專利名稱：新的癌基因、從其衍生的重組蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的來自人的癌基因，該癌基因參與了人宮頸癌 的發(fā)生，以及從該癌基因衍生的重組蛋白及其在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的用途。
背景技術(shù)：
已有許多文獻(xiàn)報(bào)道了染色體的不穩(wěn)定性與癌癥的發(fā)生相關(guān)。此外， 最近已經(jīng)報(bào)道，在控制細(xì)胞周期中G2/M期檢查點(diǎn)的分子的缺陷導(dǎo)致了 染色體的不穩(wěn)定。然而，因?yàn)樵谠S多癌細(xì)胞中，在細(xì)胞中控制檢査點(diǎn) 的分子的基因缺陷并不能被經(jīng)常地觀察到，因此誘導(dǎo)染色體不穩(wěn)定的 機(jī)理從許多方面來說尚不清楚，所述染色體不穩(wěn)定性與癌癥的發(fā)生有 著至關(guān)重要的關(guān)系。
宮頸癌的發(fā)生中包括了人乳頭瘤病毒(HPV)如HPV-16或HPV-18
型的感染，這一點(diǎn)已經(jīng)廣為人知。在宮頸癌組織中，已經(jīng)觀察到的HPV 感染的頻率在90%或者以上。在由HPV感染誘導(dǎo)的宮頸癌的發(fā)生機(jī)理 中，病毒的E6和E7基因產(chǎn)物扮演了重要的角色。具體來說，已經(jīng)知 道E6加速了 p53腫瘤抑制蛋白降解的過程，而E7阻斷了 Rb基因的產(chǎn) 物pRB(成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)腫瘤抑制蛋白的抑癌活性，這兩個(gè)步驟造成了 腫瘤發(fā)生。但是，被HPV感染激活的特異性的致癌蛋白還未被鑒別。 尤其是E6和E7， HPV的病毒基因產(chǎn)物，誘導(dǎo)了染色體的不穩(wěn)定性并 使細(xì)胞癌變(Carcedze),但是與其直接相關(guān)的機(jī)理的詳細(xì)情況在許多方 面還基本上是未知的。因此，為了能夠治療宮頸癌，鑒別出作為HPV的耙的致癌蛋白及編碼它的癌基因是非常重要的。宮頸癌是從癌前期 狀態(tài)，即發(fā)育異常(宮頸鱗狀上皮細(xì)胞的發(fā)育異常)發(fā)展為侵入性的癌 癥。在某些情況下，疾病可以保持在發(fā)育異常階段而不發(fā)展為癌癥。 在另一方面，也有相當(dāng)多情況下，發(fā)育異常可以很快地發(fā)展為晚期癌 癥。鑒于這樣的情況，進(jìn)行更精確的癌癥診斷以鑒別與宮頸癌發(fā)生直 接相關(guān)的分子，可能是非常重要的。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，在HPV感染宮頸上皮細(xì)胞、經(jīng)過一種癌前期狀態(tài)、即 發(fā)育異常誘導(dǎo)侵入性癌癥發(fā)生的過程中，其直接的起源應(yīng)該被認(rèn)為是
這樣一種機(jī)制，即抑制一些癌基因的表達(dá)的p53腫瘤抑制蛋白或pBR 腫瘤抑制蛋白的表達(dá)抑制活性被破壞了，并且這種破壞導(dǎo)致癌基因進(jìn) 入了高水平表達(dá)的狀態(tài)。因此，必須首先鑒別癌基因的完整的核苷酸 序列及其編碼的致癌蛋白，這將開辟一條道路，以發(fā)展一些手段，用 于抑制致癌蛋白的生物化學(xué)功能，并且進(jìn)一步用于阻斷由致癌蛋白推 進(jìn)的癌變的機(jī)制。
此外，鑒定癌基因的完整的核苷酸序列及其編碼的致癌蛋白的氨 基酸序列，可以允許我們生產(chǎn)核酸探針以檢測從癌基因轉(zhuǎn)錄的mRNA 的表達(dá)，或者利用其重組致癌蛋白產(chǎn)生針對(duì)致癌蛋白的特異性抗體。 換句話說，它使我們可以開發(fā)出利用核酸探針或特異性抗體的診斷方 法，用于診斷在子宮頸中經(jīng)由HPV感染引起的癌前期狀態(tài)、即發(fā)育異 常發(fā)展到侵入性癌癥的過程中的早期階段。
為了解決上面的問題，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是鑒別一個(gè)來自人類的新 的癌基因的完整核苷酸序列及其編碼的致癌蛋白的氨基酸序列，它們 在例如由HPV感染宮頸上皮細(xì)胞導(dǎo)致的宮頸癌中直接參與了癌變的機(jī) 制，此外本發(fā)明還提供了編碼癌基因蛋白的肽鏈的全長多核苷酸，所 述全長多核苷酸衍生自新的癌基因，可用于重組生產(chǎn)致癌蛋白，并提 供由其重組生產(chǎn)的致癌蛋白的肽鏈。為了解決上面的問題我們進(jìn)行了廣泛的研究，最后發(fā)現(xiàn)并克隆了 一個(gè)基因，它在宮頸癌細(xì)胞中當(dāng)向其中加入環(huán)境激素時(shí)表達(dá)增加。我 們的結(jié)論是，這個(gè)克隆的基因是一個(gè)癌基因，這是因?yàn)?br> (1) 該基因在癌細(xì)胞中高度表達(dá)；
(2) 宮頸癌由HPV感染引起，并且將E6和E7基因從HPV轉(zhuǎn) 導(dǎo)到細(xì)胞中表達(dá)E6和E7蛋白能夠增加所述基因的表達(dá)；
(3) p53蛋白抑制所述基因啟動(dòng)子區(qū)的活性；
(4) p53蛋白的缺失或突變?cè)谑聦?shí)上參與了宮頸癌的發(fā)生；
(5) 所述基因的表達(dá)可以由一個(gè)雙鏈的干擾短鏈RNA(siRNA) 所抑制以阻止腫瘤的生長，并且在經(jīng)過進(jìn)一步的研究后，完成了本發(fā) 明。
因此，根據(jù)本發(fā)明的癌基因多核苷酸是一個(gè)衍生自人的、參與了 宮頸癌發(fā)生的新的癌基因多核苷酸，它包含了編碼氨基酸序列 SEQ.ID.No.l的核苷酸序列。尤其是，它是一個(gè)多核苷酸，其中編碼氨 基酸序列SEQ.ID.No.l的核苷酸序列是SEQ.ID.No.2所示的核苷酸序 列。
本發(fā)明還-提供了在上述根據(jù)的本發(fā)明的癌基因多核苷酸的基礎(chǔ) 上，通過重組生產(chǎn)的肽或其鹽。具體來說，本發(fā)明的重組肽是重組肽 或其鹽，含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l或其部分氨基酸序列。尤其是， 它可以是含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的重組致癌蛋白。本發(fā)明還提供 了一個(gè)重組載體，含有編碼重組肽的多核苷酸，可用于制備該重組肽。 例如，當(dāng)目標(biāo)是含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的本發(fā)明的重組致癌蛋白 時(shí)，所述重組載體就是含有癌基因多核苷酸的重組載體，所述癌基因 多核苷酸含有編碼氨基酸序列SEQ.ID.No.l的核苷酸序列，尤其是含有 一個(gè)多核苷酸，其中編碼氨基酸序列SEQ.ID.No.l的核苷酸序列是 SEQ.ID.No.2。本發(fā)明還提供了使用所述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化細(xì) 胞；例如，使用針對(duì)本發(fā)明的所述重組致癌蛋白的重組載體轉(zhuǎn)化宿主 細(xì)胞而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。因此，生產(chǎn)本發(fā)明的重組肽或其鹽的過程是 一個(gè)生產(chǎn)從本發(fā)明的癌基因衍生出的重組肽或其鹽的的過程，包括下 列步驟
培養(yǎng)上述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞使得轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)本發(fā)明的重組肽；以及
收集從培養(yǎng)物中產(chǎn)生的重組肽。尤其是在優(yōu)選情況下，它可以是 一個(gè)包含下列步驟的生產(chǎn)本發(fā)明的重組致癌蛋白的過程
培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中已經(jīng)轉(zhuǎn)化了全長的基因DNA以使轉(zhuǎn)化細(xì) 胞生產(chǎn)本發(fā)明的重組致癌蛋白；以及
收集從培養(yǎng)物中產(chǎn)生的重組致癌蛋白。
利用上述的本發(fā)明的重組肽，本發(fā)明提供了一個(gè)抗體的發(fā)明，它 是使用重組肽作為免疫原而產(chǎn)生的特異性抗體。例如，本發(fā)明的抗體 可以是一個(gè)對(duì)氨基酸序列SEQ.ID.No.l中623到1185區(qū)域的部分氨基 酸序列表現(xiàn)出特異反應(yīng)性的抗體。
此外，本發(fā)明提供了一個(gè)含有所述特異性抗體的抗體試劑盒以進(jìn) 行抗原-抗體反應(yīng)，用于檢測含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的致癌蛋白 或從致癌蛋白衍生的肽片段。此外，本發(fā)明提供了一個(gè)含有本發(fā)明的 特異性抗體的診斷試劑盒，用于通過抗原抗體反應(yīng)檢測含有氨基酸序 列SEQ.ID.No.l的致癌蛋白或從致癌蛋白衍生的肽片段。
本發(fā)明還提供了一個(gè)反義多核苷酸，含有與核苷酸序列 SEQ.ID.No.2中的部分核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，它是一個(gè)具有至 少一段選自15到300堿基區(qū)域的DNA片段。此外，就根據(jù)本發(fā)明的 探針雜交試劑盒而言，還提供了一個(gè)含有上述反義多核苷酸作為DNA 探針的探針雜交試劑盒，可用于檢測含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2、其 部分核苷酸序列的mRNA或由mRNA制備的cDNA。此外，本發(fā)明還 提供了一個(gè)含有所述反義多核苷酸作為雜交探針的診斷試劑盒，通過探針雜交的方法，用于檢測含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的mRNA的 表達(dá)，該mRNA被翻譯為含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的致癌蛋白。
在另一方面，本發(fā)明還提供了一個(gè)引物對(duì)，用于對(duì)含有核苷酸序 列SEQ.ID.No.2的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物對(duì)由如下核苷酸序列組
成
5' -TTGGATCC ATGAC ATCC AGATTTGGG AA AAC AT AC AGT A GG-3，；和
5 ， -TTG AATTCCTAGC AATGTTCC A AAT ATTC A ATC ACTCT AG A-3'，此外本發(fā)明還提供了一個(gè)引物對(duì)，用于對(duì)含有核苷酸序列 SEQ.ID.No.2的cDNA的部分鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物對(duì)由如下核苷酸 序列組成
5，-GAATTCATAGGCACAGCGCTGAACTGTGTG-3，；和 5 ， -TTGAATTCCTAGC AATGTTCC AAAT ATTC A-3'。
另外，至于雙鏈的短鏈干擾RNA的發(fā)明，本發(fā)明提供了一個(gè)雙鏈 的短鏈干擾RNA，能夠在宮頸癌細(xì)胞中抑制含有核苷酸序列 SEQ.ID.No.2的mRNA的表達(dá)，其中雙鏈的siRNA的核苷酸序列為 CGGACTACCCTTAGCACAA。此外，它還可用于藥物組合物中以在宮 頸癌細(xì)胞中抑制含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的mRNA的表達(dá)，從而 阻止癌細(xì)胞的生長，所述藥物組合物含有本發(fā)明的所述雙鏈的短鏈干 擾RNA。
附圖簡述
圖l顯示了報(bào)道的果蠅dWAPL和本發(fā)明的hWAPL之間的氨基酸 序列的比較。
圖2顯示了本發(fā)明的hWAPL在位于C-末端一側(cè)的623到1185氨 基酸的部分氨基酸序列中與dWAPL—致的或同源的氨基酸的比對(duì)。
圖3顯示了人的WAPL蛋白與小鼠的WAPL蛋白的氨基酸序列之 間的極高的同源性。上排和下排分別是人和小鼠WAPL的序列，白色 和灰色部分分別表示相同和相似的氨基酸。框中的部分是與果蠅WAPL 具有相似性的區(qū)域。
7圖4顯示了使用抗hWAPL-N抗體和抗hWAPL-C抗體對(duì)Saos-2 細(xì)胞(第2、 3道)和NIH3T3細(xì)胞(第1道)的抽提液的Western印跡分析 結(jié)果。
圖5顯示了(A): Northern印跡以評(píng)估hWAPL蛋白在卵巢癌、肺 癌、結(jié)腸癌、子宮體癌和宮頸癌的癌細(xì)胞(T)與相應(yīng)的正常細(xì)胞(N)中相 比的表達(dá)水平；(B):實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果，以證實(shí)hWAPL基因在宮頸癌、
子宮體癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、腎癌、結(jié)腸癌的癌細(xì)胞oo與相應(yīng)
的正常細(xì)胞(N)中相比的表達(dá)；以及(C): RT-PCR檢測在癌細(xì)胞(T)中從 HPV衍生的E6/E7基因的mRNA的表達(dá)結(jié)果。
圖6顯示了(A): Western印跡，以證實(shí)由來自HPV16的E6和E7 重組蛋白誘導(dǎo)的hWAPL蛋白的表達(dá)，以及在HDK1細(xì)胞中p53抑制蛋 白的切割；以及(B): Western印跡，以證實(shí)E6和E7基因轉(zhuǎn)錄的抑制， p53抑制蛋白水平和BPV衍生的E2對(duì)hWAPL蛋白表達(dá)抑制的增加。
圖7顯示了(A):染色體的不穩(wěn)定性和多倍體的增加；以及(B): 在HeLa細(xì)胞中由GFP-hWAPL融合蛋白的過量表達(dá)誘導(dǎo)的微核形成頻 率的增加。
圖8顯示了在HeLa細(xì)胞中染色體的不穩(wěn)定性和由GFP-hWAPL 融合蛋白的過量表達(dá)誘導(dǎo)的多核化頻率的增加。
圖9顯示了 hWAPL蛋白誘導(dǎo)NIH3T3成纖維細(xì)胞的癌變，具體為 (A):在培養(yǎng)HA-hWAPL 3T3細(xì)胞系中轉(zhuǎn)化灶結(jié)構(gòu)的形成；(B):在無 胸腺小鼠注射HA-hWAPL3T3細(xì)胞系的位點(diǎn)腫瘤的形成；(C):在腫瘤 形成區(qū)HA-標(biāo)記的hWAPL蛋白的過量表達(dá)；以及(D):癌變細(xì)胞中的 異型有絲分裂。


圖10顯示了 hWAPL siRNA在來自HPV16陽性宮頸癌的SiHa細(xì) 胞中對(duì)細(xì)胞生長抑制效應(yīng)的評(píng)估結(jié)果，顯示為細(xì)胞數(shù)量(單位為x103， 縱坐標(biāo))對(duì)轉(zhuǎn)化siRNA的時(shí)間(單位為小時(shí)，橫坐標(biāo))的作圖。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方案
下面將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。假定染色體的不穩(wěn)定性在很大程度上參與了宮頸癌細(xì)胞中的癌變 機(jī)制，我們搜索了作為染色體不穩(wěn)定性誘導(dǎo)因素的人源蛋白。我們特 別搜索了在染色體不穩(wěn)定事件中具有很高潛力能夠誘導(dǎo)異倍性或等位 基因形成的蛋白。
我們注意到，在來自動(dòng)物中遺傳基因研究得最深入的果蠅的許多 蛋白中，已報(bào)道dWAPL蛋白在減數(shù)分裂過程的分裂間期中是一個(gè)控制 異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的蛋白。具體來說，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)鞍妆憩F(xiàn)的這種控制 異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能在正常細(xì)胞的有絲分裂過程中表達(dá)時(shí)，偶爾可以
誘導(dǎo)出異倍性或等位基因的形成。我們首先調(diào)查了對(duì)應(yīng)于這種dWAPL 的蛋白是否實(shí)際上編碼在人基因組基因上。基于報(bào)道的dWAPL基因的 核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)No. U40214),我們從GenBank中登記的 作為人源的基因片段的cDNA片段中搜索顯示出顯著同源性的片段， 并且選擇了含有與dWAPL基因相似的核苷酸序列的KIAA0261片段。
為了鑒定含有KIAA0261片段的全長的cDNA，我們?cè)贓ST數(shù)據(jù) 庫中搜索人源的表達(dá)標(biāo)記的核苷酸序列，它可以是一個(gè)含有不翻譯部 分的片段，該不翻譯部分被推測為位于KIAA0261片段5，-側(cè)的上游核 苷酸序列，并且選擇了EST克隆BE410177、 BF9516和BE257022。
我們使用5'-RACE方法參照EST克隆測定了位于KIAA0261片段 5'側(cè)的上游核苷酸序列。此外，因?yàn)楹苡锌赡芘cdWAPL功能相同的蛋 白實(shí)際上是在一個(gè)具有減數(shù)分裂過程的細(xì)胞中表達(dá)，我們使用了一個(gè) 市售的cDNA文庫、即人睪丸cDNA試劑盒(Marathon-ReadyTM cDNA Kit;Clontechlnc.)作為模板，克隆了含有KIAA0261片段的核苷酸序列 和上面測定的位于5'-側(cè)的上游核苷酸序列的全長的cDNA。
實(shí)際的測序表明在克隆的全長cDNA中編碼區(qū)有3570個(gè)堿基對(duì)， 推測對(duì)應(yīng)于一個(gè)具有1190個(gè)氨基酸的氨基酸序列。作為與dWAPL蛋 白同源的人源蛋白，它被稱為"人WAPL (hWAPL)"，相應(yīng)的基因稱為"hWAPL基因"。對(duì)應(yīng)于hWAPL基因中ORF的全長的核苷酸序列 由SEQ.ID.No.2所代表，推測的hWAPL蛋白的氨基酸序列由 SEQ.ID.No.l所代表。將本發(fā)明的hWAPL基因的ORF編碼的氨基酸序 列、即推測的hWAPL蛋白的氨基酸序列與dWAPL蛋白的氨基酸序列 進(jìn)行比較，表明，如圖1所示，在C-末端區(qū)域的623到1185氨基酸的 部分序列中的同一性為35%，同源性為53%。表現(xiàn)出這樣的同一性和 同源性的氨基酸顯示于圖2中。
此外，我們克隆了一個(gè)編碼小鼠源類似物、小鼠WAPL蛋白的 cDNA，假定除人以外的一些哺乳動(dòng)物中也可以含有相應(yīng)的蛋白。在對(duì) 其測序后，將編碼的氨基酸序列進(jìn)行比較。事實(shí)上，證實(shí)了人WAPL 蛋白和小鼠WAPL蛋白彼此之間顯示出非常高的同源性。圖3顯示了 比對(duì)的結(jié)果。我們已經(jīng)對(duì)人WAPL基因的編碼區(qū)的全長的核苷酸序列 進(jìn)行了登記，在DDBJ/EMBL/GenBank中的登錄號(hào)為No. AB065003。
我們對(duì)Saos-2細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞的抽提液進(jìn)行了 Western印跡 分析，使用抗-hWAPL-N抗體和抗-hWAPL-C抗體，它們是對(duì)人WAPL 蛋白的肽鏈特異性的抗體，在實(shí)施例6中有所解釋。如圖4所示，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與抗體反應(yīng)的蛋白帶，分子量為大約140Kda。因此，證 實(shí)了在人源細(xì)胞中人WAPL蛋白實(shí)際上在某種程度上存在。
此外，在下述的各種證實(shí)方法的基礎(chǔ)上
實(shí)施例2:在人癌組織中表達(dá)hWAPL基因；
實(shí)施例3:用源自HPV 16型的E6和E7誘導(dǎo)hWAPL基因的表達(dá)；
實(shí)施例4: p53抑制蛋白抑制hWAPL基因產(chǎn)物的啟動(dòng)子活性；
實(shí)施例7: hWAPL蛋白誘導(dǎo)染色體的不穩(wěn)定性；
實(shí)施例8: hWAPL蛋白誘導(dǎo)NIH3T3成纖維細(xì)胞的癌變，可以得 出結(jié)論，hWAPL基因是一個(gè)癌基因，至少參與了宮頸癌發(fā)生的機(jī)制。
