60849-859(1990)；Hynes，R.O.，Cell，6911-25(1992)；Nip，J.等，J.Clin.Invest.，962096-2103(1995))。纖連蛋白受體α5β1的過量表達(dá)已知減少了CHO(中國倉鼠卵巢)中的突變表型以及降低了已突變?yōu)閞as的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中整聯(lián)蛋白α5β1的表達(dá)水平(參見Plantefaben，L.C.和Hynes，R.O.，Cell，56281-290(1989))。已有報(bào)道超級(jí)纖連蛋白(一種纖連蛋白聚合物)預(yù)防癌啟動(dòng)和轉(zhuǎn)移(參見Pasqualini，R.等，Nature Medicine，21197-1203(1996))。
整聯(lián)蛋白αVβ3能用作大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記，其顯示了整聯(lián)蛋白在人惡性黑素瘤的發(fā)展中的功用(參見Albelda，S.M.等，CancerRes.，506757-6764(1990))。整聯(lián)蛋白αV基因的表達(dá)和粘著表型與體內(nèi)人黑素瘤增生具有直接的相關(guān)性(參見Felding-Habermann，J.Clin.Invest.，892018-2022(1992))。
同時(shí)，血管發(fā)生是從現(xiàn)成血管萌發(fā)新血管從而形成新血管的過程(參見Folkman，J.和D′Amore，P.A.，Cell，871153-1155(1996))。血管發(fā)生在發(fā)育、傷口愈合和炎癥過程中出現(xiàn)，其在腫瘤生長中是必需過程。細(xì)胞粘著分子調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞和毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞中的血管發(fā)生(參見Nguyen，M.等，Nature，365267(1993))。
腫瘤血管發(fā)生量由介于刺激和抑制調(diào)節(jié)劑間的平衡變化確定。與此相關(guān)，血管發(fā)生的兩個(gè)細(xì)胞因子依賴途徑已經(jīng)存在并由截然不同的血管細(xì)胞整聯(lián)蛋白αVβ3和αVβ5相區(qū)別。這兩個(gè)整聯(lián)蛋白在新形成的血管中表達(dá)，并在由bFGF(堿性成纖維生長因子)、TNF-α(腫瘤壞死因子α)、VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)以及人腫瘤片段刺激的血管發(fā)生中起重要作用(參見Friedlander，M.等，Science，2701500-1502(1995))。αVβ3整聯(lián)蛋白的活化刺激了存活信號(hào)，誘導(dǎo)血管增生和分化，這表明細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)和整聯(lián)蛋白受體與血管發(fā)生相關(guān)(參見Brooks，P.C.等，Cell，791157-1164(1994))。
解聯(lián)蛋白(disintegrin)已知是整聯(lián)蛋白潛在的拮抗劑，為衍生自蛇毒液的小蛋白(參見Niewiarowski，S.等，Semin.Hematol.，31289-300(1994))。大多數(shù)解聯(lián)蛋白含有精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(GRD)或賴氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(KGD)基元，被血小板纖維蛋白原受體α2bβ3所識(shí)別。據(jù)報(bào)道含有RGD序列的解聯(lián)蛋白抑制整聯(lián)蛋白-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移細(xì)胞與ECM的粘著并最終阻斷轉(zhuǎn)移(參見Trikha，M.等，Cancer Res.，54(8)4993-4998(1994))。整聯(lián)蛋白αVβ3已被鑒定為雞胚和人細(xì)胞中生血管性血管的標(biāo)記(參見Brooks，P.C.等，Science，264569-571(1994))。整聯(lián)蛋白αVβ3的單克隆抗體通過誘導(dǎo)新形成血管內(nèi)皮細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡破壞了血管發(fā)生。合成的肽含有RGD序列，該序列已知可防止整聯(lián)蛋白αVβ3與配體的結(jié)合，所述肽抑制腫瘤誘導(dǎo)的CAM(小雞尿囊絨膜)血管發(fā)生(參見Brooks，P.C.等，Cell，791157-1164(1994))。此外，血管生成素作為一輔助因子已知幫助內(nèi)皮細(xì)胞粘著和增生，也被合成的RGD肽抑制。最近，有報(bào)道蛇毒液衍生的解聯(lián)蛋白三黃素(Triflavin)抑制TNF-α刺激的血管發(fā)生。這些結(jié)果為合成的RGD肽和抗αVβ3單克隆抗體這些解聯(lián)蛋白提供了可被開發(fā)成抗癌藥物的可能性。
