專(zhuān)利名稱(chēng)：血栓生成素受體調(diào)節(jié)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)有生物活性的寡肽——血栓生成素(TPO)受體調(diào)節(jié)化合物，編碼該寡肽的核酸序列，包含核酸序列的載體，包含載體的宿主細(xì)胞，寡肽的抗體，包含寡肽、核酸序列、抗體以及宿主細(xì)胞的制藥和診斷合成物，以及遺傳性改變細(xì)胞的方法，調(diào)節(jié)TPO受體(TPO-R)活性的方法和篩選更多TPO受體調(diào)節(jié)化合物的方法。
背景技術(shù)：
血小板減少癥是一種廣泛存在的、嚴(yán)重的并且威脅生命的疾病，既可作為一種原發(fā)的血液疾病發(fā)生，也可以作為一種被誘導(dǎo)的疾病發(fā)生。嚴(yán)重血小板減少癥的病人有自發(fā)性大出血的危險(xiǎn)。被誘導(dǎo)的血小板減少癥可能是由于諸如骨髓移植，腫瘤化療，放射或過(guò)敏反應(yīng)導(dǎo)致。約50％診斷出的新的癌癥患者經(jīng)歷過(guò)某種形式的化療并接受過(guò)血小板輸血。血小板減少癥影響了至少25％接受化療的患者。因?yàn)橹貜?fù)循環(huán)的劑量加強(qiáng)的化療使防止流血，并且?guī)椭迯?fù)損傷血管的血小板衰竭，所以為了使血小板數(shù)恢復(fù)，癌癥治療常常被中斷。如果血小板數(shù)不能恢復(fù)，會(huì)延遲和/或限制后續(xù)化療循環(huán)的使用，使治療成功的機(jī)會(huì)減小。
血小板減少癥的治療基本是通過(guò)輸入新鮮的血小板制劑進(jìn)行的，通過(guò)注射或者口服，這些制劑可以將血小板數(shù)量增加到正常水平，但是這樣的制劑非常昂貴，并且還不能作為成熟的藥提供。每年僅僅在美國(guó)，就有約8百萬(wàn)單位的血小板輸入患者體內(nèi)以降低嚴(yán)重出血的危險(xiǎn)。至少30％的輸血導(dǎo)致并發(fā)癥，通常是發(fā)熱反應(yīng)，偶然是菌血癥，移植-對(duì)-宿主疾病，或者急性肺部損傷。對(duì)于15-25％要求重復(fù)血小板輸入的患者，由于HLA異源免疫，增加的血小板應(yīng)答是不夠的。另外，血小板輸血非常昂貴。特別的，化療誘導(dǎo)的血小板減少癥目前采用血小板輸入和/或延遲化療直到血小板數(shù)增加進(jìn)行控制。但是，輸血可能使患者有感染以血液為傳染源的疾病的危險(xiǎn)，如乙肝、丙肝、艾滋病感染、人T淋巴病毒或者免疫反應(yīng)，如發(fā)燒。降低化療的劑量和延遲或停止治療理論上可能使癌細(xì)胞生長(zhǎng)或者蔓延。因此，設(shè)計(jì)一種治療血小板減少癥的有效藥物是一種緊迫的需要，這需要對(duì)血小板減少癥的分子和生化原理有細(xì)致的了解。
巨核細(xì)胞是起源于骨髓的細(xì)胞，負(fù)責(zé)產(chǎn)生循環(huán)的血小板。盡管在大多數(shù)物種中，僅僅是骨髓細(xì)胞的一小部分，但是它們的體積超過(guò)典型骨髓細(xì)胞的10倍。巨核細(xì)胞進(jìn)行核內(nèi)有絲分裂，它們復(fù)制核但是不分裂細(xì)胞，因此產(chǎn)生多倍體細(xì)胞。血小板數(shù)降低使核內(nèi)有絲分裂率增加，更高倍數(shù)的巨核細(xì)胞形成，巨核細(xì)胞的數(shù)量可能增加到三倍。相反，血小板數(shù)增加，核內(nèi)有絲分裂率降低，較低倍數(shù)的巨核細(xì)胞形成，巨核細(xì)胞的數(shù)量可能明顯降低。
循環(huán)的血小板的量調(diào)節(jié)核內(nèi)有絲分裂率和骨髓巨核細(xì)胞數(shù)量的精確的生理反饋機(jī)理還不知道。涉及調(diào)節(jié)這個(gè)反饋環(huán)的循環(huán)血栓形成因子目前被認(rèn)為是TPO。它是一個(gè)糖蛋白，至少有2種形式，分子量分別為25和31KDa，有一個(gè)常見(jiàn)的N末端，調(diào)節(jié)血紅細(xì)胞的產(chǎn)生。在體內(nèi)和體外，TPO都顯示為巨核細(xì)胞生成的主要調(diào)節(jié)子。TPO通過(guò)結(jié)合c-mpl(以下也稱(chēng)為T(mén)PO-R)開(kāi)始它的生物效應(yīng)，它是造血蛋白受體超家族的成員。更特異的，在涉及血小板減少癥的情況下，TPO顯示為主要的體液調(diào)節(jié)子。在一些研究中TPO顯示為能使血小板增加，增大，增加受體動(dòng)物血小板的同位素滲入。特別地，TPO被認(rèn)為通過(guò)幾條途徑影響巨核細(xì)胞生成(1)它使巨核細(xì)胞的大小和數(shù)量增加；(2)在巨核細(xì)胞中，它以多倍體的形式使DNA含量增加；(3)它增加了巨核細(xì)胞核內(nèi)的有絲分裂；(4)它使巨核細(xì)胞進(jìn)一步成熟；和(5)它以小乙酰膽堿酯酶-陽(yáng)性細(xì)胞形式以及在骨髓里，使前體細(xì)胞的百分率增加。
因?yàn)檠“鍖?duì)凝血是必需的，當(dāng)它的數(shù)量很低的時(shí)候，患者有死于悲劇性大出血的嚴(yán)重危險(xiǎn)，TPO在對(duì)各種血液疾病，例如，主要由于血小板缺乏引起的疾病的診斷和治療有潛在的有用的應(yīng)用。另外，目前的研究提供了一個(gè)用于治療血小板減少癥(特別是化療、放療或者骨髓移植治療癌癥或淋巴瘤導(dǎo)致的血小板減少癥)的TPO療法的有效的投射的基礎(chǔ)。(McDonald(1992)Am.J.Ped.Hematology/Oncology 148-21)。
編碼TPO的基因已經(jīng)被克隆，并確定了特征。(Kuter等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)9111104-11108；Barley等(1994)Cell771117-1124；；Kaushansky等(1994)Nature 369568-571；Wendling等(1994)Nature369571-574；和Savage等(1994)Nature 369533-538)。
