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      新的肽以及使用該肽的篩選方法

      文檔序號:3584132閱讀:599來源:國知局
      專利名稱:新的肽以及使用該肽的篩選方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及新的肽、用該肽的篩選方法以及該篩選方法獲得的抗體。具體地說,本發(fā)明涉及與人型抗人IgE單克隆抗體結(jié)合的新肽、使用該肽篩選人型抗人IgE單克隆抗體的方法,以及用該篩選方法獲得的人型抗人IgE單克隆抗體。
      另外,本發(fā)明還涉及以該人型抗人IgE單克隆抗體為有效成分的預(yù)防和/或治療過敏癥的藥物。
      背景技術(shù)
      以往抗體不僅被用來測定抗原和診斷疾病,而且還用來治療疾病。然而,由于抗體有多克隆性等原因,抗體作為治療劑的使用直到最近還受到限制。因此,找到了有特異性的單克隆抗體(MAb)的生產(chǎn)方法(Koehler和Milstein,Nature,(1975)265,295-497),從而使抗體作為治療藥的使用更可能實現(xiàn)。
      許多MAb是通過小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合得到的雜交瘤產(chǎn)生的,所以是小鼠蛋白質(zhì)。然而,關(guān)于從人衍生的MAb的生產(chǎn)的報告卻很少。由于可獲得的MAb幾乎都來自小鼠,所以它們對人顯示出抗原性。因此,在給予人的場合,這些MAb引起了稱為人抗小鼠抗體(HAMA)反應(yīng)的免疫應(yīng)答。即,人對小鼠MAb應(yīng)答產(chǎn)生抗體,完全排除了小鼠MAb或至少降低了其效果,所以小鼠MAb作為人用治療藥實質(zhì)上受到限制。在實踐中,衍生自小鼠的MAb不能用來治療幾次以上。因此,建議制備出對人抗原性降低的非人抗體。這樣的技術(shù)通常稱為“人化”。在該技術(shù)中,采用了對編碼抗體分子多肽序列的DNA序列操作的重組DNA技術(shù)。
      MAb人化的最初方法涉及將小鼠抗體的全部可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合,制成嵌合抗體。這樣的嵌合操作實施方法在歐洲專利0120694(Celltech,Inc)、歐洲專利0012023(Genentech,Inc)、歐洲專利公開公報0171496(科學(xué)技術(shù)振興股份有限公司;日本專利公開公報59-169370)、歐洲專利公開公報0173493(Stanford University)或歐洲專利公開公報0194276(Celltech,Inc)等中報道。此后,公開了更多關(guān)于嵌合抗體的專利申請,其中報道了腫瘤特異性嵌合抗體(歐洲專利0256654,Centocor,Inc)、抗癌胎兒抗原嵌合抗體(歐洲專利公開公報0125023,Genentech,Inc.;歐洲專利0332424,Hybritech,Inc.)等。
      然而,由于這樣的人化嵌合抗體仍然含有相當(dāng)部分的非人氨基酸序列,即含有來自小鼠的可變區(qū),所以在長期給藥的場合,這樣的人化抗體誘發(fā)了某種HAMA反應(yīng)(Begent,等人,Br.J.Cancer,(1990)62,487)。Winter報道了通過用長的寡核苷酸進(jìn)行定點誘變將小鼠MAb的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人免疫球蛋白可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)(FR)內(nèi)(歐洲專利公開公報0239400)。該報道還提到了改變構(gòu)架區(qū)部分氨基酸序列的可能性?,F(xiàn)已報道了通過移植來自識別溶菌酶的小鼠MAb和識別人T細(xì)胞上抗原的小鼠MAb的CDR來制備人MAb(Verhoeyen,等人,Science,(1988)239,1534;Riechmann,等人,Nature,(1988)332,323)。這樣的CDR移植人化抗體中含有的非人氨基酸序列比例較低,因此認(rèn)為嵌合抗體誘發(fā)的HAMA應(yīng)答少。
      在抗體作為疾病診斷藥和治療藥的應(yīng)用中,為了構(gòu)建高度敏感的測定系統(tǒng)和進(jìn)行有效的治療,使用的抗體需要有高的抗原親和性(結(jié)合性)。然而,Riechmann等人指出,單獨移入CDR不足以提供CDR移植抗體能滿足的抗原結(jié)合活性,毗鄰CDR區(qū)域的構(gòu)架區(qū)部分的氨基酸殘基變化對于保持抗原結(jié)合活性是必要的。制得的大多數(shù)CDR移植抗體的親和性比顯著低于原來的小鼠MAb。另外,Queen等人描述了將小鼠MAb(抗Tac抗體)的CDR移植到人免疫球蛋白可變區(qū)的FR中,通過使所得產(chǎn)物與恒定區(qū)結(jié)合,制得與白介素2受體結(jié)合的抗體(Queen,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA(1989)86,10029和WO90/07861)。為使與小鼠抗Tac抗體的序列相同性最高,選擇人的FR區(qū),另外用計算機(jī)模型鑒定出容易與CDR或抗原相互作用的FR氨基酸殘基,用來自小鼠抗體的氨基酸代替人化抗體中的這些氨基酸位置。然而,如此變化得到的抗Tac抗體只有小鼠型抗體的約1/3的親和性。從該例知道,制造保持親和性的CDR移植抗體是不容易的。即,僅僅將供應(yīng)抗體的CDR移植到接受抗體的FR中是不充分的,為了保持親和性,需要對接受抗體的FR中的殘基加以變化。然而,根據(jù)能利用的現(xiàn)有技術(shù),目前不可能預(yù)計哪個殘基應(yīng)當(dāng)變化。
      另一方面,作為人抗體的制備方法,報道了用制備小鼠MAb常用的雜交瘤方法來制備與特定抗原結(jié)合的人MAb的方法。然而,很少有成功的例子。例如,可列舉Carrol,W.L.等人(Carrol,W.L.,等人,J.Immunol.Methods,(1986)89,61)和Strike,L.E.等人(Strike,L.E.,等人,J.Immuno.,(1984)132,1788)等的報告。在這種情況下,為了建立人雜交瘤細(xì)胞,進(jìn)行各種改良,使得人型單克隆抗體的制備成為可能。然而,目前得到的人型抗體所識別的抗原是外來異種蛋白質(zhì),而識別人源蛋白質(zhì)的很少。另外,使用體外致敏方法,目前只能得到對抗原親和性低的抗體。即,如上所述,目前制備人型單克隆抗體不象小鼠MAb那樣容易,需要對制備方法加以改進(jìn)。
      本發(fā)明者設(shè)計了獲得特異性高的人型抗人IgE單克隆自身抗體的方法,成功地用基因工程方法制得了重組抗體。認(rèn)為用該方法制得的重組人抗人IgE抗體可用來治療I型過敏癥。過敏癥是由對過敏原的免疫應(yīng)答引起的疾病狀態(tài),它包括以變應(yīng)原侵入體內(nèi)后立即產(chǎn)生過敏癥為特征的立即型(I型)過敏癥和基于T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞性免疫反應(yīng)的延遲型過敏癥。近年來,術(shù)語“過敏癥”用來表示1型過敏癥。I型變應(yīng)原由變應(yīng)原性刺激引起分化的B細(xì)胞(漿細(xì)胞)所產(chǎn)生的變應(yīng)原特異性IgE抗體引起。分泌的IgE抗體與體內(nèi)循環(huán)的嗜堿細(xì)胞以及組織中存在的肥大細(xì)胞細(xì)胞膜中存在的Fcε受體(FcεR)結(jié)合。如果變應(yīng)原與結(jié)合受體的IgE結(jié)合,則產(chǎn)生由該過敏原介導(dǎo)的FcεR交聯(lián)。結(jié)果,引起細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng),釋放出各種化學(xué)傳遞物質(zhì),例如組胺、前列腺素和白細(xì)胞三烯等化學(xué)介體。已知這些物質(zhì)是引起I性過敏癥的典型臨床癥狀的原因物質(zhì)。
      現(xiàn)在的過敏癥治療方法主要采用兩種方法。一種方法是采用抗組胺藥這樣的阻礙化學(xué)介體的藥物或細(xì)胞增殖抑制劑或用皮質(zhì)醇等免疫抑制劑對過敏癥癥狀進(jìn)行對癥治療。該方法需要反復(fù)給藥,通常伴有不希望的副作用。另一種治療方法是脫敏療法,通過定期給予引起該疾病的變應(yīng)原,以使患者獲得針對特定變應(yīng)原的免疫耐受性。然而,由于不能始終確定特異性變應(yīng)原,該治療在很多情況下沒有效果。而且,該治療方法伴有相當(dāng)?shù)耐纯嗪筒皇娣?,該方法本身并不是沒有危險。上述任何一種方法均不能預(yù)防過敏性癥狀的發(fā)生。
      由于已知I型過敏癥是由IgE增加引起的,因此,嘗試用阻礙變應(yīng)原性反應(yīng)誘發(fā)的初期階段中IgE產(chǎn)生和IgE與嗜堿細(xì)胞和肥大細(xì)胞的結(jié)合的物質(zhì)(尤其是抗體)來預(yù)防和治療I型過敏癥。日本專利公開公報1986-289100或1991-127977中揭示了用針對FcεR抗體來阻礙嗜堿細(xì)胞和肥大細(xì)胞與IgE的結(jié)合,從而來進(jìn)行預(yù)防和治療。另外,關(guān)于用針對IgE的抗體來預(yù)防和治療過敏癥,已經(jīng)公開了已知IgE抗體產(chǎn)生應(yīng)答的方法(日本專利公開公報1991-72500),以及用與細(xì)胞毒素結(jié)合的抗IgE抗體選擇性地殺傷生產(chǎn)IgE的B細(xì)胞,通過除去IgE產(chǎn)生細(xì)胞來進(jìn)行治療的方法(日本專利公開公報1989-102032和1991-501927)。然而,這些例子中采用的抗人IgE抗體是來自山羊或小鼠的抗體或小鼠人嵌合抗體。在治療中使用來自人以外動物的抗體的場合,其在血中的半衰期比人抗體短,而且,由于異源抗體有抗原性,產(chǎn)生了針對該抗體的抗體,因此治療效果減弱或消失。根據(jù)這些原因,治療過敏癥中所用的抗人IgE抗體宜是人型抗體。另外,能適用于過敏癥治療的抗IgE抗體必須識別IgE的Fc部分以至于不引起副作用,而且,為了與血清中僅微量存在的lgE結(jié)合,它必須要有高的親和性。
      發(fā)明揭示為了提供識別人IgE的高親和性人MAb且是過敏癥的根本治療藥,需要人型抗體具有以下特征。
      (1)有對人IgE的特異性。
      (2)有對人IgE的高親和性。
      (3)不誘導(dǎo)有FcεR的細(xì)胞釋放化學(xué)介體。
      (4)與人IgE產(chǎn)生細(xì)胞選擇性地結(jié)合。
      認(rèn)為具有這些特性的人型抗體在血液中與分泌的IgE結(jié)合,或能阻止IgE與FcεR的結(jié)合。另外,認(rèn)為該抗體與細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)或細(xì)胞毒性物質(zhì)的結(jié)合物有效地?fù)p傷IgE產(chǎn)生細(xì)胞,從而能抑制IgE的產(chǎn)生。因此,認(rèn)為具有這些特征的抗體在過敏癥的基本治療和預(yù)防上非常有用。