另一方面，蛇毒液已知含有各種蛋白，這些蛋白影響血栓癥和止血。由于異常血小板凝集所產(chǎn)生的血栓形成提高了致死血栓癥，因此血小板凝集拮抗劑或激動(dòng)劑可從蛇毒液中分離并鑒定出來。至于凝集機(jī)理，血小板凝集受到血小板GP IIb/IIIa受體中纖維蛋白原與糖蛋白結(jié)合的調(diào)節(jié)，已報(bào)道纖維蛋白原結(jié)合位點(diǎn)精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(RGD)的氨基酸序列對(duì)纖維蛋白原與GP IIb/IIIa受體的結(jié)合至關(guān)重要(參見Rouslagti E.和Pierschbacher M.D.，Science，238491-497(1987))。因此，含有所述序列的蛋白質(zhì)競爭性地抑制了纖維蛋白原與GP IIb/IIIa受體的結(jié)合，導(dǎo)致血小板凝集抑制。首先從蛇毒液中分離出的IIb/IIIa受體抑制劑是5kD到9kD的小蛋白(參見Huang，T.F.等，J.Biol.Chem.，26216157-16163(1987))。其次各種血小板凝集抑制劑從蛇毒液中分離出來，其中包括大分子拮抗劑。這些抑制劑富含半胱氨酸，通常通過與精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(RGD)氨基酸序列相互作用結(jié)合在GP IIb/IIIa受體上。此外，蝮蛇毒素(Kistrin)(參見Alder，M.等，Science，253445-448(1991)；Alder，M.等，Biochemistry，32282-289(1993))、Flavoridine(參見Klaus，W.等，J.Mol.Biol.，232897-906(1993)；Senn，H.和Klaus，W.，J.Mol.Biol.，232907-925(1993))、Albolabrin(參見Jaseja，M.等，Eur.J.Biochem.，218853-860(1993))和鋸鱗蝮蝰血抑環(huán)肽(參見Chen，Y.等，Biochemistry，3011625-11636(1991)；Cooke，R.M.等，Eur.J.Biochem.，202323-328(1991)；Cooke，R.M.等，Protein Eng.，5473-477(1992)；Saudek，V.等，Biochemistry，307369-7372(1991)；Dalvit，C.等，Eur.J.Biochem.，202315-321(1991))的結(jié)構(gòu)已由核磁共振(NMR)光譜鑒定。并且這些拮抗劑抑制纖維蛋白原與GP IIb/IIIa受體的結(jié)合采用動(dòng)物模型得到證實(shí)(參見Collen，B.S.，J.Clin.Invest.，76101-108(1985)；Gold，H.K.等，Circulation，77670-677(1988)；Yasuda，T.等，J.Clin.Invest.，811284-1291(1988)；Coller，B.S.等，Blood，68783-786(1986)；Hanson，S.R.等，J.Clin.Invest.，81149-158(1988))。
有關(guān)該點(diǎn)，已經(jīng)對(duì)蝮蛇Agkistrodon halys brevicaudus或Caliginosus的毒液進(jìn)行了深入的研究。衍生自蝮蛇Agkistrodon halys brevicaudus毒液的Salmosin是一個(gè)約7.5KD的蛋白，已建議作為有效的血小板凝集抑制劑(參見韓國專利號(hào)142606)。然而由于與其它蛇比較黑眉蝮蛇很稀少，所以對(duì)其毒液了解不多。黑眉蝮蛇毒液有效的毒性和高的致死率可能和出血密切相關(guān)，基于上述假設(shè)獲得了本發(fā)明。
因此本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供衍生自韓國蛇黑眉蝮蛇毒液的黑眉素。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼黑眉素的cDNA。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供從cDNA推導(dǎo)出的黑眉素的氨基酸序列。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供重組表達(dá)載體，其在酵母細(xì)胞中生產(chǎn)黑眉素。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組微生物。
本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供從轉(zhuǎn)化的微生物中制備重組黑眉素的方法。
本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供包含黑眉素的抗血小板凝集劑。
本發(fā)明的第八個(gè)目的是提供包含黑眉素的抗腫瘤劑。
圖2是重組黑眉素表達(dá)載體pPSAX的基因圖譜。
圖3表示與Salmosin比較重組黑眉素對(duì)HUVEC生長的作用。
圖4a表示抗-αVβ3單克隆抗體、GRGDSP、GRGETP和重組黑眉素對(duì)玻連蛋白與HUVEC結(jié)合的影響。
圖4b表示抗-αVβ3單克隆抗體、GRGDSP、GRGETP和重組黑眉素對(duì)黑眉素與HUVEC結(jié)合的影響。
圖5a表示bFGF刺激的CAM(小雞尿囊絨膜)血管發(fā)生。
圖5b表示重組黑眉素對(duì)CAM血管發(fā)生的影響。
圖6a表示沒有路易斯肺癌細(xì)胞的正常肺組織。
圖6b表示用路易斯肺癌細(xì)胞注射的肺組織和用PBS處理的對(duì)照肺組織。
圖6c表示用路易斯肺癌細(xì)胞注射的肺組織和用重組黑眉素處理的肺組織。