含有hWAPL基因全長cDNA的質(zhì)粒pGEMhWAPL被用來產(chǎn)生含有WAPL基因全長cDNA的轉(zhuǎn)化子；在下述的實(shí)施例1中獲得的大腸 桿菌DH5 pGEMhWAPL菌株，已經(jīng)保存在位于Chuo 6th， 1-1-1， Higashi， Tsukuga， Ibaragi， 305-8566的國立高等工業(yè)科學(xué)和技術(shù)研究所的國際專 利物種貯藏所(國立生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所)，原始保存日期為2003 年1月7日，在布達(dá)佩斯公約之下的國際保藏管理局的保藏號(hào)為FERM BP-8269。
我們還證實(shí)了，作為hWAPL基因產(chǎn)物的hWAPL蛋白的表達(dá)可以 使用雙鏈的短鏈干擾RNA(siRNA)來抑制。具體來說，表現(xiàn)出這樣的表 達(dá)抑制活性的雙鏈的短鏈干擾RNA(siRNA)包括，例如其核苷酸序列 為CGGACTACCCTTAGCACAA。在這種情況下，癌細(xì)胞的進(jìn)一步生 長也被抑制，所以癌癥的發(fā)生可以被阻止。
對(duì)于一個(gè)其氨基酸序列與本發(fā)明的氨基酸序列SEQ.ID.No.l(以下 有時(shí)被稱為"本發(fā)明的蛋白")一致或基本上一致的蛋白，其例子可以 包括一個(gè)氨基酸序列，它與氨基酸序列SEQ.ID.No.l的同源性在大約 70%或以上、優(yōu)選情況下在大約80%或以上、更優(yōu)選情況下在90%或 以上、最優(yōu)選情況下在大約95%或以上。
對(duì)于一個(gè)其氨基酸序列與氨基酸序列SEQ.ID.No.l —致或基本上 一致的蛋白，優(yōu)選情況下這樣的肽可以具有與氨基酸序列SEQ.ID.No.l 基本上一致的氨基酸序列，并且與具有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的蛋白 具有基本上相當(dāng)?shù)幕钚浴?br> 基本上相當(dāng)?shù)幕钚钥梢园?、例如含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l 的蛋白的活性，比如誘導(dǎo)癌癥的功能、酶活性、轉(zhuǎn)錄活性以及與結(jié)合 蛋白結(jié)合的活性。
在此所用的術(shù)語"基本上相當(dāng)"是指這些活性在本質(zhì)上(例如生物 化學(xué)或藥理學(xué)上)是一致的。
11與氨基酸序列SEQ.ID.No.l —致或基本上一致的氨基酸序列的例 子包括
(i) 氨基酸序列SEQ.ID.No.l;
(ii) 從氨基酸序列SEQ.ID.No.l中缺失了 1到30個(gè)、優(yōu)選為1到 20個(gè)、更優(yōu)選為1到IO個(gè)氨基酸的氨基酸序列；
(iii) 向氨基酸序列SEQ.ID.No.l中增加了 1到30個(gè)、優(yōu)選為1到 20個(gè)、更優(yōu)選為1到IO個(gè)氨基酸的氨基酸序列；
(iv) 向氨基酸序列SEQ.ID.No.l中插入了 1到30個(gè)、優(yōu)選為1到 20個(gè)、更優(yōu)選為1到IO個(gè)氨基酸的氨基酸序列；
(v) 在氨基酸序列SEQ.ID.No.l中用其它氨基酸置換了 1到30個(gè)、 優(yōu)選為1到20個(gè)、更優(yōu)選為1到IO個(gè)氨基酸的氨基酸序列；
(vi) 從上述的(ii)到(v)中選擇兩個(gè)或多個(gè)進(jìn)行組合修飾的氨基酸序列。
本發(fā)明的蛋白的一個(gè)例子可以是含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的蛋白。
本發(fā)明的一個(gè)部分肽可以是上述的本發(fā)明的蛋白的任何部分肽， 一般來說優(yōu)選的為含有本發(fā)明的蛋白的至少5個(gè)或以上氨基酸、更優(yōu) 選為至少IO個(gè)或以上氨基酸、更優(yōu)選為具有與本發(fā)明的蛋白相當(dāng)?shù)幕?性的肽。
在本發(fā)明的蛋白或其部分肽(以后有時(shí)稱為"本發(fā)明的蛋白")中， 根據(jù)常規(guī)的肽的表示法，左端是N-末端(氨基末端)，右端是C-末端(羧 基末端)。
在本發(fā)明包括了含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的蛋白的蛋白中， C-末端可以從羧基(-COOH)、羧酸鹽(-C00—)、酰胺(-CONH2)和酯基 (-COOR)中任選。在酷中R的例子包括Cl6-院基例如甲基、乙基、正丙基、異丙基 和正丁基；C3.8-環(huán)烷基例如環(huán)戊基和環(huán)己基；C^2-芳香基例如苯基和
a-萘基；苯基-Cu2-烷基例如苯甲基和苯乙基；Cw4-芳烷基例如a-萘 基-Cl2-焼基，包括a-萘基甲基；以及新戊酰氧基甲基，它通常用作酯
進(jìn)行口服。
當(dāng)本發(fā)明的蛋白在c-末端以外的位置具有羧基基團(tuán)(或羧酸鹽)
時(shí)，其中羧基基團(tuán)被酰胺化或酯化的蛋白也是本發(fā)明的一種蛋白。這
里的酯可以是上述的C-末端的酯。
此外，本發(fā)明的蛋白的例子還包括一種蛋白，其中在N-末端的氨 基酸殘基(例如甲硫氨酸殘基)的氨基基團(tuán)被一個(gè)保護(hù)基團(tuán)所保護(hù)，諸如
Ck芳基、包括d—6-垸?；缂柞；鸵阴；?； 一種蛋白，其中在 體內(nèi)切割形成的N-末端的谷氨酸殘基被轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸的形式； 一種 蛋白，其中在分中一個(gè)氨基酸殘基中的側(cè)鏈上的一個(gè)取代基(例如
-OH、 -SH、氨基、咪唑基、吲哚基和胍基)被一個(gè)適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)(例
如，Ci-6-酰基，通常包括諸如甲?；鸵阴；膁(垸?；?所保護(hù)； 以及一種共軛蛋白，諸如其中連接了糖鏈的所謂的糖蛋白。
本發(fā)明的蛋白的鹽可以是一種生理可接受的酸(例如無機(jī)和有機(jī) 酸)或堿(例如堿金屬鹽)的鹽，特別優(yōu)選的是生理可接受的酸加成的鹽。 這樣的鹽的例子包括無機(jī)酸如鹽酸、磷酸、氫溴酸和硫酸的鹽，以及 有機(jī)酸如乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、 檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲基磺酸和苯甲基磺酸的鹽。在下 面，這樣的鹽也包括在本發(fā)明的蛋白中。
本發(fā)明的蛋白或其鹽可以通過已知的從人類或溫血哺乳動(dòng)物的細(xì)
胞中純化蛋白的方法來制備，或者也可以通過將編碼蛋白的DNA如下
述轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)而制備。當(dāng)從人或哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)時(shí)，人或哺乳動(dòng)物的組 織或細(xì)胞被勻漿，然后用酸抽提。然后通過組合的色譜步驟例如反向 色譜和離子交換色譜將抽提液純化以分離出所需的產(chǎn)物。
編碼本發(fā)明的致癌蛋白的多核苷酸可以是任一含有上述的編碼本
發(fā)明的致癌蛋白的核苷酸序列的多核苷酸(DNA或RNA，優(yōu)選為DNA)。 多核苷酸可以是DNA，也可以是RNA例如編碼本發(fā)明的致癌蛋白的 mRNA，可以是單鏈的也可以是雙鏈的。當(dāng)是雙鏈時(shí)，它可以是雙鏈 DNA、雙鏈RNA或DNA: RNA的雜合體。當(dāng)是單鏈時(shí)，可以是正義 鏈、即編碼鏈，也可以是反義鏈即非編碼鏈。
編碼本發(fā)明的蛋白的多核苷酸可用來對(duì)本發(fā)明的蛋白的mRNA進(jìn) 行定量，這可以使用已知的方法或?qū)ζ溥M(jìn)行修改，例如在Experimental Medicine增刊"新的PCR及其應(yīng)用"，15(7), 1997中描述的方法。
一個(gè)編碼本發(fā)明的蛋白的DNA可以是任一含有上述的編碼本發(fā) 明的蛋白的核苷酸序列的DNA ，并且可以是基因組DNA 、基因組DNA 文庫、來自上述的細(xì)胞/組織的cDNA,來自上述的細(xì)胞/組織的cDNA 文庫或人工合成的DNA。
用于文庫的載體可以是噬菌體、質(zhì)粒、粘?；蚴删！＜?xì)胞或組 織的總RNA或mRNA部分的制備物可以用于通過直接的反轉(zhuǎn)錄酶聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(在后面稱為"RT-PCR")進(jìn)行擴(kuò)增。
可用于本發(fā)明的探針DNA的核苷酸序列可以是任何序列，諸如含 有在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下可以與核苷酸序列SEQ.ID.No.2雜交的核苷酸序 列的DNA序列，以及編碼的蛋白與含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的蛋
白具有基本上相當(dāng)?shù)幕钚缘腄NA序列。在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下可以與核苷酸序列SEQ.ID.No.2雜交的核苷酸 序列可以是一個(gè)與核苷酸序列SEQ.ID.No.2具有同源性為大約70%或 以上、優(yōu)選為大約80%或以上、更優(yōu)選為大約90%或以上、更優(yōu)選為 大約95%或以上的核苷酸序列。
雜交可以根據(jù)已知的方法或其修飾方法來進(jìn)行，例如在《分子克 隆第二版》(J. Sambrook等人，Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)中描
述的方法。當(dāng)使用市售的文庫時(shí)，雜交可以按照附帶的手冊(cè)來進(jìn)行。 在更優(yōu)選情況下，雜交可以在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行。
高度嚴(yán)謹(jǐn)條件可以包括、例如鈉濃度為大約19到40mM，優(yōu)選為 大約19到20mM，溫度為大約50到70°C，更優(yōu)選為大約60到65°C ， 在最優(yōu)選情況下，鈉濃度為大約19mM，溫度為大約65。C。
在更具體的情況下，編碼含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的蛋白的 DNA可以是含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的DNA。
編碼本發(fā)明部分的肽的DNA可以是任何含有編碼上述的本發(fā)明 的肽的核苷酸序列的DNA，并且可以是基因組DNA、基因組DNA文 庫、來自上述的細(xì)胞/組織的cDNA，來自上述的細(xì)胞/組織的cDNA文 庫或人工合成的DNA。
編碼本發(fā)明的部分肽的DNA可以是一種含有包括核苷酸序列 SEQ.ID.No.2的DNA的部分核苷酸序列的DNA，或者是另一種DNA， 其含有包括在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與核苷酸序列SEQ.ID.No.2雜交的核 苷酸序列并且編碼一種蛋白與含有氨基酸序列SEQ.ID.No.l的蛋白具 有基本上相當(dāng)?shù)幕钚缘腄NA的部分核苷酸序列。
可以與核苷酸序列SEQ.ID.No.2雜交的核苷酸序列的定義如上所述。
15雜交方法和高度嚴(yán)謹(jǐn)條件可以如上所述。
含有編碼本發(fā)明的蛋白或其部分肽(以下有時(shí)稱為"本發(fā)明的蛋
白")的DNA序列的一部分、或與DNA互補(bǔ)的核苷酸序列的一部分的 多核苷酸可以包含編碼本發(fā)明的蛋白或其部分肽的DNA和RNA。
根據(jù)本發(fā)明，在編碼被克隆或測定的本發(fā)明的蛋白的DNA的核苷 酸序列數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)和合成了能夠抑制本發(fā)明的蛋白基因的復(fù)制 和表達(dá)的反義多核苷酸(核酸)。這樣的多核苷酸(核酸)可以與本發(fā)明的 蛋白基因的RNA雜交以抑制RNA的合成或活性，或通過與和本發(fā)明 的蛋白相關(guān)的RNA相互作用而調(diào)節(jié)或控制本發(fā)明的蛋白基因的表達(dá)。 與在和本發(fā)明的蛋白相關(guān)的RNA中選定的序列互補(bǔ)的多核苷酸以及能 夠與和本發(fā)明的蛋白相關(guān)的RNA特異性雜交的多核苷酸，對(duì)于在體內(nèi) 和體外對(duì)本發(fā)明的蛋白基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)或控制、以及對(duì)于疾病的 治療或診斷，是非常有用的。在此所用的術(shù)語"相應(yīng)于"是指與包括 塞因的核苷酸、核苷酸序列或核酸的部分序列同源或互補(bǔ)。在核苷酸、 核苷酸序列或核酸與肽(蛋白)之間的關(guān)系方面，術(shù)語"相應(yīng)于" 一般是 指在一個(gè)蛋白(肽)中的一個(gè)氨基酸，從核苷酸(核酸)的序列或其互補(bǔ)序 列衍生的一個(gè)控制序列。優(yōu)選的靶區(qū)域的例子可以包括在本發(fā)明蛋白 基因中的一個(gè)5'-端的發(fā)夾環(huán)， 一個(gè)5'-端的6個(gè)堿基對(duì)的重復(fù)、 一個(gè)5'-端的非翻譯區(qū)、 一個(gè)蛋白翻譯起始密碼子、 一個(gè)蛋白編碼區(qū)、 一個(gè)ORF 翻譯終止密碼子， 一個(gè)3'-端非翻譯區(qū)、 一個(gè)3'-端回文區(qū)和一個(gè)3'-端 的發(fā)夾環(huán)，但是在本發(fā)明的蛋白基因中的任何區(qū)域都可以被選為靶。
一個(gè)給定的核酸和與靶區(qū)域至少部分互補(bǔ)的多核苷酸之間、以及 耙和可雜交的多核苷酸之間的關(guān)系可以被稱為"反義"。反義多核苷 酸的例子包括含有2-脫氧-D-核糖的多核苷酸、 一個(gè)含有D-核糖的多核 苷酸、其它類型的多核苷酸如嘌呤或嘧啶堿的N-糖苷、以及其它含有 非核苷酸結(jié)構(gòu)的聚合物(例如市售的蛋白核酸和合成的序列特異性的核酸聚合物)或其它含有特殊鍵的聚合物，只要聚合物中含有一個(gè)其構(gòu)型
如在DNA或RNA中觀察到的可以接受堿基配對(duì)或堿基結(jié)合的核苷酸。 它們可以是雙鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA或DNA:RNA 雜合體。它們還可以包括未修飾的多核苷酸(或未修飾的寡核苷酸)，那 些具有已知的修飾如本領(lǐng)域熟知的標(biāo)記、加帽、甲基化、用類似物取 代至少一個(gè)天然的核苷酸及分子內(nèi)的核苷酸修飾的多核苷酸；那些具
有不帶電荷的鍵(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸 酯)的多核苷酸；那些具有帶電荷的鍵或含硫的鍵(例如硫代磷酸酯和二 硫代磷酸酯)的多核苷酸；那些具有一個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)的多核苷酸，所述側(cè) 鏈基團(tuán)包括蛋白(核酸酶、核酸酶抑制劑、毒素、抗體、信號(hào)肽和聚-L-賴氨酸)或糖(例如單糖)；那些含有一個(gè)中間化合物(如吖啶和補(bǔ)骨脂素) 的多核苷酸；那些含有一個(gè)鏊合化合物(例如金屬、放射性金屬、硼和 氧化金屬)的多核苷酸；那些含有烷基化試劑的多核苷酸；以及那些含 有修飾的鍵(例如a-異頭型核酸)的多核苷酸。在此所用的術(shù)語"核苷"、 "核苷酸"和"核酸"不僅可以包括那些含有嘌呤和嘧啶堿的化合物， 而且還包括那些另含有其它修飾雜環(huán)堿基的化合物。這樣的修飾物質(zhì) 可以含有甲基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤和嘧啶或其它雜環(huán)化合物。 修飾的核苷和修飾核苷酸可以在糖基團(tuán)上修飾；例如一個(gè)或多個(gè)羥基 可以被鹵素或脂肪族的基團(tuán)所取代，或者可以被轉(zhuǎn)化為另一個(gè)官能團(tuán) 如醚和胺。
本發(fā)明的反義多核苷酸(核酸)是一個(gè)RNA、 DNA或修飾的核酸 (RNA、 DNA)。修飾的核酸的例子包括但不限于核酸的硫衍生物或硫代 磷酸衍生物以及那些對(duì)多聚核苷酰胺或寡聚核苷酰胺的降解有抗性的 核酸。本發(fā)明的反義核酸可以被優(yōu)選設(shè)計(jì)為，例如使產(chǎn)生的反義核酸 在細(xì)胞中更加穩(wěn)定、使反義核酸在細(xì)胞中有較高的通透性、對(duì)靶正義 鏈具有親和性、或者如果它有毒性，產(chǎn)生的反義核酸可以具有較低的 毒性。
多種這樣的修飾在本技術(shù)領(lǐng)域中是廣為人知的，并且在例如J.Kawakami等，Pharm Tech Japan, Vol.8, pp.247, 1992; Vol.8, pp.395， 1992; S.T. Crooke等編，反義研究和應(yīng)用，CRC Press, 1993中已經(jīng)公開。
本發(fā)明的反義核酸可以包含轉(zhuǎn)化的和/或修飾的糖、堿基和/或鍵， 因此可以以一種特別的形式諸如脂質(zhì)體和微球體的形式提供，可以應(yīng) 用于基因治療或可以作為加合物提供。這樣的加合物的例子包括聚陽 離子加合物、如作為磷酸結(jié)構(gòu)中的電荷中和劑的多聚賴氨酸，以及疏 水加合物、例如一個(gè)增強(qiáng)與細(xì)胞膜相互作用或增加核酸的攝取的脂類 (例如，磷脂和膽固醇)。優(yōu)選的用于加成的脂類的例子包括膽固醇及其 衍生物(例如氯甲酸膽固醇酯和膽酸)。它可以通過堿基、糖或分子內(nèi)核 苷鍵連接到核酸的3'-或5'-末端。另一種可用的基團(tuán)可以是、例如一個(gè) 具體定位于一個(gè)核酸的3'-或5'-末端以防止核酸酶諸如核酸外切酶和 RNase降解的加帽基團(tuán)。這樣的加帽基團(tuán)的例子包括但不限于那些在本 領(lǐng)域已知的羥基保護(hù)基團(tuán)例如乙二醇、包括聚乙二醇和冰縮四乙二醇。
反義核酸的抑制活性可以使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子、本發(fā)明的體內(nèi)或 體外基因表達(dá)系統(tǒng)、或本發(fā)明的蛋白的體內(nèi)或體外翻譯系統(tǒng)來測定。 可以使用任何己知的多種方法將核酸引入細(xì)胞。
編碼本發(fā)明的蛋白的D N A可以用任何已知的方法來標(biāo)記；例如同 位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記(例如，使用熒光素進(jìn)行熒光標(biāo)記)、生物素?；?br> 酶標(biāo) 。
完整地編碼本發(fā)明的蛋白的DNA可以通過已知的PCR方法擴(kuò)增 來克隆，使用含有本發(fā)明蛋白的部分核苷酸序列的合成的DNA引物， 或者通過與標(biāo)記了編碼本發(fā)明的蛋白的部分或全長DNA片段或合成的 DNA進(jìn)行雜交來篩選整合在一個(gè)適當(dāng)?shù)妮d體中的DNA。雜交可以使用 例如在《分子克隆第二版》(J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)中描述的方法來進(jìn)行。當(dāng)使用市售的文庫時(shí)，雜交可以按 照附帶的手冊(cè)來進(jìn)行。一個(gè)DNA的序列可以使用已知的試劑盒例如MutanTM-super Express Km (TaKara Shuzo Co.， Ltd.)、 MutanTM-K (TaKara Shuzo Co.， Ltd.),利用已知的方法例如ODA-LA PCR、帶缺口雙鏈方法和Kunkel 方法或修改的方法來進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
根據(jù)使用的情況，編碼克隆的肽的DNA、如果需要、可以這樣使 用或者在用限制性酶消化后或添加了接頭后使用。DNA可以在5'-末端 帶有ATG作為翻譯起始密碼子，在3'-末端帶有TAA、 TGA或TAG 作為翻譯的終止密碼子。可以使用適當(dāng)?shù)暮铣傻腄NA接頭來添加翻譯 起始密碼和或翻譯終止密碼。
本發(fā)明的蛋白的表達(dá)載體可以通過例如(i)從編碼本發(fā)明的蛋白的 DNA中切下所需DNA片段，和(ii)將DNA片段連接在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體 的啟動(dòng)子的下游來制成。
