專利名稱：修飾的bdnf的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用1-?；视脱苌镄揎椀哪X衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。此外，本發(fā)明還涉及治療2型糖尿病的治療劑，其中包含作為活性組分的1-?；视脱苌镄揎椀哪X衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
已知BDNF是治療神經(jīng)變性疾病(例如ALS)或糖尿病性外周神經(jīng)病的治療劑(參見A.P.Mizisin等人，Journal of Neuropathology andExperimental Neurology，vol.56，p.1290(1997))。
此外，WO 98/32458公開了BDNF用作治療糖尿病的治療劑。
因?yàn)锽DNF是表現(xiàn)出上述多種功能的有用蛋白質(zhì)，所以希望開發(fā)出具有更高的效力和更優(yōu)良的藥動(dòng)學(xué)特征、同時(shí)保持BDNF固有活性的化合物。
已嘗試著通過修飾來改善蛋白質(zhì)的物理特征和活性，同時(shí)保持其功能。例如，JP 2679852和JP 2718809公開了用卵磷脂或溶血卵磷脂修飾生理活性蛋白質(zhì)，具體來說是修飾過氧化物歧化酶(SOD)的一般技術(shù)。然而，沒有公開表現(xiàn)出多種功能的有用蛋白質(zhì)的修飾BDNF。
本發(fā)明公開本發(fā)明的目的是提供具有更高的效力、保持BDNF的固有活性、并具有優(yōu)良的藥動(dòng)學(xué)特征的化合物。
本發(fā)明者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可通過用1-?；视脱苌镄揎桞DNF來改善BDNF的藥理活性、藥動(dòng)學(xué)特征和物理性質(zhì)，并完成了本發(fā)明。
更具體來說，本發(fā)明涉及(1)用1-?；视脱苌镄揎椀腂DNF；(2)依據(jù)上述(1)修飾的BDNF，所述修飾的BDNF是式(1)化合物A(X-B)m(1)其中A是腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殘基，B是在甘油部分的2-位具有羥基的1-?；视脱苌锏臍埢?，其是通過從羥基上除去氫原子而獲得的，X是化學(xué)交聯(lián)，且m是平均引入數(shù)目，并且不小于約0.5；(3)依據(jù)上述(2)修飾的BDNF，其中X是式(2)所示基團(tuán) 其中R1是亞烷基，或式(3)所示基團(tuán) 其中R2和R3獨(dú)立地為亞烷基；(4)依據(jù)上述(2)修飾的BDNF，其中所述1-酰基甘油衍生物是1-酰基甘油-3-磷?；憠A、1-?；视?3-磷酰基絲氨酸、或1-?；视?3-磷酰基乙基胺；(5)依據(jù)上述(2)修飾的BDNF，其中B是式(4)所示的1-?；视?3-磷酰基膽堿殘基 其中R4是?；?5)所示的1-?；视?3-磷酰基絲氨酸殘基 其中R4是?；?，或式(6)所示的1-酰基甘油-3-磷?；一窔埢?其中R4是?；?6)依據(jù)上述(2)或(3)修飾的BDNF，其中B是式(4)所示基團(tuán) 其中R4是酰基；(7)依據(jù)上述(2)、(3)、(4)、(5)和(6)任一項(xiàng)修飾的BDNF，其中所述?；蔷哂?-30個(gè)碳原子的鏈烷?；?；(8)依據(jù)上述(2)、(3)、(4)、(5)、(6)和(7)任一項(xiàng)修飾的BDNF，其中所述?；亲貦磅；?；(9)依據(jù)上述(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)和(8)任一項(xiàng)修飾的BDNF，其中m為約1-約6；(10)依據(jù)上述(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)和(9)任一項(xiàng)修飾的BDNF，其中X是式(2)所示基團(tuán) 其中R1是亞烷基；(11)依據(jù)上述(10)修飾的BDNF，其中R1是具有2-10個(gè)碳原子的直鏈亞烷基；(12)依據(jù)上述(10)修飾的BDNF，其中R1是三亞甲基；(13)式(7)修飾的BDNFA(X-B)n(7)其中A是腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殘基，B是在甘油部分的2-位具有羥基的1-酰基甘油衍生物的殘基，其是通過從羥基上除去氫原子而獲得的，X是化學(xué)交聯(lián)，且n是1或1以上的整數(shù)；(14)依據(jù)上述(13)修飾的BDNF，其中X是式(2)所示基團(tuán) 其中R1是亞烷基，或式(3)所示基團(tuán) 其中R2和R3獨(dú)立地為亞烷基；(15)依據(jù)上述(13)修飾的BDNF，其中B是式(4)所示的1-?；视?3-磷?；憠A殘基 其中R4是酰基，式(5)所示的1-?；视?3-磷酰基絲氨酸殘基 其中R4是?；蚴?6)所示的1-?；视?3-磷?；一窔埢?其中R4是?；?；(16)依據(jù)上述(13)或(14)修飾的BDNF，其中B是式(4)所示基團(tuán) 其中R4是?；?；(15)用于治療2型糖尿病的治療劑，其包括用1-?；视脱苌镄揎椀腂DNF作為活性組分；(16)依據(jù)上述(15)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，所述修飾的BDNF是式(1)化合物