發(fā)明詳述本發(fā)明人從韓國蛇黑眉蝮蛇毒液中分離出黑眉素，并克隆出編碼黑眉素的cDNA、包含該cDNA的重組表達(dá)載體以及用該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組微生物，并通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)重組黑眉素。
從黑眉蝮蛇分離黑眉素的方法以及用于制備重組黑眉素的方法以下文更詳細(xì)說明。
收集黑眉蝮蛇毒液并采用凝膠過濾柱和反相HPLC純化從而獲得具有血小板凝集抑制活性的蛋白。該蛋白氨基酸序列的測定揭示出這是個(gè)新型蛋白并命名為黑眉素。本發(fā)明人從衍生自黑眉蝮蛇毒液的cDNA文庫中克隆了編碼黑眉素的cDNA。該黑眉素cDNA設(shè)計(jì)為含有Xho I限制性位點(diǎn)和在N端區(qū)域蛋白酶KEX2識(shí)別位點(diǎn)，并在表達(dá)載體pPIC9(8.0kb)α-因子分泌信號(hào)蛋白的C末端區(qū)域引入EcoR I/XhoI位點(diǎn)。編碼黑眉素的該表達(dá)載體命名為pPSAX。該表達(dá)載體可轉(zhuǎn)化到畢赤屬(Pichia sp.)、漢遜屬(Hansenula sp.)和酵母屬(Saccharomycessp.)的酵母細(xì)胞中，優(yōu)選畢赤屬如巴斯德畢赤酵母GS115、SMD 1168和KM71。
將構(gòu)建的pPSAX轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母GS115，并將轉(zhuǎn)化細(xì)胞命名為“巴斯德畢赤酵母Y/pPSAX(Pichia pastoris Y/pPSAX)”，于2000年7月21日存放在國際保藏機(jī)構(gòu)韓國微生物保藏中心(KCCM，Hongje-1-dong 361-221，Seodaemun-gu，Seoul，Korea)，保藏號(hào)為KCCM-10201。
重組黑眉素的制備方法包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物以獲得重組黑眉素步驟將轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種到甘油基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至1.0 OD600單位，離心收集并懸浮在甲醇基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)料分批培養(yǎng)。甘油基礎(chǔ)培養(yǎng)基(pH 6.0)含有0.5-1.5％的酵母提取物或蛋白胨作氮源、0.5-2.5％的甘油、右旋糖或葡萄糖作碳源以及微量生物素。甲醇基礎(chǔ)培養(yǎng)基為甘油基礎(chǔ)培養(yǎng)基和0.1-1.0％(v/v)，優(yōu)選0.3-0.8％(v/v)，更優(yōu)選0.5％(v/v)的甲醇作碳源。細(xì)胞在甘油基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過程中，溫度條件為25-35℃，優(yōu)選28-32℃，更優(yōu)選30℃，連續(xù)培養(yǎng)12-24小時(shí)，優(yōu)選培養(yǎng)16-20小時(shí)，更優(yōu)選18小時(shí)。細(xì)胞在甲醇基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過程中，溫度條件為25-35℃，優(yōu)選28-32℃，更優(yōu)選30℃，連續(xù)培養(yǎng)72-120小時(shí)，優(yōu)選培養(yǎng)84-108小時(shí)，更優(yōu)選96小時(shí)。
對(duì)于重組黑眉素的純化，從細(xì)胞肉湯通過離心獲得的上清液施加到疏水柱和HPLC上，這里疏水柱裝填苯基瓊脂糖樹脂并優(yōu)選用0.5-2M的硫酸銨溶液洗脫，而HPLC采用Source 30 RPC柱并優(yōu)選用0.01-0.2％(v/v)TFA的乙腈溶液洗脫。
將重組黑眉素的血小板凝集抑制活性與已知的血小板凝集抑制劑重組Salmosin比較。結(jié)果顯示重組黑眉素對(duì)血小板凝集的抑制活性與重組Salmosin相似。此外，在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的情況下，黑眉素的表達(dá)效率優(yōu)于Salmosin。將重組黑眉素的氨基酸序列與Salmosin比較，可確認(rèn)兩個(gè)蛋白第49位氨基酸的差異帶來了兩個(gè)蛋白不同的表達(dá)方式和效率。由于重組Salmosin第48位和第49位含有精氨酸，其容易受到酵母中存在的信號(hào)肽酶的破壞，該酶識(shí)別賴氨酸和精氨酸氨基酸序列，而重組黑眉素第49位為甲硫氨酸則很少受到同種酶的攻擊。因此，可以理解重組黑眉素中的第49位氨基酸在提高表達(dá)效率和穩(wěn)定性方面發(fā)揮了重要作用。
為了研究黑眉素是否抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，黑眉素對(duì)血管發(fā)生的作用由HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)分析和CAM(小雞尿囊絨膜)分析測定，其已發(fā)展成用于研究血管發(fā)生的模型系統(tǒng)。結(jié)果顯示黑眉素抑制由腫瘤誘導(dǎo)的血管發(fā)生。黑眉素抑制HUMEC增生是由于黑眉素與玻連蛋白受體的直接作用，玻連蛋白受體是位于HUVEC表面上的αVβ3整聯(lián)蛋白。已知解聯(lián)蛋白預(yù)防腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合，導(dǎo)致抑制轉(zhuǎn)移腫瘤形成集落。但對(duì)是否抑制已經(jīng)侵入的轉(zhuǎn)移腫瘤生長知之甚少。在這方面，對(duì)于黑眉素對(duì)轉(zhuǎn)移腫瘤生長的作用進(jìn)行了研究，揭示出黑眉素有效抑制轉(zhuǎn)移腫瘤生長而沒有細(xì)胞毒性。