重組血栓生成素(以下也稱(chēng)為rTPO)是目前獲得的特異設(shè)計(jì)的唯一可能有效地用于治療血小板減少癥的化合物。它在血小板減少癥里表現(xiàn)為一種血小板誘導(dǎo)物藥物。已經(jīng)顯示外源的單劑量的rTPO的應(yīng)用普遍與血小板數(shù)的增加相關(guān)。在一些情況下，它可以提高巨核細(xì)胞的應(yīng)答，因此導(dǎo)致血栓形成的并發(fā)癥。這表明，盡管在眾所周知的激動(dòng)劑(凝血酶、膠原質(zhì))不存在的情況下，血小板減少癥不會(huì)導(dǎo)致血小板聚集，但是它使血小板對(duì)于這些藥劑的聚合效應(yīng)變得敏感。這樣的“引火藥”也在體內(nèi)被證實(shí)。來(lái)源于經(jīng)過(guò)治療的血小板減少癥的動(dòng)物的血小板對(duì)刺激血小板聚集的物質(zhì)有高敏感性。因此TPO可能使血栓形成情況加劇，所以在TPO應(yīng)用于患者之前，它的危險(xiǎn)性應(yīng)該被仔細(xì)評(píng)估。同時(shí)，成熟的血小板將血栓生成素從溶液中移去，在患血小板減少癥的動(dòng)物體內(nèi)，血漿的血栓生成素濃度在血小板輸入不久后下降，只是在血小板數(shù)重新下降以后血栓生成素濃度才上升。血小板可以將TPO從循環(huán)中移去的發(fā)現(xiàn)至少有2個(gè)臨床作用i)血小板輸入可能減弱巨核細(xì)胞的恢復(fù)；ii)TPO和存在的血小板的結(jié)合可能減弱外源TPO對(duì)脊髓抑制治療的反應(yīng)。但是，因?yàn)榇嬖诘难“宄掷m(xù)結(jié)合TPO，血漿血栓生成素濃度的增加被延遲，直到許多天以后血小板減少癥介入。另外，一種去尾的重組血栓生成素形式被假設(shè)為一個(gè)單一的PEG共軛部分，在一些情況下，這些治療與血小板減少癥和抗體中和的發(fā)展相關(guān)。
除了重組血栓生成素以外，另外的一些重組細(xì)胞因子(IL-1、IL-3，、IL-6，、IL-11、GM-CSF，、鋼因子和原形成素-IL-3-血栓生成素融合蛋白)在體內(nèi)和體外的巨核細(xì)胞系的細(xì)胞中有直接和間接的刺激作用。但是，大部分這類(lèi)物質(zhì)對(duì)脊髓抑制治療后血小板的恢復(fù)沒(méi)有有益的影響，或者有不能接受的毒作用。相反的，IL-11證明為有效的和相對(duì)安全的。IL-11用于接受化療的癌癥患者的降低血小板輸入的要求。對(duì)于癌癥患者，當(dāng)每天皮下注射IL-11，能誘導(dǎo)血小板數(shù)量的增加。但是，主要是由于血漿體積擴(kuò)大導(dǎo)致這個(gè)藥物有副作用(前房節(jié)律不整、心悸、外周浮腫、頭疼、呼吸困難、貧血、肌痛、增重、厭食、反胃)。在一些癌癥患者中，發(fā)現(xiàn)了抗體的形成(在那些考慮的中和之下)。IL-11看上去只對(duì)嚴(yán)重和治療受限制的血小板減少癥患者，或者那些要求預(yù)先血小板輸入的患者適合。它不適用于常規(guī)減輕血小板減少癥。
人類(lèi)TPO-R的DNA序列和編碼的肽序列已經(jīng)被描述(Vigon等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA895640-5644)。TPO-R是造血蛋白生長(zhǎng)因子受體家族的成員。這個(gè)家族的特征是一個(gè)普遍的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，包括N端部分的4個(gè)保守的半胱氨酸殘基。
TPO-R基因克隆的提供有助于發(fā)現(xiàn)這個(gè)重要受體的激動(dòng)劑。重組受體蛋白的提供使能夠在各種任意的或者半任意的肽多樣性產(chǎn)生系統(tǒng)中研究受體-配體反應(yīng)。
WO99/42127公開(kāi)了一個(gè)TPO-受體肽(以下稱(chēng)為T(mén)PO-Rp野生型)，由23個(gè)氨基酸組成，對(duì)應(yīng)于人類(lèi)TPO-Rp氨基酸444-466。公開(kāi)了通過(guò)應(yīng)用TPO-Rp于受體調(diào)節(jié)TPO-R活性的方法。但是，專(zhuān)門(mén)治療血小板減少癥的方法沒(méi)有公開(kāi)。
不同的作者報(bào)告了TPO-R的缺失突變有利于結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的分析Dorsch等J.Exp.Med.(1997)186，1947-1955，Drachman和Kaushansky，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94，2350-2355，Porteu等，Mol.Cell.Biol.(1996)，2473-2482和Takatoku等，J.Biol.Chem，(1997)272，7259-7263。
更多的血栓生成素受體激動(dòng)劑肽被了解，比如Kimura等(J.Biochem.(1997)122，1046-1051，Biochem.Mol.Biol.Int.(1998)44，1203-1209)公開(kāi)了一個(gè)從任意噬菌體肽庫(kù)獲得的15氨基酸的肽，它刺激了血栓生成素依賴(lài)細(xì)胞的增生和鼠骨髓細(xì)胞分化為巨核細(xì)胞。Cwirla等公開(kāi)了一個(gè)14氨基酸的血栓生成素受體激動(dòng)劑肽，從人骨髓細(xì)胞在體外刺激巨核細(xì)胞的增生和成熟。(Science(1997)276，1696-1699)。
這些TPO-R或者激動(dòng)劑肽的缺失突變是否被證明能夠作為血栓生成素的模擬物具有潛在的能開(kāi)發(fā)成為穩(wěn)定和制藥有效的藥物的能力并沒(méi)有被公開(kāi)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一個(gè)有效的化合物，它有助于診斷和治療血液病，比如先天的和誘導(dǎo)的血小板減少癥，特別是化療、過(guò)敏和放射誘導(dǎo)的血小板減少癥，而同時(shí)無(wú)毒并穩(wěn)定。
本發(fā)明通過(guò)提供一個(gè)分離并純化的具有TPO-R調(diào)節(jié)子生物活性的寡肽解決了以上的問(wèn)題，這個(gè)寡肽包含，特別在本質(zhì)上，更優(yōu)先的由15-18個(gè)氨基酸組成，具有通式X1GTLELX2PX3SRYRLQLX4，其中X1是ARG或缺失。
X2是R或AX3是R或A，以及X4是RAR或缺失。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)先的實(shí)施例中，該寡肽包含，特別本質(zhì)上，更優(yōu)的由一個(gè)氨基酸序列組成，這個(gè)氨基酸序列被定義為SEQ ID Nos.1，2，3，4，5或6的任何一個(gè)，它們完全符合本發(fā)明。