可以使用的載體的例子包括從大腸桿菌衍生的質(zhì)粒(例如， pBR322、 pBR325、 pUC12和pUC13);從枯草芽孢桿菌衍生的質(zhì)粒(例 如pUB110、pTP5和pC194);從酵母衍生的質(zhì)粒(例如pSH19和pSH15); 噬菌體例如X-噬菌體；哺乳動(dòng)物的病毒例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒和桿 狀病毒；pAl-ll; pXTl; pRc/CMV; pRc/RSV和pcDNAI/Neo。
用于本發(fā)明的啟動(dòng)子可以是任何適合于在基因表達(dá)中所用的宿主 的啟動(dòng)子。例如，當(dāng)使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為宿主時(shí)，可以使用SR a-啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、HIV-LTR啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子或HSV-TK啟動(dòng)子。
在這些啟動(dòng)子中，優(yōu)選使用CMV(黃瓜花葉病毒)啟動(dòng)子或SR ot-啟動(dòng)子。當(dāng)宿主是大腸桿菌時(shí)，優(yōu)選的啟動(dòng)子為trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng) 子、recA啟動(dòng)子、X-PL啟動(dòng)子、lpp啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子；當(dāng)宿主是芽
19孢桿菌時(shí)，優(yōu)選的啟動(dòng)子為SPOl啟動(dòng)子、SP02啟動(dòng)子和penP啟動(dòng)子； 當(dāng)宿主是酵母時(shí)，優(yōu)選啟動(dòng)子為PH05啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟 動(dòng)子和ADH啟動(dòng)子。當(dāng)宿主是昆蟲細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選啟動(dòng)子為多角蛋白 (polyhetdrin)啟動(dòng)子和P10啟動(dòng)子。
如果需要，也可以使用其它的表達(dá)載體，包括那些含有增強(qiáng)子、 剪接信號(hào)、poly-A加尾信號(hào)、選擇標(biāo)記和/或SV40復(fù)制原點(diǎn)(以下有時(shí) 稱為"SV40ori")的載體。選擇標(biāo)記的例子包括二氫葉酸還原酶(以下 有時(shí)稱為"dhfr")基因[氨甲蝶呤(MTX)抗性]、氨卞青霉素抗性基因(以 下有時(shí)稱為"Ampr")和新霉素抗性基因(以下有時(shí)稱為"Neor" ， G418 抗性)。尤其是在使用缺失了 dhfr基因的中華倉鼠細(xì)胞、以dhfr基因?yàn)?選擇標(biāo)記時(shí)，可以使用缺乏胸腺嘧啶的培養(yǎng)基來篩選所需基因的整合。
報(bào)告基因或藥物抗性基因也可用作選擇標(biāo)記(New Biochemical Experimental Lectures (Shin Seikagaku Jikken Koza) 2， nucleic acid III， 3.6 Mammalian cell expression vector, p84-103)。
可以使用的藥物抗性基因和藥物的組合的例子包括
(1) 嘌呤霉素-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因和嘌呤霉素的組合；
(2) 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(APH)和G418的組合；
(3) 潮霉素-B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPH)和潮霉素-B的組合；以及
(4) 黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)和霉酚酸酯 (mycophenolate)的組合。
當(dāng)親本細(xì)胞系是一個(gè)次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT) 或胸腺嘧啶激酶(TK)缺陷株時(shí)，可以使用這些基因和HAT(次黃嘌呤、 氨基蝶呤和胸腺嘧啶)的組合。
二氫葉酸還原酶或氨卞青霉素抗性基因可以用作選擇標(biāo)記基因。如果需要，可以在本發(fā)明的蛋白的N-末端添加適合于宿主的信號(hào)
序列。當(dāng)宿主是大腸桿菌時(shí)，可以使用PhoA信號(hào)序列和OmpA信號(hào) 序列；當(dāng)宿主是芽孢桿菌時(shí)，可以使用a-淀粉酶信號(hào)序列和枯草桿菌 蛋白酶信號(hào)序列；當(dāng)宿主是酵母時(shí)，可以使用MFci信號(hào)序列和SUC2 信號(hào)序列；當(dāng)宿主是哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，可以使用胰島素信號(hào)序列、a-干擾素信號(hào)序列和抗體-分子信號(hào)序列。
這樣構(gòu)建的含有編碼本發(fā)明的蛋白的DNA的載體可以用來產(chǎn)生 轉(zhuǎn)化子。
宿主可以是、例如大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、昆蟲 或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
大腸桿菌的例子包括大腸桿菌K12 DHl[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 60, 160 (1968)]、 JM103[Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309 (1981)]、 JA221[Journal of Molecular Biology, Vol. 120, 517 (1978)]、 HBlOl[Jo腦al of Molecular Biology, Vol. 41, 459 (1969)]禾口 C600[Genetics， Vol. 39， 440 (1954)]。
芽孢桿菌的例子包括枯草芽孢桿菌MT114[Gene, Vol. 24, 255 (1983)]和207-21 [Journal of Biochemistry, Vol. 95, 87 (1984)]。
酵母的例子包括釀酒酵母AH22、 AH22R—、 NA87-11A、 DKD-5D 禾口 20B-12;粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913和 NCYC2036;以及巴斯德畢赤氏酵母KM71。
至于昆蟲細(xì)胞，當(dāng)病毒是AcNPV時(shí)，可以使用從黏蟲幼蟲(草地 夜蛾細(xì)胞；Sf細(xì)胞)衍生的確立的細(xì)胞、從粉紋夜蛾中腸衍生的MG1 細(xì)胞、從粉紋夜蛾卵得到的High FiveTM細(xì)胞、從甘藍(lán)夜蛾(Mamestra brassicae)獲得的細(xì)胞或從Estigmena acrea衍生的細(xì)胞。當(dāng)病毒是BmNPV時(shí)，可以使用從蠶(中國家蠶N細(xì)胞；BmN細(xì)胞)確立的細(xì)胞。 可以使用的Sf細(xì)胞的例子包括Sf9細(xì)胞(ATCC CRL1711)和Sf21細(xì)胞， 這在Vaughn, J. L.等，In Vivo, 13， 213-217 (1977)中已經(jīng)描述。
昆蟲的例子包括家蠶幼蟲[Maeda等，Nature, Vol. 315， 592 (簡)]。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞的例子包括猴細(xì)胞COS-7(COS7)、非洲綠猴腎細(xì)胞 系、中華倉鼠細(xì)胞CHO(以下稱為"CHO細(xì)胞")、dhfr-基因缺失的中 華倉鼠細(xì)胞CHO(以下稱為"CHO(dhfr-)細(xì)胞")、鼠L細(xì)胞、鼠AtT-20 細(xì)胞、鼠骨髓瘤細(xì)胞、大鼠GH3和人FL細(xì)胞。
大腸桿菌的轉(zhuǎn)化可以按照例如在Proc. Natl. Acad. Sci. USA， Vol. 69, 2U0(1972)或Gene， Vol.17, 107(1982)中描述的方法進(jìn)行。
芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化可以按照例如在Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111(1979)中描述的方法進(jìn)行。
酵母的轉(zhuǎn)化可以按照例如在酶學(xué)方法，Vol. 194, 182-187(1991)或 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.75, 1929 (1978)中描述的方法進(jìn)行。
昆蟲細(xì)胞或昆蟲的轉(zhuǎn)化可以按照例如在Bio/Technology, 6， 47-55 (1988)中描述的方法進(jìn)行。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以按照例如在細(xì)胞技術(shù)增刊8，新細(xì)胞技 術(shù)實(shí)驗(yàn)方法，263-267(1995) (Shuju Co. Ltd.)或Virology, Vol.52, 456(1973)中描述的方法進(jìn)行。
因此，可以獲得用含有編碼本發(fā)明的蛋白的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 得到的轉(zhuǎn)化子。當(dāng)對(duì)宿主為大腸桿菌或芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，用于培養(yǎng) 的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基是含有碳源、氮源、無機(jī)鹽等轉(zhuǎn)化子生長所需組合物 的液體培養(yǎng)基。碳源的例子包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉和蔗糖。 氮源的例子包括無機(jī)和有機(jī)物如銨鹽、硝酸鹽、玉米浸汁、蛋白胨、 酪蛋白、肉汁、豆餅和土豆汁。無機(jī)鹽的例子包括氯化鈣、磷酸二氫 鈉和氯化鎂?？梢蕴砑咏湍柑崛∥?、維生素和/或生長促進(jìn)因子。預(yù)期
的培養(yǎng)基的pH為大約5到8。
培養(yǎng)大腸桿菌的優(yōu)選的培養(yǎng)基的例子可以是含有葡萄糖和酪蛋白 氨基酸的 M9 培養(yǎng)基[Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 413-433, Cold Spring Harbor LaboHumanory, New York, 1972]。如果需要，可以添加其它的試劑例如3(3-吲哚丙烯酸用于高效 的啟動(dòng)子活性。
當(dāng)宿主是大腸桿菌時(shí)，培養(yǎng)一般在大約15到43'C進(jìn)行3到24小 時(shí)，如果需要，通氣和/或攪拌。
當(dāng)宿主是芽孢桿菌時(shí)，培養(yǎng)一般在大約30到4(TC進(jìn)行大約6到 24小時(shí)，如果需要，通氣和/或攪拌。
當(dāng)對(duì)宿主為酵母的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以使用的培養(yǎng)基的例子 包括Burkholder基礎(chǔ)培養(yǎng)基[Bostian, K丄.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， Vol.77, 4505(1980)]和含有0.5%酪蛋白氨基酸的SD培養(yǎng)基[Bitter， G. A. 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， Vol. 81, 5330(1984)]。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選 被調(diào)整到大約5到8。培養(yǎng)一般在大約20到35'C進(jìn)行大約24到72小 時(shí)，如果需要，通氣和/或攪拌。
當(dāng)對(duì)宿主為昆蟲細(xì)胞或昆蟲的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基可以是 Grace昆蟲培養(yǎng)基(Grace, T. C. C.， Nature, 195, 788(1962))，適當(dāng)時(shí)可以含有添加物如10。/。除去補(bǔ)體的牛血清。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選被調(diào)整到大約 6.2到6.4。培養(yǎng)一般在大約27X:進(jìn)行大約3到5天，如果需要，通氣 和/或攪拌。
當(dāng)對(duì)宿主為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基的例子包 括含有大約5%到10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基[Science, VoU22, 501(1952)]、 DMEM培養(yǎng)基[Virology, Vol. 8， 396(1959)]、 RPMI 1640 培養(yǎng)基[The Journal of the American Medical Association, Vol. 199, 519(1967)]禾卩199培養(yǎng)基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol.73， 1(1950)]。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選被調(diào)整到大約6到8。培 養(yǎng)一般在大約30到40'C進(jìn)行大約15到60小時(shí)，如果需要，通氣和/ 或攪拌。
如上所述，本發(fā)明的蛋白可以在轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜或 細(xì)胞外區(qū)域生產(chǎn)。
本發(fā)明的蛋白可以從上述的培養(yǎng)基中通過例如下面的方法分離和 純化。
本發(fā)明的蛋白可以從培養(yǎng)的細(xì)菌或細(xì)胞中利用合適的方法提取， 方法為培養(yǎng)后，通過己知的步驟收集細(xì)菌或細(xì)胞，將它們懸浮在適當(dāng) 的緩沖液中，使用超聲、溶菌酶和/或凍融將細(xì)菌或細(xì)胞裂解，然后離 心或過濾以得到本發(fā)明的蛋白的粗提液。緩沖液可以含有蛋白修飾物 如尿素和鹽酸胍和表面活性劑如Triton X-100 。當(dāng)肽分泌到培養(yǎng)基中 時(shí)，在培養(yǎng)后通過己知的方法將細(xì)菌或細(xì)胞與上清液分離，然后收集 上清液。
這樣獲得的包含在培養(yǎng)基上清液或抽提液中的本發(fā)明的蛋白可以 通過將現(xiàn)有的分離/純化方法進(jìn)行適當(dāng)組合來純化。這種現(xiàn)有的分離/純 化方法的例子包括利用溶解度的方法如鹽析和溶劑沉淀；主要利用分子量差別的方法如透析、超濾、凝膠過濾和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳； 利用電荷差別的方法如離子交換層析；利用特異的親和性的方法如親 和層析；利用疏水性差別的方法例如反向高效液相色譜；以及利用等 電點(diǎn)差別的方法如等電聚焦。
當(dāng)這樣獲得的本發(fā)明的蛋白是游離形式時(shí)，它可以通過現(xiàn)有的方 法或其修飾的方法被轉(zhuǎn)化為鹽。反過來說，當(dāng)獲得的是鹽形式時(shí)，它 可以通過現(xiàn)有的方法或其修飾的方法被轉(zhuǎn)化為游離的形式。
純化前或純化后，由重組子產(chǎn)生的本發(fā)明的蛋白可以被適當(dāng)?shù)牡?白修飾酶作用以獲得適當(dāng)?shù)男揎椈虿糠秩コ粋€(gè)肽。蛋白修飾酶的例 子包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰內(nèi)肽酶、蛋白激酶和糖苷酶。
針對(duì)本發(fā)明的蛋白的抗體(以下有時(shí)簡單稱為"本發(fā)明的抗體") 可以是多克隆或者是單克隆的，只要它能夠識(shí)別本發(fā)明的蛋白的抗體。
本發(fā)明的蛋白的抗體可以使用現(xiàn)有的制備抗體或抗血清的方法， 以本發(fā)明的蛋白為抗原來生產(chǎn)。
單克隆抗體的制備 (a)單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備
將本發(fā)明的蛋白單獨(dú)或與載體和稀釋劑結(jié)合起來施用到溫血?jiǎng)游?中能夠產(chǎn)生抗體的部位。在應(yīng)用時(shí)，可以使用Freund's完全或不完全 佐劑來提高抗體生產(chǎn)能力。 一般來說在2到6周施用一次，總共施用 大約2到10次。溫血?jiǎng)游锏睦影ê?、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠?綿羊、山羊和禽類，優(yōu)選為大鼠和小鼠。
為制備單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞，從被抗原免疫的溫血?jiǎng)游锢缧∈?中選擇出表現(xiàn)抗體滴度的個(gè)體，并且在最后免疫后2到5天分離出脾 臟或淋巴結(jié)。包含在分離物中的抗體產(chǎn)生細(xì)胞可以與一個(gè)相同的或不同動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞融合以制備一個(gè)產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。可以 通過例如將下面描述的標(biāo)記肽與抗血清反應(yīng)然后測量結(jié)合到抗體上的 標(biāo)記的活性來測定抗血清中的抗體滴度。融合可以使用現(xiàn)有的方法進(jìn)
行，例如Kaehler-Milstein方法[Nature, 256,495(1975)]。融合促進(jìn)劑的 例子包括聚乙二醇(PEG)和副流感病毒，優(yōu)選PEG。
骨髓瘤細(xì)胞的例子包括溫血?jiǎng)游锏墓撬枇黾?xì)胞，例如NS-1、P3U1、 SP2/0和AP-1，優(yōu)選為P3U1?？贵w產(chǎn)生細(xì)胞(脾臟細(xì)胞)與骨髓瘤細(xì)胞 的數(shù)量比優(yōu)選為大約1: 1到20: 1， PEG(優(yōu)選為PEGIOOO到PEG6000) 添加濃度為大約10%到80%，通過在20到40°C、優(yōu)選為30到37°C 1 到10分鐘，細(xì)胞融合可以有效地進(jìn)行。
可以使用多種方法中的任意一種來篩選產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤 細(xì)胞；例如，通過在已經(jīng)直接吸附了肽(蛋白)抗原或吸附了肽(蛋白)抗 原與載體的組合物的固相介質(zhì)(例如，微孔板)中加入雜交瘤培養(yǎng)上清 液，然后加入抗免疫球蛋白抗體(當(dāng)用于細(xì)胞融合的細(xì)胞是鼠細(xì)胞時(shí)， 使用抗小鼠免疫球蛋白抗體)或用放射性試劑或酶標(biāo)記的蛋白A，并最 后檢測結(jié)合到固相介質(zhì)上的單克隆抗體，或者在已經(jīng)吸附了抗免疫球 蛋白抗體或蛋白A的固相介質(zhì)上加入雜交瘤培養(yǎng)上清液，然后加入用 放射性試劑或酶標(biāo)記的肽，最后檢測結(jié)合到固相介質(zhì)上的單克隆抗體。