本發(fā)明以下列實(shí)施例進(jìn)一步說明，這些實(shí)施例不應(yīng)看作是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1黑眉素的純化為從黑眉蝮蛇的毒液中分離出黑眉素，302.4mg的粗制蛇毒液加到已用PBS緩沖液平衡過的葡聚糖G-75凝膠過濾柱(1.8×100cm)上，以流速20ml/小時(shí)分級(jí)分離。黑眉素的活性由血小板凝集抑制分析測定將從400ml人血中獲得的富含血小板的濃血漿(PRP)稀釋到濃度為300,000個(gè)血小板/μl。將稀釋的PRP(450μl)和50μl的PBS混合然后在凝集器(aggregometer)(Chromo-Log，美國)中37℃培養(yǎng)3分鐘。將膠原質(zhì)(2nM)加入到PRP溶液中誘導(dǎo)血小板凝集，然后測定光透射的差異。
活性級(jí)分顯示對(duì)血小板凝集具有抑制作用，含有在Native-PAGE膠中分子量范圍從7kD到10kD的蛋白質(zhì)。將活性級(jí)分集中加入到用含0.1％(v/v)TFA的蒸餾水平衡過的反相HPLC(C18)柱(7.8×300mm)中，用含0.1％(v/v)TFA的5-45％乙腈線性梯度洗脫。黑眉素在21％乙腈點(diǎn)洗脫下來，純化產(chǎn)率為0.2％。實(shí)施例2黑眉素的氨基酸序列分析為分析黑眉素的氨基酸序列，純化的黑眉素在SDS-PAGE凝膠上還原條件下電泳并電印跡到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Biorad，美國)上。黑眉素N端氨基酸序列由全自動(dòng)蛋白序列分析儀測定為GEECDCGAPANP(SEQ ID NO9)。實(shí)施例3質(zhì)譜儀測定黑眉素的分子量采用質(zhì)譜儀(Kratos Kompact Mold II，Kratos Analytical，Manchester，英國)測定黑眉素的分子量有三種形式7444、7515和7647 Da，這歸因于三種同種型，除‘GEE’外，還存在含有N端序列‘EAGEE’和‘AGEE’的同種型。實(shí)施例4編碼黑眉素的DNA序列測定為克隆黑眉素cDNA，mRNA使用寡脫氧胸苷酸纖維素從黑眉蝮蛇毒腺中抽提出來。應(yīng)用從毒腺中獲得的mRNA作模板以及寡脫氧胸苷酸引物和反轉(zhuǎn)錄酶構(gòu)建cDNA文庫。然后5′引物設(shè)計(jì)演繹自N端序列，其為5′-GGNGARGARTGYGAYTGYGG-3′(SEQ ID NO3)引物1。3′引物設(shè)計(jì)演繹自C端序列，在亞克隆過程中測定，其為5′-GGCATGGAAGGGATTTCTGG-3′(SEQ ID NO4)引物2。使用5′引物、3′引物和合成的毒腺cDNA文庫作模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。220bp的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上分離出來，并亞克隆到pGEM-T載體(Promega，美國)中用于分析編碼黑眉素的DNA序列(SEQ ID NO2)。黑眉素的總氨基酸序列演繹自克隆的cDNA序列(SEQ ID NO1)。實(shí)施例5黑眉素的抑制作用與具有血小板凝集抑制活性的已知肽比較為了將黑眉素的抑制作用與其它具有血小板凝集抑制活性的已知肽進(jìn)行比較，如Salmosin(參見韓國專利號(hào)142606，SEQ ID NO10)和GRGDSP(SEQ ID NO7)，血小板凝集抑制分析按下列進(jìn)行將225μl富含人血小板的血漿(300,000個(gè)血小板/升)與25μl PBS中血小板凝集抑制肽溶液混合，然后在凝集器(Chromo-Log，美國)中25℃培養(yǎng)5分鐘。將ADP加入到每個(gè)PRP溶液中誘導(dǎo)血小板凝集，分別測定濁度(參見

圖1)。圖1中，(●)代表黑眉素血小板凝集抑制的程度；(○)代表Salmosin(SEQ ID NO10)血小板凝集抑制的程度；以及(■)代表GRGDSP(SEQ ID NO7)血小板凝集抑制的程度。如圖1所示，黑眉素IC50值為179nM，而對(duì)比Salmosin為173nM，黑眉素抑制效果比GRGDSP肽強(qiáng)1000倍。實(shí)施例6黑眉素DNA的克隆使用實(shí)施例4制備的含有黑眉素cDNA的質(zhì)粒為模板以及下列兩個(gè)引物進(jìn)行PCR(RobocyclerTM，Stratagene，美國)N端引物，含有Xho I限制位點(diǎn)和蛋白酶KEX2識(shí)別位點(diǎn)，5′-CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCCGGAGAAGAATGT-3′(SEQ IDNO5)。
C端引物，含有EcoR I限制位點(diǎn)和兩個(gè)終止密碼子，5′-CGGAATTCTCATTAGGCATGGAAGGGA-3′(SEQ ID NO6)。