      鑒于上述情況,本發(fā)明者為獲得副作用少、與IgE特異性結(jié)合的人型抗人IgE單克隆抗體進(jìn)行了深入地研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了可用作獲得這樣的抗體的工具的18個氨基酸組成的新的肽。另外還發(fā)現(xiàn)用該肽可得到具有上述性質(zhì)的人型抗人IgE單克隆抗體。因此,本發(fā)明的課題是提供被人型抗人IgE單克隆抗體識別的新的肽、用該肽來篩選人型抗人IgE單克隆抗體的方法、該篩選方法得到的人型抗人IgE單克隆抗體以及采用該單克隆抗體的過敏癥疾病治療藥。
      本發(fā)明涉及新的肽,具體地說,涉及與人型抗人IgE單克隆抗體結(jié)合的新的肽。本發(fā)明的新的肽可用作篩選高特異性人型抗人IgE單克隆抗體的工具。
      另外,本發(fā)明還涉及使用該肽的篩選方法,具體地說,使用該肽來篩選人型抗人IgE單克隆抗體的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法,可以有效地得到高特異性人型抗人IgE單克隆抗體。
      本發(fā)明還涉及用該篩選方法得到的抗體,具體地說,涉及用該篩選方法獲得的人型抗人IgE單克隆抗體。
      另外,本發(fā)明還涉及以如此得到的抗體作為有效成分的預(yù)防和/或治療過敏癥疾病的藥物。為了預(yù)防和/或治療過敏癥疾病,本發(fā)明的太可作為疫苗與其它佐劑并用。
      本發(fā)明的新肽(下文稱本發(fā)明肽)是根據(jù)人IgE(Elvin A.Kabat,等人,“免疫學(xué)上感興趣的蛋白質(zhì)的序列”第1卷,第5版(1991),美國國立衛(wèi)生研究院出版)設(shè)計的肽。它是由人IgE的CH2-CH3區(qū)域的18個氨基酸組成的部分肽(F349-A369),具有序列表中SEQ ID NO1所示的序列。對本發(fā)明肽序列有特異性的抗體能識別可溶性IgE(分泌型IgE)和IgE產(chǎn)生細(xì)胞表面存在的IgE(膜結(jié)合IgE)的任何一種。本發(fā)明肽很容易用市售的肽合成裝置來合成。例如,可用肽合成儀(Applied Biosystems Inc.;431A型)合成該肽。即,使活性基團(tuán)受保護(hù)的氨基酸吸附在樹脂上,加入去保護(hù)溶液除去保護(hù)基團(tuán),再加入活性基團(tuán)受保護(hù)的氨基酸,使兩者反應(yīng),合成肽。通過重復(fù)該操作,合成得到具有目的序列的肽。肽的保護(hù)基團(tuán)可通過在除去溶液(Applied Biosystems Inc.)中反應(yīng)數(shù)小時來除去,在所得濾液中加入冷的二乙醚,回收得到肽沉淀物。將該肽溶解在2N乙酸中,然后凍干,得到粗制的肽。所得肽粗品可用反相色譜等方法來純化。目標(biāo)肽具有特定的洗脫位置。另外,如此得到的肽的氨基酸序列可用蛋白質(zhì)測序儀進(jìn)行序列分析,用氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸分析來確定。該肽的特征是對與IgE抗體的Fcε有親和性的抗體有高親和性。本發(fā)明肽可用作以預(yù)防和/或治療過敏癥為目的的疫苗。
      利用本發(fā)明的肽可以篩選得到人型抗人IgE單克隆抗體。即,為了制備針對IgE的人抗體,通過雜交瘤方法從體外致敏的人淋巴細(xì)胞建立自身抗體產(chǎn)生細(xì)胞。用所建立細(xì)胞所產(chǎn)生的人型抗人IgE單克隆抗體與本發(fā)明肽的結(jié)合性作為指標(biāo),可以得到有望作為過敏癥治療藥、具有上述特征、特異性高的人型抗人IgE單克隆抗體。針對本發(fā)明肽的結(jié)合活性可以如下測定將本發(fā)明肽制備在固相化板上,在其中加入抗體產(chǎn)生細(xì)胞的培養(yǎng)上清,用EIA法或RIA法等方法測定。通過使用該方法,可以選出產(chǎn)生對人IgE特異性高、有望作為過敏癥治療藥、具有上述特征的人型抗人IgE單克隆抗體的細(xì)胞。
      從如此選出的細(xì)胞克隆出編碼抗體可變區(qū)(VH和VL)的基因。利用編碼該抗體可變區(qū)的DNA,通過基因工程方法可以制得人型抗人IgE單克隆抗體作為重組蛋白質(zhì)。另外,根據(jù)需要,為了制備親和性更高的抗體,用基因工程手段在VH和VL區(qū)的CDR部分中導(dǎo)入隨機(jī)突變,制得抗體DNA文庫,然后使該抗體基因表達(dá),用淘選法選出親和性高的噬菌體抗體,從而可制得表現(xiàn)出高親和性的人型抗人IgE單克隆抗體。
      本發(fā)明的人型抗人IgE單克隆抗體可如下制得。
      (1)抗原宜用純化的人源IgE作為免疫原。它可從正常人或骨髓瘤患者的血清或人IgE產(chǎn)生細(xì)胞的培養(yǎng)上清純化得到。
      (2)雜交瘤細(xì)胞的制備在體外用人IgE作為免疫原對淋巴細(xì)胞進(jìn)行敏化。用聚乙二醇將該致敏(敏化)的淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合。骨髓瘤細(xì)胞可列舉來自人的LICR-LON-HMy2、WI-L2/729HF2、8226AR/NIP4-l和K6H6/B5等。
      (3)雜交瘤細(xì)胞的選擇產(chǎn)生人MAb抗體的雜交瘤細(xì)胞可用denovo DNA復(fù)制抑制劑來選擇。在本發(fā)明實施例所示用K6H6/B5細(xì)胞作為骨髓瘤細(xì)胞的場合,用含有重氮絲氨酸的培養(yǎng)基來選擇。另外,通過分析培養(yǎng)上清,可以僅選出產(chǎn)生目標(biāo)抗體的細(xì)胞作為雜交瘤細(xì)胞。培養(yǎng)上清可通過ELISA法或與IgE產(chǎn)生細(xì)胞的結(jié)合反應(yīng)等來分析。
      (4)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)選出的雜交瘤細(xì)胞可用含有胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基來培養(yǎng)。另外,也可根據(jù)常規(guī)方法培養(yǎng)已導(dǎo)入抗體基因的大腸桿菌等微生物或CHO細(xì)胞等動物細(xì)胞??蓮倪@些菌體或培養(yǎng)上清純化得到抗體。
      (5)抗體的純化來自所得培養(yǎng)上清的抗體可用常規(guī)方法進(jìn)行純化。例如,可使用硫酸銨鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、疏水層析等方法,或者根據(jù)需要將這些方法作適當(dāng)組合。
      (6)抗體的特性鑒定本發(fā)明的人型抗人IgE單克隆抗體不僅對本發(fā)明肽有高度親和性,而且還具有以下特性。
      (i)對人IgE有特異性。
      (ii)對IgE有高親和性。
      (iii)不誘導(dǎo)有FcεRI的細(xì)胞釋放出化學(xué)介體。
      (iv)與人IgE產(chǎn)生細(xì)胞選擇性地結(jié)合。
      本發(fā)明的人型抗人IgE單克隆抗體在血液中與分泌的IgE結(jié)合,又能阻止IgE與FcεR的結(jié)合。另外,認(rèn)為該抗體與細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)或細(xì)胞毒性物質(zhì)的結(jié)合物有效地?fù)p傷IgE產(chǎn)生細(xì)胞,從而能抑制IgE的產(chǎn)生。
      本發(fā)明的人型抗人IgE單克隆抗體可用以下所示的方法來確認(rèn)。
      (a)對IgE的結(jié)合型和特異性該抗體與IgE的結(jié)合性(1)和特異性(2)例如可通過采用固定了人IgE的膜或固定了來自人IgE的肽的微量板的ELISA法、或用人IgE進(jìn)行競爭抑制來確認(rèn)。另外,與IgE產(chǎn)生細(xì)胞的結(jié)合(4)可以這樣來證明用產(chǎn)生人IgE的骨髓瘤細(xì)胞(例如SKO-007或U266Bl等),使這些細(xì)胞與該抗體反應(yīng)后,用ELISA法或流式細(xì)胞計數(shù)法檢測與細(xì)胞結(jié)合的抗體。抗體處理誘發(fā)的化學(xué)介體的釋放(3)可用以下方法來確定,例如,在IgE致敏的周圍血單核細(xì)胞中加入抗體進(jìn)行培育,然后用RIA法或ELISA法定量測定從細(xì)胞中釋放出的組胺等化學(xué)傳遞物質(zhì)。
      (b)IgE產(chǎn)生抑制活性由于單獨的人MAb或人MAb與增殖抑制物質(zhì)或毒性物質(zhì)的結(jié)合物預(yù)計能通過選擇性地?fù)p傷人IgE產(chǎn)生細(xì)胞來抑制IgE的產(chǎn)生,因此這些物質(zhì)可能適合治療過敏癥。合適的細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)是環(huán)磷酰胺等烷基化劑、氨甲喋呤和氟尿嘧啶等代謝拮抗劑以及阿霉素等抗生素等。另外,細(xì)胞毒性物質(zhì)可以是細(xì)胞毒素(例如蓖麻毒素和白喉毒素等)和其A鏈。IgE產(chǎn)生抑制活性可如下確定在單獨的抗體或其與增殖抑制物質(zhì)或毒性物質(zhì)的結(jié)合物的存在下培養(yǎng)標(biāo)的細(xì)胞IgE產(chǎn)生細(xì)胞后,測定殘存的活細(xì)胞數(shù),或用ELISA方法定量測定IgE產(chǎn)生量。
      如此得到的高特異性人型抗人IgE單克隆抗體可列舉本發(fā)明公開的抗體,具體是序列表中SEQ ID NO10(H鏈)和11(L鏈)中所示的抗體。這些抗體可用作以預(yù)防和/或治療過敏癥疾病為目的的醫(yī)藥組合物,或用來建立免疫學(xué)診斷的試劑等。
      本發(fā)明的人型抗人IgE單克隆抗體可以安全地給予人和靈長動物。本發(fā)明蛋白質(zhì)可制成制劑來經(jīng)口或非經(jīng)口給藥。作為醫(yī)藥組合物的形態(tài)可列舉注射用組合物、點滴用組合物、栓劑、經(jīng)鼻劑、舌下劑、經(jīng)皮吸收劑等。這些制劑可根據(jù)公知的制劑學(xué)方法來制成制劑,通過使用藥理學(xué)上容許的載體、賦形劑、穩(wěn)定劑、著色劑、表面活性劑和/或其它添加劑等,制成目標(biāo)制劑。在注射用組合物場合,宜將藥理學(xué)有效量的本發(fā)明人型抗人IgE單克隆抗體與制藥學(xué)上容許的賦形劑/活化劑(如氨基酸、糖類、纖維素衍生物和其它有機(jī)/無機(jī)化合物等)混合。另外,在用本發(fā)明抗體和這些賦形劑/活化劑來配制注射劑的場合,可根據(jù)需要通過常規(guī)方法添加pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑等,制成各種注射劑。