A(X-B)m(1)其中A是腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殘基，B是在甘油部分的2-位具有羥基的1-酰基甘油衍生物的殘基，其是通過從羥基上除去氫原子而獲得的，X是化學(xué)交聯(lián)，且m是平均引入數(shù)目，并且不小于約0.5；(17)依據(jù)上述(16)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，其中X是式(2)所示基團(tuán) 其中R1是亞烷基，或式(3)所示基團(tuán) 其中R2和R3獨(dú)立地為亞烷基；(18)依據(jù)上述(16)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，其中所述1-?；视脱苌锸?-?；视?3-磷酰基膽堿、1-?；视?3-磷酰基絲氨酸或1-?；视?3-磷?；一罚?19)依據(jù)上述(16)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，其中B是式(4)所示的1-?；视?3-磷酰基膽堿殘基 其中R4是?；?5)所示的1-?；视?3-磷酰基絲氨酸殘基 其中R4是?；?，或式(6)所示的1-酰基甘油-3-磷?；一窔埢?其中R4是?；?；(20)依據(jù)上述(16)或(17)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，其中B是式(4)所示基團(tuán) 其中R4是?；?；(21)依據(jù)上述(16)、(17)、(18)、(19)和(20)的任一項(xiàng)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，其中所述?；蔷哂?-30個(gè)碳原子的鏈烷?；?；(22)依據(jù)上述(16)、(17)、(18)、(19)、(20)和(21)的任一項(xiàng)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，其中所述?；亲貦磅；?23)依據(jù)上述(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)和(22)的任一項(xiàng)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，其中m為約1-約6；(24)依據(jù)上述(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)、(22)和(23)的任一項(xiàng)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，其中X是式(2)所示基團(tuán) 其中R1是亞烷基；(25)依據(jù)上述(24)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，其中R1是具有2-10個(gè)碳原子的直鏈亞烷基；(26)依據(jù)上述(25)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，其中R1是三亞甲基；(27)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，其中所述修飾的BDNF是式(7)化合物A(X-B)n(7)其中A是腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殘基，B是在甘油部分的2-位具有羥基的1-?；视脱苌锏臍埢⑶沂峭ㄟ^從羥基上除去氫原子而獲得的，X是化學(xué)交聯(lián)，且n是1或1以上的整數(shù)；(28)依據(jù)上述(27)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，其中X是式(2)所示基團(tuán) 其中R1是亞烷基，或式(3)所示基團(tuán) 其中R2和R3獨(dú)立地為亞烷基；(29)依據(jù)上述(27)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，其中B是式(4)所示的1-?；视?3-磷?；憠A殘基 其中R4是?；?，式(5)所示的1-酰基甘油-3-磷?；z氨酸殘基 其中R4是酰基，或式(6)所示的1-?；视?3-磷?；一窔埢?其中R4是?；?；(30)依據(jù)上述(27)或(28)包含修飾的BDNF作為活性組分的用于治療2型糖尿病的治療劑，其中B是式(4)所示基團(tuán) 其中R4是?；?br> 附圖概述附

圖1是在實(shí)施例1中獲得的卵磷脂化的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的飛行時(shí)間質(zhì)譜的光譜圖案(TOF-MALDI MS)。
附圖2是表明卵磷脂化的BDNF與BDNF對(duì)db/db小鼠血糖水平的影響的圖。
附圖3是表明卵磷脂化的BDNF與BDNF對(duì)db/db小鼠食物攝取量的影響的圖。