尤其，本發(fā)明基于一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即以上的寡肽調(diào)節(jié)TPO-R的活性，特別是強(qiáng)烈的與TPO-R結(jié)合，激活TPO-R，并提高內(nèi)源TPO的利用。本發(fā)明的寡核苷酸因此顯示至少兩個(gè)不同的活性，即(i)對(duì)TPO-R活性的調(diào)節(jié)效用，比如激動(dòng)效用，如TPO-模擬效用，或者詰抗效用，以及(ii)和TPO的協(xié)作效用，特別是當(dāng)兩個(gè)化合物都在極限下的濃度時(shí)，協(xié)作作用特別重要，因?yàn)樗葍H僅使用TPO更具有臨床優(yōu)勢(shì)。
此外，本發(fā)明的寡肽顯示了非常高的效能和效率，也就是，在nM到μM的范圍里都有活性。本發(fā)明的寡肽可以單獨(dú)應(yīng)用或者與TPO結(jié)合使用。與TPO相反，本發(fā)明的寡肽不導(dǎo)致TPO受體的下調(diào)節(jié)，因此不導(dǎo)致TPO敏感性下降。相反，外源TPO給藥可能導(dǎo)致這樣的TPO受體下調(diào)節(jié)，因此敏感性或忍耐誘導(dǎo)下降。此外，本發(fā)明的寡肽對(duì)TPO-R有高度選擇性，并且顯示例如與密切相關(guān)的紅細(xì)胞生成素受體沒(méi)有交叉反應(yīng)性。
本發(fā)明的寡肽與TPO-R的結(jié)合位點(diǎn)和TPO與TPO-R的結(jié)合位點(diǎn)完全不同。本肽不妨礙TPO-R與TPO的結(jié)合，兩種化合物都能和同一個(gè)受體分子結(jié)合。至于活性，這些結(jié)合特性導(dǎo)致TPO和本寡肽的協(xié)同反應(yīng)，這在細(xì)胞信號(hào)測(cè)定中被觀察到，當(dāng)本寡肽和TPO分別為極限下的濃度時(shí)，通過(guò)測(cè)定底物磷酸化，獲得約20％最大信號(hào)的信號(hào)。但是當(dāng)兩者同時(shí)存在時(shí)，也為極限下的濃度，可得最大信號(hào)。當(dāng)TPO在一個(gè)很高的劑量時(shí)，本發(fā)明的寡肽倒轉(zhuǎn)了TPO-R的下調(diào)節(jié)。在高濃度TPO中加入本寡肽導(dǎo)致TPO-R的信號(hào)傳導(dǎo)。盡管與TPO-R特異結(jié)合，本發(fā)明的寡肽能夠誘導(dǎo)受體最適合結(jié)合的構(gòu)像，并且這樣激活了信號(hào)途徑中的底物。因此，除了它自身對(duì)TPO-R信號(hào)途徑的激動(dòng)效應(yīng)，本寡肽當(dāng)和天然的激素TPO結(jié)合時(shí)，擴(kuò)大了TPO活性的范圍，在化合物極限下濃度時(shí)，與TPO協(xié)同作用；在高激素濃度時(shí)，倒轉(zhuǎn)了“鐘形”曲線效應(yīng)。
本發(fā)明進(jìn)一步顯示野生型TPO-Rp也具有特異治療血液病，特別是血小板減少癥的活性作用。這樣，本發(fā)明的寡肽以及野生型TPO-Rp，單獨(dú)使用或者與TPO或血小板結(jié)合使用，對(duì)于診斷，特別是治療血液病表現(xiàn)出特別的作用，例如由于血小板紊亂引起的疾病，和所有各種類(lèi)型的血小板減少癥。由于本發(fā)明的寡肽在制藥合成中的小體積和高穩(wěn)定性，尤其在應(yīng)用于口服的情況下，它們還有優(yōu)勢(shì)。它們進(jìn)一步顯示了在體內(nèi)的高穩(wěn)定性。
不被理論束縛，本發(fā)明的寡肽似乎能特別的調(diào)節(jié)TPO-R的活性。就是說(shuō)，和TPO的結(jié)合導(dǎo)致了受體二聚化，并且激活了細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)途徑。在這期間，發(fā)生受體的特異磷酸化，該受體與JAK激酶家族的激酶(JAK2和TYK2)相關(guān)，以及后續(xù)的轉(zhuǎn)錄因子STAT5的磷酸化和二聚化?；罨腟TAT5蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與刺激細(xì)胞增生和增加血小板數(shù)量的目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。但是，盡管以上的野生型機(jī)制可能也對(duì)本寡肽有效，不能排除本寡肽有不同的機(jī)制，例如，通過(guò)結(jié)合受體單體，模擬受體的第二根鏈，或者與那些受體上天然TPO不結(jié)合的位點(diǎn)結(jié)合。事實(shí)上，本寡肽似乎與天然TPO有不同的作用位點(diǎn)。
本發(fā)明也涉及一個(gè)野生型TPO-Rp的替換突變衍生物Y14F，也就是野生型TPO-Rp14位的酪氨酸被苯丙氨酸替換。這樣改變了的肽可能對(duì)諸如肽降解的研究特別有價(jià)值，因?yàn)檫@樣的肽在它的N或者C端可以特異的用碘處理。
本發(fā)明的寡肽和野生型TPO-Rp對(duì)防止和治療由TPO調(diào)節(jié)的疾病有作用，特別是對(duì)于治療血液病，包括但不僅限于血小板紊亂、由過(guò)敏反應(yīng)、化療、放療或者骨髓移植引起的血小板減少癥，以及先天性血小板減少癥。因此，本發(fā)明也提供了一個(gè)用于治療以上疾病的方法，其中患血小板紊亂的患者對(duì)用TPO-R調(diào)節(jié)化合物治療易感，特別是當(dāng)TPO激動(dòng)劑接受或輸入一個(gè)治療有效的本發(fā)明的寡肽和/或野生型TPO-Rp的劑量或數(shù)量時(shí)。
本發(fā)明還提供了一個(gè)制藥合成物，包括一個(gè)或多個(gè)這里描述的寡肽和/或野生型TPO-Rp和一個(gè)生理上能接受的載體。這些制藥合成物有各種形式，包括口服形式、可吸入粉末和溶液，以及可注射和可注入的溶液。
在本發(fā)明的一個(gè)特優(yōu)實(shí)施例中，這樣的合成物和方法也包括TPO結(jié)合野生型TPO-Rp和/或本發(fā)明的寡肽的應(yīng)用。
下列定義是為了說(shuō)明和明確本發(fā)明所描述的各種術(shù)語(yǔ)的意義和范圍。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”定義為使一個(gè)宿主細(xì)胞包含一個(gè)目的核酸分子的行為，包括天然的TPO-Rp核酸序列或者編碼不是細(xì)胞原始的一部分的，或不在天然部位，不是天然拷貝數(shù)的或使用已知方法定向的本發(fā)明寡肽的核酸序列。