      另外,本發(fā)明的抗體也可用作免疫毒素。免疫毒素最初是制成抗體分子與毒素化學(xué)結(jié)合而成的嵌合分子(Vietta等人.Cell,41653-654(1985);Pastan等人,Ann.Rev.Biochem.61331-354(1992))。在這些分子中,抗體部分參與選擇性結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞,而毒素部分則參與導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì),隨后使細(xì)胞死亡。幾種毒素已被用來制備免疫毒素。例如,已知有蓖麻毒素A鏈、封閉的蓖麻毒素、皂草素、美洲商陸抗病毒蛋白、白喉毒素和假單胞菌外毒素A(Pastan等人,Science 2541173-77(1991);Vietta等人,Semin.Cell Biol.247-58(1991);Tazzari等人,Br.J.Hematol.81203-211(1992);Uckun等人,Blood,792201-14(1992)等。這些毒素是從植物或細(xì)菌得到的蛋白質(zhì),一般由A鏈和B鏈通過二硫鍵結(jié)合而成。該A鏈有阻礙蛋白質(zhì)合成,在導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)后使細(xì)胞死亡的活性。B鏈介導(dǎo)A鏈導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。利用比完全毒素相比副作用少的單單A鏈或A鏈突變體,可制成免疫毒素和抗體或抗體一部分結(jié)合的分子。該免疫毒素的制備可以是將毒素與抗體化學(xué)結(jié)合,也可以是作為基因重組體在大腸桿菌等宿主產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)。由于產(chǎn)生IgE的淋巴細(xì)胞是導(dǎo)致過敏癥,因此本發(fā)明抗體或其片段與毒素的制得的免疫毒素可用來除去產(chǎn)生IgE的淋巴細(xì)胞,從而能預(yù)防和治療過敏癥病發(fā)。
      附圖簡單說明

      圖1顯示了用EIA測定的純化的人型抗人IgE單克隆抗體與P18肽的結(jié)合結(jié)果。
      □本發(fā)明抗體1012G◆本發(fā)明抗體72D○本發(fā)明抗體611B▲本發(fā)明抗體46E圖2顯示了表達(dá)抗體H鏈的載體pCISRα/H的圖譜。
      圖3顯示了表達(dá)抗體L鏈的載體pCISRα/L的圖譜。
      圖4顯示了表達(dá)抗體H+L鏈的質(zhì)粒pCISRα-HL的圖譜。
      圖5顯示了用于通過MTX來基因擴(kuò)增的質(zhì)粒pUCDHFR的圖譜。
      圖6顯示了用EIA測定本發(fā)明抗體在體外形成免疫復(fù)合體的能力的結(jié)果。
      □本發(fā)明抗體72D○小鼠嵌合抗體(M#9Ch)圖7顯示了用EIA測定本發(fā)明抗體直接固定化在IgE上時在體外形成免疫復(fù)合體的能力的結(jié)果。
      □本發(fā)明抗體72D○小鼠嵌合抗體(M#9Ch)圖8顯示了用EIA測定本發(fā)明抗體在體外與IgE產(chǎn)生細(xì)胞的結(jié)合活性的結(jié)果。
      圖9顯示了本發(fā)明抗體在體內(nèi)使游離IgE濃度降低的作用隨時間推移的測定結(jié)果。
      (1)用溶劑和小鼠嵌合抗體的結(jié)果◆小鼠嵌合抗體(M#9Ch),以10微克/千克給藥■小鼠嵌合抗體(M#9Ch),以100微克/千克給藥▲小鼠嵌合抗體(M#9Ch),以1000微克/千克給藥●給予溶劑(2)用溶劑和本發(fā)明抗體的結(jié)果◆本發(fā)明抗體72D,以100微克/千克給藥■本發(fā)明抗體72D,以300微克/千克給藥▲本發(fā)明抗體72D,以1000微克/千克給藥●給予溶劑圖10顯示了本發(fā)明抗體對于IgE處理的嗜堿細(xì)胞的反應(yīng)性。(A)是添加0微克/毫升本發(fā)明抗體時的結(jié)果。(B)是添加1微克/毫升本發(fā)明抗體時的結(jié)果。(C)是添加10微克/毫升本發(fā)明抗體時的結(jié)果。
      實施發(fā)明的最佳方式實施例用下面實施例來更詳細(xì)地說明本發(fā)明,但給予這些實施例只是為了說明,本發(fā)明不局限于這些實施例。
      實施例1產(chǎn)生人型抗人IgE單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的建立(1)體外抗原致敏將從同種異型不同的二個健康人得到的周圍淋巴細(xì)胞在37℃下融化,用RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco BRL Co.)離心洗滌2次(250xg下10分鐘)。混合相同數(shù)量的淋巴細(xì)胞,懸浮于含2.5mM亮氨酸-O-甲酯(Aldrich Co.)的培養(yǎng)基中,室溫下處理40分鐘。用RPMI-1640培養(yǎng)基洗凈細(xì)胞,以107個/毫升懸浮于RPMI-1640培養(yǎng)基中。在其中添加胞壁酰二肽(40微克/毫升;Sigma)、人IL-4(100U/ml;Peprotech Co.)和人IL-6(10ng/ml;R &amp; D Systems,Inc.),分注入6孔板內(nèi),每個孔2.5毫升。加入不同量(0.1-10微克)的致敏抗原(人IgE;Scripps Research Institute),在室溫下放置15分鐘,然后每個混合物內(nèi)各添加含40%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培養(yǎng)基2.5毫升,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培育3-5天。作為細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基(CRPMI),在含10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中添加25mM HEPES、100U/ml青霉素、100微克/毫升鏈霉素、2mM丙酮酸鈉、2mM非必需氨基酸和5×10-5M 2-巰基乙醇。250xg下離心5分鐘來回收淋巴細(xì)胞,洗滌2次,懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中。
      (2)細(xì)胞融合通過250xg下離心5分鐘來回收對數(shù)生長期的K6H6/B5異雜交瘤細(xì)胞(ATCCCRLl832)。用RPMI-1640培養(yǎng)基洗凈細(xì)胞,計數(shù)細(xì)胞數(shù)。將致敏淋巴細(xì)胞與K6H6/B5細(xì)胞以2∶1至4∶1的比例加入50毫升錐形管內(nèi)并混合。將該混合物250xg下離心5分鐘,完全除去培養(yǎng)基后,輕輕振搖細(xì)胞,使沉淀松開。在轉(zhuǎn)動試管的同時,將1毫升42%(w/v)聚乙二醇3350(Merck Co.)-17%(v/v)二甲基亞砜-RPMll640溶液緩慢地在1分鐘內(nèi)加入細(xì)胞中。將10毫升無血清RPMI-1640培養(yǎng)基緩緩加入并同時攪拌。細(xì)胞在250xg下離心5分鐘,除去培養(yǎng)基。然后,將K6H6/B5細(xì)胞重懸于HAzT培養(yǎng)基(含有次黃嘌呤(0.1mM)、重氮絲氨酸(1微克/毫升,Sigma Corp.)、胸苷(16μM)和Human IL-6(1ng/ml)的CRPMI培養(yǎng)基)中至濃度為2.5×105個/毫升。將融合的細(xì)胞接種到96孔微量滴定板中,每孔0.2毫升,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4日后,在各孔內(nèi)加入50微升新鮮的HAzT培養(yǎng)基。此后每5日除去孔中50微升培養(yǎng)基,換成新的培養(yǎng)基。
      實施例2產(chǎn)生人型抗人IgE單克隆抗體的雜交瘤的選擇和克隆在確認(rèn)細(xì)胞增殖的孔內(nèi),用ELISA方法測定雜交瘤產(chǎn)生的抗體的抗原特異性。在每個孔內(nèi)加入100微升溶解在0.1M NaHCO3(pH9.6)的人IgE(2微克/毫升),通過吸引將抗原固定在膜(BiodyneA;German Science Co.)上。然后,在各孔內(nèi)加入200微升含2%牛血清白蛋白(BSA)/10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)-0.15M NaCl(PBS),將殘余的結(jié)合部位封閉。加入100微升培養(yǎng)上清,在室溫下反應(yīng)2小時。用PBS-0.05%吐溫20(PBST)吸引洗凈4次后,為了檢測結(jié)合的抗體,每孔加入0.5%BSA/PBS稀釋10000倍的堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體(Capel Corp.)100微升,室溫下反應(yīng)2小時。用PBST吸引洗凈4次后,加入100微升AP底物溶液,室溫下發(fā)色,然后轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板,用微量滴定板讀數(shù)儀(ImmunoReader NJ-2000;Nalge NuncInternational)測定405nm下的吸光度。用有限稀釋法(0.3個/孔)進(jìn)行3次克隆,使產(chǎn)生抗原特異性抗體的細(xì)胞單克隆化。
      (1)P18的合成和純化用0.25毫摩爾HMP樹脂(Applied Biosystems Inc.)和1毫摩爾Fmoc氨基酸(Applied Biosystems Inc.)通過Fmoc法用肽合成儀(431A型,Applied Biosystems Inc.)合成P18(根據(jù)來自人IgE的CH2-CH3區(qū)域的18個氨基酸設(shè)計的本發(fā)明肽)。在所得肽樹脂(1047毫克)中加入10毫升除去溶液(Applied Biosystems Inc.),4℃下反應(yīng)1小時,然后在室溫下反應(yīng)1.5小時,從樹脂上除去肽。濃縮通過玻璃濾膜所得的溶液,然后,加入冷的二乙醚使肽沉淀,用玻璃濾膜回收沉淀。將該肽溶解在2N乙酸溶液中,然后冷凍干燥,得到392毫克粗制肽。取150毫克進(jìn)行反相HPLC(capsule pack C18;資生堂社)純化,得到純度為98%的P18(94毫克)。
      (2)抗體與P18的結(jié)合活性用EIA方法,以與根據(jù)人IgE的CH2-CH3區(qū)域的18個氨基酸設(shè)計的本發(fā)明肽(P18;序列表中SEQ ID NO1)的結(jié)合性為指標(biāo),從所建立的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的人型抗人IgE單克隆抗體中選擇。作為AP底物溶液,采用對硝基苯基磷酸鈉(Sigma 104;Sigma Co.)在1M二乙醇胺/0.5mM氯化鎂中的溶液(pH9.8)(濃度為1毫克/毫升)。在用PBST將添加2%BSA于4℃包被過夜的96孔微量滴定板洗凈后,在每個孔內(nèi)加入P18(10微克/毫升)/戊二醛(0.25%;Sigma Co.)/PBS(10毫克/毫升),室溫下反應(yīng)1小時。用PBST洗凈后,添加含0.02%NaN3的40mM Tris鹽酸緩沖液(pH7.4),4℃下封閉過夜,制成P18固定化板。加入細(xì)胞培養(yǎng)上清100微升,室溫下反應(yīng)2小時。用PBST洗凈3次后,加入用1%BSA/PBS稀釋1000倍的AP標(biāo)記的抗人IgG抗體(CapelCo.)100微升,室溫下反應(yīng)2小時。洗凈后,加入100微升AP底物溶液,室溫下發(fā)色,用微量滴定板讀數(shù)儀測定405nm下的吸光度。利用該方法從約2000孔(估計200000個克隆)中選出有與P18結(jié)合活性的4種抗體(1012G、72D、611B和46E)。結(jié)果示于表1。