附圖4是表明卵磷脂化的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)db/db小鼠體重的影響的圖。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的用1-酰基甘油衍生物修飾的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(在下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱為修飾的BDNF)可用作治療神經(jīng)系統(tǒng)障礙和疾病或治療糖尿病的治療劑。更具體地，本發(fā)明的用1-?；视脱苌镄揎椀哪X衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可施用給神經(jīng)系統(tǒng)被傷口、手術(shù)、缺血、感染、代謝性疾病、營(yíng)養(yǎng)不良、惡性腫瘤、或毒性藥物等損傷的患者。尤其是，其可用于治療其中感覺神經(jīng)元或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞被損傷的病癥。更尤其是，本發(fā)明修飾的BDNF可用于治療先天性病癥或神經(jīng)變性疾病例如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病(帕金森氏病的癥狀可能是由多巴胺能神經(jīng)元變性引起的)、帕金森-Plus綜合征(例如進(jìn)行性spranuclear麻痹(Steele-Richardson-Olszewski綜合征)、橄欖體小腦腦橋萎縮(OPCA)、Shy-Drager綜合征(多發(fā)性系統(tǒng)萎縮)、和Guam帕金森氏癡呆綜合征)、和亨廷頓氏舞蹈病，但并不限于此。此外，本發(fā)明修飾的BDNF可用于治療感覺神經(jīng)機(jī)能障礙和先天性疾病或與視網(wǎng)膜變性有關(guān)的神經(jīng)變性疾病。本發(fā)明修飾的BDNF還可用于治療與視網(wǎng)膜變性有關(guān)的遺傳性驚厥性截癱(Kjellin和Barnard-Scholz綜合征)、色素性視網(wǎng)膜炎、發(fā)身期前視網(wǎng)膜黃斑變性、Usher綜合征(伴有先天性聽覺損失的色素性視網(wǎng)膜炎)、和Refsum綜合征(色素性視網(wǎng)膜炎、先天性聽覺損失、和多神經(jīng)病)。
還可以使用本發(fā)明修飾的BDNF促進(jìn)糖尿病性視網(wǎng)膜病或多發(fā)性單神經(jīng)病患者的恢復(fù)。此外，本發(fā)明修飾的BDNF也可用作治療糖尿病，尤其是由于胰島素機(jī)能障礙或胰島素抗性而具有高血糖的2型糖尿病等的治療劑。
此外，本發(fā)明修飾的BDNF可用作改善胰島素機(jī)能障礙或胰島素抗性的治療劑，或治療或改善伴有胰島素分泌減少或衰竭的高血糖的治療劑，或治療或改善高脂血的治療劑，或治療或改善高胰島素血的治療劑。
更詳細(xì)地解釋式(1)、式(2)、式(3)、式(4)、式(5)和式(6)的基團(tuán)。
A代表的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子殘基是指通過從BDNF的官能團(tuán)例如氨基酸(例如賴氨酸殘基)的羧基和氨基上除去m或n個(gè)與基團(tuán)(X-B)m或(X-B)n結(jié)合的羥基或氫原子而形成的殘基。
引入的修飾基團(tuán)的平均數(shù)目是指引入到一分子BDNF中的修飾基團(tuán)的平均數(shù)目，并不小于0.5，優(yōu)選為約1或1以上，更優(yōu)選為約1-約10，尤其是約1-約6。其最優(yōu)選為約2-約4。
對(duì)于m，1或1以上的整數(shù)是例如1-10的整數(shù)，優(yōu)選為1-6的整數(shù)，更優(yōu)選為2-4的整數(shù)。
亞烷基包括具有1-24個(gè)碳原子的直鏈或支鏈亞烷基，優(yōu)選為具有2-10個(gè)碳原子的直鏈亞烷基，例如亞乙基、1，3-亞丙基、1，4-亞丁基、1，5-亞戊基、1，6-亞己基、1，7-亞庚基、1，8-亞辛基、1，9-亞壬基、1，10-亞癸基等。
?；ɡ珂溚轷；㈡溝；⒎减；?、取代的芳?；?。
鏈烷?；ň哂?-30個(gè)碳原子的鏈烷酰基，例如辛酰基、壬酰基、癸酰基、十一烷?；⑹轷；⑹轷；?、十四烷酰基、十五烷酰基、十六烷酰基、十七烷酰基、十八烷?；?、十九烷?；?、二十烷?；?、二十一烷?；?、二十三烷酰基、二十四烷?；⒍逋轷；?、二十六烷酰基、二十七烷?；?、二十八烷?；?、二十九烷?；⑷轷；龋瑑?yōu)選為具有14-22個(gè)碳原子的鏈烷?；?，例如十四烷?；?、十五烷酰基、十六烷酰基、十七烷酰基、十八烷?；?、十九烷酰基、二十烷?；⒍煌轷；取?br> 芳?；ň哂?-11個(gè)碳原子的芳?；?，例如苯甲?；⑤良柞；取?br> 鏈烯?；ň哂?-30個(gè)碳原子的鏈烯酰基，例如油酰基、亞油?；?、花生四烯?；?。
取代的芳酰基包括被烷基、鹵素原子、烷氧基、羥基、硝基等取代的芳?；?-甲基苯甲?；?、2-甲基苯甲?；?、4-氟苯甲酰基、2-氟苯甲?；?、4-氯苯甲酰基、3-氯苯甲?；?-氯苯甲?；?、4-甲氧基苯甲?；?、3-甲氧基苯甲?；?-甲氧基苯甲?；?、4-羥基苯甲?；?、3-硝基苯甲?；取?br> 烷基包括具有1-6個(gè)碳原子的低級(jí)烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、2-甲基丙基等。