可以通過現(xiàn)有的方法或其修改方法來篩選單克隆抗體。通?？梢?使用含有HAT(次黃嘌呤、氨基蝶吟和胸腺嘧啶)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 基。用于篩選和繁殖的培養(yǎng)基可以是任何雜交瘤能夠生長的培養(yǎng)基； 例如，含有1%到20%、優(yōu)選為0到20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基， 含有1%到10。/。胎牛血清(Wako Pure Chemicals Co. Ltd.)的GIT培養(yǎng)基， 以及無血清的雜交瘤培養(yǎng)基(SFM-lOl， Nissui Pharmaceutical Co.， Ltd.)。 培養(yǎng)溫度一般為20到40°C、優(yōu)選為大約37°C。培養(yǎng)時(shí)間一般為5天 到3周，優(yōu)選為1到2周。培養(yǎng)一般可以在5%氣態(tài)二氧化碳條件下進(jìn) 行。雜交瘤培養(yǎng)上清液中的抗體滴度可以按照上面描述的測定抗血清中的抗體滴度的方法來測定。
(b)單克隆抗體的純化
可以使用現(xiàn)有的方法來分離和純化單克隆抗體，包括分離/純化免 疫球蛋白的方法，如鹽析、醇沉淀、等電點(diǎn)沉淀、電泳、使用離子交 換劑(例如DEAD)的吸附和解吸方法、超速離心、凝膠過濾，以及特異
性的純化方法，在這種方法中抗體被活化的吸附劑如結(jié)合了抗原的固
相介質(zhì)專一性收集，然后用蛋白A或蛋白G解離結(jié)合鍵而獲得抗體。
多克隆抗體的制備
可以根據(jù)現(xiàn)有的方法或其修改方法來制備本發(fā)明的多克隆抗體。 例如，制備免疫原(肽抗原)或其與載體蛋白的混合物，然后象上述的單 克隆抗體的制備過程那樣用它免疫溫血?jiǎng)游?，從被免疫的?dòng)物收集含 有本發(fā)明的蛋白的抗體產(chǎn)物，并在分離和純化后，就可以制備到抗體 了。
就免疫溫血?jiǎng)游锏拿庖咴洼d體蛋白的混合物而言，可以使用任 何類型的載體蛋白和任一的載體對(duì)半抗原的混合比率，只要能夠有效 地產(chǎn)生用交聯(lián)了載體的半抗原免疫的半抗原的抗體；例如，大約0.1到 20重量份、優(yōu)選為大約1到5重量份的牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋 白、血藍(lán)蛋白等結(jié)合到1重量份的半抗原上。
多種縮合試劑可用于將半抗原與載體偶聯(lián)起來，包括戊二醛、碳 二亞胺、活化的順丁烯二酰亞胺酯和活化的具有硫醇基和/或二硫吡啶 基團(tuán)的酯試劑。
將縮合產(chǎn)物單獨(dú)或與載體和稀釋劑結(jié)合施用到溫血?jiǎng)游锬軌虍a(chǎn)生 抗體的部位。在應(yīng)用時(shí)，可以使用Freund's完全或不完全佐劑來提高 抗體生產(chǎn)能力。 一般來說在2到6周內(nèi)施用一次，總共使用大約3到 10次。多克隆抗體可以從血液或腹水中收集，優(yōu)選為如上所述免疫的溫 血?jiǎng)游锏难骸?br> 抗血清中的多克隆抗體的滴度可以按照測定抗血清中的抗體滴度 的方法來測定。多克隆抗體的分離和純化可以按照分離/純化上述的單 克隆抗體過程中的分離和純化免疫球蛋白的方法來進(jìn)行。
含有與編碼本發(fā)明的蛋白的DNA互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的核苷酸序
列的反義DNA(以后，后一個(gè)DNA有時(shí)稱為"本發(fā)明的DNA"，前一 個(gè)反義DNA有時(shí)稱為"反義DNA")可以是任何含有與本發(fā)明的DNA 互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的核苷酸序列、并且能夠抑制DNA的表達(dá)的反義 DNA。
與本發(fā)明的DNA基本上互補(bǔ)的核苷酸序列可以是，例如，與本發(fā) 明的DNA互補(bǔ)的全部或部分核苷酸序列(即本發(fā)明的DNA的互補(bǔ)鏈) 具有大約70%或以上、優(yōu)選為大約80%或以上、更優(yōu)選為大約90%或 以上、最優(yōu)選為大約95%或以上的同源性的核苷酸序列。特別優(yōu)選的 是與編碼本發(fā)明的蛋白的N-末端位點(diǎn)(例如，靠近起始密碼子的核苷酸 序列)的區(qū)域的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈具有大約70%或以上、優(yōu)選為大約 80%或以上、更優(yōu)選為大約卯％或以上、最優(yōu)選為大約95%或以上的 同源性的反義DNA。這樣的反義DNA可以使用例如現(xiàn)有的DNA合成 儀來制備。
下面將描述本發(fā)明的致癌蛋白(部分肽，包括鹽)、本發(fā)明的DNA、 本發(fā)明的抗體和本發(fā)明的反義DNA的應(yīng)用。
(2)促進(jìn)或抑制本發(fā)明的致癌蛋白的表達(dá)的化合物的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的致癌蛋白、本發(fā)明的寡聚核苷酸、本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子或本 發(fā)明的抗體可用于促進(jìn)或抑制本發(fā)明的致癌蛋白的表達(dá)的化合物的篩選方法。
具體來說，本發(fā)明提供了
(i)篩選促進(jìn)或抑制本發(fā)明的致癌蛋白的表達(dá)的化合物的方法，包 括在含有或不含測試化合物的情況下培養(yǎng)能夠表達(dá)本發(fā)明的致癌蛋白 的細(xì)胞和組織時(shí)，測定和比較本發(fā)明的致癌蛋白的表達(dá)量或編碼本發(fā)
明的致癌蛋白的mRNA的量。
能夠表達(dá)本發(fā)明的致癌蛋白的細(xì)胞和組織的例子包括來源于人的 細(xì)胞、溫血?jiǎng)游?例如，豚鼠、大鼠、小鼠、禽類、兔、豬、綿羊、牛 和猴)細(xì)胞(例如，神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì) 細(xì)胞、胰腺e-細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾細(xì)胞、血管素膜細(xì)胞、表 皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂 肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞(例如巨嗜細(xì)胞、T-細(xì)胞、B-細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、 肥大細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、嗜酸性白細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹 枝狀細(xì)胞)、巨核細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破 骨細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及其前體細(xì)胞、干細(xì)胞和癌細(xì)胞，以及 任何這些細(xì)胞存在的所有組織，例如腦、腦部位點(diǎn)(例如嗅球、杏仁核、 基底池、海馬區(qū)、視丘、下丘腦、大腦皮質(zhì)、延髓(medula oblongata). 小腦)、脊髓、垂體腺、胃、胰腺、腎、肝、生殖腺、甲狀腺(thyroid gland)、 膽囊、骨髓、腎上腺、皮膚、肌肉、肺、胃腸道(例如大腸和小腸)、血 管、心臟、胸腺、脾臟、唾液腺、外周血、前列腺、睪丸(精巢)、卵巢、 胎盤、子宮、骨、軟骨、關(guān)節(jié)和骨骼肌。在此，可以使用己確立的細(xì) 胞或原代培養(yǎng)系統(tǒng)。特別是，優(yōu)選使用上述的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞。
培養(yǎng)能夠表達(dá)本發(fā)明蛋白的細(xì)胞的方法如同上述的培養(yǎng)本發(fā)明的 轉(zhuǎn)化體的方法。
除了上述的測試化合物外，測試化合物還可以是一個(gè)DNA文庫。本發(fā)明的癌細(xì)胞的表達(dá)量可以使用現(xiàn)有的方法來測定，例如使用
例如抗體的免疫化學(xué)方法，或者可以使用利用Northern雜交、RT-PCR 或TaqManPCR的現(xiàn)有方法來測定編碼本發(fā)明的致癌蛋白的mRNA。
可以根據(jù)現(xiàn)有的方法或其修改方法通過雜交來比較mRNA的表達(dá) 量，例如在《分子克隆第二版》，J. Sambrook等，Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989中所描述的方法。
具體來說，按照現(xiàn)有的方法來測定編碼本發(fā)明的致癌蛋白的 mRNA的量，即通過將從細(xì)胞中提取的RNA與本發(fā)明的多核苷酸或其 部分或本發(fā)明的反義多核苷酸接觸，然后測量與本發(fā)明的多核苷酸或 其部分或本發(fā)明的反義多核苷酸結(jié)合的mRNA的量。本發(fā)明的多核苷 酸或其部分或本發(fā)明的反義多核苷酸可以使用例如放射性同位素或染 料進(jìn)行標(biāo)記，有助于測定與本發(fā)明的多核苷酸或其部分或本發(fā)明的反 義多核苷酸結(jié)合的mRNA的量。放射性同位素的例子包括32P和3H， 染料的例子包括熒光染料如熒光素、FAM(PE Biosystems Inc.)、 JOE(PE Biosystems Inc.)、 TAMRA(PE Biosystems Inc.)、 ROX(PE Biosystems Inc.)、 Cy5(Amersham Inc.)禾口 Cy3(Amersham Inc.)。
mRNA的量的測定可以通過使用反轉(zhuǎn)錄酶將從細(xì)胞提取的RNA 轉(zhuǎn)化為cDNA，然后使用本發(fā)明的多核苷酸或其部分或本發(fā)明的反義多 核苷酸作為引物測量通過PCR擴(kuò)增的cDNA的量。
因此， 一種增加編碼本發(fā)明的致癌蛋白的mRNA的量的測試化合 物可以被選為促進(jìn)本發(fā)明的致癌蛋白表達(dá)的化合物，而一種降低編碼 本發(fā)明的致癌蛋白的mRNA的量的測試化合物可以被選為抑制本發(fā)明 的致癌蛋白表達(dá)的化合物。
本發(fā)明還提供了
(ii)篩選促進(jìn)或抑制啟動(dòng)子活性的化合物的方法，包括在存在或不含測試化合物的情況下，對(duì)使用重組DNA轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)
時(shí)，測定并比較報(bào)告蛋白的活性，在所述重組DNA中報(bào)告基因被連接
在編碼本發(fā)明的致癌蛋白基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域的下游。
可以使用的報(bào)告基因的例子包括lacZ(e-半乳糖苷酶基因)、氯霉 素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、熒光素酶、生長因子、e-葡糖醛酸酶、堿性磷 酸酶、綠色熒光蛋白(GFP)和e-內(nèi)酰胺酶。
通過使用現(xiàn)有的方法測定報(bào)告基因產(chǎn)物(例如mRNA和蛋白)的 量，增加了報(bào)告基因產(chǎn)物的量的測試化合物可以被選為控制(尤其是促 進(jìn))本發(fā)明的蛋白的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子活性的化合物，即作為促進(jìn)本發(fā)明 的蛋白的表達(dá)的化合物。反過來，降低了報(bào)告基因產(chǎn)物的量的測試化 合物可以被選為控制(尤其是抑制)本發(fā)明的蛋白的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子活 性的化合物，即作為抑制本發(fā)明的蛋白的表達(dá)的化合物。
測試化合物可以如前所述。
可以通過現(xiàn)有的技術(shù)構(gòu)建或分析含有報(bào)告基因的載體(例如，參見 Molecular Biotechnology 13， 29-43, 1999)。
因?yàn)橐种票景l(fā)明的致癌蛋白的表達(dá)的化合物可以抑制本發(fā)明的致 癌蛋白的生物學(xué)活性，它作為一種安全、低毒的抑制本發(fā)明的致癌蛋 白的生物學(xué)活性的醫(yī)用藥物是有用的。具體來說，它在作為癌癥如肺 癌、腎癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、 乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌和胰腺癌、特別是宮頸癌的預(yù)防或 治療劑方面是有用的。
使用本發(fā)明的篩選方法或篩選試劑盒獲得的化合物或其鹽可以
是，例如從下面的物質(zhì)中選出的一種化合物肽、蛋白、非肽化合物、 合成的化合物、發(fā)酵產(chǎn)品、細(xì)胞提取物、植物提取物、動(dòng)物組織提取
31物和血漿?；衔锏柠}可以是如同描述的本發(fā)明的致癌蛋白衍生的肽 的鹽。
當(dāng)使用利用本發(fā)明的篩選方法或篩選試劑盒獲得的化合物作為上 述的治療或預(yù)防試劑時(shí)，它可以照常使用。例如象在含有本發(fā)明的蛋
白的藥物中描述的那樣，它可以制成片劑、膠囊、酏劑(elixir)、微囊、
無菌溶液和懸浮液。
化合物或其鹽的劑量依賴于多種因素，例如它的效果、靶疾病、 接受者和給藥路線。例如，抑制本發(fā)明的蛋白表達(dá)的化合物的口服給
藥來治療癌癥，它的劑量對(duì)于正常成年人(體重60公斤)來說每天為大 約0.1到100mg，優(yōu)選為大約1.0到50mg,更優(yōu)選為大約1.0到20mg。 盡管化合物的劑量依賴于多種因素諸如接受者和靶疾病，但在非腸道 給藥時(shí)，在給一個(gè)正常的成年人(體重60公斤)施用抑制本發(fā)明的蛋白 的化合物治療癌癥時(shí)，每天靜脈內(nèi)注射的適當(dāng)劑量為大約0.01到30mg， 優(yōu)選為大約0.1到20mg，更優(yōu)選為大約0.1到10mg。對(duì)于其它的動(dòng)物， 可以施用將重量轉(zhuǎn)換為60公斤的量。
(3)本發(fā)明的致癌蛋白的分析
本發(fā)明的抗體可以特異性識(shí)別本發(fā)明的致癌蛋白，因此可用于在 測試溶液中測定本發(fā)明的致癌蛋白，尤其是使用三明治免疫測試方法 的分析。
因此，本發(fā)明提供了
(i) 一種在測試溶液中測定本發(fā)明的致癌蛋白的方法，包含下列步 驟將本發(fā)明的抗體與測試溶液和本發(fā)明標(biāo)記的蛋白進(jìn)行競爭性反應(yīng)， 然后測定結(jié)合到抗體上的本發(fā)明的標(biāo)記的蛋白的比例；以及
(ii) 一種在測試溶液中分析本發(fā)明的致癌蛋白的方法，包含下列步 驟將測試溶液同時(shí)或連續(xù)地與在載體上不溶的本發(fā)明的抗體以及另 一個(gè)標(biāo)記的本發(fā)明的抗體進(jìn)行反應(yīng)，然后測定在不溶性載體上的標(biāo)記試劑的活性。
在(ii)中描述的測定中，理想的情況是一個(gè)抗體是能夠識(shí)別本發(fā)明 的致癌蛋白的N-末端的抗體，而另一個(gè)抗體是能夠與本發(fā)明的致癌蛋 白的C-末端反應(yīng)的抗體。
針對(duì)本發(fā)明的致癌蛋白的單克隆抗體可以使用例如組織染色的方 法用來測定本發(fā)明的致癌蛋白或進(jìn)行檢測。為了這些目的，可以使用
抗體分子本身，也可以使用抗體分子的F(ab')2、 Fab'或Fab片段。
對(duì)使用本發(fā)明的抗體測定本發(fā)明的致癌蛋白的步驟沒有特別的限 制，它可以是任何步驟，只要在測量溶液中相對(duì)于抗原的量(例如肽的 量)的抗體、抗原或抗體-抗原復(fù)合物的量可以通過化學(xué)的或物理的方法 來測定，并且可以使用利用含有已知量的抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液作出的標(biāo)準(zhǔn) 曲線來計(jì)算所需的值。例如，濁度測定法、競爭測定、放免分析和三 明治分析方法都適合使用，根據(jù)靈敏度和特異性，下面描述的三明治 分析方法是特別優(yōu)選的。
在使用這樣的標(biāo)記材料的分析中使用的標(biāo)記試劑的例子包括放射 性同位素、酶、熒光物質(zhì)和發(fā)光材料。放射性同位素的例子包括[1251]、 [1311]、卩H]和["C]。在這些當(dāng)中，優(yōu)選的是表現(xiàn)出很高比活性的穩(wěn)定的 酶，包括e-半乳糖苷酶、P-葡萄糖醛酸酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶 和蘋果酸脫氫酶。熒光物質(zhì)的例子包括熒光胺和異硫氰酸熒光素。發(fā) 光材料的例子包括氨基苯二酰肼、氨基苯二酰肼衍生物、熒光素和硝 酸雙-N-甲基吖啶。生物素-親和素系統(tǒng)可用于將抗原或抗體與標(biāo)記試劑
5口 口 o
抗原或抗體可以使用物理吸附，或者使用通常用于不溶化或固定 化肽或酶的化學(xué)鍵進(jìn)行不溶化。載體的例子包括不溶性的多糖如瓊脂
糖、葡聚糖、和纖維素；合成樹脂例如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和聚硅氧烷；以及玻璃。
在三明治分析中，本發(fā)明的不溶性的單克隆抗體與測試溶液反應(yīng) (第一個(gè)反應(yīng))，然后與另一個(gè)標(biāo)記的本發(fā)明的單克隆抗體反應(yīng)(第二個(gè) 反應(yīng))。然后，可以測定在不溶性的載體上的標(biāo)記試劑的活性來分析在 測試溶液中的本發(fā)明的蛋白的量。第一個(gè)和第二個(gè)反應(yīng)可以以相反的 次序，同時(shí)或連續(xù)地進(jìn)行。標(biāo)記試劑和不溶化的方法可以是如上所述 的方法。在使用三明治分析的免疫測定方法中，并不必需只使用一個(gè) 抗體來作為固定介質(zhì)或進(jìn)行標(biāo)記，而是可以使用兩個(gè)或多個(gè)抗體的混 合物來例如提高測量的靈敏度。
在根據(jù)本發(fā)明使用三明治分析法測定本發(fā)明的致癌蛋白中，用于 第一個(gè)和第二個(gè)反應(yīng)的本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選為結(jié)合到本發(fā)明的癌 蛋白上不同位點(diǎn)的抗體。具體來說，對(duì)于用于第一個(gè)和第二個(gè)反應(yīng)的 抗體而言，當(dāng)用于第二個(gè)反應(yīng)的抗體識(shí)別本發(fā)明的致癌蛋白的C-末端 時(shí)，用于第一個(gè)反應(yīng)的抗體為識(shí)別C-末端以外的位點(diǎn)，例如N-末端的 抗體。 '
本發(fā)明的單克隆抗體可以用于三明治分析法以外的測量系統(tǒng)中， 例如競爭分析法、免疫測量法和濁度測定法。 '
在競爭分析法中，測試溶液中的抗原和標(biāo)記的抗原與抗體進(jìn)行競 爭性反應(yīng)，未反應(yīng)的標(biāo)記抗原(F)與結(jié)合的標(biāo)記抗原(B)分開(B/F分離)， 測定被標(biāo)記B或F的量來分析在測試溶液中抗原的量。這種反應(yīng)分析 可以在液相方法中使用，其中一種可溶性的抗體用作抗體，聚乙二醇 和針對(duì)上述抗體的第二抗體被用于B/F分離，此外也可以在固相方法 中使用，其中一種固定化的抗體被用作第一抗體，或者第一抗體是可 溶性的，第二抗體是一種固定化抗體。
在免疫測量法中，在測試溶液中的抗原和一個(gè)固定化抗原與給定量的標(biāo)記的抗體進(jìn)行競爭反應(yīng)，然后分離固相和液相，也可以是測試 溶液中的抗原與過量的標(biāo)記抗體進(jìn)行反應(yīng)，然后加入一種固定化的抗 原將未反應(yīng)的標(biāo)記抗體結(jié)合到固相上，然后將固相和液相分離。然后， 測定在兩種相中的標(biāo)記的量以分析在測試溶液中的抗原的量。
濁度測定法測定在凝膠或溶液中由于抗原-抗體反應(yīng)形成的不溶 性沉淀的量。即使當(dāng)測試溶液中的抗原量很少以至于只形成少量的沉 淀時(shí)，利用激光散射的激光濁度測定法也可以適當(dāng)使用。
對(duì)于實(shí)施每一種分析本發(fā)明的免疫測定方法而言，不需要特殊的 條件或操作?？梢愿鶕?jù)每種方法的通用條件和操作進(jìn)行對(duì)熟悉本領(lǐng)域 技術(shù)的人來說熟知的修改，來建立本發(fā)明的蛋白的測量系統(tǒng)。有關(guān)這 些通用的技術(shù)步驟的詳細(xì)情況可以在各種綜述和教科書中發(fā)現(xiàn)。