經(jīng)過(guò)“可操作的連接”指一個(gè)基因和至少一個(gè)調(diào)控序列結(jié)合，當(dāng)以一個(gè)合適的分子(例如轉(zhuǎn)錄激活蛋白)與調(diào)控序列結(jié)合的方式時(shí)，能夠進(jìn)行正義或反義表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)“載體”指一個(gè)重組DNA結(jié)構(gòu)，可能是從任何來(lái)源導(dǎo)出的質(zhì)粒、病毒或自主復(fù)制序列、噬菌體、或核酸序列，線性或環(huán)狀，單鏈或雙鏈DNA或RNA，其中一些核酸序列被連接或重組進(jìn)一個(gè)特定結(jié)構(gòu)，它能夠引入一個(gè)用于一個(gè)被選擇的基因產(chǎn)物的啟動(dòng)子片段和DNA序列，從正義或反義方向，與一個(gè)合適的的3’非翻譯序列進(jìn)入細(xì)胞。
“質(zhì)?！笔沁z傳元件，可以不成為它們宿主細(xì)胞染色體的一部分而穩(wěn)定遺傳。它們可以包含DNA或RNA，可能是線性的或者環(huán)狀的。質(zhì)粒編碼分子在細(xì)胞復(fù)制時(shí)保證了它們的復(fù)制和穩(wěn)定遺傳，而且可能編碼了大量具有制藥、農(nóng)業(yè)和環(huán)境重要性的產(chǎn)物。他們還可以編碼對(duì)抗生素有抗性的基因。質(zhì)粒在分子生物學(xué)中，作為克隆和表達(dá)重組基因的載體被廣泛運(yùn)用。這里公開(kāi)的起始質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)商業(yè)途徑、公開(kāi)途徑得到，或者可以從可得的質(zhì)粒通過(guò)常規(guī)使用的已知的公開(kāi)的步驟構(gòu)建。根據(jù)本發(fā)明可以使用的許多質(zhì)粒和其他克隆和表達(dá)載體都是已知的，并且通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)可以得到。另外，這些技術(shù)可以構(gòu)建任何數(shù)量的其它適用于本發(fā)明的質(zhì)粒。在本發(fā)明中，這些質(zhì)粒和其他載體的性質(zhì)、構(gòu)建和使用對(duì)于本發(fā)明公開(kāi)的技術(shù)是很明顯的。
“宿主細(xì)胞”指一個(gè)經(jīng)過(guò)遺傳改變的細(xì)胞，它通過(guò)嵌合的、異源的或自體的核酸序列的遷移進(jìn)行遺傳改變，或者它的子代細(xì)胞仍然包含這個(gè)序列。這些細(xì)胞也稱(chēng)為“轉(zhuǎn)基因細(xì)胞”。在自體的核酸序列被遷移的情況中，序列在宿主細(xì)胞中，在另外的遺傳環(huán)境中或者在另外的方向上與天然發(fā)生的相比有更高的拷貝數(shù)。
通過(guò)“固體支持”一個(gè)不溶的介質(zhì)指無(wú)論是天然生物的，比如但不僅限于一個(gè)細(xì)胞或抗菌素微粒，或合成的，比如但不僅限于丙烯酰胺衍生物、纖維素、尼龍、硅土和或磁性的微粒，可溶的分子可以與它連接或結(jié)合。
術(shù)語(yǔ)“抗體”指一個(gè)多肽，由一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白基因或它的一部分編碼。它特異結(jié)合和識(shí)別被分析物(抗原)。被識(shí)別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ξ和μ恒定區(qū)基因，以及無(wú)數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因?？贵w以例如完整的免疫球蛋白或一些由不同的肽酶產(chǎn)生的特有的片段的方式存在。“抗體”也指經(jīng)修改的抗體(如寡聚的，還原的，氧化的和標(biāo)記的抗體)。這里使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”，也包括通過(guò)那些整個(gè)抗體的修改或用重組DNA方法從頭合成的抗體片段。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整的分子和片段，這里，如Fab、F(ab’)2和Fv，它們可以和抗原決定基結(jié)合。這些抗體片段保留了選擇性結(jié)合它的抗原或受體的一些能力，定義如下1)Fab，包含一價(jià)抗體-結(jié)合的抗體分子片段。可以通過(guò)整個(gè)抗體用木瓜蛋白酶消化獲得，產(chǎn)生一個(gè)完整的輕鏈和一個(gè)重鏈的一部分。
2)Fab’，抗體分子的一部分，可以通過(guò)整個(gè)抗體用胃蛋白酶處理然后還原得到，產(chǎn)生一個(gè)完整的輕鏈和一部分重鏈；每個(gè)抗體分子得到2個(gè)Fab’片段。
3)(Fab’)2，抗體的片段，可以通過(guò)整個(gè)抗體用胃蛋白酶處理然后不經(jīng)過(guò)還原得到。F(ab’)22個(gè)Fab’由2個(gè)二硫鍵連接的二聚體。
4)Fv，定義為遺傳工程片段，包含輕鏈的可變區(qū)域和重鏈的可變區(qū)域，表達(dá)為2條鏈；以及5)單鏈抗體(“SCA”)，定義為遺傳工程分子，包含輕鏈的可變區(qū)域，重鏈的可變區(qū)域，通過(guò)一個(gè)合適的多肽連接物連接，作為一個(gè)遺傳融合單鏈分子。
合成這些片段的方法在本領(lǐng)域已知。(比如參見(jiàn)，Harlow和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約(1988))。
本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“抗原決定基”指一個(gè)抗原上的任何抗原決定簇，抗體的抗體結(jié)合部位結(jié)合于此?？乖瓫Q定基通常包括表面化學(xué)活性基團(tuán)分子，如氨基酸或者糖側(cè)鏈，而且通常有特異的三維結(jié)構(gòu)和特異電荷特征。