鹵素原子是氟原子、氯原子、溴原子、和碘原子。
烷氧基包括具有1-6個(gè)碳原子的低級(jí)烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、2-甲基丙氧基等。
X代表的化學(xué)交聯(lián)是由在化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)后聯(lián)接A和B的有機(jī)基團(tuán)構(gòu)成的化學(xué)交聯(lián)。化學(xué)交聯(lián)的一個(gè)末端優(yōu)選經(jīng)由酯鍵與1-?；视脱苌锝Y(jié)合?；瘜W(xué)交聯(lián)的另一個(gè)末端直接與腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的官能團(tuán)例如氨基或羧基結(jié)合。化學(xué)交聯(lián)優(yōu)選具有羧基、氨基、羥基、亞氨基等作為官能團(tuán)。此外，化學(xué)交聯(lián)可任選具有兩個(gè)或更多個(gè)官能團(tuán)，其中一個(gè)官能團(tuán)與1-?；视脱苌锝Y(jié)合，另一個(gè)官能團(tuán)與腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的官能團(tuán)結(jié)合。化學(xué)交聯(lián)還可以插在其它官能團(tuán)之間。優(yōu)選的化學(xué)交聯(lián)是例如式(2)所示基團(tuán) 其中R1是亞烷基，式(3)所示基團(tuán)等 其中R2和R3獨(dú)立地為亞烷基。最優(yōu)選的化學(xué)交聯(lián)是式(2’)所示基團(tuán) 其中R1’是C2-C10亞烷基。
在定義n為1或1以上的整數(shù)中，優(yōu)選的整數(shù)是1-10，更優(yōu)選的整數(shù)是1-5。
本發(fā)明腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)包括通過刪除一部分氨基酸序列、或用其它氨基酸替代、或加入一部分其它氨基酸序列而獲得的修飾的BDNF，在N-末端和/或C-末端具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合的氨基酸的修飾的BDNF，或其中糖鏈被刪除或替代的修飾的BDNF，只要它們表現(xiàn)出與天然腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基本上相同的活性即可。
本發(fā)明所用的BDNF可通過不同方法制得，例如將可產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的原代培養(yǎng)細(xì)胞或建立的細(xì)胞系培養(yǎng)，并從其培養(yǎng)基(例如培養(yǎng)物上清液、培養(yǎng)的細(xì)胞)中分離和純化BDNF。此外，可通過常規(guī)基因工程技術(shù)可獲得重組神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，例如將編碼BDNF的基因插入到合適的載體中，用重組載體轉(zhuǎn)化合適的宿主，并從所得轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物上清液中分離出BDNF。用于上述方法的宿主細(xì)胞不受限制，并且可以是已用于基因工程技術(shù)的任何常規(guī)宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、毛霉菌、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。例如，當(dāng)采用常規(guī)基因工程技術(shù)時(shí)，BDNF是這樣制得的將編碼BDNF的基因插入到合適的載體中，用該重組載體轉(zhuǎn)化合適的宿主，并從所得轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物上清液中分離出BDNF(參見Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.88，p.961(1991)；Biochem.Biophys.Res.Commun.，vol.186，p.1553(1992))?；蚬こ碳夹g(shù)適于以大批量生產(chǎn)具有相同質(zhì)量的BDNF。
制備方法H-B→X1-B→A(X-B)m(10) (11)(1)其中A是腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殘基，B是在甘油部分的2-位具有羥基的1-?；视脱苌锏臍埢?，其是通過從羥基上除去氫原子而獲得的，X是化學(xué)交聯(lián)，m是平均引入數(shù)目，并且不小于約0.5，且X1是具有反應(yīng)性官能團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)。