這些文獻(xiàn)可以是，例如"放射免疫分析"Hiroshilrie編，Kodansha， 1974年出版；"放射免疫分析第二版"Hiroshilrie編，Kodansha， 1979 年出版；"酶免疫分析"Eiji Ishikawa等編，Igaku-Shoin， 1978年出版; "酶免疫分析第二版"Eijilshikawa等編，Igaku-Shoin， 1982年出版； "酶的免疫分析第三版"Eijilshikawa等編，Igaku-Shoin， 1987年出版; "酶學(xué)方法"Vol. 70 (免疫化學(xué)技術(shù)(部分A));"酶學(xué)方法"Vol. 73 (免 疫化學(xué)技術(shù)(部分B));"酶學(xué)方法"Vol. 74(免疫化學(xué)技術(shù)(部分C));
"酶學(xué)方法"Vol. 84(免疫化學(xué)技術(shù)(部分D:免疫分析精選))；"酶學(xué)
方法"Vol. 92 (免疫化學(xué)技術(shù)(部分E:單克隆抗體和普通免疫分析方 法))；和"酶學(xué)方法"Vol. 121 (免疫化學(xué)技術(shù)(部分I:雜交瘤技術(shù)和 單克隆抗體))(這些由Academic Press出版)。
當(dāng)使用本發(fā)明的抗體分析本發(fā)明的致癌蛋白的水平檢測到該水平 降低時(shí)，例如，可以得出診斷，受試者有與本發(fā)明的致癌蛋白不足有 關(guān)的疾病，或者在將來可能得此病。當(dāng)檢測到本發(fā)明的蛋白的水平增加時(shí)，例如，可以得出診斷，受 試者有由本發(fā)明的致癌蛋白過量表達(dá)所誘導(dǎo)的疾病，包括癌癥例如肺
癌、腎癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、 乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌和胰腺癌(特別是宮頸癌)，或者在將 來可能得病。
本發(fā)明的抗體可用于檢測存在于樣品例如體液和組織中的本發(fā)明 的致癌蛋白。它也可以用于制備抗體柱，用于純化本發(fā)明的致癌蛋白， 在純化中檢測每個(gè)級(jí)分中的本發(fā)明的蛋白，以及分析本發(fā)明的蛋白在 測試細(xì)胞中的特性。
(4)基因診斷試劑
本發(fā)明的多核苷酸或反義多核苷酸也可用作例如核酸探針，用于
檢測主要是人體編碼本發(fā)明的致癌蛋白的DNA或mRNA的異常(基因 缺陷)。例如，它可用作損傷、突變、或DNA或mRNA的表達(dá)減少或 mRNA的過量表達(dá)的基因診斷試劑。
上述的使用本發(fā)明的多核苷酸或反義多核苷酸的基因診斷，可以 根據(jù)例如現(xiàn)有的Northern雜交或PCR-SSCP來進(jìn)行(參見Genomics, Vol. 5， pp.874-879 (1989); Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America, Vol.86, pp.2766-2770 (1989))。
例如，當(dāng)使用Northern雜交檢測到mRNA表達(dá)降低時(shí)，可以得出 診斷，受試者有與本發(fā)明的致癌蛋白不足有關(guān)的疾病，或者在將來可 能得病。
當(dāng)使用Northern雜交檢測到mRNA過量表達(dá)時(shí)，例如，可以得出 診斷，受試者有由本發(fā)明的致癌蛋白過量表達(dá)所誘導(dǎo)的疾病，包括癌 癥例如肺癌、腎癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、 膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌和胰腺癌(特別是宮頸癌)，或者在將來可能得病。 (5)含有反義多核苷酸的藥物
能夠互補(bǔ)結(jié)合到本發(fā)明的多核苷酸(例如DNA)上并抑制多核苷酸 (例如DNA)的表達(dá)的本發(fā)明的反義多核苷酸具有較低的毒性，并且可 以在體內(nèi)抑制本發(fā)明的蛋白或本發(fā)明的多核苷酸(例如DNA)的活性。 因此，它可用作由本發(fā)明的蛋白的過量表達(dá)誘導(dǎo)的疾病的預(yù)防或治療 劑，例如癌癥如肺癌、腎癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、前列腺 癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌和胰腺癌。
當(dāng)使用反義多核苷酸作為上述的預(yù)防或治療劑時(shí)，反義多核苷酸 可以配制成上述的本發(fā)明的多核苷酸的劑型。
這樣獲得的制劑具有較低毒性，可以口服或非胃腸道施用到人或 哺乳動(dòng)物(例如大鼠、兔、綿羊、豬、牛、貓、狗和猴)。
反義多核苷酸可以這樣給藥，為了促進(jìn)攝入也可以與生理可接受 的載體如佐劑結(jié)合使用，使用基因槍或?qū)Ч苋缢z導(dǎo)管。
反義多核苷酸的劑量依賴于許多因素而變化，例如靶疾病、接受 者以及給藥路線，當(dāng)本發(fā)明的反義多核苷酸局部給藥到器官(例如，肝 臟、肺、心臟和腎臟)以治療癌癥時(shí)，劑量為例如每個(gè)成年人(60公斤體 重)每天大約0.1到100mg。
此外，反義多核苷酸可以用作診斷的核苷酸探針，用來測定組織 或細(xì)胞中本發(fā)明的癌基因的存在或其表達(dá)狀態(tài)。
本發(fā)明還提供了
(i) 一個(gè)含有編碼本發(fā)明的蛋白的RNA或其互補(bǔ)RNA的一部 分的雙鏈RNA;(ii) 一種含有雙鏈RNA的藥物； 在適當(dāng)時(shí)
(iii) 一個(gè)含有編碼本發(fā)明的蛋白的RNA—部分的核酶；以及
(iv) —個(gè)含有核酶的藥物。
這些雙鏈RNA(RNAi;RNA干擾方法)和核酶象上述的反義寡聚核 苷酸一樣能夠抑制本發(fā)明的多核苷酸(例如，DNA)的表達(dá)，并能夠在體 內(nèi)抑制本發(fā)明的致癌蛋白或多核苷酸(例如DNA)的活性。因此，它可
以用作預(yù)防或治療劑用于由本發(fā)明的致癌蛋白過量表達(dá)所誘導(dǎo)的疾 病，例如癌癥例如肺癌、腎癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、前列 腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌和胰腺癌， 尤其是宮頸癌。
雙鏈RNA可以在本發(fā)明的多核苷酸序列的基礎(chǔ)上根據(jù)現(xiàn)有的方 法(參見例如Nature, Vol. 411， p.494, 2001)來設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。
核酶可以在本發(fā)明的多核苷酸的基礎(chǔ)上根據(jù)現(xiàn)有的方法(參見例 如Trends in Molecular Medicine, Vol.7， p.221, 2001)來設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。例 如，它可以通過將現(xiàn)有的核酶連接到編碼本發(fā)明的蛋白的RNA的一個(gè) 部分上來產(chǎn)生。編碼本發(fā)明的蛋白的RNA的一個(gè)部分的例子是一個(gè)靠 近本發(fā)明的RNA上能夠被現(xiàn)有的核酶降解的限制性位點(diǎn)的部分(RNA 片段)。
當(dāng)使用雙鏈RNA或核酶作為上述的預(yù)防或治療劑時(shí)，它可以象使 用反義多核苷酸中描述的那樣配制和給藥。
(6)含有本發(fā)明的抗體的醫(yī)療藥物
能夠中和本發(fā)明的致癌蛋白的癌變活性的本發(fā)明的抗體可以用作 預(yù)防或治療劑用于本發(fā)明的致癌蛋白過量表達(dá)所誘導(dǎo)的疾病，例如癌 癥例如肺癌、腎癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌和胰腺癌，尤其是宮頸癌。
上述的含有本發(fā)明的抗體的用于預(yù)防和治療疾病的藥物可以口服 或非胃腸道施用給人或哺乳動(dòng)物(例如，大鼠、兔、綿羊、豬、牛、貓、 狗和猴)，可以作為溶液或藥物組合物的合適劑型使用。劑量可以依賴 于許多因素而變化，例如接受者、靶疾病、癥狀以及給藥路線，本發(fā)
明的抗體的劑量可以是，例如， 一般為0.01至lj 20mg/Kg，優(yōu)選為0.1 到10 mg/Kg，更優(yōu)選為0.1到5 mg/Kg，每天大約1次到5次，優(yōu)選為 每天1到3次。它可以通過靜脈內(nèi)注射而適當(dāng)?shù)亟o藥。在其它的非胃 腸道或口服給藥方式中，可以使用與上述相似的劑量。如果癥狀特別 嚴(yán)重，劑量也可以根據(jù)癥狀增加。
本發(fā)明的抗體可以本身或作為適當(dāng)?shù)乃幬锝M合物給藥。用于上述 給藥的藥物組合物含有上述的抗體或其鹽以及可藥用的載體、稀釋劑 或賦形劑。這些組合物被提供為適合于口服或非胃腸道給藥的劑型。
具體而言，口服的組合物的例子包括固體和液體劑型，包括片劑 如糖衣片劑和薄膜片劑、丸劑、顆粒、粉末、膠囊例如軟膠囊、糖漿、 乳劑和懸浮劑。這樣的組合物使用現(xiàn)有的方法制備，并且含有在藥物 領(lǐng)域常用的載體、稀釋劑或賦形劑。用于片劑的載體或賦形劑的例子 包括乳糖、淀粉、蔗糖和硬脂酸鎂。
用于非胃腸道給藥的組合物的例子包括注射液和栓劑。注射液的 例子包括靜脈內(nèi)注射液、皮下注射液、皮內(nèi)注射液、肌內(nèi)注射液和靜 脈內(nèi)滴注液。這樣的注射液可以用現(xiàn)有方法制備；例如，通過將上述 的抗體或其鹽在注射液常用的無菌水或油液中溶解、懸浮或乳化。用 于注射的水性液體的例子包括鹽水和含有葡萄糖或其它佐劑的等滲溶 液，可以與適當(dāng)?shù)闹軇┙Y(jié)合使用，包括醇類如乙醇；多元醇如丙二 醇和聚乙二醇；非離子性表面活性劑如聚山梨酸酯80和HCO-50(氫化 的蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加成物)。油狀液體的例子包括芝麻油和大豆油，可以與助溶劑如芐基苯甲酸和芐醇結(jié)合使用。這樣制備的注射 液一般填充在適當(dāng)?shù)陌碴持?。用于直腸給藥的栓劑一般通過將上述的 抗體或其鹽與常用的栓劑基質(zhì)混合而制備。
口服或非胃腸道給藥的藥物組合物方便地制備成適合于活性組合 物的劑型。這樣的單位劑型的例子包括片劑、丸劑、膠囊、注射劑(安
瓿)和栓劑。每個(gè)單位劑型優(yōu)選一般含有大約5到500mg上述抗體。特 別是，注射劑含有5到100mg，而另外的劑型含有10到250mg。
每個(gè)上述的組合物可以含有其它的活性組合物，只要當(dāng)它們與抗 體復(fù)合時(shí)不產(chǎn)生不需要的相互作用。
(7)轉(zhuǎn)化DNA的動(dòng)物
本發(fā)明提供了非人類的哺乳動(dòng)物，例如一個(gè)"敲入"動(dòng)物，它含 有編碼本發(fā)明的人源致癌蛋白的DNA(以下稱為"本發(fā)明的癌基因 DNA")或其變體DNA。
具體來說，本發(fā)明提供了
(1) 一個(gè)具有本發(fā)明的人源癌基因DNA或其變體DNA的非人類哺
乳動(dòng)物("敲入"動(dòng)物)；
(2) "敲入"動(dòng)物，其中非人類哺乳動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物；
(3) "敲入"大鼠或小鼠，其中嚙齒動(dòng)物是大鼠或小鼠；以及
(4) 一個(gè)重組載體，其中含有可以在非人類哺乳動(dòng)物中表達(dá)的本發(fā) 明的人源癌基因DNA或其變體DNA。
含有本發(fā)明的人源癌基因DNA或其變體DNA的非人類哺乳動(dòng)物 (以下稱為"本發(fā)明的轉(zhuǎn)化DNA的動(dòng)物")可以通過將所需的DNA轉(zhuǎn) 入一個(gè)未受精的卵、 一個(gè)受精卵、 一個(gè)精子或生殖細(xì)胞包括它們的原 始細(xì)胞而產(chǎn)生，優(yōu)選為在非人類哺乳動(dòng)物發(fā)育的胚胎發(fā)生階段(更優(yōu)選 為在單細(xì)胞或受精卵細(xì)胞階段并且通常直到8細(xì)胞階段)，可以使用適當(dāng)?shù)姆椒ɡ缌姿徕}方法、電脈沖方法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、凝聚、微注射、
微粒槍法和DEAE-葡聚糖進(jìn)行。通過DNA轉(zhuǎn)化方法，可以將本發(fā)明所 需的外源DNA轉(zhuǎn)化到體細(xì)胞、活器官或組織細(xì)胞中，用于細(xì)胞培養(yǎng)或 組織培養(yǎng)。此外，可以通過現(xiàn)有的細(xì)胞融合方法將細(xì)胞與上述的生發(fā) 細(xì)胞融合，以產(chǎn)生本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化的動(dòng)物。
非人類哺乳動(dòng)物的例子包括牛、豬、綿羊、山羊、兔、狗、貓、
豚鼠、倉鼠、小鼠和大鼠。在這些動(dòng)物中，優(yōu)選的為嚙齒動(dòng)物，特別 是小鼠(例如純系如C57BL/6和DBA2株，以及雜交系如B6C3F, 、 BDF!、 B6D2F^ BALB/c、 ICR株)或大鼠(例如，Wistar和SD)，因?yàn)閷?duì)于產(chǎn) 生一個(gè)疾病動(dòng)物模型來說，它們的個(gè)體發(fā)育和生物學(xué)周期相對(duì)較短， 并且易于飼養(yǎng)。
對(duì)于能夠在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的重組載體而言，"哺乳動(dòng)物"除了 上述的非人類哺乳動(dòng)物外，還可以是人。
本發(fā)明的人源癌基因的變體DNA不是指在非人類哺乳動(dòng)物中天 生的與本發(fā)明的癌基因類似的DNA，而是人工突變的DNA。
本發(fā)明的變體DNA可以是這樣的本發(fā)明的人源癌基因DNA，其 原始核苷酸序列已經(jīng)改變(例如，突變)，諸如添加了一個(gè)堿基、缺失、 或用其它堿基取代的DNA，或是一個(gè)異常的DNA。
異常的DNA是指一個(gè)DNA，它能夠表達(dá)與本發(fā)明的正常致癌蛋 白相同但活性不同的蛋白；例如一個(gè)DNA，它表達(dá)了一個(gè)本發(fā)明的正 常致癌蛋白的活性被抑制的肽。
為了將本發(fā)明的癌基因DNA轉(zhuǎn)化入靶非人類哺乳動(dòng)物，一般來說 優(yōu)選使用的DNA為結(jié)合在一個(gè)能夠在非人類動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)DNA的 啟動(dòng)子的下游的DNA構(gòu)建體。例如，當(dāng)轉(zhuǎn)化本發(fā)明的人源DNA時(shí)，
41已經(jīng)結(jié)合了本發(fā)明的人源癌基因DNA的DNA構(gòu)建體(例如，載體)被 微注射到一個(gè)靶非人類哺乳動(dòng)物的受精卵中，例如， 一個(gè)鼠的受精卵， 該DNA構(gòu)建體位于任一的多種啟動(dòng)子的下游，這些啟動(dòng)子能夠表達(dá)從 任何與本發(fā)明的DNA具有較高的同源性的多種非人類哺乳動(dòng)物(例如 兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠、大鼠和小鼠)衍生的DNA，從而產(chǎn)生一個(gè)能 夠高效表達(dá)本發(fā)明的癌基因DNA的DNA轉(zhuǎn)化的非人類哺乳動(dòng)物。
適用于本發(fā)明的致癌蛋白的表達(dá)載體的例子包括大腸桿菌衍生的 質(zhì)粒、枯草芽孢桿菌衍生的質(zhì)粒、酵母衍生的質(zhì)粒、噬菌體如A-噬菌 體、反轉(zhuǎn)錄病毒如莫洛尼白血病病毒和哺乳動(dòng)物病毒如痘苗病毒和桿 狀病毒，優(yōu)選為大腸桿菌衍生的質(zhì)粒、枯草芽孢桿菌衍生的質(zhì)粒和酵 母衍生的質(zhì)粒。
調(diào)控DNA表達(dá)的啟動(dòng)子的例子包括
(i) 從病毒(例如猿猴病毒、巨細(xì)胞病毒、莫洛尼白血病病毒、JC病 毒、乳癌病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒)衍生的DNA的啟動(dòng)子；
(ii) 從各種哺乳動(dòng)物(例如人、兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠、大鼠和小 鼠)衍生的啟動(dòng)子；例如白蛋白、胰島素II、 uroplakinll、彈性蛋白酶、 紅細(xì)胞生成素、內(nèi)皮素、肌酸激酶(muscle cretine kinase)、膠質(zhì)原纖維 酸性蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶'、血小板衍生生長因子(5、角蛋白Kl、 K10和K14、 I和II型膠原蛋白、環(huán)-AMP依賴性蛋白激酶pi亞基、肌 營養(yǎng)不良蛋白、酒石酸抗性堿性磷酸酶、心房鈉利尿因子、內(nèi)皮受體 酪氨酸激酶(一般縮寫為"Tie2")、鈉鉀腺苷三磷酸酶(Na,K-ATPase)、 神經(jīng)絲輕鏈、金屬硫堇I和IIA、金屬蛋白酶-1組織抑制劑、MHCI類 抗原(H-2L)、 H-ms、腎素、多巴胺(5-羥化酶、甲狀腺過氧化物酶(TPO)、 肽鏈延伸因子la(EF-la)、 (3-肌動(dòng)蛋白、oc-和p-肌球蛋白重鏈、肌球蛋 白輕鏈1和2、髓鞘基質(zhì)蛋白、甲狀腺球蛋白、Thy-l、免疫球蛋白、 可變H鏈部分(VNP)、血清淀粉狀P組合物、肌紅蛋白、肌鈣蛋白C、 平滑肌a-肌動(dòng)蛋白、前腦啡肽原A和加壓素啟動(dòng)子。在這些啟動(dòng)子中， 優(yōu)選的為能夠在全身高效表達(dá)的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、人類肽鏈延伸因子lot(EF-la)、人類和禽類(5-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。
上述的載體優(yōu)選包含在DNA轉(zhuǎn)化的非人類哺乳動(dòng)物中能夠終止 所需信使RNA轉(zhuǎn)錄的序列(一般稱為"終止子")。例如可以使用來自 牛或多種哺乳動(dòng)物的DNA序列，優(yōu)選為猿猴病毒SV40終止子。
此外，如果需要，可以給每個(gè)DNA連接上剪接信號(hào)，在啟動(dòng)子區(qū) 的5，-上游中、在啟動(dòng)子區(qū)和翻譯區(qū)之間或在翻譯區(qū)的3'-下游連入增強(qiáng) 子區(qū)或一部分真核DNA內(nèi)含子以更高地表達(dá)所需的癌基因DNA。
使用從人源的肝、腎或甲狀腺細(xì)胞得到的全部或部分基因組 DNA、來自成纖維細(xì)胞的DNA或各種市售的基因組DNA文庫，或是 通過現(xiàn)有方法從來自肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的RNA 制備的互補(bǔ)DNA作為起始材料，可以獲得本發(fā)明的正常致癌蛋白的翻 譯區(qū)。為了通過突變誘導(dǎo)產(chǎn)生異常的DNA，可以通過點(diǎn)突變誘導(dǎo)方法 對(duì)從上述細(xì)胞或組織獲得的正常肽的翻譯區(qū)進(jìn)行突變以產(chǎn)生突變的翻 譯區(qū)。
可以通過常用的DNA工程步驟將翻譯區(qū)產(chǎn)生為能夠在DNA轉(zhuǎn)化 的動(dòng)物中表達(dá)的DNA構(gòu)建體，其中翻譯區(qū)被連接在啟動(dòng)子的下游，或 者如果需要，可以連接在轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的上游。
本發(fā)明的人源癌基因DNA在受精卵細(xì)胞階段進(jìn)行轉(zhuǎn)移以便DNA 被靶非人類哺乳動(dòng)物中所有的生殖細(xì)胞和體細(xì)胞所攜帶。在一個(gè)DNA 轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的動(dòng)物的生殖細(xì)胞中存在本發(fā)明的癌基因DNA意味著產(chǎn)生
的動(dòng)物的所有后裔在它們的所有生殖細(xì)胞和體細(xì)胞中都攜帶本發(fā)明的 癌基因DNA。這類遺傳了本發(fā)明的癌基因DNA的動(dòng)物的后代在它們 的所有生殖細(xì)胞和體細(xì)胞中都攜帶本發(fā)明的癌基因DNA。
轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的人源的癌基因DNA的非人類哺乳動(dòng)物，在經(jīng)過交配證實(shí)了該哺乳動(dòng)物穩(wěn)定地?cái)y帶了人源的癌基因DNA后，可以作為攜
帶癌基因DNA的哺乳動(dòng)物在常規(guī)的繁殖條件下連續(xù)地繁殖。