      表1抗體 吸光度1012G 0.601611B 0.07346B 0.04672D 0.045實施例3本發(fā)明抗體的制備和純化將含5%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長的產(chǎn)生4種抗體的雜交瘤分別用PBS洗凈3次,然后懸于不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中至106個/毫升,在37℃下5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3日。在離心分離的培養(yǎng)上清中加入硫酸銨(Nacalai Tesque Co.)至最終濃度為40%,調(diào)節(jié)pH至中性,4℃下放置1小時,進(jìn)行鹽析。將離心(7000xg,20分鐘)所得沉淀溶解在少量PBS中,4℃下對PBS透析,除去硫酸銨。最后,用20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)透析后,離心除去不溶物,過濾樣品,加入NaN3至最終濃度為0.02%。將樣品加入經(jīng)20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)平衡的蛋白G-Sepharose 4B柱(Zymed Laboratories,Inc.;2毫升)中,用30毫升平衡緩沖液洗凈。用冰冷的0.1M甘氨酸鹽酸緩沖液(pH3.0)8毫升將抗體洗脫,立即用0.4毫升1.5Mtris-HCl緩沖液(pH8.9)中和。在4℃下用PBS透析該抗體溶液后,測定280nm下的吸光度,算出抗體濃度(E1%13.5)。結(jié)果示于表2。用ELISA法測定所得抗體的同種型,結(jié)果表明4種抗體分類均為IgG1(λ)。
      表2抗體 無血清培養(yǎng)量(毫升) 純化抗體量(毫克)1012G 400 2.93611B 450 2.1446B450 5.6372D300 2.26實施例4本發(fā)明抗體的抗原識別(1)對P18的結(jié)合性用與實施例2相同的方法測定經(jīng)1%BSA/PBS系列稀釋的4種純化的人型抗人IgE單克隆抗體與P18肽的結(jié)合活性。結(jié)果如圖1所示。結(jié)果確認(rèn),所有四種抗體均具有P18結(jié)合性。
      (2)通過人IgE的結(jié)合抑制活性用競爭抑制法檢查人IgE對于本發(fā)明抗體與P18的結(jié)合抑制活性。將0.2毫克抗體與不同量的人IgE混合,37℃下反應(yīng)1小時后,加入P18固定化微量滴定板中,室溫下培育2小時。洗凈后,加入1%BSA/PBS稀釋1000倍的AP標(biāo)記的抗人IgG抗體(Capel Co.)100微升,室溫下反應(yīng)2小時。洗凈后,加入100微升AP底物溶液,在室溫下發(fā)色,測定405納米下的吸光度。結(jié)果示于表3。該結(jié)果確認(rèn),4種抗體通過人IgE預(yù)處理與P18的結(jié)合受到抑制,從而確認(rèn)抗體與人IgE結(jié)合。
      表3加入的人IgE(微克/毫升 結(jié)合抑制(%)46E611B72D1012G0 0 0 0 022.5 46 32 17 444566 33 51 659076 72 74 85(3)本發(fā)明抗體與人IgE產(chǎn)生細(xì)胞的結(jié)合活性將產(chǎn)生人IgE的骨髓瘤細(xì)胞(SKO-007;ATCC CRL-803 3-1)懸于PBS-0.02%NaN3中至2.5×106個/毫升,將其與相同量的溶解在2%BSA/PBS中的本發(fā)明抗體(20微克/毫升)混合,在37℃下反應(yīng)1小時。洗凈細(xì)胞后,將其懸于1000倍稀釋的AP標(biāo)記的抗人IgG抗體(Capel Corp.),在室溫下反應(yīng)2小時。用PBST洗凈后,在每個樣品中加入AP底物溶液(對硝基苯基磷酸二鈉(2毫克/毫升))0.5毫升,在室溫下反應(yīng)后,測定取樣上清的405納米吸光度。結(jié)果示于表4。結(jié)果確認(rèn),4種本發(fā)明抗體全部與人IgE-產(chǎn)生細(xì)胞結(jié)合。另外,用同樣方法確認(rèn)這些抗體不與IgG產(chǎn)生細(xì)胞IM-9(ATCCCCL-159)和IgM產(chǎn)生細(xì)胞RPMI-1788(ATCC CCL-156)結(jié)合。
      表4抗體吸光度(405納米)實驗1 實驗2正常IgE 0.060 0.0371012GND0.795611B 0.861 1.09046E 0.186 ND72D 0.626 ND(ND表示未實施)實施例5本發(fā)明抗體的周圍單核細(xì)胞的組胺釋放用IgE使用Ficoll-Conray(Lymphosepar I;免疫生物研究所社)從人周圍血液分離的單核細(xì)胞(1.6×106個/毫升)致敏,然后加入本發(fā)明抗體(0.1微克),37℃下反應(yīng)30分鐘。然后用HRT試劑盒(Miles Corp.)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序定量測定單核細(xì)胞釋放的組胺。結(jié)果示于表5。結(jié)果,經(jīng)本發(fā)明抗體處理的周圍血單核細(xì)胞組胺釋放以抗體72D為最少。
      表5抗體 釋放的組胺濃度(nM)1012G 2.09611B 3.1146E 4.5172D 1.5實施例6抗體cDNA的克隆(1)抗體庫的制備用mRNA分離試劑盒(Invitrogen Inc.)從108個雜交瘤細(xì)胞(72D)得到poly(A)+RNA 32.8微克。用5微克該mRNA作為模板,用cDNA合成試劑盒(AmarshamCo.)合成雙鏈cDNA。用所得cDNA(1.86微克)的一半量,在其兩端加EcoRI-NotI-BamHI銜接子(寶酒造社),然后用sepharose為載體進(jìn)行凝膠層析,分離出含cDNA的級分。根據(jù)Huynh,T.V.的方法(《DNA克隆實驗方法》,48-78頁,Glover,D.M.編輯(1985),IRL Press出版),通過將cDNA插入噬菌體載體λgt10的EcoRI臂中,制得cDNA文厙。
      (2)cDNA文庫的篩選用Gigapack Gold(Stratagene Co.)將上述制得的重組噬菌體DNA體外包裝,感染大腸桿菌,得到1.7×104個噬斑。將該噬斑吸附在Hybond-N濾膜(Amarsham Co.)上,獲得復(fù)制濾膜。然后,以編碼32P標(biāo)記的抗體基因的恒定區(qū)的DNA片段作為探針進(jìn)行噬斑雜交方法,分別篩選出含有抗體H鏈和L鏈cDNA的噬斑。結(jié)果,識別出數(shù)十個對H鏈和L鏈的陽性噬斑。將這些陽性噬斑個別收集在500微升SM緩沖液中,作為噬菌體原液。從該原液回收噬菌體DNA,用限制性內(nèi)切酶NotI消化,進(jìn)行凝膠電泳,確認(rèn)DNA片段的長度,純化得到估計含有cDNA全長的DNA片段。從所選噬菌體原液H53和L5分別得到約1.7kb的H鏈cDNA和0.9kb的L鏈cDNA。
      (3)cDNA堿基序列的決定用連接試劑盒(寶酒造社)將上述所得的全長cDNA插入經(jīng)限制性內(nèi)切酶NotI消化的質(zhì)粒載體pBLUE SCRIOT II SK+(東洋紡社)中,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果分別得到含有1拷貝H鏈cDNA和L鏈cDNA的亞克隆。從該亞克隆回收重組質(zhì)粒,作為測序用模板。在測序中,使用DNA測序試劑盒(PerkinElmer Co.)依照其程序進(jìn)行反應(yīng),用自動化DNA測序儀(PRISM模型377;ABI社)對其產(chǎn)物進(jìn)行測序,確定全部堿基序列。測得的堿基序列顯示在序列表中SEQ ID NO2(H鏈)和SEQ ID NO3(L鏈)中,從這些序列翻譯出的氨基酸序列分別顯示在序列表中SEQ ID NO10(H鏈)和11(L鏈)中。
      另外,根據(jù)同樣的方法,測定所得其它三種抗體(1012G、611B和46E)的全部堿基序列。抗體1012G所測得的堿基序列顯示在序列表中SEQ ID NO4(H鏈)和SEQ IDNO5(L鏈)中,從這些序列翻譯得到的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO12(H鏈)和SEQID NO13(L鏈)中??贵w611B所測得的堿基序列顯示在序列表中SEQ ID NO6(H鏈)和SEQ ID NO7(L鏈)中,從這些序列翻譯得到的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO14(H鏈)和SEQ ID NO15(L鏈)中。抗體46E所測得的堿基序列顯示在序列表中SEQ ID NO8(H鏈)和SEQ ID NO9(L鏈)中,從這些序列翻譯得到的氨基酸序列顯示在SEQ IDNO16(H鏈)和SEQ ID NO17(L鏈)中。
      實施例7(1)抗體表達(dá)用載體的構(gòu)建用表達(dá)載體pcDL-SRα296(Takebe,Y.,等人.Mol.and Cell.Biol.,(1988)466-472)的含有16S剪接點的SRα啟動子區(qū)域代替哺乳動物表達(dá)載體(pCI;Promega Co.)的CMV/IE增強(qiáng)子/啟動子區(qū)域,制得表達(dá)載體。根據(jù)它構(gòu)建抗體表達(dá)載體。即,用BgIII消化哺乳動物表達(dá)載體-pCI,用DNA鈍化試劑盒(寶酒造社)將末端變平,然后用苯酚/氯仿萃取,乙醇沉淀純化。用PstI消化,凝膠純化不含CMV/IE增強(qiáng)子/啟動子區(qū)域的載體。用HindIII消化表達(dá)載體pcDL-SRα296,同樣進(jìn)行平頭化后,用PstI消化。對其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,純化得到含有16S剪接點的SRα啟動子區(qū)域。用DNA連接試劑盒(寶酒造社)將其與不含CMV/IE增強(qiáng)子/啟動子區(qū)域的pCI載體相連,制得抗體H鏈表達(dá)用載體(pCISRα)。
      另外,將ClaI磷酸化連接序列(Nippon Gene Co.)導(dǎo)入表達(dá)載體pCI的Bgl II位點,用BalI消化所得載體(pCICIa),平頭化后,用苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀來純化。純化載體用PstI消化,凝膠純化得到不含CMV/IE增強(qiáng)子/啟動子區(qū)域的載體。將其與含有16S剪接點的SRα啟動子區(qū)域DNA按照上述同樣方法連接,獲得表達(dá)抗體L鏈用的載體(pCICIaSRα).
      (2)抗體H鏈表達(dá)載體的構(gòu)建將通過產(chǎn)生本發(fā)明抗體的雜交瘤(72D)得到抗體H鏈cDNA作為模板,用SalIsigVH1F(SEQ ID NO18)和HFR4CH1A palR(SEQ ID NO19)作為引物,進(jìn)行PCR(25輪;94℃1分鐘,55℃1分鐘,72℃1分鐘),得到含有信號序列、VH和CH1的一部分的DNA片段(SigVHCH1)。另外,用ApaICH1F(SEQ ID NO20)和CH4Eco52IR(SEQID NO21)作為引物,通過PCR得到CH片段。