X1的反應(yīng)性官能團(tuán)是指被活化以便與BDNF的官能團(tuán)例如氨基、羧基進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)的官能團(tuán)。更具體地，該反應(yīng)性官能團(tuán)是例如羧基、氨基、或活化的羧基。
對(duì)于具有羧基作為反應(yīng)性官能團(tuán)的化合物(11)，反應(yīng)性官能團(tuán)可這樣引入在催化劑存在下在惰性溶劑中，如果需要在堿存在下，將具有2個(gè)羧基的二羧酸酐與1-?；视脱苌锓磻?yīng)。所述惰性溶劑包括例如非質(zhì)子傳遞溶劑(例如二甲基甲酰胺、乙腈等)、醚(例如四氫呋喃等)、芳族溶劑(例如甲苯等)、鹵代烴(例如二氯甲烷、二氯乙烷等)。所述催化劑包括例如酸(例如對(duì)甲苯磺酸等)、吡啶化合物(例如4-二甲基氨基吡啶、4-(N-吡咯烷基)吡啶等)。所述堿包括例如有機(jī)堿(例如三乙胺、吡啶等)。反應(yīng)溫度為約0℃-約100℃。
對(duì)于具有活化的羧基作為反應(yīng)性官能團(tuán)的化合物(11)，活化羧基的方法是例如混合酸酐法、活化酯法等?；旌纤狒ㄊ沁@樣進(jìn)行的在無水條件下，在堿存在下，在惰性溶劑中將在上述方法中獲得的具有引入的羧基的1-酰基甘油衍生物與烷氧基羰基鹵反應(yīng)，以生成化合物(11)。所述烷氧基羰基鹵包括例如異丁氧基羰基氯、仲丁氧基羰基氯、異丙氧基羰基氯、乙氧基羰基氯、甲氧基羰基氯等。所述惰性溶劑可以是非質(zhì)子傳遞溶劑(例如二甲基甲酰胺、乙腈等)、醚(例如四氫呋喃等)、芳族溶劑(例如甲苯等)等。所述堿可以是烷基胺(例如三乙胺、N-甲基嗎啉等)、吡啶化合物(例如吡啶、4-二甲基氨基吡啶、4-(N-吡咯烷基)吡啶等)、和這些溶劑的組合。反應(yīng)溫度可以為約-20℃-約室溫。
活化酯法是這樣進(jìn)行的在堿存在下，在惰性溶劑中，在縮合劑存在下，將在上述方法中獲得的具有引入的羧基的1-?；视脱苌锱cN-羥基二酰亞胺或苯酚反應(yīng)，以生成化合物(11)。所述N-羥基二酰亞胺包括例如N-羥基琥珀酰亞胺等。苯酚包括例如4-硝基苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚、4-硝基苯硫酚等。所述縮合劑包括碳二亞胺例如二環(huán)己基碳二亞胺、1-(3-二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽等。所述惰性溶劑可以是非質(zhì)子傳遞溶劑(例如二甲基甲酰胺、乙腈等)、醚(例如四氫呋喃等)、芳族溶劑(例如甲苯等)、鹵代烴(例如二氯甲烷、二氯乙烷等)。所述堿可以是例如烷基胺(例如三乙胺等)、吡啶化合物(例如吡啶、4-二甲基氨基吡啶、4-(N-吡咯烷基)吡啶等)、或這些溶劑的組合。反應(yīng)溫度可以為約0℃-約100℃。
當(dāng)使用具有羧基作為反應(yīng)性官能團(tuán)的化合物(11)時(shí)，用1-?；视脱苌镄揎椀腂DNF(1)可通過在堿存在下在溶劑中使用縮合劑使化合物(11)與BDNF反應(yīng)而制得。所述縮合劑包括碳二亞胺例如二環(huán)己基碳二亞胺、1-(3-二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽等，或這些碳二亞胺與N-羥基二酰亞胺例如N-羥基琥珀酰亞胺的組合等。所述溶劑是例如非質(zhì)子傳遞溶劑(例如二甲基甲酰胺、乙腈等)、醚(例如四氫呋喃等)、或這些溶劑與水的混合溶劑、和水等。所述堿可以是例如烷基胺(例如三乙胺等)、吡啶化合物(例如吡啶、4-二甲基氨基吡啶、4-(N-吡咯烷基)吡啶等)、和它們的組合。反應(yīng)溫度可以為約0℃-約100℃。
當(dāng)使用具有活化的羧基作為反應(yīng)性官能團(tuán)的化合物(11)時(shí)，用1-?；视脱苌镄揎椀腂DNF(1)可通過在堿存在下在惰性溶劑中將化合物(11)與BDNF反應(yīng)而制得。所述溶劑是例如非質(zhì)子傳遞溶劑(例如二甲基甲酰胺、乙腈等)、醚(例如四氫呋喃等)、或這些溶劑與水的混合溶劑、和水等。所述堿可以是例如烷基胺(例如三乙胺等)、吡啶化合物(例如吡啶、4-二甲基氨基吡啶、4-(N-吡咯烷基)吡啶等)、和它們的組合。反應(yīng)溫度可以為約0℃-約100℃。
當(dāng)使用具有活化的二酰亞胺基團(tuán)作為反應(yīng)性官能團(tuán)的化合物(11)時(shí)，用1-酰基甘油衍生物修飾的BDNF(1)可通過在堿存在下在惰性溶劑中將化合物(11)與BDNF反應(yīng)而制得。所述溶劑可以是例如非質(zhì)子傳遞溶劑(例如二甲基甲酰胺、乙腈等)、醚(例如四氫呋喃等)、或這些溶劑與水的混合溶劑、或水等。所述堿可以是例如烷基胺(例如三乙胺等)、吡啶化合物(例如吡啶、4-二甲基氨基吡啶、4-(N-吡咯烷基)吡啶等)、或這些溶劑的組合。反應(yīng)溫度可以為約0℃-約100℃。
通過上述方法獲得的本發(fā)明的用1-鏈烷?；视脱苌镄揎椀腂DNF可通過下列方法的一種或其組合來純化。(1)聚乙烯亞胺分級(jí)；(2)使用Sephacryl S-200的凝膠過濾色譜法；(3)使用Biorex-70樹脂或CM Sephadex的離子交換色譜法；(4)硫酸銨分級(jí)和/或pH分級(jí)，和(5)使用抗體樹脂的親和色譜法，所述抗體樹脂是用從雜交瘤或致敏動(dòng)物分離的抗體制備的?？稍谒嵝詶l件下或輕微變性條件下將修飾的BDNF解吸。