本發(fā)明的人源癌基因DNA在受精卵細(xì)胞階段進(jìn)行轉(zhuǎn)移以便DNA 被靶非人類哺乳動(dòng)物中所有的生殖細(xì)胞和體細(xì)胞所攜帶。在一個(gè)DNA 轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞中存在本發(fā)明的癌基因DNA意味著 產(chǎn)生的動(dòng)物的所有后裔在它們的所有生殖細(xì)胞和體細(xì)胞中都攜帶本發(fā) 明的癌基因DNA。這類遺傳了本發(fā)明的人源癌基因DNA的動(dòng)物的后 代在它們的所有生殖細(xì)胞和體細(xì)胞中都攜帶本發(fā)明的癌基因DNA。
可以產(chǎn)生在兩條同源染色體上都帶有轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA的純合動(dòng)物，并 且雄性和雌性動(dòng)物可以交配以連續(xù)地繁殖，以便所有的后代都連續(xù)地 帶有DNA。
在具有本發(fā)明的人源癌基因DNA的非人類哺乳動(dòng)物中，本發(fā)明的 正常DNA高效表達(dá)，固有的正常DNA的活性可以被促進(jìn)，有時(shí)會(huì)導(dǎo) 致出現(xiàn)本發(fā)明的蛋白的活性過強(qiáng)。因此，它可以被用作疾病的模型動(dòng) 物。例如，本發(fā)明的正常DNA轉(zhuǎn)化的動(dòng)物可以被用來解釋本發(fā)明的致 癌蛋白活性過強(qiáng)的機(jī)制、或是與本發(fā)明的致癌蛋白相關(guān)的疾病的機(jī)制， 還可用來研究這些疾病的治療。
此外，因?yàn)檗D(zhuǎn)化了本發(fā)明的人源的癌基因DNA的非人類哺乳動(dòng)物 表現(xiàn)出本發(fā)明的游離蛋白量的增加，因此可用于篩選針對(duì)與本發(fā)明的 致癌蛋白相關(guān)的疾病的治療劑。
另一方面，帶有異常的本發(fā)明的DNA的非人類哺乳動(dòng)物，在經(jīng)過 交配證實(shí)了該動(dòng)物穩(wěn)定地?cái)y帶了轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA后，可以作為攜帶DNA 的動(dòng)物在常規(guī)的繁殖條件下連續(xù)地繁殖。此外，所需的異常DNA可以 整合到上述的質(zhì)粒中作為起始材料。帶有啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體可以通 過常規(guī)的DNA工程過程產(chǎn)生。異常的本發(fā)明的DNA在受精卵細(xì)胞階段被轉(zhuǎn)化，以便DNA被靶哺乳動(dòng)物中所有的生殖細(xì)胞和體細(xì)胞所攜帶。 在DNA轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的動(dòng)物的生殖細(xì)胞中存在異常的本發(fā)明的DNA意 味著產(chǎn)生的動(dòng)物的所有后裔在它們的所有生殖細(xì)胞和體細(xì)胞中都攜帶 異常的本發(fā)明的DNA。這類遺傳了異常的本發(fā)明的DNA的動(dòng)物的后 代在它們的所有生殖細(xì)胞和體細(xì)胞中都攜帶異常的本發(fā)明的DNA?？?以產(chǎn)生在兩條同源染色體上都帶有轉(zhuǎn)化的DNA的純合動(dòng)物，并且雄性 和雌性動(dòng)物可以交配以連續(xù)地繁殖，以便所有的后代都連續(xù)地帶有 DNA。
在具有異常的本發(fā)明的DNA的非人類哺乳動(dòng)物中，異常的本發(fā)明 的DNA高效表達(dá)，固有的正常DNA的活性可以被抑制，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致 本發(fā)明的蛋白的失活型的失效。因此，它可以被用作疾病的模型動(dòng)物。 例如，本發(fā)明的異常DNA轉(zhuǎn)化的動(dòng)物可以被用來解釋本發(fā)明的致癌蛋 白失活型不應(yīng)性的機(jī)制，還可用來研究這些疾病的治療。
作為一種特殊的應(yīng)用，高度表達(dá)異常的本發(fā)明的DNA的動(dòng)物可以 用作一個(gè)模型，以解釋在本發(fā)明的蛋白的失活型不應(yīng)性中異常的本發(fā) 明的肽對(duì)正常肽活性的抑制(顯著的負(fù)活性)。
此外，因?yàn)檗D(zhuǎn)化了異常的本發(fā)明的DNA的非人類哺乳動(dòng)物表現(xiàn)出 本發(fā)明的游離致癌蛋白量的增加，因此可用于篩選針對(duì)致癌蛋白或其 失活型不應(yīng)性的治療劑。
本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化的動(dòng)物可用于研究與本發(fā)明的致癌蛋白相關(guān) 的疾病的臨床癥狀，例如本發(fā)明的蛋白的失活型不應(yīng)性。此外，動(dòng)物 可以在與本發(fā)明的致癌蛋白相關(guān)的疾病模型中給出每個(gè)器官的更特異 的病理觀察，并且對(duì)新的療法的開發(fā)以及研究和治療由于上述疾病引 起的第二種疾病有貢獻(xiàn)。
可以從本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化的動(dòng)物中提取每個(gè)器官、切碎，用蛋白
45酶如胰蛋白酶處理以獲得游離的DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。然后將細(xì)胞進(jìn)行培 養(yǎng)，并將培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行世系研究。此外，它還可用于鑒定產(chǎn)生本發(fā) 明的致癌蛋白的細(xì)胞，以及研究其中與細(xì)胞凋亡(apotosis)、分化或生 長或信號(hào)傳導(dǎo)和畸形有關(guān)的機(jī)制。因此，它可以成為一種有效的研究 對(duì)象，用來闡明本發(fā)明的致癌蛋白及其活性。
此外，為了開發(fā)針對(duì)與本發(fā)明的致癌蛋白相關(guān)的疾病如本發(fā)明的 蛋白的失活型不應(yīng)性的治療劑，本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化的動(dòng)物可用于提供 一種有效和快速的篩選方法，使用上述的測試和分析步驟進(jìn)行篩選。
一個(gè)其類似于本發(fā)明的癌基因的基因DNA是失活的非人類哺乳 動(dòng)物的生殖干細(xì)胞，對(duì)于產(chǎn)生不足以表達(dá)本發(fā)明的癌基因DNA的非人 類哺乳動(dòng)物模型是非常有用的。 一個(gè)其類似于本發(fā)明的癌基因的基因 DNA表達(dá)不足的非人類哺乳動(dòng)物不具有可以被本發(fā)明的致癌蛋白誘導(dǎo) 的各種生物活性。因此，它可以作為一個(gè)模型用于本發(fā)明的致癌蛋白 的生物活性失活所引起的疾病。因此，它對(duì)于闡明疾病的原因以及研 究其治療方法是有用的。
(8a)篩選針對(duì)由本發(fā)明的癌基因DNA缺失或損壞而引起的疾病的治療 或預(yù)防化合物的方法
一個(gè)其本發(fā)明的DNA表達(dá)不足的非人類哺乳動(dòng)物可以用來篩選 針對(duì)由本發(fā)明的DNA缺失或損壞而引起的疾病的治療或預(yù)防化合物。
因此，本發(fā)明提供了一種用于篩選針對(duì)由本發(fā)明的DNA缺失或損 壞而引起的疾病的治療或預(yù)防化合物或其鹽的方法，包括下列步驟-將測試化合物施用給本發(fā)明的DNA表達(dá)不足的非人類哺乳動(dòng)物，然后 觀察和/或測定動(dòng)物中的變化。
用于篩選過程的本發(fā)明的DNA表達(dá)不足的非人類哺乳動(dòng)物可以 如前所述的非人類哺乳動(dòng)物。測試化合物的例子包括肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、發(fā) 酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取物、植物提取物、動(dòng)物組織提取物和血漿，它們可 以是新的也可以是已知的化合物。
(8b)篩選促進(jìn)或抑制本發(fā)明的癌基因DNA的啟動(dòng)子活性的化合物
本發(fā)明提供了一種篩選促進(jìn)或抑制本發(fā)明的癌基因DNA的啟動(dòng) 子活性的化合物或其鹽的方法，包括下列步驟將測試化合物施用給 本發(fā)明的DNA表達(dá)不足的非人類哺乳動(dòng)物，然后測定報(bào)告基因的表達(dá)。
在篩選方法中，在本發(fā)明的DNA表達(dá)不足的非人類哺乳動(dòng)物中， 本發(fā)明的DNA表達(dá)不足的非人類哺乳動(dòng)物可以是這樣的動(dòng)物，其中本 發(fā)明的DNA由于轉(zhuǎn)導(dǎo)了報(bào)告基因而失活，并且報(bào)告基因可以在本發(fā)明 的DNA的啟動(dòng)子控制下表達(dá)。
測試化合物的例子包括肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、發(fā) 酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取物、植物提取物、動(dòng)物組織提取物和血漿，它們可 以是新的也可以是已知的化合物。
可以使用的報(bào)告基因可以如前所述；適當(dāng)?shù)膒-半乳糖苷酶基因 (lacZ)、可溶性堿性磷酸酶基因和熒光素酶基因。
在本發(fā)明的癌基因DNA被報(bào)告基因取代了的本發(fā)明的DNA表達(dá) 不足的非人類哺乳動(dòng)物中，報(bào)告基因在本發(fā)明的DNA的啟動(dòng)子控制之 下，以便可以跟蹤報(bào)告基因編碼的物質(zhì)以檢測啟動(dòng)子的活性。
例如，當(dāng)編碼本發(fā)明的致癌蛋白的DNA區(qū)的一部分被一個(gè)來自大 腸桿菌的P-半乳糖苷酶基因(lacZ)所取代時(shí)，(3-半乳糖苷酶代替了本發(fā) 明的致癌蛋白在自然情況下表達(dá)本發(fā)明的致癌蛋白的組織中表達(dá)。因 此，例如通過用p-半乳糖苷酶的底物如5-溴-4-氯-3』引哚-(3-半乳糖吡喃糖苷(X-gal)作為試劑進(jìn)行染色，就可以方便地觀察在活動(dòng)物中本發(fā)明 的致癌蛋白的表達(dá)狀態(tài)。具體來說， 一個(gè)與本發(fā)明的致癌蛋白同源的 蛋白缺陷的小鼠或其組織切片通過例如戊二醛進(jìn)行固定，用磷酸鹽緩 沖液(PBS)沖洗，然后在室溫或大約37'C下與含有X-gal的染色液反應(yīng) 30分鐘到1小時(shí)。這樣獲得的組織樣品用lmMEDTA/PBS沖洗以終止 (3-半乳糖苷酶的反應(yīng)，然后可以觀察到顏色。此外，編碼lacZ的mRNA 也可以這樣檢測。
使用上述篩選方法獲得的化合物或其鹽選自上述的測試化合物， 所述測試化合物能夠促進(jìn)或抑制本發(fā)明的癌基因DNA的啟動(dòng)子活性。
通過上述篩選方法選出的化合物可以形成鹽，可以是生理可接受 的酸(例如無機(jī)酸)或堿(例如有機(jī)堿)的鹽，優(yōu)選為酸加成的鹽。這樣的 鹽的例子包括無機(jī)酸如鹽酸、磷酸、氫溴酸和硫酸、或有機(jī)酸如乙酸、 甲酸、丙酸、延胡索酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、 草酸、甲基磺酸和苯甲基磺酸的鹽。
因?yàn)榇龠M(jìn)本發(fā)明的癌基因DNA的啟動(dòng)子活性的化合物或其鹽促 進(jìn)肽的活性，它在作為例如預(yù)防和治療劑用于與本發(fā)明的致癌蛋白不 足相關(guān)的疾病的醫(yī)用藥物方面是有用的。
在另一方面，抑制編碼本發(fā)明的致癌蛋白的DNA的啟動(dòng)子活性的 化合物及其鹽，在作為安全低毒的抑制本發(fā)明的致癌蛋白的癌癥誘導(dǎo) 活性的藥物，例如作為癌癥如肺癌、腎癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、卵 巢癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、直腸癌 和胰腺癌的預(yù)防或治療劑方面是有用的。
從上述篩選選出的化合物的衍生物也可以使用。
含有通過篩選方法選出的化合物或其鹽的藥物可以制備成適合于
48運(yùn)送到靶癌組織的劑型，如同含有針對(duì)給定癌癥的現(xiàn)有的抗癌藥的藥 物。
因?yàn)檫@樣制備的劑型是安全和低毒的，它可以施用給主要的接受
者人或可以預(yù)期獲得同樣的療效的哺乳動(dòng)物(如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、 綿羊、豬、牛、馬、貓、狗和猴)。
化合物或其鹽的劑量依賴于多種因素例如靶疾病、接受者和給藥
路線而改變。例如，口服施用抑制本發(fā)明的DNA的啟動(dòng)子活性的化合 物來治療癌癥，它的劑量對(duì)于正常成年病人(體重60公斤)來說每天為 大約0.1到100mg，優(yōu)選為大約l.O到50mg，更優(yōu)選為大約1.0到20mg。 盡管化合物的劑量依賴于多種因素如接受者和靶疾病而改變，但在非 腸道給藥時(shí)，在給一個(gè)正常的成年病人(體重60公斤)使用抑制本發(fā)明 的DNA的啟動(dòng)子活性的化合物治療癌癥時(shí)，每天靜脈內(nèi)注射的適當(dāng)劑 量為大約0.01至ij 30mg，優(yōu)選為大約0.1至ij 20mg，更優(yōu)選為大約0.1 到lOmg。對(duì)于其它的動(dòng)物，可以施用將重量轉(zhuǎn)換為60公斤的量。
因此，本發(fā)明的癌基因DNA表達(dá)不足的非人類哺乳動(dòng)物，對(duì)于篩 選促進(jìn)或抑制本發(fā)明的癌基因DNA的啟動(dòng)子活性的化合物或其鹽來說 是相當(dāng)有用的，并且對(duì)賴明由于本發(fā)明的癌基因DNA表達(dá)不足引起的 各種疾病的原因，以及開發(fā)用于疾病的預(yù)防或治療劑，具有極大的貢 獻(xiàn)。
此外，使用含有本發(fā)明的致癌蛋白的啟動(dòng)子區(qū)域的DNA，編碼給 定蛋白的基因可以連接在下游位點(diǎn)，并且產(chǎn)物可以被注射到動(dòng)物卵細(xì) 胞中以產(chǎn)生所謂的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(滲入基因的動(dòng)物)，以便可以特異性地引 起癌基因的體內(nèi)表達(dá)而同時(shí)避免癌變。此外，合適的報(bào)告基因可以連 接到啟動(dòng)子區(qū)以建立一個(gè)表達(dá)基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，可以用作一個(gè)體內(nèi) 搜索系統(tǒng)，用于搜索能夠特異性促進(jìn)或抑制本發(fā)明自身的致癌蛋白的 體內(nèi)生產(chǎn)能力的低分子量化合物。20091 當(dāng)被用于預(yù)防或治療癌癥時(shí)，調(diào)節(jié)本發(fā)明的致癌蛋白的活性的化
合物或其鹽可以和其它的抗癌試劑結(jié)合使用，例如ifosfamide、 UTF、 阿霉素、博來霉素(peplomycin)、順氯氨鉑、環(huán)磷酰胺、5-FU、 UFT、 氨甲蝶呤、絲裂霉素C和米托蒽醌。
實(shí)施例
參考實(shí)施例本發(fā)明將更為具體。這些實(shí)施例包含在本發(fā)明的最優(yōu) 選實(shí)施方案中，但是本發(fā)明不限于這些實(shí)施方案。
實(shí)施例1
編碼人的hWAPL的cDNA的克隆和測序
使用市售的cDNA文庫、人的睪丸cDNA試劑盒 (Marathon-Ready cDNA Kit; Clontech Inc.)作為模板，使用下述兩個(gè)引 物進(jìn)行PCR:
引物l
(j^列:TTGGATCCATGACATCCAGATTTGGGAAAACATACAGTAGG);禾口
引物2
(序歹U: TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCAATCACTCTAGA)。 在PCR反應(yīng)中使用了 Advantage 2聚合酶混合物試劑盒(Clontech Inc.),
參考試劑盒的說明用下列的溫度循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增
(1) 94 °C 1分鐘；
(2) 94°C 10秒，72°C 2分鐘，共5個(gè)循環(huán)；
(3) 96°C 10秒，70°C 2分鐘，共25個(gè)循環(huán)，然后在72。C進(jìn) 行延伸反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)后，參考pGEM-Teasy (PROMEGA)的使用說 明，將獲得的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物被克隆到質(zhì)粒載體pGEM-T easy (PROMEGA)中。它被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a (Invitrogen)中，利用質(zhì)粒 載體pGEM-Teasy上的氨卞青霉素抗性基因，在含有氨卞青霉素的LB 瓊脂培養(yǎng)基上篩選帶有質(zhì)粒的克隆。每個(gè)選出的克隆帶有的質(zhì)粒被測序，獲得克隆的新的CDNA的序
列(SEQ.ID.No.2)。含有從cDNA核苷酸序列中的ORF推導(dǎo)出的氨基酸 序列(SEQ.ID.No.l)的新的蛋白被命名為人的WAPL(hWAPL)。帶有克 隆在質(zhì)粒中的全長hWAPL cDNA的轉(zhuǎn)化子被命名為大腸桿菌DH5 pGEMhWAPL。
實(shí)施例2
hWAPL基因在人癌組織中的表達(dá)
在東京醫(yī)學(xué)院醫(yī)院外科切除癌組織的受試病人的同意之下，提供 了外科切除的癌組織的樣品。通過Northern雜交和實(shí)時(shí)PCR檢測了在 外科切除的癌組織的樣品中存在hWAPL基因的表達(dá)，并測定了其表達(dá)
在Northern雜交中，利用具有與SEQ.ID.No.2的hWAPL全長序 列中的核酸從2511到2813的部分互補(bǔ)的核苷酸序列的DNA為檢測探 針，從制備的總RNA中鑒定了從hWAPL表達(dá)的mRNA。另一方面， 在實(shí)時(shí)PCR中，使用擴(kuò)增試劑盒SYBR Green I (TaKaRa Co. Ltd.)和下 列的PCR引物對(duì)作為引物，擴(kuò)增了 hWAPL的cDNA:
5, -G AATTC ATAGGC ACAGCGCTGAACTGTGTG-3'禾口 5 ，匿TTGAATTCCTAGC AATGTTCC AAATATTC 3'
此外，人的P-肌動(dòng)蛋白被用作內(nèi)在的標(biāo)準(zhǔn)。用于擴(kuò)增人的P-肌動(dòng) 蛋白的cDNA的PCR引物是市售的引物對(duì)(Clontech): 5 ， -GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3'和 5' -TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3'。
實(shí)時(shí)PCR選擇的熱循環(huán)條件如下
(a) 95。C 30秒；
(b) 95°C 3秒，68°C 30秒，共40個(gè)循環(huán)；然后
(c) 87。C 6秒。對(duì)于PCR反應(yīng)中的熱循環(huán)，使用了 Smart Cyder System (TaKaRa Co.Ltd.)。雙鏈cDNA的量通過熒光標(biāo)記的方法檢測，以測定擴(kuò)增產(chǎn)物 的量。
對(duì)于上面提到的癌組織樣品，總RNA的比較樣品是根據(jù)現(xiàn)有的方 法(Oikawa等，Cancer Res., 61， 5707-5709 (2001))，從每個(gè)組織的正常 細(xì)胞和癌細(xì)胞中制備的。在被檢測宮頸癌、子宮體癌、卵巢癌、胃癌、 腎癌、肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌的癌細(xì)胞之中，大約40%的宮頸癌癌細(xì) 胞樣品表現(xiàn)出明顯的hWAPL基因表達(dá)(圖5)。
檢測宮頸癌的癌細(xì)胞樣品中是否存在HPV的感染。具體來說，參 考現(xiàn)有的方法(Nakagawa等，J. Med. Virol., 62, 251-258 (2000))，使用相 應(yīng)的引物通過RT-PCR檢測了來自HPV的E6/E7基因的mRNA區(qū)域， 并且在所有侵入性宮頸癌癌細(xì)胞樣品中，HPV的感染和E6/E7基因的 表達(dá)都被證實(shí)了。意外的是， 一些胃癌樣品也表現(xiàn)出hWAPL基因的高 表達(dá)。