      PCR條件寶酒造社ExTaq(5U/微升) 0.5微升10x ExTaq緩沖液10微升dNTP混合物(各2.5mM)8微升模板 約100微克引物(2-型) 各0.2μM加入無菌蒸餾水至100微升用pT7Blue T-載體試劑盒(Novaken Co.,Ltd.)克隆所得PCR產(chǎn)物。即,在含有凝膠純化的各PCR產(chǎn)物約20毫微克與經(jīng)限制性內(nèi)切酶(ApaI和Eco52I)消化的pT7BlueT載體50毫微克的連接酶反應(yīng)緩沖液中加入T4 DNA連接酶(4U),在16℃下保溫2小時。然后,將2微升上述連接酶反應(yīng)液與加入了0.5M 2-巰基乙醇2微升的感受態(tài)大腸桿菌(DH5α)50微升混合,在冰上靜置30分鐘,然后在42℃下加熱40秒,再于冰上靜置2分鐘。然后加入0.5毫升SOC培養(yǎng)基,37℃下振搖培養(yǎng)1小時。將該培養(yǎng)肉湯散布在含有0.1毫克/毫升氨芐青霉素的LB平板上,37℃培育過夜。挑取板上出現(xiàn)的單菌落,在含有0.1毫克/毫升氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(LB-Amp)1毫升中37℃培養(yǎng)過夜。從該培養(yǎng)液回收細(xì)胞,根據(jù)堿法制得質(zhì)粒DNA。進(jìn)行DNA序列分析,得到攜帶具有正確核苷酸序列的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。從培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)液(5毫升)純化質(zhì)粒DNA,用限制性內(nèi)切酶(ApaI和Eco52I)消化含有SigVHCH1的載體,用苯酚/氯仿抽提后通過乙醇沉淀來純化。用限制性內(nèi)切酶(ApaI和Eco52I)消化含有CH片段的載體,凝膠純化,制得經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理過的片段。將8微升CH片段(約20毫微克)加入1微升(約50毫微克)經(jīng)酶處理過的載體中,在其中加入DNA連接試劑盒Ver.2I溶液(寶酒造社)10微升,16℃下連接2小時。將反應(yīng)產(chǎn)物加入感受態(tài)TG1(500微升)中,0℃下靜置45分鐘后,施加熱休克(42℃,2分鐘)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將100微升所得產(chǎn)物懸浮于900微升的LB/20mM葡萄糖(LBG)培養(yǎng)基中,37℃下振搖培養(yǎng)1小時。將經(jīng)LBG階段稀釋的轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮液涂布在SOBAG板上,37℃培育過夜。挑取出現(xiàn)的單菌落,懸浮于1毫升LB-Amp培養(yǎng)基中,37℃下培養(yǎng)16小時。從該培養(yǎng)液回收細(xì)胞,用堿法制得質(zhì)粒DNA。進(jìn)行堿基序列分析,結(jié)果得到攜帶具有正確抗體cDNA堿基序列的質(zhì)粒(pT7Blue/H-72D)的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。從該過夜的培養(yǎng)液純化質(zhì)粒DNA,用限制性內(nèi)切酶(SalI和Eco52I)消化后,進(jìn)行純化。將其與經(jīng)限制性內(nèi)切酶(SalI和Eco52I)消化的上述H鏈表達(dá)用質(zhì)粒載體(pCISRα)相連接,獲得抗體H鏈表達(dá)載體(pCISRα/H)。圖2顯示了抗體H鏈表達(dá)載體的圖譜。
      (3)抗體L鏈表達(dá)載體的構(gòu)建以用產(chǎn)生本發(fā)明抗體的雜交瘤(72D)得到的抗體L鏈cDNA作為模板,以SalIsigVL1F(SEQ ID NO22)和CLNotIR(SEQ ID NO23)作為引物,通過PCR得到含有信號序列、VL和CL的DNA片段(SigVLCL)。所得PCR產(chǎn)物用上述同樣的方法克隆到pT7Blue載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌。得到導(dǎo)入了顯示行正確堿基序列的抗體L鏈的質(zhì)粒(pT7Blue/L-72D)的大腸桿菌。
      從該過夜的培養(yǎng)液純化質(zhì)粒DNA,用限制性內(nèi)切酶(SalI和NotI)消化,純化得到抗體L鏈DNA。將抗體L鏈DNA與同樣經(jīng)酶消化的上述L鏈表達(dá)用質(zhì)粒載體(pCIClaSRα)相連接,獲得抗體L鏈表達(dá)載體(pCISRα/L)。圖3顯示了抗體L鏈表達(dá)載體的圖譜。
      (4)抗體(H+L)表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶(AatII和SalI)消化抗體L鏈表達(dá)質(zhì)粒(pCIClaSRα/L),凝膠純化得到含抗體L鏈DNA的片段(SalI/AatII)。剩余的載體片段用ClaI進(jìn)一步消化,用同樣方法純化得到含啟動子區(qū)域的DNA片段(ClaI/SalI)。用限制性內(nèi)切酶(AatII和ClaI)消化抗體H鏈表達(dá)質(zhì)粒(pCISRα/H),凝膠純化含抗體H鏈DNA的載體片段(ClaI/AatII)。將其與對應(yīng)的來自抗體L鏈表達(dá)質(zhì)粒的Sall/AatII片段和ClaI/SalI片段相連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α),得到攜帶抗體H+L鏈表達(dá)質(zhì)粒(p-CISRα-HL;圖4)的大腸桿菌。該大腸桿菌命名為DH5a/pWT-Z,于1999年1月27日保藏于國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(日本茨城縣Tsukuba市東一區(qū)1番3號(郵編305-3566))(保藏號FERM BP-7344,由1999年1月27日的P-17l73移管)。
      實施例15質(zhì)粒大規(guī)模制備和電穿孔將抗體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的甘油原液在含有氨芐青霉素的LB平板上劃線,將出現(xiàn)的單菌落接種于20毫升含氨芐青霉素的terrific肉湯(AT-Amp)中,37℃振搖培養(yǎng)過夜。在4個加入了400毫升TB-Amp的2升有擋板的錐形瓶中各加入5毫升大腸桿菌培養(yǎng)液,37℃、160rpm下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng),在600nm下的吸光度為0.8-1.0時,添加大觀霉素(Sigma Co.;最終濃度為0.17毫克/毫升),再培養(yǎng)約20小時。從培養(yǎng)液離心(4000xg,10分鐘,4℃)收集大腸桿菌,用大型質(zhì)粒Plasmid Mega試劑盒(QiagenCompany)純化得到9.0毫克質(zhì)粒DNA。
      用限制性內(nèi)切酶AatII(2000U)在37℃下對所得的最終量為3毫升的1毫克質(zhì)粒DNA消化過夜。然后用苯酚抽提、用氯仿抽提、乙醇沉淀,在溶解于TE中。將200微克抗體表達(dá)載體和經(jīng)AatII消化的pUCDHFR(20微克;圖5)混合后,再次進(jìn)行無菌乙醇沉淀。將其溶解在20微升TE中,添加80微升含10%FCS的IMDM培養(yǎng)基(IMDM-10)。
      將浮游的CHO細(xì)胞(dhfr-)2×107個懸浮于700微升IMDM-10中,加入上述DNA溶液混合后,轉(zhuǎn)移至比色杯(基因脈沖儀比色杯;0.4厘米電極;Biorad Co.)。在330V、960μF的條件下通過電穿孔導(dǎo)入基因。靜置10分鐘后,將其懸浮于添加了HT(GibcoBRL Co.)的PF325培養(yǎng)基(JRH Bioscience Corp.)中,37℃下培養(yǎng)2日。將細(xì)胞懸浮在PF325培養(yǎng)基中至104個/毫升,然后在96孔微量滴定板(Nunc Co.;MaxiSorp)中每孔內(nèi)加入200微升,37℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
      實施例16抗體表達(dá)細(xì)胞的檢測在固定有1微克抗人IgG(Fc)抗體(Capel Corp.)的96孔板上加入100微升培養(yǎng)上清,在室溫下靜置2小時后,用PBS T洗凈6次。每孔內(nèi)加入溶解在25%Block Ace(BA;雪印乳業(yè)社)/PBS中的AP標(biāo)記的抗人λ鏈抗體(Bio Source Co.;2000倍稀釋)各100微升,在室溫下放置2小時。洗凈后,各加入100微升AP底物溶液,在室溫下反應(yīng)。用3N-NaOH溶液終止反應(yīng),然后用微量滴定板讀數(shù)儀(NJ-2000;Japan Intermed Co.,Ltd.)測定405nm下的吸光度。根據(jù)結(jié)果,選出顯示出高吸光度的幾個孔中的細(xì)胞。
      實施例17基因擴(kuò)增和克隆使所選抗體表達(dá)細(xì)胞增殖后,將其懸浮于含有20nM氨甲喋呤(MTX;Sigma Co.)的PF325培養(yǎng)基中,接種入96孔板內(nèi),每個孔接種104細(xì)胞/0.2毫升,在37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培育。選擇MTX耐受性細(xì)胞,以25×104細(xì)胞/毫升的濃度接種入12孔板中,培養(yǎng)4日。測定培養(yǎng)上清的抗體濃度,選出產(chǎn)量高的細(xì)胞。另外,用純化的人IgG(λ)(Nordic Immunology Co.,Ltd.)作為標(biāo)準(zhǔn)品。將該細(xì)胞以100個/孔接種到96孔微量滴定板中,進(jìn)行克隆,同樣選出產(chǎn)量高的細(xì)胞。用依次階段性增加MTX濃度的培養(yǎng)基反復(fù)進(jìn)行基因擴(kuò)增和克隆,建立高產(chǎn)細(xì)胞株。
      實施例18重組抗體的生產(chǎn)和純化將上述獲得的高產(chǎn)細(xì)胞株懸浮于含有MTX的ExCell 301培養(yǎng)基(Nichirei Corp.)中至25×104個/毫升,在37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3日。無菌分離培養(yǎng)液和細(xì)胞,將回收的細(xì)胞懸浮于新的培養(yǎng)基中至25×104個/毫升,再培養(yǎng)3日。反復(fù)進(jìn)行這樣的培養(yǎng),得到92.3升含抗體的培養(yǎng)液。用6N-NaOH將含抗體培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至7.4,過濾(millipack 0.22μm;Millipore Co.)。將其施加到經(jīng)PBS平衡的HiTrap rProtein A(5毫升;Pharmacia Biotech Inc.)上,使抗體吸附。用PBS洗柱后,用0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.0)洗脫抗體,立即用1.5M Tris-HCl緩沖液(pH8.7)中利,獲得純化的重組抗體。結(jié)果從含有1.86毫克抗體72D的培養(yǎng)液得到1.70毫克純化抗體。