本發(fā)明用1-鏈烷?；视脱苌镄揎椀哪X衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的確切劑量和給藥方案應(yīng)當(dāng)根據(jù)每名患者所需的劑量、治療方法、所治療的疾病種類、或必要程度、以及醫(yī)師的診斷而變。當(dāng)非胃腸道給藥時(shí)，劑量和給藥頻率可根據(jù)患者的病癥、年齡、體重、和給藥途徑而變，但是當(dāng)以注射劑的形式皮下或靜脈內(nèi)給藥時(shí)，對(duì)于成人，其日劑量為每kg體重約1-約2500μg、優(yōu)選約10-約500μg。當(dāng)以氣霧劑形式呼吸道給藥時(shí)，對(duì)于成人，其日劑量為每kg體重約1-約2500μg，優(yōu)選約10-約500μg。給藥方案是連續(xù)每日給藥、間歇給藥、或聯(lián)合采用這些方法的方案。
當(dāng)經(jīng)口給藥時(shí)，劑量和給藥頻率可根據(jù)患者的病癥、年齡、體重、和給藥途徑而變，對(duì)于成人，其日劑量為每kg體重約5-約2500μg、優(yōu)選約10-約1000μg。
本發(fā)明修飾的BDNF可局部施用給在不同組織的隔離的感覺神經(jīng)元，所述組織有例如膝關(guān)節(jié)、錐體和小結(jié)神經(jīng)節(jié)；第8腦神經(jīng)前庭聽神經(jīng)復(fù)合體；三叉神經(jīng)節(jié)上下頜的腹側(cè)后外側(cè)核；和三叉神經(jīng)的中腦核。在這種情況下，優(yōu)選通過吸收到能夠在所述隔離的神經(jīng)元周圍遷移的膜例如硅橡膠膜上來給藥。
對(duì)于患有2型糖尿病的患者，本發(fā)明用1-鏈烷?；视脱苌镄揎椀哪X衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的確切劑量和給藥方案應(yīng)當(dāng)根據(jù)每名患者所需的劑量、治療方法、所治療的疾病種類、或必要程度、以及醫(yī)師的診斷而變。當(dāng)非胃腸道給藥時(shí)，劑量和給藥頻率可根據(jù)患者的病癥、年齡、體重、和給藥途徑而變，但是當(dāng)以注射劑的形式皮下或靜脈內(nèi)給藥時(shí)，對(duì)于成人，其日劑量為每kg體重約1-約500μg、優(yōu)選約10-約250μg。當(dāng)以氣霧劑的形式施用給氣道時(shí)，對(duì)于成人，其日劑量為每kg體重約1-約500μg、優(yōu)選約10-約250μg。給藥方案是連續(xù)每日給藥、間歇給藥、或聯(lián)合采用這些方法的方案。
藥物組合物可通過將本發(fā)明的用1-酰基甘油衍生物修飾的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與可藥用無毒載體混合來制得。當(dāng)制備非胃腸道給藥(皮下注射、肌內(nèi)注射、或靜脈內(nèi)注射)的用藥物組合物時(shí)，其優(yōu)選呈溶液制劑或懸浮制劑的形式。當(dāng)制備陰道內(nèi)給藥或直腸給藥的用藥物組合物時(shí)，其優(yōu)選呈半固體制劑例如霜?jiǎng)┗蛩▌┑男问?。?dāng)制備鼻內(nèi)給藥用藥物組合物時(shí)，其優(yōu)選呈粉劑、滴鼻劑、或氣霧劑的形式。
藥物組合物呈單一劑量單位的形式，并且可通過藥物領(lǐng)域已知的任何常規(guī)方法例如在Remington’s Pharmaceutical Science(由MackPublishing Company出版，Easton，PA，1970)中描述的方法制得。注射劑可任選含有衍生自血漿的蛋白質(zhì)例如白蛋白質(zhì)、氨基酸例如甘氨酸、或糖類例如甘露糖醇作為藥物載體，此外還可以含有緩沖劑、助溶劑、或等滲劑等。當(dāng)本發(fā)明藥物組合物呈水溶液制劑或冷凍干燥制劑的形式時(shí)，其可以優(yōu)選含有表面活性劑例如吐溫80(注冊(cè)商標(biāo))、吐溫20(注冊(cè)商標(biāo))等以防止聚集。當(dāng)本發(fā)明藥物組合物是非胃腸道給藥用組合物而不是注射劑時(shí)，其可以含有蒸餾水或生理鹽水溶液、聚亞烷基二醇例如聚乙二醇、衍生自植物的油、氫化萘等。例如，陰道內(nèi)給藥或直腸給藥用藥物組合物例如栓劑可含有聚亞烷基二醇、凡士林、可可脂等作為常規(guī)賦形劑。陰道內(nèi)給藥用藥物組合物可含有吸收劑例如膽汁鹽、乙二胺鹽、檸檬酸鹽等。吸入用藥物組合物可以呈固體制劑的形式，并且可以含有乳糖等作為賦形劑，滴鼻用藥物組合物可以呈水溶液或油溶液的形式。
本發(fā)明藥物組合物特別優(yōu)選呈其中可通過單次給藥在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)例如1周-1年時(shí)間內(nèi)將本發(fā)明化合物持續(xù)地釋放給受治療者的制劑形式，并且可采用多種緩釋制劑、貯藥庫制劑、或植入制劑。