本發(fā)明的蛋白及其片段的單克隆抗體也可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)獲得。通過(guò)運(yùn)用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備單克隆抗體的基本方法已經(jīng)被知道。不死的抗體產(chǎn)生細(xì)胞系可以通過(guò)細(xì)胞融合制備，也可以通過(guò)其他技術(shù)獲得，如B淋巴細(xì)胞和致瘤DNA的直接轉(zhuǎn)化，或Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)染。見(jiàn)例如M.Schreier等，“雜交瘤細(xì)胞技術(shù)”(1980)；Hammerling等，“單克隆抗體和T-細(xì)胞雜交瘤”(1981)；Kennett等，“單克隆抗體”(1980)；也見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,452,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632和4,496,890。目的蛋白，特別是TPO-Rp或本發(fā)明的寡肽及其片段的一組單克隆抗體可以通過(guò)不同的特性進(jìn)行篩選，即同型、抗原決定基、親和力等?？蛇x擇的，編碼目的單克隆的基因可以通過(guò)PCR技術(shù)(這種技術(shù)在本領(lǐng)域已知)從雜交瘤細(xì)胞中分離、克隆，并在特別的合適的載體中表達(dá)。運(yùn)用單個(gè)蛋白和其直接對(duì)應(yīng)的免疫親和技術(shù)，單克隆抗體在純化中有作用。本發(fā)明的抗體，無(wú)論是多克隆或是單克隆都有另外的作用，他們可以作為免疫測(cè)定、RIA、ELISA等的試劑。另外，他們可以被用于從細(xì)胞抽提液或細(xì)胞中檢測(cè)和/或分離本發(fā)明的寡肽。這些抗體，例如，可以用于建立基于組織培養(yǎng)的測(cè)定，以發(fā)現(xiàn)或修飾調(diào)節(jié)TPO-R活性的新化合物，如模擬TPO活性。
人化的或嵌合的抗體可以包含來(lái)源于兩個(gè)不同物種的部分(如人的恒定區(qū)和鼠的結(jié)合區(qū)域)。來(lái)源于兩個(gè)不同物種的部分可以通過(guò)傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)結(jié)合在一起，或用遺傳工程技術(shù)制備成單個(gè)融合蛋白。編碼嵌合抗體兩個(gè)部分蛋白的DNA可以作為單個(gè)融合蛋白表達(dá)。
在一群異源蛋白和其他生物制劑存在的情況下，當(dāng)抗體能夠進(jìn)行一個(gè)結(jié)合反應(yīng)，而這個(gè)反應(yīng)對(duì)鑒定某個(gè)蛋白是否存在是決定性的，稱(chēng)這個(gè)抗體與一個(gè)蛋白“特異結(jié)合”或?qū)@個(gè)蛋白“有特異的免疫反應(yīng)性”。因此，在指定的免疫測(cè)定時(shí)，特異的抗體優(yōu)先與特定的蛋白結(jié)合，不和大量存在于樣品中的其它蛋白結(jié)合。在這樣的情況下，與蛋白特異結(jié)合要求一個(gè)對(duì)特定蛋白特異的抗體。不同的免疫測(cè)定方式被用于選擇對(duì)一個(gè)特定蛋白有特異免疫反應(yīng)性的抗體。比如，固相ELISA免疫測(cè)定常規(guī)地用于選擇對(duì)特定蛋白有特異免疫反應(yīng)性的單克隆抗體。見(jiàn)Harlow和Lane(1988)抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。冷泉港出版社，紐約。它描述了免疫測(cè)定的形式和能夠用于決定特異免疫反應(yīng)性的條件。
術(shù)語(yǔ)“免疫測(cè)定”指利用抗體或抗原與分析物，也可以是一個(gè)抗體或抗原特異結(jié)合的測(cè)定。免疫測(cè)定的特征是運(yùn)用特定的抗體或抗原特異結(jié)合性質(zhì)對(duì)被分析物進(jìn)行檢測(cè)、分離、定位和/或定量?？乖蛘呖贵w可以被標(biāo)記以能夠被檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“治療”指一個(gè)藥物或藥劑的預(yù)防和/或治療作用。也就是說(shuō)，定義為一個(gè)包含治療或診斷有效的化合物和至少一個(gè)添加劑，例如載體結(jié)合的合成物。
“激動(dòng)劑”指一個(gè)有生物活性的配體，與它的互補(bǔ)的有生物活性的受體結(jié)合，并激活受體，導(dǎo)致受體的一個(gè)生物應(yīng)答或提高受體的生物活性。一個(gè)TPO激動(dòng)劑與TPO受體(TPO-R)結(jié)合。TPO激動(dòng)劑可能表現(xiàn)為類(lèi)似TPO模擬物。但是，TPO激動(dòng)劑也可能通過(guò)不同于那些TPO的結(jié)合位點(diǎn)或機(jī)制激活或有助于激活TPO-R。
“詰抗劑”指一個(gè)有生物活性的配體，與它的互補(bǔ)的有生物活性的受體結(jié)合，并抑止、降低或消除TPO-R的活性，例如通過(guò)不同或相似于那些TPO的結(jié)合位點(diǎn)或機(jī)制的方式。
術(shù)語(yǔ)“制藥可接受的鹽”指無(wú)毒的堿金屬、堿土金屬和銨鹽，通常使用的包括銨、鋇、鈣、鋰、鎂、鉀、魚(yú)精蛋白鋅鹽和鈉鹽。它們都用本領(lǐng)域已知的方法制備獲得。這個(gè)術(shù)語(yǔ)也包括無(wú)毒，即制藥可接受的酸添加鹽，通常通過(guò)將本發(fā)明的寡肽和合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸反應(yīng)，例如醋酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、延胡索酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、馬來(lái)酸鹽、乙-苯磺酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽、戊酸鹽等。
術(shù)語(yǔ)“制藥可接受的酸添加鹽”指保留了生物有效性和自由堿基性質(zhì)的鹽，它們是非生物的或其它不需要的，由無(wú)機(jī)酸，如氫溴酸、鹽酸、硝酸、磷酸、硫磺酸，和有機(jī)酸如醋酸、苯甲酸、肉桂酸、檸檬酸、利尿酸、延胡索酸、乙醇酸、馬來(lái)酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、苦杏仁酸、薄荷烷磺酸、草酸、丙酸、p-甲苯亞磺酸、丙酮酸、水楊酸、琥珀酸、酒石酸等形成。
術(shù)語(yǔ)“制藥可接受的酯”指酯鍵水解后，其成分保留了生物有效性和其組成性質(zhì)的，即羧酸或乙醇以及非生物的或其它不需要的酯。本發(fā)明也計(jì)劃利用這些既是以上描述的酯，也同時(shí)是其制藥可接受的酸添加鹽的合成物。
本發(fā)明的鹽可以通過(guò)將自由的寡肽和一個(gè)合適的堿溶解在水或水/乙醇溶劑或其它合適的溶劑中獲得，然后通過(guò)蒸發(fā)溶液、冷凍和凍干或向含有寡核苷酸鹽的水或乙醇溶液加入其它的溶劑(如二乙醚)分離本發(fā)明獲得的鹽，包括不可溶鹽的分離。至于鹽的形成，通常由1或最多2摩爾堿基，即陽(yáng)離子，和1摩爾自由寡肽組成。為了制備堿寡肽鹽，優(yōu)先的使用堿金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽。制備的肽鹽可以自由溶解于水。因此，本發(fā)明也涉及制備寡肽鹽的工藝。