      實施例19通過體外試驗評價本發(fā)明抗體
      (1)免疫復(fù)合體的形成能力使人IgE(Scripps Research Institute;最終濃度為0.5微克/毫升)和各種量的抗人IgE抗體(72D)在25%BA/PBS中37℃下反應(yīng)2小時。另外,用小鼠抗人IgE抗體嵌合化獲得的重組抗體(M#9Ch;日本專利公開公報1993-199895號)作為對照陽性對照。在固定了100毫微克山羊抗人IgE抗體(Capel Corp.)且用25%BA/PBS封閉的96孔板上,使上述反應(yīng)液在室溫下培育2小時。用PBST洗凈4次后,添加25%BA/PBS稀釋1000倍的AP標(biāo)記的抗人IgE(Fc)抗體(Capel Corp.),在室溫下培育2小時。用PBST洗凈4次后,每孔各添加100微升AP底物溶液,在室溫下反應(yīng)。用3N-NaOH終止反應(yīng),用微量滴定板讀數(shù)儀(NJ-2000;Japan Intermed Co.,Ltd.)測定405nm下的吸光度。結(jié)果示于圖6。結(jié)果確認(rèn)抗體72D能形成免疫復(fù)合體。
      另外,將人IgE(100ng)添加到96孔微量滴定板(Nunc Co.;MaxiSorp)的各孔內(nèi)、4℃過夜固定后,添加25%BA/PBS,在室溫下靜置2小時,進(jìn)行封閉。用PBST洗凈4次后,加入不同量的本發(fā)明抗體(72D)或上述嵌合重組抗體(M#9Ch),在室溫下培育2小時。用PBST洗凈4次后,添加25%BA/PBS稀釋1000倍的AP標(biāo)記的抗人IgE(Fc)抗體(Capel Corp.),在室溫下培育2小時。用PBST洗凈4次后,每孔各添加100微升AP底物溶液,在室溫下反應(yīng)。用3N-NaOH終止反應(yīng),用微量滴定板讀數(shù)儀(NJ-2000;Japan Intermed Co.,Ltd.)測定405nm下的吸光度。結(jié)果示于圖7。結(jié)果發(fā)現(xiàn),本發(fā)明的抗體不與直接固定在微量滴定板上的IgE結(jié)合。
      (2)與產(chǎn)生IgE的細(xì)胞的結(jié)合離心(100xg,10分鐘)收集在含10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長的產(chǎn)生IgE的骨髓瘤細(xì)胞株U266B1(ATCC TIB-196),懸浮于ExCell 301培養(yǎng)基中至5×106個/毫升。在1.5毫升微量離心管中加入100微升細(xì)胞懸液、400微升抗體(72D或M#9Ch)溶液、50微升1%BSA/PBS/0.02%NaN3,在室溫下培育2小時并不時地混合。用PBS離心洗凈2次后,添加100微升1%BSA/PBS/0.02%NaN3稀釋1000倍的AP標(biāo)記的抗人IgG(Fc)抗體(Capel Corp.),在室溫下反應(yīng)2小時并不時地混合。用PBS離心洗凈3次后,加入200微升對硝基苯基磷酸二鈉鹽至濃度為3毫克/毫升AP基質(zhì)溶液,在室溫下反應(yīng)15分鐘并不時地混合。將離心(10000xg,5分鐘,4℃)所得的上清150微升轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板中,用微量滴定板讀數(shù)儀測定405nm下的吸光度。結(jié)果示于圖8。
      實施例20本發(fā)明抗體引起血中游離IgE濃度降低(體內(nèi)藥效試驗)
      將純化的人IgE(Scripps Inc.)靜脈內(nèi)(50微克/千克)給予雄性Wistar大鼠(9周齡;Japan Charlesriver Co.,Ltd.)。5分鐘后從眼窩收集的血液制得抗人IgE抗體給藥前的血清。給予IgE的10分鐘后,靜脈內(nèi)給予溶解在0.1%BSA/PBS中的本發(fā)明抗體(72D)和賦形劑(0.1%BSA/PBS)。另外,用小鼠抗人IgE抗體嵌合化獲得的重組抗體(M#9Ch;日本專利公開公報1993-199895號中揭示)作為對照陽性對照。本發(fā)明抗體在100、300、1000微克/千克的用量下、作為陽性細(xì)胞使用的M#9ch在10、100、1000微克/千克的用量下進(jìn)行試驗。在IgE給藥后、15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、24小時時從眼窩中取血。離心分離制得的血清保藏于-30℃直至測定。游離IgE濃度的測定根據(jù)下述反復(fù)進(jìn)行。即,在96孔微量滴定板中加入溶解在50mM NaHCO3(pH9.6)至2微克/毫升的待測抗人IgE抗體和多克隆抗人IgE抗體(Dako Japan,Co.,Ltd.)作為固定化抗體,4℃下靜置過夜,使抗體固定。在各孔內(nèi)加入300微升的2%BSA/PBS后,在室溫下放置1小時后封閉。然后加入100微升25%BA/PBS稀釋的血清樣品,在室溫下培育2小時。同時,為了制作標(biāo)定曲線,還制備添加已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)IgE的孔。用PBST洗凈6次后,在各孔內(nèi)加入100微升5000倍稀釋的AP標(biāo)記的山羊抗人IgE抗體(Capel Corp.),室溫下靜置2小時,作為二次抗體。用PBST洗凈6次后,各孔內(nèi)添加100微升AP底物溶液,室溫下反應(yīng)。用3N-NaOH終止反應(yīng),用微量滴定板讀數(shù)儀(NJ-2000;Japan Intermed Co.,Ltd.)測定405nm下的吸光度,根據(jù)制得的標(biāo)定曲線定量測定血清中存在的游離IgE濃度。結(jié)果示于表6和圖9。結(jié)果確認(rèn)通過給予本發(fā)明抗體72D使血中IgE濃度依賴于劑量地降低,1000微克/千克給藥使血中IgE完全消失。
      表6抗體(微克/千克) 血清IgE AUC(ng·ml-1·hr)賦形劑 5307±574M#9Ch(10)2536±577M#9Ch(100) 2128±193M#9Ch(1000) 1009±27972D(10) 1695±22172D(300) 289±25572D(1000)0±0(數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)表示)實施例21
      血清素釋放試驗將40×105個大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞(RBL-1;ATCC CRL-1378)懸浮于4毫升0.1%BSA/PBS/0.02%NaN3中,添加人IgE至1微克/毫升后,4℃下培育30分鐘。用0.1%BSA/PBS/0.02%NaN3洗凈后,懸浮于8毫升試劑盒所附的稀釋液中。將該懸浮液以0.5毫升的用量分別注入每個微量離心管內(nèi)。在每個管內(nèi)加入10微克/毫升人正??贵w(Capel Corp.)或本發(fā)明抗體(72D),37℃下培育30分鐘。然后,離心(100G,5分鐘),獲得上清作為檢測樣品。用血清素測定試劑盒(Immunotech Co.)定量測定游離的血清素。結(jié)果示于表7。與不添加抗體時相比,添加正常人IgG和本發(fā)明抗體引起的血清素釋放方面沒有統(tǒng)計學(xué)上的差別(t-檢驗)。因此表明本發(fā)明抗體(72D)不誘發(fā)IgE致敏的嗜堿細(xì)胞的脫顆粒。
      表7抗體 釋放的血清素(nM)賦形劑 91.50±11.02正常IgE(10微克/毫升)99.49±9.3872D(10微克/毫升)104.97+11.22(數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=4)表示)實施例22本發(fā)明抗體對于IgE處理的嗜堿細(xì)胞的反應(yīng)性將2.52×107個大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞(RBL-1;ATCC CRL-1378)懸浮于12.6毫升的0.1%BSA/PBS/0.02%NaN3中,使細(xì)胞濃度為2×106個/毫升。將其以0.5毫升分注到微量離心管內(nèi)。在其中添加人IgE(Scripps Research Institute)至最終濃度為1微克/毫升,4℃下培育30分鐘,用鞘(sheath)溶液(IsoFlo;Beckman Coulter,Inc.)洗凈3次后,重懸于0.2毫升鞘溶液中。在管內(nèi)加入本發(fā)明抗體(72D)至最終濃度為0、1或10微克/毫升,4℃下培育30分鐘。用鞘溶液洗凈3次后,將其懸浮于0.5毫升1000倍稀釋的FITC標(biāo)記的抗IgG抗體(熒光素偶聯(lián)的山羊F(ab′)2片段抗人IgGFc;CapelCorp.)中,4℃下培育30分鐘。用鞘溶液洗凈3次后,重懸于1毫升相同溶液中,用流式細(xì)胞儀(EPICSXL;Beckman Coulter,Inc.)分析。結(jié)果示于圖10。結(jié)果確認(rèn)本發(fā)明抗體與經(jīng)IgE預(yù)處理的RBL-1細(xì)胞劑量依賴性地結(jié)合。
      產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明提供了與人型抗人IgE單克隆抗體結(jié)合的新的肽、用該肽篩選人型抗人IgE單克隆抗體的方法以及該篩選方法獲得的人型抗人lgE單克隆抗體。本發(fā)明的新的肽可用作篩選高特異性人型抗人IgE單克隆抗體的工具以及過敏癥疾病的治療藥。另外,本發(fā)明的篩選方法可用作獲得高特異性人型抗人lgE單克隆抗體的方法。本發(fā)明獲得的抗體可用作過敏癥疾病的預(yù)防藥和/或治療藥。
      保藏的生物材料的信息A.保藏該生物材料的保藏機(jī)構(gòu)的名稱和地址名稱國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所地址日本茨城縣Tsukuba市東一區(qū)1番3號(郵編305-3566)B.交機(jī)構(gòu)保藏A的日期 1999年1月27日C.保藏機(jī)構(gòu)A給予的保藏號 FERM BP-7344