PCR進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)分別是94℃、1分鐘(變性)，55℃、1分鐘(退火)以及72℃、1分鐘(聚合)。PCR產(chǎn)物大約250bp的DNA片段通過與T4 DNA連接酶克隆到pBluescriptKS(2.9kb，Stratagene，美國)中構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化E.coli XL-1Blue。轉(zhuǎn)化的E.coli在含有100μg/ml的氨芐青霉素的LB(LuriaBotani)平板上培養(yǎng)并挑選出白色菌落。從白色菌落中抽提的質(zhì)粒使用限制性酶切圖譜分析和DNA序列分析(ALF system，AmershamPharmacia Biotech，美國)進(jìn)行研究，并因此證實(shí)通過PCR產(chǎn)生的250bp的DNA片段是黑眉素cDNA。將質(zhì)粒EcoR I/Xho I片段克隆到表達(dá)載體pPIC9(8.0kb)的α-因子分泌信號(hào)蛋白的C端區(qū)域，生成包含編碼黑眉素cDNA的表達(dá)載體pPSAX(8.3kb)(參見圖2)。
pPSAX以SalI消化產(chǎn)生線性DNA片段并溶解在TE緩沖液中，濃度為0.5μg/μl，然后與80μl的巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen，美國)混合，采用電穿孔器(Bio-Rad Gene Pulser，美國)和1.5kV條件，以進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂抹在缺乏組氨酸的瓊脂板上30℃培養(yǎng)3天。將挑選的菌落接種到1升甘油基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(100mM磷酸鈉pH 6.0、酵母氮源1.34％、生物素4×105％、甘油1％)，30℃培養(yǎng)直至OD600達(dá)到1.0水平。在培養(yǎng)結(jié)束后，3000×g離心收集細(xì)胞，并重懸浮于甲醇基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(含有100mM磷酸鈉pH6.0、酵母氮源1.34％、生物素4×10-5％、甲醇0.5％)。將這些細(xì)胞置于30℃生長并誘導(dǎo)表達(dá)重組黑眉素。間隔24小時(shí)加入0.5％甲醇進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞96小時(shí)，并證實(shí)培養(yǎng)期間培養(yǎng)基中有黑眉素積累。含有黑眉素表達(dá)載體pPSAX的轉(zhuǎn)化細(xì)胞命名“巴斯德畢赤酵母Y/pPSAX(Pichia pastoris Y/pPSAX)”，于2000年7月21日存放在國際保藏機(jī)構(gòu)韓國微生物保藏中心(KCCM，Hongje-1-dong 361-221，Seodaemun-gu，Seoul，Korea)，保藏號(hào)為KCCM-10201。
對(duì)于黑眉素的純化，將從細(xì)胞肉湯中通過5000×g離心獲得的上清液加到經(jīng)1.5M硫酸銨溶液平衡過的1.3×20cm苯基瓊脂糖柱(Bio-Rad，美國)上，用1M硫酸銨溶液流速20ml/小時(shí)洗脫，獲得黑眉素的活性級(jí)分。黑眉素活性的測定以實(shí)施例1中相似的方式進(jìn)行。將活性級(jí)分鋪裝到經(jīng)含0.1％(v/v)TFA的蒸餾水平衡的HPLC柱(source30 RPC柱，7.8×300mm)中，并用0-50％(v/v)乙腈以線性梯度洗脫，產(chǎn)生純黑眉素，純化產(chǎn)率為107mg/L。實(shí)施例7重組黑眉素抑制血小板凝集實(shí)施例6獲得的重組黑眉素的分析采用實(shí)施例1所描述的血小板凝集抑制方法，并分別與實(shí)施例1中獲得的野生型黑眉素和GRGDSP(SEQ ID NO7)進(jìn)行比較(參見表1)。
如下表1所顯示，重組黑眉素表現(xiàn)了與野生型黑眉素相當(dāng)?shù)难“迥种苹钚浴?br> 表1由血小板凝集抑制分析測定的IC50
實(shí)施例8黑眉素抗血小板凝集活性當(dāng)膠原質(zhì)和腎上腺素的混合物靜脈內(nèi)注射給小鼠時(shí)，肺動(dòng)脈中形成血栓，這導(dǎo)致偏癱、瞳孔擴(kuò)大、呼吸困難和驚厥，并最終70％的小鼠不超過5分鐘死亡。因此，研究了靜脈內(nèi)注射重組黑眉素是否能降低血栓癥癥狀。
在黑眉素(按0、0.1、0.25和0.5mg/kg分別溶解在0.1ml的PBS中)靜脈內(nèi)注射給ICR小鼠的尾巴中10分鐘后，膠原質(zhì)和腎上腺素的混合物(120μg膠原質(zhì)和12μg腎上腺素溶解在0.1ml的PBS中)也靜脈內(nèi)注射到ICR小鼠的尾巴中，并測定存活率(參見表2)。
表2 如表2所示，基于黑眉素處理導(dǎo)致存活率增加的結(jié)果，推定黑眉素抑制了由膠原質(zhì)和腎上腺素誘導(dǎo)的凝結(jié)，處理前比處理后具有更有效的抑制活性。實(shí)施例9重組黑眉素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的作用已知當(dāng)解聯(lián)蛋白含有RGD序列，RGD序列是重組黑眉素的一部分(氨基酸序列49-51)，可抑制bFGF刺激的內(nèi)皮細(xì)胞生長。為研究含有RGD序列的重組黑眉素是否抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生，采用HUVEC進(jìn)行增生抑制分析。黑眉素的活性與Salmosin(SEQ ID NO10)進(jìn)行比較，Salmosin已知抑制bFGF刺激的內(nèi)皮細(xì)胞增生。