本發(fā)明中，堿基被認(rèn)為作為可以在溶液中，特別是在水或乙醇溶液中，形成陽(yáng)離子的物質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“制藥可接受的氨基化合物”指氨基鍵水解后，其成分保留了生物有效性和羧酸或胺性質(zhì)的，以及非生物的或其它不需要的氨基化合物。這些氨基化合物代表性的由相應(yīng)的羧酸和胺構(gòu)成。本發(fā)明也計(jì)劃利用這些既是以上描述的氨基化合物，也同時(shí)是其制藥可接受的酸添加鹽的合成物。
制備制藥可接受的酯和氨基化合物的技術(shù)比如公開(kāi)在March AdvancedOrganic Chemistry，3rdEd.，John Wiley & Sons，紐約(1985)p.1152.制藥可接受的酯和氨基化合物可用作藥物前體，公開(kāi)在Bundgaard，H.，ed.，(1985)藥物前體的設(shè)計(jì)，Elsevier Science Publishers，阿姆斯特丹。
術(shù)語(yǔ)“制藥或治療可接受的載體”指不妨礙活性成分的生物活性有效性的，并且對(duì)宿主或患者無(wú)毒的載體媒介。
本發(fā)明的寡肽和合成物應(yīng)用的“治療或制藥有效的量”指足夠誘導(dǎo)目的生物效果的寡肽和合成物的量。這個(gè)效果可以是征兆、現(xiàn)象的緩和，或?qū)е录膊?，或任何其它生物系統(tǒng)中預(yù)期的改變。在本發(fā)明中，效果將在一優(yōu)選實(shí)施例中涉及TPO模擬活性，即選擇的防止、消除和/或降低血小板減少癥的征兆，比如提高血小板的數(shù)量，和/或防止血小板數(shù)量的降低。
本發(fā)明的寡肽的氨基酸殘基被傳統(tǒng)地縮寫(xiě)如下苯丙氨酸為Phe或F；亮氨酸為L(zhǎng)eu或L；異亮氨酸為Ile或I；蛋氨酸為Met或M；纈氨酸為ValV；絲氨酸為Ser或S；脯氨酸為Pro或P；蘇氨酸為T(mén)hr或T；丙胺酸為Ala或A；酪氨酸為T(mén)yr或Y；組氨酸為His或H；谷氨酰氨為Gln或Q；天冬酰氨為Asn或N；賴(lài)氨酸為L(zhǎng)ys或K；天冬氨酸為Asp或D；谷氨酸為Glu或E；半胱氨酸為Cys或C；色氨酸為T(mén)rp或W；精氨酸為Arg或R；以及甘氨酸為Gly或G。
這樣，比如連續(xù)的ARG，為一個(gè)有丙胺酸、精氨酸和甘氨酸組成的三肽，而連續(xù)的RAR是精氨酸、丙胺酸和精氨酸。
本發(fā)明不僅涉及特別異在SEQ ID No.1-6中提到的寡肽，還涉及其生物等價(jià)物，即有不同結(jié)構(gòu)但表現(xiàn)出相似或可比的生物效應(yīng)的代替物，特別是其衍生物，它有相似或可比的結(jié)構(gòu)和/或功能，并作為T(mén)PO-R調(diào)節(jié)子。這些生物等價(jià)物，特別是其衍生物，可能和本發(fā)明的寡肽在對(duì)水解或蛋白質(zhì)水解的易感性上和/或其它生物性質(zhì)上，如對(duì)TPO受體親和力的增加有所不同。因此，本發(fā)明也涉及了例如制藥可接受的本發(fā)明的寡肽鹽、氨基化合物或酯。
因此，除了包含天然存在的氨基酸的寡肽，也提供了肽模擬物或肽類(lèi)似物。肽類(lèi)似物通常作為與那些模板氨基酸性質(zhì)類(lèi)似的非肽藥物。這些類(lèi)型的非肽化合物被稱(chēng)為“肽的模擬物”或“肽模擬物”。與治療有用的肽結(jié)構(gòu)相似的肽的模擬物可以用于制備等價(jià)物或提高治療或預(yù)防疾病的效果。通常的，肽模擬物與典型多肽結(jié)構(gòu)相似(典型多肽指具有生物或制藥活性的多肽)，如天然存在的受體結(jié)合多肽，但有一個(gè)或更多的肽連接鍵選擇性地通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法被以下的連接鍵替換，包括-CH2-NH-NH-、-C-CH2-S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(順式和反式)，-COCH2-、-CH(OH)-CH2-和-CH2-SO-。特別的非肽連接鍵是-CH2-NH-。相比多肽，這樣的肽的模擬物可能有顯著的優(yōu)勢(shì)，體現(xiàn)在包括，例如提高化學(xué)穩(wěn)定性，提高制藥特性(半衰期、吸收、效能、效率等)，改變了專(zhuān)一性以更節(jié)約地制備(如廣譜的生物活性)，降低抗原性等。肽模擬物的標(biāo)記通常涉及與一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記直接的或者通過(guò)間隔區(qū)(如氨基)與肽模擬物上的非干擾位點(diǎn)共價(jià)連接。肽模擬物通過(guò)大量結(jié)構(gòu)-活性數(shù)據(jù)和/或分子模型被預(yù)測(cè)。這樣的非干擾位點(diǎn)通常是不和那些與肽模擬物結(jié)合使產(chǎn)生治療效果的大分子(如免疫球蛋白超家族分子)形成直接接觸的位點(diǎn)。衍生作用如肽的模擬物的標(biāo)記不能實(shí)質(zhì)地干擾它預(yù)想的生物或制藥活性。通常，受體結(jié)合肽的肽的模擬物與受體結(jié)合有高親和力，并具有可檢測(cè)的生物活性，即激動(dòng)或詰抗一個(gè)或更多的受體介導(dǎo)的表型的改變。
本發(fā)明中，一個(gè)或更多的L-氨基酸替換為同型的D-氨基酸(如D-賴(lài)氨酸代替L-賴(lài)氨酸)可能被用于產(chǎn)生更多穩(wěn)定的肽。
另外，本發(fā)明涉及一種寡肽，它包含有以上通式確定的一致序列或?qū)嵸|(zhì)上相同的已知序列地變體，它可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，比如加入內(nèi)在的半胱氨酸殘基能夠形成分子內(nèi)二硫鍵，使肽環(huán)化。
本發(fā)明不僅涉及以上線性化形式的寡肽，當(dāng)然也涉及環(huán)化的寡肽，比如通過(guò)第一個(gè)和最后一個(gè)氨基酸的氨基鍵形成的環(huán)化。
“合成的或者不是天然發(fā)生的氨基酸”指在體內(nèi)不是天然存在的，但可以和本發(fā)明的寡肽合成一體的氨基酸。其它優(yōu)先的合成氨基酸包括那些氨基酸，其氨基基團(tuán)通過(guò)一個(gè)以上的碳原子(如β-丙胺酸或γ-氨基丁酸)與羧基基團(tuán)分離。特別優(yōu)先的合成氨基酸包括天然發(fā)生的L-氨基酸的D-氨基酸，L-1-萘-丙胺酸，L-2-萘丙胺酸，L-環(huán)己基丙胺酸，L-2-氨基異丁酸，蛋氨酸的亞砜和砜衍生物。