      序列表&lt;110&gt; 雪印乳業(yè)株式會社&lt;120&gt; 新的肽以及使用該肽的篩選方法&lt;130&gt; SNOW-134&lt;150&gt; JP7061-2000&lt;151&gt; 2000-1-14&lt;160&gt; 23&lt;170&gt; PatentIn Ver.2.0&lt;210&gt; 1&lt;211&gt; 18&lt;212&gt; PRT&lt;213&gt; 人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt; 人工序列的描述合成的肽&lt;400&gt; 1Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val1 5 10 15Ser Ala&lt;210&gt;2&lt;211&gt;1422&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述合成的DNA&lt;400&gt;2atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcgcag 60gagcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagcagactg ggtcctcagt gagagtctcc 120tgcaaagctt ctggaggcac cttcagcaga tacgccatca actgggtgcg acaggtccct 180ggacaagggc ttgagtggat ggcagggatc atccctatct ttggtccacc aaagtatgca 240cagaaattcc agggcagagt ctccctgacc gcggacagat ccacgaacac agcctacatg 300gagatggccc gcctgaggtc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag acgggtggct 360aggcggttgc gtgctggggc tagtgggttt gactactggg gccagggaac accggtcgcc 420gtctcctcgg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422&lt;210&gt;3&lt;211&gt;708&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述合成的DNA&lt;400&gt;3atgacctgct cccctctcct cctcaccctt ctcattcact gcacagggtc gtgggcccag 60tctgtgttga cgcagccgcc ctcagtgtct gcggccccag gacagaaggt caccatctcc 120tgctctggaa ggagctccac cattgcagtt aattctgttt cctggtacca gctgctccca 180ggatcagccc ccaaactcct catttatgac actactaagc gaccctcagg gattcctgac 240cgattctctg ggtccaagtc tggcacgtcg gccaccctgg gcatcaccgg actccggact 300ggggacgagg ccgtttatta ctgcagtgtg gtgcggtata attatgtgcg gctgcggttc 360ggaggaggca cccacctgac cgtcctcggt cagcccaagg cggcgccctc ggtcactctg 420ttcccaccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 480gacttctacc ctggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 540ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac 600ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacaaaagct acagctgcca ggtcacgcat 660gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gctcatag 708&lt;210&gt;4&lt;211&gt;1422&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述合成的DNA&lt;400&gt;4atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcgcag 60gagcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagcagactg ggtcctcagt gagagtctcc 120tgcaaagctt ctggaggcac cttcagcaga tacgccatca actgggtgcg acaggtccct 180ggacaagggc ttgagtggat ggcagggatc atccctatct ttggtccacc aaagtatgca 240cagaaattcc agggcagagt ctccctgacc gcggacagat ccacgaacac agcctacatg 300gagatggccc gcctgaggtc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag accggggagg 360tttccgttgt atagggattg gcctgggttt gactactggg gccagggaac accggtcgcc 420gtctcctcgg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422&lt;210&gt;5&lt;211&gt;1422&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述合成的DNA&lt;400&gt;5atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcgcag 60gagcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagcagactg ggtcctcagt gagagtctcc 120tgcaaagctt ctggaggcac cttcagcaga tacgccatca actgggtgcg acaggtccct 180ggacaagggc ttgagtggat ggcagggatc atccctatct ttggtccacc aaagtatgca 240cagaaattcc agggcagagt ctccctgacc gcggacagat ccacgaacac agcctacatg 300gagatggccc gcctgaggtc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag accggggagg 360tttccgttgt atagggattg gcctgggttt gactactggg gccagggaac accggtcgcc 420gtctcctcgg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422&lt;210&gt;6&lt;211&gt;1422&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述合成的DNA&lt;400&gt;6atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcgcag 60gagcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagcagactg ggtcctcagt gagagtctcc 120tgcaaagctt ctggaggcac cttcagcaga tacgccatca actgggtgcg acaggtccct 180ggacaagggc ttgagtggat ggcagggatc atccctatct ttggtccacc aaagtatgca 240cagaaattcc agggcagagt ctccctgacc gcggacagat ccacgaacac agcctacatg 300gagatggccc gcctgaggtc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag agctccgact 360cctttgtatg atacggagac ggggccgtgg ggccagggaa caccggtcgc ctttgactac 420gtctcctcgg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422&lt;210&gt;7&lt;211&gt;708&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述合成的DNA&lt;400&gt;7atgacctgct cccctctcct cctcaccctt ctcattcact gcacagggtc gtgggcccag 60tctgtgttga cgcagccgcc ctcagtgtct gcggccccag gacagaaggt caccatctcc 120tgctctggaa ggagctccac cattgcagtt aattctgttt cctggtacca gctgctccca 180ggatcagccc ccaaactcct catttatgac actactaagc gaccctcagg gattcctgac 240cgattctctg ggtccaagtc tggcacgtcg gccaccctgg gcatcaccgg actccggact 300ggggacgagg ccgtttatta ctgcgcgctg ttggaggagg gtgcgaaggg gccggagttc 360ggaggaggca cccacctgac cgtcctcggt cagcccaagg cggcgccctc ggtcactctg 420ttcccaccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 480gacttctacc ctggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 540ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac 600ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacaaaagct acagctgcca ggtcacgcat 660gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gctcatag 708&lt;210&gt;8&lt;211&gt;1422&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述合成的DNA&lt;400&gt;8atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcgcag 60gagcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagcagactg ggtcctcagt gagagtctcc 120tgcaaagctt ctggaggcac cttcagcaga tacgccatca actgggtgcg acaggtccct 180ggacaagggc ttgagtggat ggcagggatc atccctatct ttggtccacc aaagtatgca 240cagaaattcc agggcagagt ctccctgacc gcggacagat ccacgaacac agcctacatg 300gagatggccc gcctgaggtc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag accggtgcct 360gcgacttatg