實(shí)施例3
通過來自HPV 16的E6和E7誘導(dǎo)hWAPL基因的表達(dá)
使用下面的引物對(duì)通過RCR方法擴(kuò)增和分離了來自HPV 16的E6
基因
16E6attBl:
5' - AAAAAGCAGGCTCC ACCATGTTTCAGGACCC ACAGGAGC GACCC-3，，和 16E6attB2:
5 ，-AGAAAGCTGGGTTACAGCTGGGTTTCTCTACGTG-3'
使用下面的引物對(duì)通過RCR方法擴(kuò)增和分離了來自HPV 16的E7
基因16E7attBl:
5 ， - AA AAAGC AGGCTCC ACC ATGC ATGG AG ATAC ACCT ACAT-
3',和
16E6attB2:
5'-AGAAAGCTGGGTTATGGTTTCTGAGAACAGATGGGG-3'
然后，按照Naviaux等的步驟(Naviaux等，J. Virol., 70， 5701-5705 (1996))，每個(gè)這些基因被克隆到反轉(zhuǎn)錄病毒載體pCLXSN中，產(chǎn)生了 分別能夠產(chǎn)生E6和E7重組子的反轉(zhuǎn)錄病毒LXSN-16E6和 LXSN-16E7。此外，同時(shí)產(chǎn)生了能夠產(chǎn)生E6和E7重組子的反轉(zhuǎn)錄病 毒LXSN-16E6E7。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來自HPV的E2基因的產(chǎn)物能夠結(jié)合到E6和E7基因的 啟動(dòng)子區(qū)域，具有抑制其轉(zhuǎn)錄的功能，并且來自牛乳頭瘤病毒(BPV) 的E2基因的產(chǎn)物具有同樣的抑制轉(zhuǎn)錄的功能。以pBPV-MII為模板通 過嵌套PCR獲得了 BPV1 E2基因片段。在嵌套PCR中，所用的內(nèi)側(cè) 引物對(duì)為
5' - AAAAAGC AGGCTCCACC ATGGAGACAGCATGCGAAC-3'和 5' - AGAAAGCTGGGTCAGAAGTCC AAGCTGGCTGTAAAG-3'
所用的外側(cè)引物對(duì)為
5, -GGGG AC AAGTTTGTACAAAAAAGC AGGCT-3'禾卩 5' -GGGGAC AAGTTTGTAC AAGAAAGCTGGGT-3'
這樣獲得的BPVl E2基因片段被克隆到反轉(zhuǎn)錄病毒載體 pCMSVpuro中，這是一個(gè)基于通用目的的病毒載體pCMSV (Clontech) 的載體，制備了能夠產(chǎn)生來自BPV的E2重組子的反轉(zhuǎn)錄病毒 MSCV-puro BPV1E2。反轉(zhuǎn)錄病毒載體pCMSVpuro含有一個(gè)嘌呤霉素 抗性基因作為選擇標(biāo)記。用反轉(zhuǎn)錄病毒LXSN-16E6、 LXSN-16E7和LXSN-16E6E7感染人 表皮細(xì)胞HDKl(BioWhittaker)以分別產(chǎn)生來自HPV16的E6和E7重組 蛋白。使用用反轉(zhuǎn)錄病毒載體pCLXSN感染的人表皮細(xì)胞HDKl作為 陰性對(duì)照。通過將細(xì)胞在含有50ixg/mL G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天， 篩選到了其中建立了連續(xù)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體感染的細(xì)胞系。感染后， 通過Western印跡，使用了識(shí)別致癌蛋白hWAPL的50到66的部分氨 基酸序列區(qū)(氨基酸序列CNFKPDIQEIPKKPKVEE)的特異性抗體，測 定了由來自HPV16的E6或E7重組蛋白誘導(dǎo)的hWAPL基因的表達(dá)(圖 6)。
同時(shí)，通過Western印跡還測定了 p53抑制蛋白的表達(dá)量。然后， 再度證實(shí)了 E6產(chǎn)物促進(jìn)p53腫瘤抑制蛋白的切割，導(dǎo)致了致癌蛋白 hWAPL的表達(dá)。
此外，當(dāng)用MSCV-puro BPV1E2感染宮頸癌的癌細(xì)胞系CaSki、 SiHa和C33A時(shí)，在產(chǎn)生來自HPV16的E6和E7的CaSki和SiHa細(xì) 胞系中，由于來自BPV的E2抑制了E6和E7基因的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出剩 余的p53腫瘤抑制蛋白增加。與此相伴隨，致癌蛋白hWAPL的表達(dá)被 抑制了(圖6)。另一方面，在C33A細(xì)胞系中，誘導(dǎo)其癌變的機(jī)理不是 由HPV感染引起的，剩余的p53腫瘤抑制蛋白的量或致癌蛋白hWAPL 的表達(dá)量不受影響。這個(gè)結(jié)果表明，盡管致癌蛋白hWAPL的表達(dá)量增 加與癌變緊密相關(guān)，可能還存在一種獨(dú)立的機(jī)制能夠引起致癌蛋白 hWAPL的表達(dá)增加，這種機(jī)制不同于由來自HPV的E6和E7導(dǎo)致的 致癌蛋白hWAPL表達(dá)的增加。
實(shí)施例4
p53抑制蛋白抑制hWAPL基因的啟動(dòng)子活性
已經(jīng)證實(shí)了 p53抑制蛋白具有從啟動(dòng)子抑制hWAPL基因轉(zhuǎn)錄的 功能。如下所述。
54以DLD-1細(xì)胞的基因組DNA為模板，使用下述引物對(duì)通過PCR 方法擴(kuò)增和分離了 hWAPL基因的啟動(dòng)子
引物1:
(序列GTGCATCCCACCCACAGTGGAAGACATGG)禾口
引物2:
(序歹'J: CCGCTTCCGCCGGTGAATGGTCAGTGCTGG)。
PCR產(chǎn)物的DNA片段首先被克隆到pGEMT-easy (Promega)中， 然后用限制性酶EcoRI酶切的片段被克隆到pBluescript (Stratagene)中。 用Sall/Xhol酶切含有插入到質(zhì)粒中的hWAPL基因的啟動(dòng)子區(qū)的區(qū)域， 然后克隆到pGL3-Basic載體(Promega)中。
在用 Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen)純化后，使用 LipofectAmine2000 (Invitrogen)將獲得的載體與p53表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞，以pHM6 (Roche)作為對(duì)照，pGR3-tK載體作為熒光素酶分 析的標(biāo)準(zhǔn)。在熒光素酶分析中使用雙熒光素酶試劑盒(Promega)測定標(biāo) 記蛋白熒光素酶的量，熒光素酶作為在hWAPL基因啟動(dòng)子控制下轉(zhuǎn)錄 和翻譯的報(bào)告基因產(chǎn)物。
結(jié)果證實(shí)了當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)p53表達(dá)載體時(shí)，與對(duì)照相比，表達(dá)的p53抑 制蛋白的量的增加減少了 30%的標(biāo)記蛋白熒光素酶的量，而熒光素酶 是在hWAPL基因啟動(dòng)子控制下轉(zhuǎn)錄和翻譯的。換句話說，證實(shí)了p53 抑制蛋白具有導(dǎo)致hWAPL基因啟動(dòng)子活性降低的功能。
實(shí)施例5
構(gòu)建表達(dá)載體生產(chǎn)hWAPL重組蛋白
通過使用PCR的點(diǎn)突變方法在具有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的 cDNA的第1至U 3570堿基區(qū)域的末端分別轉(zhuǎn)導(dǎo)了一個(gè)HindIII和一個(gè) EcoRI限制性位點(diǎn)。獲得的PCR產(chǎn)物用HindlII/EcoRI酶切，相應(yīng)的
DNA片段被插入一個(gè)HA-標(biāo)記的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pHM6 (RocheDiagnostics)中，構(gòu)建了一個(gè)能夠生產(chǎn)重組的HA-標(biāo)記的hWAPL蛋白的 表達(dá)載體pHM6-hWAPL。該片段也被插入一個(gè)用于表達(dá)具有hrGFP融 合部分的融合蛋白的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體phrGFP-Nl (Stratagene)中，以 構(gòu)建一個(gè)能夠生產(chǎn)重組的GFP融合的hWAPL蛋白的表達(dá)載體 phrGFP-hWAPL。
使用LipofectAmine2000 (Invitrogen)將產(chǎn)生重組蛋白的表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染宿主哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2天后，在存在hrGFP標(biāo)記表 達(dá)的基礎(chǔ)上使用EPICS ALYRA HyperSort (Bechman Coulter)進(jìn)行篩選。
在進(jìn)一步培養(yǎng)和另外篩選后，獲得了一個(gè)帶有所需的表達(dá)載體能夠生 產(chǎn)hWAPL重組蛋白的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞系。
實(shí)施例6
針對(duì)hWAPL蛋白的特異性抗體的產(chǎn)生
為了產(chǎn)生針對(duì)致癌蛋白hWAPL的特異性抗體，通過化學(xué)合成制 備了一個(gè)具有位于致癌蛋白hWAPL N-末端區(qū)域的50到66(序列 CNFKPDIQEIPKKPKVEE)部分氨基酸序列的肽鏈(hWAPL5G.66)作為免 疫原肽。此外，通過重組產(chǎn)生了一個(gè)標(biāo)記了 6XH組氨酸的融合多肽， 它含有位于致癌蛋白hWAPL C-末端區(qū)域814到1037的部分氨基酸序 列。
按照常規(guī)的技術(shù)，這兩個(gè)免疫原肽被分別用來免疫兔，以產(chǎn)生特 異性針對(duì)這些抗原肽的多克隆抗體，抗-hWAPL-N抗體和抗-hWAPL-C 抗體。在實(shí)施例3等的Western印跡中，使用特異性針對(duì)hWAPL50.66 抗原的抗-hWAPL-N抗體檢測致癌蛋白hWAPL。
實(shí)施例7
hWAPL蛋白誘導(dǎo)染色體的不穩(wěn)定性
用表達(dá)載體phrGFP-hWAPL感染HeLa細(xì)胞以生產(chǎn)hrGFP融合的 hWAPL重組蛋白。執(zhí)行實(shí)施例5描述的步驟篩選產(chǎn)生GFP-hWAPL融合蛋白的GFP-hWAPL陽性細(xì)胞系和不產(chǎn)生GFP-hWAPL融合蛋白的 GFP-hWAPL陰性細(xì)胞系。在篩選后傳代5代后，根據(jù)Buse的方法(J. Biol. Chem., 274， 7253-7263 (1999))用激光掃描細(xì)胞儀分析染色體基因 DNA的含量。
GFP-hWAPL陰性細(xì)胞系表現(xiàn)出與宿主細(xì)胞HeLa細(xì)胞相當(dāng)?shù)娜旧?體基因含量，其中一半或以上由正常的二倍體組成，四倍體大約為二 倍體的一半。另一方面，在GFP-hWAPL陽性細(xì)胞系中，正常的二倍 體含量少，主要部分為多倍體，四倍體的含量略多于二倍體的含量， 八倍體也存在，含量為10.1%。因此，可以判斷出hWAPL蛋白的過量 表達(dá)誘導(dǎo)了染色體的不穩(wěn)定性(圖7)。
同樣地，核的異型、特別是多核化的誘導(dǎo)也源自于hWAPL蛋白 的過量表達(dá)。在傳代3代以后，觀察到的多核化的比率在GFP-hWAPL 陰性細(xì)胞系和用phrGFP-Nl載體(對(duì)照)感染的HeLa細(xì)胞中分別只是 5%和4%，而在GFP-hWAPL陽性細(xì)胞系中是15.6%(三倍或以上)(圖 8)。
此外，與染色體的畸形、例如在染色體基因有絲分裂的分離過程 中由于異常的著絲粒分裂而產(chǎn)生的核的異型相關(guān)，微核形成的誘導(dǎo)也 是源自于hWAPL蛋白的過量表達(dá)。在GFP-hWAPL陽性細(xì)胞系中微核 形成的頻率大約為在GFP-hWAPL陰性細(xì)胞系中的2倍(圖7)。
實(shí)施例8
hWAPL蛋白誘導(dǎo)NIH 3T3成纖維細(xì)胞的癌變
用表達(dá)載體pHM6-hWAPL感染NIH 3T3成纖維細(xì)胞以產(chǎn)生HA-標(biāo)記的hWAPL重組蛋白，產(chǎn)生了一個(gè)過量表達(dá)HA-標(biāo)記的hWAPL蛋 白的重組細(xì)胞系HA-hWAPL3T3細(xì)胞系。產(chǎn)生了用pHM6載體感染的 HA-3T3細(xì)胞系作為陰性對(duì)照。當(dāng)在平板上培養(yǎng)時(shí)，用于陰性對(duì)照的 HA-3T3細(xì)胞系象宿主細(xì)胞NIH 3T3成纖維細(xì)胞一樣形成了類似均勻地鋪滿的單細(xì)胞層，而HA-hWAPL 3 T3細(xì)胞系則形成了聚集的結(jié)構(gòu)。
對(duì)裸鼠在皮下注射了 HA-hWAPL 3T3細(xì)胞系和HA-3T3細(xì)胞系。 連續(xù)地追蹤表明在IO天內(nèi)，在所有注射了 HA-hWAPL 3T3細(xì)胞系的位 點(diǎn)都誘導(dǎo)了腫瘤發(fā)生，而在注射了 HA-3T3細(xì)胞系的位點(diǎn)沒有誘導(dǎo)腫瘤 發(fā)生。使用抗-HA抗體和抗-hWAPL-C抗體進(jìn)行Western印跡，證實(shí)了 HA-標(biāo)記的hWAPL蛋白在癌變細(xì)胞中確實(shí)過量表達(dá)了。在癌變細(xì)胞中， 觀察到異型的有絲分裂；例如，也觀察到了三極分裂。
實(shí)施例9
使用定向于hWAPL基因的siRNA抑制癌細(xì)胞的生長
使用定向于hWAPL基因的siRNA，證實(shí)了抑制hWAPL蛋白的表 達(dá)可以導(dǎo)致對(duì)癌細(xì)胞生長的抑制。
(l)使用siRNA體外抑制癌細(xì)胞的生長
使用Silencer siRNA構(gòu)建試劑盒(Ambion)，分別生產(chǎn)了定向于下 列基因序列(hWAPL AsiRNA)和對(duì)照(陰性對(duì)照)的siRNA: hWAPL AsiRNA: CGGACTACCCTTAGCACAA 陰性對(duì)照ACTACAACTGGTCGCAACC
在實(shí)際中，針對(duì)每一個(gè)制備了兩個(gè)合成的寡聚體；具體來說，對(duì) 于hWAPL AsiRNA來說，是
AACGGACTACCCTTAGCACAAcctgtctc和 AATTGTGCTAAGGGTAGTCCGcctgtctc
對(duì)于陰性對(duì)照來說，是 AAACTACAACTGGTCGCAACCcctgtctc禾口 AAGGTTGCGACCAGTTGTAGTcctgtctc
然后，在每個(gè)合成的寡聚體中，在ctgtcto部分與T7啟動(dòng)子引物雜交，并用KlenowDNA聚合酶處理以制備完整的雙鏈DNA。然后， 用T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，制備的反義鏈和正義鏈RNA彼此雜交，然后 用Rnase消化兩端的粘性末端，產(chǎn)生了具有平末端的雙鏈siRNA。
在一個(gè)來自宮頸癌的高度表達(dá)hWAPL的SiHa細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)濃度為 lnM的hWAPL AsiRNA和陰性對(duì)照siRNA，以評(píng)估對(duì)細(xì)胞生長的影響。
siRNA被轉(zhuǎn)化到來自HPV16陽性的宮頸癌的SiHa細(xì)胞中，其中 觀察到了 hWAPL的高效表達(dá)。圖10顯示了以活細(xì)胞數(shù)(xlO勺為縱坐標(biāo) 對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)siRNA后的時(shí)間(小時(shí))為橫坐標(biāo)的作圖的結(jié)果。在圖中， "siRNA"指轉(zhuǎn)染定向于DIF-2的siRNA， "cont"指轉(zhuǎn)染對(duì)照的siRNA， "TSA"表明了在轉(zhuǎn)染siRNA后分別向培養(yǎng)物中加入組蛋白脫乙酰酶 抑制劑、制滴菌素A時(shí)獲得的結(jié)果。
直到轉(zhuǎn)染hWAPL AsiRNA后20小時(shí)，可以觀察到活的腫瘤細(xì)胞 數(shù)的增加。在此期間，與對(duì)照進(jìn)行比較，可以表明對(duì)腫瘤生長的抑制。 然后，轉(zhuǎn)導(dǎo)hWAPL AsiRNA的細(xì)胞開始顯示出活細(xì)胞數(shù)量的減少，并 且在100小時(shí)后，只有少量細(xì)胞存活。與之相反，當(dāng)通過加入制滴菌 素A抑制了包含在組蛋白中的乙酰化的賴氨酸的脫乙?；M(jìn)程時(shí)，減 弱了 hWAPL AsiRNA對(duì)細(xì)胞生長的抑制效果。
這些結(jié)果表明通過抑制hWAPL造成的細(xì)胞死亡是由于抑制了組 蛋白的修飾例如乙?；鸬?，并且暗示了 hWAPL本身可能參與了 組蛋白編碼的控制。
(2)體內(nèi)抑制腫瘤生長的效果
對(duì)6周齡的BALB3T3/裸鼠接種2xl(^的SiHa細(xì)胞。從接種后10 天起，對(duì)接種的腫瘤細(xì)胞分別注射hWAPL AsiRNA和陰性對(duì)照siRNA， 兩天一次，共5次。取hWAPL AsiRNA注射組中的6只動(dòng)物、陰性對(duì)照siRNA注射 組中的6只動(dòng)物和未處理組中的5只動(dòng)物，對(duì)接種的腫瘤的大小的變 化進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明，與未處理組相比，hWAPL AsiRNA注射組中 平均的腫瘤大小減少了 33%。
此外，證實(shí)了我們克隆的hWAPL的cDNA核苷酸序列位于人基 因組的10q23.31到q23.32。其核苷酸序列在下面顯示，同時(shí)給出了闡 述的hWAPL基因中5'-非翻譯區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列以及上面的 小鼠WAPL的cDNA核苷酸序列。在cDNA的ORFs中，從起始密碼 子ATG到終止密碼子TAG之間的區(qū)域用大寫字母書寫，而在啟動(dòng)子 區(qū)中，在與EST比較的基礎(chǔ)上推測的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之后的區(qū)域用大寫 字母書寫。
hWAPL的cDNA序列
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CCAGCACTGACCATTCACCGGCGGAAGCG 小鼠WAPL的cDNA序列
ncggccgccagggaggcctaggccctgtccggccggcgcgcctgaggtggggagggaagttgcggg
gccgccgctcaccccccaccccccctgtcgcccgagcttcctatttaccgaagcggagccgcggactgtg
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gcgccgaggggaatatgaaacaggtgtcaaaATGACATCCAGATTTGGAAAAACT
TCAGAATCTAGTGAGGCTGCTCAGCTGgAAGAAGTCACTTCTGTA<formula>formula see original document page 67</formula>ACCATGtgGGcaAAGCAGTGGAGGACTGCaTGAGGGCTATAATTGG
GAACATTGCTAGctgctttacctttgcttcaggtgcttggtaatgctgaagctatccttagacaaag aaaattggatttttatgatcacccgatttcttcatcatgcattctgcgtttgctaaatgacagttactacatcaatc tgcagctatcaaaaatgagggaaaaggttcaggctgttaacaatcccatgcagtatttaaatacacttac
在描述和圖表中，當(dāng)對(duì)核苷酸和/或氨基酸縮寫時(shí)，縮寫與 IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)或本領(lǐng)域的常規(guī)縮寫一致。下面列出 了一些例子。當(dāng)氨基酸存在光學(xué)異構(gòu)體時(shí)，除非特別說明，都是指L-異構(gòu)體。