“可檢測(cè)的標(biāo)記”指一類(lèi)物質(zhì)，當(dāng)與寡肽、寡肽模擬物和/或本發(fā)明的抗體物質(zhì)共價(jià)結(jié)合的時(shí)候，在體內(nèi)或體外系統(tǒng)里能夠檢測(cè)體內(nèi)的寡肽和寡肽的模擬物，例如寡肽或寡肽的模擬物被給予的患者。合適的可檢測(cè)標(biāo)記在本領(lǐng)域已知，例如通過(guò)放射性同位素和熒光標(biāo)記(如熒光素)。
可檢測(cè)的標(biāo)記與寡肽或寡肽模擬物的共價(jià)結(jié)合通過(guò)本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)方法完成。比如，當(dāng)125I放射性同位素應(yīng)用于可檢測(cè)的標(biāo)記，125I與寡肽或寡肽模擬物的共價(jià)結(jié)合可以通過(guò)與氨基酸酪氨酸結(jié)合進(jìn)入寡肽或寡肽的模擬物，然后用碘處理寡肽。同樣，32P可以作為磷酸部分通過(guò)例如肽或肽模擬物的羥基基團(tuán)，和寡肽或寡肽的模擬物結(jié)合。
本發(fā)明的寡肽可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)方法制備，例如通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)。標(biāo)準(zhǔn)的方法包括，但不僅限于，專(zhuān)用的固相合成，部分固相合成方，片段濃縮，經(jīng)典固相合成，以及重組DNA技術(shù)。本發(fā)明的寡肽因此可以直接通過(guò)重組技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，CSHL出版社，冷泉港，紐約1989)，或作為融合蛋白，例如對(duì)于一個(gè)特異結(jié)合對(duì)中的一個(gè)蛋白，通過(guò)親和試劑可以純化融合蛋白，然后，通常在得到目標(biāo)肽的位點(diǎn)用蛋白水解切開(kāi)。
寡肽可能擴(kuò)展以提供方便的結(jié)合位點(diǎn)(如半胱氨酸或賴(lài)氨酸)，提高穩(wěn)定性，結(jié)合特定受體，提供位點(diǎn)-直接反應(yīng)，提供簡(jiǎn)便的純化，改變物理性質(zhì)(如可溶性，電荷等)，穩(wěn)定構(gòu)像等。通過(guò)連接基團(tuán)或通過(guò)半胱氨酸(二硫鍵)或肽鍵共價(jià)連接，寡肽可以作為融合蛋白加入非野生型側(cè)面區(qū)域。寡肽可以通過(guò)各種具有兩種不同功能的試劑連接，如馬來(lái)酸酯苯甲酸，甲基二硫代乙酸，巰基苯甲酸，S-吡啶二硫代丙酰胺等。為了促進(jìn)目標(biāo)寡肽的抗體的制備，寡肽可以在氨基酸鏈的N或C末端或者當(dāng)中加入單個(gè)氨基酸。例如，本發(fā)明的寡肽可以和一個(gè)產(chǎn)生免疫性的蛋白共價(jià)連接，如鎖眼帽貝血青蛋白，卵清蛋白等。
本發(fā)明的寡肽可以與其它肽和蛋白連接表達(dá)，使得在中間或者在N或C末端成為鏈的一部分。這樣的融合寡肽被稱(chēng)為融合或共軛肽。不同的表達(dá)后可以進(jìn)行修飾，包括糖基化。例如，通過(guò)應(yīng)用合適的編碼序列，法呢基化或異戊二烯基可以被提供，這樣目標(biāo)肽就可以和一個(gè)末端的脂類(lèi)基團(tuán)結(jié)合，并且可以插入脂膜，如脂質(zhì)體。本發(fā)明的寡肽可以PEG化，這里聚乙烯基團(tuán)提高了其在血液中的壽命。本發(fā)明的寡肽也可以和血清蛋白(如白蛋白)連接。寡肽可以通過(guò)蛋白融合或通過(guò)連接其它蛋白結(jié)合，如IgG同型的Fc，以提高互補(bǔ)結(jié)合，或和一個(gè)毒素，如篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素，或其類(lèi)似物，特別是A鏈。寡肽可能和用于位點(diǎn)直接反應(yīng)的抗體連接。本發(fā)明因此也提供了包含本發(fā)明的寡肽的共軛肽。
本發(fā)明的寡肽可以作為具有相似生物活性的非肽化合物的結(jié)構(gòu)模型。本領(lǐng)域的各種技術(shù)可以用于構(gòu)建與本寡肽有相同或相似預(yù)期生物活性的，但是在溶解度、穩(wěn)定性和對(duì)水解和蛋白酶水解的敏感度上有更多更好活性的化合物。這些技術(shù)包括用由磷酸鹽、氨基化合物、碳酸鹽、磺酰胺、二級(jí)胺和N-甲基氨基酸組成的骨架代替肽骨架。
因此，本發(fā)明也涉及重組制備本發(fā)明的寡肽。
因此，本發(fā)明涉及編碼SEQ ID No.1-7的寡肽的核酸序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并，這些寡肽包含多于6種不同的核酸序列。當(dāng)然，本發(fā)明也涉及通過(guò)例如核酸增加、缺失、插入或倒置以上核酸的突變的序列，只要具有本發(fā)明預(yù)期的TPO-R調(diào)節(jié)子作用。
本發(fā)明也涉及包含以上核酸序列的載體，可以使用傳統(tǒng)的材料和技術(shù)導(dǎo)入宿主系統(tǒng)，并表達(dá)。DNA元件，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、聚腺苷化位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄中止信號(hào)等，應(yīng)該和核酸序列關(guān)聯(lián)，以啟動(dòng)并調(diào)控表達(dá)。使用的特異調(diào)控元件將依賴(lài)于被選擇的用于表達(dá)的宿主系統(tǒng)是否被期望分泌寡肽或共軛肽。在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的載體為細(xì)菌、病毒、哺乳動(dòng)物或酵母的載體，在一特優(yōu)實(shí)施例中包含以上確定的能夠在合適的宿主細(xì)胞里直接表達(dá)的核酸序列的5’和/或3’調(diào)控元件。