agtctactgc tggttatttt gactactggg gccagggaac accggtcgcc 420gtctcctcgg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422&lt;210&gt;9&lt;211&gt;708&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;智人(Homo sapiens)&lt;220&gt;&lt;223&gt;人工序列的描述合成的DNA&lt;400&gt;9atgacctgct cccctctcct cctcaccctt ctcattcact gcacagggtc gtgggcccag 60tctgtgttga cgcagccgcc ctcagtgtct gcggccccag gacagaaggt caccatctcc 120tgctctggaa ggagctccac cattgcagtt aattctgttt cctggtacca gctgctccca 180ggatcagccc ccaaactcct catttatgac actactaagc gaccctcagg gattcctgac 240cgattctctg ggtccaagtc tggcacgtcg gccaccctgg gcatcaccgg actccggact 300ggggacgagg ccgtttatta ctgcagtccg gtgcagcggt attctggggg ttctctgttc 360ggaggaggca cccacctgac cgtcctcggt cagcccaagg cggcgccctc ggtcactctg 420ttcccaccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 480gacttctacc ctggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 540ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac 600ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacaaaagct acagctgcca ggtcacgcat 660gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gctcatag 708&lt;210&gt;10&lt;21l&gt;473&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;智人(Homo sapiens)&lt;400&gt;10Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly1 5 10 15Val Gln Ser Gln Glu Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Gln20 25 30Thr Gly Ser Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe35 40 45Ser Arg Tyr Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Met Ala Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Pro Pro Lys Tyr Ala65 70 75 80Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Sar Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ash85 90 95Thr Ala Tyr Met Glu Met Ala Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Val Ala Arg Arg Leu Arg Ala Gly Ala Ser115 120 125Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Ala Val Ser Ser Ala130 135 140Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser145 150 155 160Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe165 170 175Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly180 185 190Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu195 200 205Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr210 215 220Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys225 230 235 240Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro245 250 255Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys260 265 270Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val275 280 285Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr290 295 300Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu305 310 315 320Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His325 330 335Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys340 345 350Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln355 360 365Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu370 375 380Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro385 390 395 400Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn405 410 415Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 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Ilc Ser145 150 155 160Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser165 170 175Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn180 185 190Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp195 200 205Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
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      權(quán)利要求
      1.一種肽,它具有序列表中SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
      2.一種人型抗人IgE單克隆抗體的篩選方法,其特征在于,該方法使用了權(quán)利要求1所述的肽。
      3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法,其特征在于,在用IgE體外致敏淋巴細(xì)胞,通過雜交瘤方法建立人型抗人IgE抗體產(chǎn)生細(xì)胞,然后檢查細(xì)胞與具有序列表中SEQID NO1所示氨基酸序列的肽的結(jié)合活性,選出產(chǎn)生高抗原特異性抗體的細(xì)胞,得到人型抗人IgE單克隆抗體。
      4.一種人型抗人IgE單克隆抗體,它具有以下性質(zhì)(a)與權(quán)利要求1所述的肽結(jié)合,(b)與人IgE特異性結(jié)合,(c)與產(chǎn)生人IgE的細(xì)胞選擇性結(jié)合,(d)與IgE致敏的肥大細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞有結(jié)合性,且不誘導(dǎo)嗜堿細(xì)胞釋放出血清素。
      5.一種DNA,它編碼權(quán)利要求4所述的人型抗人IgE單克隆抗體的H鏈或L鏈。
      6.一種表達(dá)產(chǎn)物,它通過權(quán)利要求5所述的DNA經(jīng)基因工程技術(shù)表達(dá)得到。
      7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人型抗人IgE單克隆抗體,它有序列表中SEQ IDNO10(H鏈)和11(L鏈)記載的氨基酸序列。
      8.一種DNA,它編碼權(quán)利要求7所述的氨基酸序列。
      9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA,它具有序列表中SEQ ID NO2(H鏈)和3(L鏈)所示的核苷酸序列。
      10.一種細(xì)胞,它被權(quán)利要求5、8或9所述的DNA轉(zhuǎn)染。
      11.一種微生物,它被權(quán)利要求5、8或9所述的DNA轉(zhuǎn)染。
      12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的微生物,它是FERM P-17173。
      13.一種藥物,它含有權(quán)利要求4或7所述的人型抗人IgE單克隆抗體作為有效成分。
      14.一種過敏癥疾病治療藥,它含有權(quán)利要求4或7所述的人型抗人IgE單克隆抗體作為有效成分。
      全文摘要
      本發(fā)明提供了新的肽、用該肽的篩選方法以及該篩選方法獲得的抗體。序列表中SEQ ID NO1記載的18個氨基酸組成的新的肽、用該肽篩選人型抗人IgE單克隆抗體的方法、該篩選方法得到的人型抗人IgE單克隆抗體。得到的抗體可用作過敏癥疾病的預(yù)防和/或治療藥。
      文檔編號C07K7/08GK1418222SQ01806679
      公開日2003年5月14日 申請日期2001年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月14日
      發(fā)明者鷲田尚洋, 高橋研, 佐竹紀(jì)子, 藤瀨暢彰, 田中秀樹, 栗山昌之 申請人:第一制藥株式會社
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