本發(fā)明用1-酰基甘油衍生物修飾的BDNF可以呈在活流體中具有低溶解度的其可藥用鹽形式。這樣的可藥用鹽是例如，(1)酸加成鹽例如磷酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、鞣酸鹽、撲酸鹽、藻酸鹽、多谷氨酸鹽等，(2)與多價(jià)金屬陽離子例如鋅、鈣、鉍、鋇、鎳等形成的鹽或絡(luò)合物，或(1)與(2)的組合例如鞣酸鋅鹽等。優(yōu)選將本發(fā)明用1-?；视脱苌镄揎椀腂DNF轉(zhuǎn)化成其弱水溶性鹽，將這樣的鹽與凝膠例如一硬脂酸鋁凝膠和芝麻油等混合，以生成合適的注射劑。在這種情況下，特別優(yōu)選的鹽是鋅鹽、鞣酸鋅鹽、撲酸鹽等。另一類緩釋注射劑是這樣的，其中本發(fā)明用1-?；视脱苌镄揎椀腂DNF優(yōu)選轉(zhuǎn)化成其弱水溶性的鹽，將其包封在分解緩慢的無毒且非抗原性聚合物例如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物或共聚物中。在這種情況下，特別優(yōu)選的鹽是鋅鹽、鞣酸-鋅鹽、撲酸鹽等。此外，可將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或其弱水溶性鹽包封在膽固醇基體或膠原基體中，以生成緩釋制劑。
經(jīng)口施用的藥物制劑可以是通過將本發(fā)明用1-?；视脱苌镄揎椀腂DNF或其鹽與卵磷脂、膽固醇、游離脂肪酸進(jìn)行微囊包封而制得的制劑，或者通過將所述微膠囊包封到明膠膠囊內(nèi)而制得的制劑，或者通過將用1-?；视脱苌镄揎椀腂DNF或其鹽包封在腸溶膠囊中而制得的制劑等。這些制劑還可以包含例如吸收劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑等。
因?yàn)槁蚜字且环N用于修飾本發(fā)明BDNF的1-?；视脱苌锏氖菑V泛天然存在的無毒物質(zhì)，所以從毒性的角度來看卵磷脂修飾的BDNF也是安全的。
實(shí)施例參考實(shí)施例1合成2-(4-羥基羰基丁?；?溶血卵磷脂
向在甘油部分的2-位具有羥基的溶血卵磷脂(式(4)?；鵕4是棕櫚?；?，在下文中也是相同的)(204mg，0.4mmol)在氯仿-吡啶(8ml/2ml)內(nèi)的懸浮液中加入DMAP(N，N-二甲基氨基吡啶)(98mg，0.8mmol)和戊二酸酐(91mg，0.8ml)，并將該混合物在60℃攪拌15小時(shí)。將該反應(yīng)溶液冷卻，并減壓濃縮。將濃縮的殘余物溶解在氯仿/甲醇/水＝4∶5∶1(2ml)中，并將該反應(yīng)溶液過已經(jīng)用所述溶液平衡過的離子交換柱(Dowex 50W-X8)，減壓濃縮，通過硅膠柱色譜純化殘余物。產(chǎn)量225mg(0.36mmol，90％)。
1H-HMR(CDCL3)0.84(t，3H)，1.20(brs)，1.52-1.60(brs，2H)，1.80-1.95(m，2H)，2.20-2.42(m，6H)，3.35(s，9H)，3.78(m，4H)，3.90-4.35(m，4H)，5.20(s，1H)參考實(shí)施例2合成2-(4-羥基羰基丁?；?溶血卵磷脂的活化酯 將在參考實(shí)施例1中獲得的羧酸(225mg，0.36mmol)溶解在二氯甲烷(5ml)中，并將該混合物冷卻至0℃，并向其中加入N-羥基琥珀酰亞胺(41mg，0.36mmol)和DCC(74mg，0.36mmol)。將該混合物在室溫?cái)嚢?5小時(shí)。經(jīng)由硅藻土將不溶物過濾，并將溶劑減壓蒸發(fā)，獲得了活性酯。
如附圖2所示，卵磷脂化的BDNF表現(xiàn)出顯著的劑量依賴性降血糖活性。雖然BDNF也表現(xiàn)出劑量依賴性降血糖活性，但是在10mg/kg的劑量沒有顯著差異。此外，當(dāng)比較卵磷脂化的BDNF 10mg/kg治療組與BDNF 10mg/kg治療組的數(shù)據(jù)時(shí)，卵磷脂化的BDNF表現(xiàn)出更強(qiáng)的作用。
此外，在第0天到第4天期間將卵磷脂化的BDNF和BDNF皮下施用給db/db小鼠后，隨著時(shí)間的推移測(cè)定給藥期間和給藥后的食物攝取量，并且食物攝取量的變化如附圖3所示。在附圖3中，■表示載體治療組的數(shù)據(jù)；□表示BDNF 10mg/kg治療組的數(shù)據(jù)；△表示BDNF 20mg/kg治療組的數(shù)據(jù)；◆表示卵磷脂化的BDNF 1mg/kg治療組的數(shù)據(jù)；○表示卵磷脂化的BDNF 3mg/kg治療組的數(shù)據(jù)；●表示卵磷脂化的BDNF10mg/kg治療組的數(shù)據(jù)；每個(gè)數(shù)據(jù)都是以平均值±S.D.(n＝5)表示的；*P＜0.05，**P＜0.01vs.載體治療組(Dunnet’s檢驗(yàn))。
此外，在第0天到第4天期間將卵磷脂化的BDNF和BDNF皮下施用給db/db小鼠后，隨著時(shí)間的推移測(cè)定給藥期間和給藥后的體重，并且體重的變化如附圖4所示。在附圖4中，■表示載體治療組的數(shù)據(jù)；□表示BDNF 10mg/kg治療組的數(shù)據(jù)；△表示BDNF 20mg/kg治療組的數(shù)據(jù)；◆表示卵磷脂化的BDNF 1mg/kg治療組的數(shù)據(jù)；○表示卵磷脂化的BDNF 3mg/kg治療組的數(shù)據(jù)；●表示卵磷脂化的BDNF 10mg/kg治療組的數(shù)據(jù)；每個(gè)數(shù)據(jù)都是以平均值±S.D.(n＝5)表示的；*P＜0.05，**P＜0.01vs.載體治療組(Dunnet’s檢驗(yàn))。