DNA:脫氧核糖核酸CDNA:互補(bǔ)的脫氧核糖核酸
A:腺嘌呤
T:胸腺嘧啶
G:鳥嘌呤
C:胞嘧啶
I:肌苷
R:腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)
Y:胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C) M:腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C) K:鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)
S:鳥嘌呤(G)或胞嘧啶(C)
W:腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)
B:鳥噤呤(G)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)
D:腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)
V:腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)或胞嘧啶(C)
N:腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)或未知的或 其它堿基
RNA:核糖核酸 mRNA:信使核糖核酸 dATP:脫氧腺苷三磷酸 dTTP:脫氧胸苷三磷酸
dGTP:脫氧鳥苷三磷酸 dCTP:脫氧胞苷三磷酸 ATP:腺苷三磷酸
EDTA:乙二胺四乙酸
SDS:十二烷基硫酸鈉
BHA: 二苯甲基胺
pMBHA:對(duì)-甲基二苯甲基胺
TOS:對(duì)-甲苯磺酰 Bzl:苯甲基Bom:芐氧甲基 BOC:叔-丁氧羰基 DCM: 二氯甲烷
HOBt: 1-羥基苯并三唑 DCC: N，N'-二環(huán)己基碳二亞胺 TFA:三氟乙酸
DIEA: 二.異丙基乙胺
Gly或G:甘氨酸
Ala或A:丙氨酸
Val或V:纈氨酸
Leu或L:亮氨酸
Ile或I:異亮氨酸Ser或S:絲氨酸
Thr或T:蘇氨酸
Cys或C:半胱氨酸
Met或M:甲硫氨酸
Glu或E:谷氨酸
Asp或D:天冬氨酸
Lys或K:賴氨酸
Arg或R:精氨酸
His或H:組氨酸
Phe或F:苯丙氨酸
Tyr或Y:酪氨酸
Trp或W:色氨酸
Pro或P:脯氨酸
Asn或N:天冬酰胺
Ghi或Q:谷氨酰胺
pGhl:焦谷氨酸Tyr(I): 3-碘酪氨酸
DMF: N,N-二甲基甲酰胺Fmoc: N-9-新基甲氧基羰基 Trt:三苯甲基
Pbf: 2,2,4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰
Clt: 2-氯三苯甲基 BU、叔丁基；以及
Met(O):甲硫氨酸亞砜
工業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明的hWAPL癌基因的全長核苷酸序列可用于生產(chǎn)由hWAPL 癌基因編碼的重組hWAPL致癌蛋白，以及用于研究在來自多種上皮細(xì) 胞的細(xì)胞系中hWAPL致癌蛋白的過量表達(dá)誘導(dǎo)癌變的機(jī)理。此外，在 本發(fā)明中，鑒定的hWAPL癌基因的啟動(dòng)子區(qū)可以提供一個(gè)新的靶，在 通過抑制癌基因的轉(zhuǎn)錄從而抑制由hWAPL致癌蛋白的過量表達(dá)所誘 導(dǎo)的癌變的機(jī)制的基礎(chǔ)上，用于研究癌癥的預(yù)防或者治療。此外，生 產(chǎn)本發(fā)明的hWAPL癌基因全長核苷酸序列的重組子，hWAPL致癌蛋 白，可用于制備核酸探針或PCR引物，用于檢測由hWAPL癌基因轉(zhuǎn) 錄引起的mRNA的表達(dá)，或者用于制備特異性抗體，用于檢測翻譯的 hWAPL致癌蛋白肽。因此，這使得使用多種診斷試劑盒檢測直接參與 癌癥發(fā)生的hWAPL癌基因的過量表達(dá)成為可能。
71序列表
〈110〉日本電氣株式會(huì)社(NEC Corporation) 黑田雅彥(Masahiko KURODA)
<120>新的癌基因、從其衍生的重組蛋白及其應(yīng)用 (Novel Cancer Gene And Its Use)
<130> SPI090779-01
<160〉 2
1
〈210〉 <211〉 〈212〉 <213>
PRT 人
<400> 1
Met Thr Ser Arg 1
Ser Ser Lys Phe 20
Thr Lys Trp Gly 35
Pro Asn Phe Lys 50
Glu Glu Glu Ser 65
Ser Leu Pro Val
Tyr Ser Glu Ser 100
Leu Glu Ala Asn 115
Val Ser Asp Lys 130
Lys Ser Thr Asn 145
Asn Lys Leu lie
Glu Lys Asn Ser 180
Phe 5
Asp
Glu
Pro
Thr
Ser 85 Ser
Ser
Cys
Arg
Thr 165 His
Gly
Glu
Thr
Asp
Gly
70
Ser
Glu
Lys
Phe
lie 150 Ser
His
Lys Thr Tyr Ser 10
Val Phe Ser Asn 25
Thr Phe Met Ala 40
lie Gin Glu lie 55
Asp Pro Phe Gly
Lys Asn Leu Ala 90
Ala Ala Gin Leu 105
lie Ser His Val 120
Pro Leu Glu Asp 135
Val Glu Asp Asp
Asp Lys Val Glu 170
lie His Lys Asn 185
Arg Lys Gly Gly Asn Gly
15
Lys Arg Thr Thr Leu Ser 30
Lys Leu Gly Gin Lys Arg 45
Pro Lys Lys Pro Lys Val 60
Phe Asp Ser Asp Asp Glu 75 80 Gin Val Lys Cys Ser Ser
95
Glu Glu Val Thr Ser Val 110
Val Val Glu Asp Thr Val 125
Thr Leu Leu Gly Lys Glu 140
Ala Ser lie Ser Ser Cys 155 160 Asn Phe His Glu Glu His 175
Ala Asp Asp Ser Thr Lys 190Lys Pro
Asp Thr 210 lie Ser 225
Asn Asp
Ser Asp
Glu Asn
Arg Pro 290 Ser Gin 305
Ala Leu
Ala Lys
Gly Arg
Cys Asn 370 Thr Ala 385
Lys Ala
Asn Thr
Asp His
Lys lie 450 Glu Asp 465
Lys Thr Asn Ser Phe Thr
Asn 195 Trp
Pro
Phe
Pro
Leu 275 Thr
Gly
Ala
Lys
Thr 355 Val
Ser
Asp
Lys
Glu 435 Lys
Asp
Ala
Gin
Glu
Ala
Asn
lie
Glu
Leu 260 Asn
Asn
Ala
Lys
Gly 340 Arg
Thr
Thr
lie
Ser 420 Thr
Tyr
Asp
Pro
Asp 500 Asp
Glu
Ser
Lys
Asp 245 Leu
Glu
Cys
Ser
Ala 325 Gly
Asp
lie
Pro
Ala 405 Lys
Gly
Phe
Cys
Ser 485 Ser
Leu
Thr
Gin
Gly 230 lie
Glu
Ala
Arg
Asn 310 Asn
Val
Tyr
Gin
Ala 390 Thr
Lys
Gly
Gly
Gin 470 Pro
Gin
Pro
Thr
Phe 215 Ser
Arg
Met
lie
Thr 295 Phe
Ser
Ser
Thr
Asp 375 Asp
Ser
Asp
Asp
Phe 455 Val
Ser
Ser
Gly
Val 200 Gly
Val
Ser
Lys
Glu 280 Tyr
Asp
Glu
Cys
Val 360 Thr
Leu
Lys
Val
Glu 440 Asp
Glu
Leu
Gly
Val
Ala
Lys
Arg
Glu
Asp 265 Glu
Cys
Lys
Ser
Gly 345 Leu
Met
Gly
Thr
Lys 425 Gly
Asp
Arg
Gin
Thr 505 Pro
Ser
Arg
Thr
Asp 250 Asp
Asp
Arg
Leu
Ser 330 Thr
His
Glu
Glu
Thr 410 Leu
Gly
Leu
Lys
Pro 490 Asn
Glu
Glu
Pro
Gly 235 Cys
Asp
lie
Ala
Met 315 Lys
Ser
Pro
Arg
Ala 395 Thr
Glu
Ser
Ser
Thr 475 Pro
Asn
Ser
lie
Glu 220 Leu
lie
Phe
Val
Asn 300
Asp
Asp
Phe
Ser
Ser 380 Gly
Arg
Phe
Gly
Glu 460
Ser
Pro Ala Val
Lys 205 Ser
Phe
Leu
Lys
Gin 285 Lys
Gly
Gly
Arg
Cys 365 Met
Arg
Phe
Phe
Ser 445 Ser
Lys
Glu
Glu
Lys
Glu
Pro
Glu
Ser
Asn 270 Ser
Thr
Thr
Leu
Gly 350 Leu
Asp
Leu
Arg
Gly 430 Ser
Glu
Lys
Ser
Asn 510 Lys
Thr Asn
Ser Glu
Trp Asp 240 Leu Asp 255
Arg Leu
Val Leu
Lys Ser
Ser Gin 320 Asn Gin 335
Thr Val
Ser Val
Glu Phe
Arg Lys 400 Pro Ser 415
Phe Glu
Asn Tyr
Asp Asp
Arg Thr ■ Asn Asp 495
Leu Asp Pro lieAsn Lys 530 Gly Pro 545
Asn His
515 Gin
Lys
Pro
Gly Arg Asp
Gin Ser Val Thr 580
Asp Gly Val Phe 595
Val Thr lie Pro 610
Cys Arg Arg Glu 625
His Phe Asn Asp
Asp lie Glu Tyr 660
Thr Arg Cys Leu 675
Ser Phe Arg Met 690
Lys Thr Leu Asp 705
Ala Ala Leu Met
Asp Arg Ala Ser 740
Asp Ala Ser Ser 755
Lys Glu Lys lie 770
Asp Leu Glu Asn 785
Ser Leu Thr Ser
Leu Leu Gly Gly 820
Asp His Leu Ser 835
Asp
Ser
Ser 565 Val
Lys
Thr
Asp
Val 645 Leu
Ser
His
Asp
Tyr 725 Leu
Ala
Arg
lie
Lys 805 Leu
Arg
Lys
Pro 550 Glu
Arg
Ala
Gin
Lys 630
Val
Leu
Val
Leu
Ser 710 lie
Asp
Lys
Arg
Thr 790 Arg
Asp
Asp
520
Ser Lys Glu Asn 535
Thr Lys Ala Val
Glu Leu Pro Gly 570
Leu Ser Ser Lys 585
Pro Ala Pro Pro 600
Pro Tyr Gin Asp 615
Glu Leu Tyr Thr
Glu Phe Gly Glu 650
Ser Gly Leu Lys 665
lie Ser Leu Ala 680
Arg Ala His Gly 695
Gin His His Gin
Leu Ser Arg Asp 730
Leu Met lie Arg 745
Leu Leu Asn Glu 760
Leu Cys Glu Thr 775
Thr Gly His Leu
Ala His Glu
Gly
lie
Asp 840
Asp
Val 825 Glu
Trp 810 Asp
Glu
525
Thr Arg Lys lie 540
Tyr Asn Ala Arg 555
Pro Pro Val Val
Glu Pro Asn Gin 590
Ser Lys Val lie 605
lie Val Thr Ala 620
Val Val Gin His 635
Asn Gin Glu Phe
Ser Thr Gin Pro 670
Thr Lys Cys Ala 685
Met Val Ala Met 700
Asn Leu Ser Leu 715
Arg Leu Asn Met
Leu Leu Glu Leu 750
Lys Asp Met Asn 765
Val His Asn Lys 780
Ala Met Glu Thr 795
Phe Lys Glu Glu
Lys Val Lys Glu 830
Lys Leu Val Ala 845
Phe
His
Lys 575 Lys
Lys
Leu
Val
Thr 655 Leu
Met
Val
Cys
Asp 735 Glu
Lys
His
Leu
Leu 815 Cys
Ser
Ser
Trp 560 Pro
Asp
Thr
Lys
Lys 640 Asp
Asn
Pro
Phe
Thr 720 Leu
Gin
lie
Leu
Leu 800 Arg
Val
LeuTrp Gly 850 Asn Pro 865
lie Val
Gin Tyr
Leu Pro
Cys Met 930 Glu Trp 945
Ala Leu Arg Phe Glu Tyr
Ala
Glu
Ser
Asn
His 915 Arg
Gly
Asn
Asp
Ser 995 Phe
Glu Asn Ser
Arg
■ Gin
Ala
Ser
Cys
lie
■ Ala
Arg
Gin
Ala 885 Ala
Asn
lie
Thr
Val 965 Arg
Cys Ser
1010 Arg lie Gly 1025
Leu Glu Arg Leu lie Lys
Cys
Ser 870 Lys
Glu
Val
lie
Lys 950
Leu
Val Asn Ser
Leu 855 Tyr
Ala
Asp
Thr
Gly 935 Thr
Gin
Leu
Arg
Arg
Leu
Leu
Ser
Asn 920 Val
Gly
Val
Gly
Arg Asn Arg His 1000
Asp Ser Ser lie Cys 1015
Gly Gin Val His Ala 1030
Glu Arg Ala Ala Gin 1045
Asp Ala Pro Thr Thr 1060
Val
lie
Gin
lie 905 His
Leu
Glu
Pro
Leu 985 Cys
Leu
Ala
His 890 Cys
Val
Leu
Gin
Lys 970 Gly
Glu
Tyr 875 Cys
Leu
Gly
Asn
Asp 955 Tyr
Leu
Val
Glu
Ser 860 Lys
Glu
Ala
Lys
Leu 940 Gly
Leu
Leu
Asn
Val
Asp
Glu
Asp
Ala 925 Thr
Leu
Pro
lie
Leu Val Asn Met 1005
Ser Gly Glu Gly Asp 1020
Val Gin Ala Leu Val 1035
Leu Ala Glu Ser Lys 1050
Gin His Asp Lys Ser 1065
Thr
Ser
Leu
Ser 910 Val
Asn
lie
Gin
Asn 990 Glu
Asp
Gin
Thr
Val
Gin
lie 895 Lys
Glu
Asp
Gly
Glu 975 Leu
Thr
Ser
Leu
His
Leu 880 Gin
Pro
Asp
Asn
Thr 恥O Gin
Val
Ser
Leu
Phe 1040 Asp Glu 1055 Gly Glu Trp 1070
Gin Glu Thr Ser Gly Glu lie Gin Trp Val Ser Thr Glu Lys Thr Asp
1075 1080 1085
Gly Thr Glu Glu Lys His Lys Lys Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Asp
1090 1095 1100
Leu Asn Lys Ala Leu Gin His Ala Gly Lys His Met Glu Asp Cys lie 1105 1110 1115 1120
Val Ala Ser Tyr Thr Ala Leu Leu Leu Gly Cys Leu Cys Gin Glu Ser
1125 1130 1135
Pro lie Asn Val Thr Thr Val Arg Glu Tyr Leu Pro Glu Gly Asp Phe
1140 1145 1150
Ser lie Met Thr Glu Met Leu Lys Lys Phe Leu Ser Phe Met Asn Leu
1155 1160 1165
Thr Cys Ala Val Gly Thr Thr Gly Gin Lys Ser lie Ser Arg Val lie
751170 1175 Glu Tyr Leu Glu His Cys 1185 1190
1180
<210> 2
〈211〉 3570
<212〉 DNA <213〉人
〈400〉 2
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gstg犯gtct
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catgtggtcg cttgggaaag
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agaaatacag3240
ggaggaggat3300
ggattgcatt3360
aatcaatgta3420
gatgctcaaa3480
gaaatctatc3540
權(quán)利要求
1.一種雙鏈的短鏈干擾RNA，其能夠抑制含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的mRNA在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)，其中siRNA的核苷酸序列為CGGACTACCCTTAGCACAA。
2. —種藥物組合物，其用于抑制含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的 mRNA在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)，從而阻止癌細(xì)胞的生長，其中所述藥 物組合物含有權(quán)利要求1中所述的雙鏈的短鏈干擾RNA。
3. —種引物對(duì)，其用于對(duì)含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的cDNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由下列成對(duì)引物組成核苷酸序列 5，-TTGGATCCATGACATCCAGATTTGGGAAAACATACAGTA GG誦3，；和核苷酸序列A-3，。
4. 一種引物對(duì)，其用于對(duì)含有核苷酸序列SEQ.ID.No.2的cDNA 的部分鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由下列成對(duì)引物組成 -GAATTCATAGGCACAGCGCTGAACTGTGTG-3';禾口 5 ，-TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCA-3'。
全文摘要
本發(fā)明從人中鑒定了一個(gè)新的癌基因的全部核苷酸序列，該癌基因直接參與了例如由HPV感染宮頸上皮細(xì)胞而誘導(dǎo)的宮頸癌的癌變機(jī)制，并鑒定了由該癌基因編碼的致癌蛋白的氨基酸序列，還提供了編碼衍生自新癌基因的致癌蛋白肽鏈的全長多核苷酸，可用于致癌蛋白的重組生產(chǎn)，并提供了由此重組生產(chǎn)的致癌蛋白的肽鏈。具體來說，本發(fā)明提供了來自人的參與了宮頸癌的發(fā)生的新的癌基因多核苷酸，其中含有編碼氨基酸序列SEQ.ID.No.1的核苷酸序列，尤其是SEQ.ID.No.2的核苷酸序列的多核苷酸。
文檔編號(hào)C07K16/32GK101608182SQ20091012616
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2004年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月20日
發(fā)明者黑田雅彥, 齊藤彰 申請(qǐng)人:日本電氣株式會(huì)社;黑田雅彥