將HUVEC在用明膠包被的24孔微量培養(yǎng)板中5％的CO2環(huán)境下37℃培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)基用0.25ml含有5％胎牛血清的DMEM替換后，分別以濃度0、20和30μg/ml加入實(shí)施例6獲得的重組黑眉素和Salmosin。然后，細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)20分鐘并用1ng/ml的bFGF溶液處理。培養(yǎng)72小時(shí)后，細(xì)胞用胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)測定細(xì)胞存活率(參見圖3)。如圖3所示，黑眉素以與Salmosin相似的劑量依賴方式抑制HUVEC生長。實(shí)施例10黑眉素抑制HUVEC粘著為證實(shí)黑眉素抑制HUVEC增生是由于黑眉素與玻連蛋白受體的直接作用，玻連蛋白受體為αVβ3整聯(lián)蛋白，位于HUVEC表面上，研究黑眉素是否阻止HUVEC與玻連蛋白包被的96孔板結(jié)合。
96孔板用溶解在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中的從實(shí)施例6獲得的重組黑眉素(1μg/孔)以及玻連蛋白(0.5μg/孔)4℃包被16小時(shí)。洗滌板后，加入10mg/ml熱處理的牛血清白蛋白(BSA)封閉未負(fù)載的蛋白結(jié)合位點(diǎn)。將板培養(yǎng)1小時(shí)并用PBS洗滌。HUVEC用胰蛋白酶消化并用PBS洗三次，然后重懸浮在無血清的DMEM中。將5×104個(gè)細(xì)胞與抗αVβ3單克隆抗體、合成的RGD肽GRGDSP(SEQ IDNO7)、合成的RGE肽GRGETP(SEQ ID NO8)和黑眉素混合，37℃預(yù)培養(yǎng)20分鐘。然后將混合物加入到黑眉素和玻連蛋白包被的96孔板的孔中。5％CO2環(huán)境下37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，用PBS洗滌板去除未結(jié)合的細(xì)胞，并將結(jié)合細(xì)胞固定再用考馬絲藍(lán)染色。在540nm處測定孔的吸光度從而計(jì)算相對(duì)細(xì)胞數(shù)(參見圖4a和4b)。
如圖4a和4b所示，bFGF刺激的HUVEC和GRGDSP(SEQ IDNO7)、黑眉素和抗αVβ3單克隆抗體的預(yù)培養(yǎng)可防止HUVEC同玻連蛋白(參見圖4a)和黑眉素(參見圖4b)的粘著，這表明黑眉素通過與HUVEC表面上的αVβ3整聯(lián)蛋白結(jié)合抑制了整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘著。實(shí)施例11小雞尿囊絨膜(CAM)分析黑眉素對(duì)血管發(fā)生的影響進(jìn)行體內(nèi)模擬模型小雞尿囊絨膜(CAM)分析，以測定黑眉素對(duì)bFGF刺激的血管發(fā)生的影響。小心打碎受精3天的雞蛋外殼部分，并用透明帶密封，在60％濕度環(huán)境下37℃培養(yǎng)10天。然后將bFGF應(yīng)用到單個(gè)胚胎(6ng/胚胎)的小雞尿囊絨膜(CAM)中誘導(dǎo)血管發(fā)生。進(jìn)一步培養(yǎng)24小時(shí)，PBS作為陰性對(duì)照和從實(shí)施例6中獲得的5μg重組黑眉素分別應(yīng)用到CAM中。處理后72小時(shí)，觀察胚胎血管(參見圖5a和圖5b)。如圖5a和5b所示，PBS未顯示效果(參見圖5a)，而黑眉素對(duì)血管發(fā)生具有抑制作用(參見圖5b)。實(shí)施例12黑眉素對(duì)轉(zhuǎn)移瘤生長的抑制作用解聯(lián)蛋白通過阻止腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘著抑制肺腫瘤群落的形成。然而，從沒有報(bào)道解聯(lián)蛋白抑制轉(zhuǎn)移瘤的啟動(dòng)。因此研究了黑眉素是否對(duì)轉(zhuǎn)移瘤生長有效果。
1×106個(gè)路易斯肺癌細(xì)胞(購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC，Rockville，Md，美國)靜脈內(nèi)注射8周齡的雄性C57BL/6小鼠(Charlesriver，Japan)的尾巴中。注射后4天，將從實(shí)施例6獲得的重組黑眉素以1.25mg/kg/天的量(每天一次)通過靜脈內(nèi)注射周期性地施用給小鼠。經(jīng)過4周的周期性治療后，將攜帶腫瘤的小鼠處死，使用立體顯微鏡給腫瘤群落計(jì)數(shù)。結(jié)果清楚地表明黑眉素有效地抑制了轉(zhuǎn)移瘤生長(參見表3)。
表3黑眉素抑制轉(zhuǎn)移路易斯肺癌生長
黑眉素抑制轉(zhuǎn)移瘤生長歸因于黑眉素的的抗血管發(fā)生效果，通過阻斷對(duì)血管發(fā)生必要的αVβ3整聯(lián)蛋白功用，其有效地抑制bFGF刺激的BCE細(xì)胞增生。此外，黑眉素對(duì)測試小鼠未顯示毒性。