如附圖3和附圖4所示，就象對(duì)血糖水平的作用一樣，卵磷脂化的BDNF對(duì)食物攝取量和體重的作用也是劑量依賴性的，并且比BDNF更顯著。
工業(yè)實(shí)用性通過用1-?；视脱苌镄揎桞DNF，獲得了具有比BDNF改善了的藥理活性、藥動(dòng)學(xué)特征和物理性質(zhì)的修飾的BDNF。本發(fā)明的用1-?；视脱苌镄揎椀腂DNF可用作治療神經(jīng)變性疾病的治療劑。此外，本發(fā)明修飾的BDNF表現(xiàn)出劑量依賴性降血糖活性以及促進(jìn)食物攝取量和體重下降的活性，因此可用作治療糖尿病、尤其是2型糖尿病的治療劑。
權(quán)利要求
1.用1-?；视脱苌镄揎椀哪X衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
2.權(quán)利要求1的修飾的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其中所述修飾的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是式(1)化合物A(X-B)m(1)其中A是腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殘基，B是在甘油部分的2-位具有羥基的1-?；视脱苌锏臍埢?，并且是通過從羥基上除去氫原子而獲得的，X是化學(xué)交聯(lián)，且m是平均引入數(shù)目，并且不小于約0.5。
3.權(quán)利要求2的修飾的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其中X是式(2)所示基團(tuán) 其中R1是亞烷基，或式(3)所示基團(tuán) 其中R2和R3獨(dú)立地為亞烷基。
4.權(quán)利要求2的修飾的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其中所述1-酰基甘油衍生物是1-?；视?3-磷?；憠A、1-?；视?3-磷?；z氨酸、或1-酰基甘油-3-磷?；一贰?br> 5.權(quán)利要求2或3的修飾的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其中B是式(4)所示基團(tuán) 其中R4是酰基。
6.權(quán)利要求4的修飾的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其中所述?；蔷哂?-30個(gè)碳原子的鏈烷酰基。
7.治療2型糖尿病的治療劑，其中包含式(1)的修飾的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作為活性組分A(X-B)m(1)其中A是腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的殘基，B是在甘油部分的2-位具有羥基的1-?；视脱苌锏臍埢?，并且是通過從羥基上除去氫原子而獲得的，X是化學(xué)交聯(lián)，且m是平均引入數(shù)目，并且不小于約0.5。
8.權(quán)利要求7的包含修飾的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作為活性組分的治療2型糖尿病的治療劑，其中X是式(2)所示基團(tuán) 其中R1是亞烷基，或式(3)所示基團(tuán) 其中R2和R3獨(dú)立地為亞烷基。
9.權(quán)利要求7的包含修飾的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作為活性組分的治療2型糖尿病的治療劑，其中所述1-?；视脱苌锸?-酰基甘油-3-磷?；憠A、1-酰基甘油-3-磷?；z氨酸、或1-酰基甘油-3-磷?；一?。
10.權(quán)利要求7或8的包含修飾的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作為活性組分的治療2型糖尿病的治療劑，其中B是式(4)所示基團(tuán) 其中R4是?；?br> 11.權(quán)利要求10的包含修飾的腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作為活性組分的治療2型糖尿病的治療劑，其中所述酰基是具有8-30個(gè)碳原子的鏈烷?；?。
全文摘要
通過用1－?；视脱苌镄揎桞DNF而獲得的具有提高的藥理活性、生物動(dòng)力學(xué)特征和物理性質(zhì)的修飾的BDNF。該修飾的BDNF具有治療對(duì)BDNF有特異性的神經(jīng)變性疾病和糖尿病的作用，還具有高效且優(yōu)良的生物動(dòng)力學(xué)特征，這使得其特別適于治療2型糖尿病。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1426422SQ01808667
公開日2003年6月25日 申請(qǐng)日期2001年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月29日
發(fā)明者五十嵐理慧, 水島裕, 泰地睦夫, 中山智加男, 野口浩 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Ltt研究所