此外，為觀察黑眉素對(duì)轉(zhuǎn)移肺癌的直接作用，進(jìn)行了組織化學(xué)的研究。將攜帶腫瘤的肺組織依據(jù)常規(guī)已知的方法固定在石蠟上，接著用布安氏溶液處理4小時(shí)。4μm厚的組織切片以胰蛋白酶37℃滲透10分鐘，然后用PBS洗滌。組織切片用蘇木精和曙紅染色，然后封固(參見圖6a、6b和6c)。圖6a表示沒有路易斯肺癌細(xì)胞的肺組織；圖6b表示將路易斯肺癌細(xì)胞植入的肺組織然后用PBS處理；和圖6c表示將路易斯肺癌細(xì)胞植入的肺組織然后用黑眉素處理。如圖6b和6c顯示，在用PBS處理的對(duì)照組中觀察到明顯的轉(zhuǎn)移瘤生長(參見圖6b)，而在施用黑眉素的組中未觀察到(參見圖6c)。如上所說明，認(rèn)定黑眉素處理的小鼠中轉(zhuǎn)移瘤生長的抑制是由于黑眉素阻斷了血管發(fā)生，而血管發(fā)生對(duì)繼發(fā)性腫瘤生長是必要的。給藥和有效量本發(fā)明的藥物組合物包含黑眉素的活性成分和可藥用載體，可以注射形式給藥。該注射形式可進(jìn)一步包含滅菌的等滲水溶液或懸浮液，以及可藥用載體涵蓋防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、用于改變滲透壓的鹽或緩沖液。盡管黑眉素的有效量依賴病人的年齡和體重以及病情進(jìn)展是可變的，但用于治療血栓癥時(shí)腸胃外給藥每劑量優(yōu)選20-52mg/60kg/天，而用于治療癌癥時(shí)每劑量為30-120mg/60kg/天，其可根據(jù)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)因人而異。急性毒性為測定黑眉素作為抗血小板凝集劑和抗腫瘤劑的急性毒性，將黑眉素皮下注射到雄性C57BL/6小鼠中，連續(xù)7天對(duì)死小鼠計(jì)數(shù)以測定LD50。結(jié)果LD50測定為約1100mg/kg，顯示包含黑眉素的抗血小板凝集劑和抗腫瘤劑在有效量的范圍內(nèi)是足夠安全的。
如上清晰地說明和顯示，本發(fā)明提供了黑眉素，為一種衍生自韓國蛇黑眉蝮蛇毒液的蛋白質(zhì)，還提供了制備黑眉素的方法以及包含黑眉素活性成分的抗血小板凝集劑和抗腫瘤劑。本發(fā)明從黑眉蝮蛇的毒液中純化了黑眉素，克隆了編碼黑眉素的cDNA，構(gòu)建了包含cDNA的重組表達(dá)載體以及構(gòu)建了用表達(dá)黑眉素的該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組微生物，和通過培養(yǎng)重組微生物制備了黑眉素。
黑眉素有效抑制了腫瘤細(xì)胞的血小板凝集和血管發(fā)生，這使得其實(shí)際應(yīng)用為抗血小板劑和抗腫瘤劑成為可能。
盡管本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案為說明目的已經(jīng)公開，但那些本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員將理解各種修飾、添加和替代都是可能的，而不會(huì)背離如權(quán)利要求書所描述的本發(fā)明的范圍和精神。
有關(guān)保藏的微生物或其它生物材料的說明(PCT細(xì)則13之二)
表PCT/RO/134(1998年7月)
序列表<110>Kwang-Hoe CHUNG(中文待定)Doo-Sik KIM(中文待定)<120>衍生自黑眉蝮蛇的新型蛋白以及制備該蛋白的方法(Novel Protein Derived from Agkistrodon saxatilis emelianov and Process for Preparing the Same)<160>10<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>71<212>PRT<213>黑眉蝮蛇(Agkistrodon saxatilis emelianov)<400>1Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ala Pro Ala Asn Pro Cys Cys1 510 15Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly20 25 30Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Glu Gly Thr Ile Cys Arg35 40 45Met Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala5055 60Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala6570<210>2<211>213<212>DNA<213>黑眉蝮蛇(Agkistrodon saxatilis emelianov)<400>2ggagaagaat gtgactgtgg cgctcctgca aatccgtgct gcgatgctgc aacctgtaaa 60ctgagaccag gggcgcagtg tgcagaagga ctgtgttgtg accagtgcag atttatgaaa 120gaaggaacaa tatgccggat ggcaaggggt gatgacatgg atgattactg caatggcata 180tctgctggct gtcccagaaa tcccttccat gcc 213<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3ggngargart gygaytgygg 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4ggcatggaag ggatttctgg 20<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5ccgctcgaga aaagagaggc cggagaagaa tgt 33<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6cggaattctc attaggcatg gaaggga 27<210>7<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>寡肽<400>7Gly Arg Gly Asp Ser Pro1 5<210>8<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>寡肽<400>8Gly Arg Gly Glu Thr Pro1 5<210>9<211>12<212>PRT<213>黑眉蝮蛇(Agkistrodon saxatilis emelianov)<400>9Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ala Pro Ala Asn Pro1 5 10<210>10<211>73<212>PRT<213>Agkistrodon halys brevicaudus<400>10Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Cys Cys1 510 15Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Gln Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly20 25 30Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Glu Gly Thr Ile Cys Arg35 40 45Arg Ala Arg Gly Asp Asp Leu Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala5055 60Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala6570
權(quán)利要求
1.如SEQ ID NO2的核苷酸序列所示的cDNA，其編碼黑眉素，一種衍生自黑眉蝮蛇毒液的蛋白。
2.如SEQ ID NO1的氨基酸序列所示的黑眉素，其衍生自權(quán)利要求1的cDNA。
3.一種制備黑眉素的方法，其包括下列步驟(i)凝膠過濾從黑眉蝮蛇收集到的毒液以獲得活性級(jí)分；和，(ii)將活性級(jí)分應(yīng)用到高效液相色譜以純化黑眉素。
4.一種表達(dá)載體pPSAX，其含有權(quán)利要求1的cDNA。
5.一種巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoria)Y/pPSAX(KCCM-10201)的生物純培養(yǎng)物，其由將權(quán)利要求4的表達(dá)載體pPSAX轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母GS115中獲得。
6.一種制備重組黑眉素的方法，其包括培養(yǎng)微生物以獲得重組黑眉素的步驟，所述微生物是經(jīng)含有權(quán)利要求1的cDNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物。
7.權(quán)利要求6的制備重組黑眉素的方法，其中表達(dá)載體是pPSAX。
8.權(quán)利要求6的制備重組黑眉素的方法，其中轉(zhuǎn)化的微生物是巴斯德畢赤酵母Y/pPSAX(KCCM-10201)。
9.權(quán)利要求8的制備重組黑眉素的方法，其中轉(zhuǎn)化的微生物在pH5.5-6.5、25-35℃條件下培養(yǎng)12-24小時(shí)，離心收集并再次在含有0.5-1.5％(v/v)甲醇的培養(yǎng)基上在pH5.5-6.5、25-35℃條件下培養(yǎng)72-120小時(shí)。
10.權(quán)利要求8的制備重組黑眉素的方法，其中對(duì)含有經(jīng)轉(zhuǎn)化微生物的培養(yǎng)物進(jìn)行疏水柱和高效液相層析以純化黑眉素。
11.抗血小板劑，其包含黑眉素活性成分和可藥用載體。
12.抗腫瘤劑，其包含黑眉素活性成分和可藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及黑眉素,其為一種衍生自韓國蛇黑眉蝮蛇毒液的蛋白質(zhì),還涉及制備黑眉素的方法以及黑眉素作為抗血小板凝集劑和抗腫瘤劑的藥物應(yīng)用。本發(fā)明從黑眉蝮蛇的毒液中純化了黑眉素,克隆了其cDNA,用含有所述cDNA的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化微生物,通過培養(yǎng)該微生物制備了重組黑眉素。黑眉素有效抑制了腫瘤細(xì)胞的血小板凝集和血管發(fā)生,這使得其實(shí)際應(yīng)用為抗血小板劑和抗腫瘤劑的活性成分成為可能。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1382214SQ00813366
公開日2002年11月27日 申請(qǐng)日期2000年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月26日
發(fā)明者鄭光會(huì), 金斗植, 洪性洧, 高裕錫, 孫英德, 劉原圭, 張良洙, 許鎮(zhèn)圭 申請(qǐng)人:鄭光會(huì), 金斗植