各種載體被用來(lái)作為在宿主細(xì)胞中導(dǎo)入本發(fā)明寡肽并表達(dá)的媒介物。已知這些載體在不同的宿主細(xì)胞類(lèi)型中有作用，包括，例如哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pSG5(Stratagene)，p-RKI(Genetics Institute)，P-SVK3(Pharmacia)，p-EUK-Cl(Clontech)，pCDM(Invitrogen)，pcDNAI(Invitrogen)，和細(xì)菌表達(dá)載體pFLAG-1(IBI)，所有的pET系統(tǒng)質(zhì)粒(Novagen)，pTrcHis(Invitrogen)，pGEX系列(Pharmacia)和pKK233-2(Clontech).這些載體可以在宿主細(xì)胞中作為附加體存在，或者可以促進(jìn)該核酸序列整合到宿主細(xì)胞基因組上，或兩者皆有。載體也包括其它有用的特征，如使成功引入載體的細(xì)胞能夠被選擇或檢測(cè)的基因。
適合本發(fā)明的核酸序列表達(dá)的宿主細(xì)胞包括，但不僅限于原核的和真核的宿主，如枯草桿菌、大腸桿菌、酵母、非洲爪蟾卵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞和各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型，包括特別的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)細(xì)胞、Hela細(xì)胞、L(tk-)細(xì)胞、原始培養(yǎng)、Cos17細(xì)胞、Cos1細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞和CV1細(xì)胞。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞也包括提供糖基化。
本發(fā)明也涉及通過(guò)轉(zhuǎn)染上述確定的載體遺傳地改變細(xì)胞的方法。轉(zhuǎn)染可以通過(guò)傳統(tǒng)的方法，如生物的、物理的、化學(xué)的或電誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)。特別是電穿孔、細(xì)胞融合、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒或病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移或粒子轟擊法。
本發(fā)明也涉及制備非人的能夠在其細(xì)胞里產(chǎn)生本發(fā)明的寡肽的哺乳動(dòng)物的方法，這里，本發(fā)明的核酸序列被導(dǎo)入一個(gè)非人的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別不晚于8-細(xì)胞-，優(yōu)先1-細(xì)胞-階段，然后在合適的條件下培養(yǎng)，以得到成熟的分化了的動(dòng)物。這樣的動(dòng)物可以在它們的生殖細(xì)胞或體細(xì)胞，特別是在它們的染色體中包含本發(fā)明的核酸序列，能夠表達(dá)本發(fā)明的寡肽。本發(fā)明的一個(gè)特優(yōu)實(shí)施例在于哺乳動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。這樣的方法使各種方式的基因治療成為可能，如體細(xì)胞基因治療或生殖細(xì)胞基因治療。
本發(fā)明也包括特別是對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，更特別的是哺乳動(dòng)物，最特別的靈長(zhǎng)類(lèi)和小鼠及其細(xì)胞的遺傳控制。這些動(dòng)物的至少一些細(xì)胞中包含比如在調(diào)控元件的控制下被轉(zhuǎn)染的本發(fā)明的核酸序列的正義或反義結(jié)構(gòu)，這對(duì)研究和診斷目的是有用的，因?yàn)楦淖兞薚PO-R的活性。通過(guò)用本發(fā)明的正義或反義的核酸序列，如倒置、缺失、插入、添加等的改變使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的TPO-R改變，并得到這樣的被遺傳控制的動(dòng)物是可能的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的載體或寡核苷酸被轉(zhuǎn)染并整合到非人的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的染色體上，以表達(dá)能夠調(diào)控TPO-R活性的寡肽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的載體和寡核苷酸通過(guò)同源重組，轉(zhuǎn)染并插入基因組，特別是外源TPO-R基因，以制備動(dòng)物表達(dá)改變了的TPO-R。因此，本發(fā)明也涉及被遺傳改變的動(dòng)物，特別是相比野生型動(dòng)物，表現(xiàn)了改變的TPO-R功能的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這樣的在哺乳動(dòng)物中，特別是在非人的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的功能改變是由于導(dǎo)入了本發(fā)明的反義或正義結(jié)構(gòu)可能包含了核酸序列改變和/或是由于外源核酸序列對(duì)TPO-R的控制。依靠這些改變，如插入其它突變，或根據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)的沒(méi)有突變的TPO-Rp編碼序列的正義或反義的拷貝，或外源基因的改變，可能能夠獲得對(duì)上述定義的目的有用的動(dòng)物。本發(fā)明因此也涉及單個(gè)包含上述定義的改變的非人的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)。
本發(fā)明也涉及一個(gè)制備本發(fā)明的寡肽的方法，包括根據(jù)該方法轉(zhuǎn)染載體進(jìn)入細(xì)胞，在培養(yǎng)基中，在能表達(dá)寡肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并且用傳統(tǒng)技術(shù)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收寡肽。
本發(fā)明也涉及特別與本發(fā)明的寡肽結(jié)合的單克隆或多克隆抗體或其片段。這些抗體可用于檢測(cè)和分離本發(fā)明的寡肽及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，甚至TPO-R本身。如果寡肽或TPO-R存在于包含TPO-R或寡肽的來(lái)源中，如細(xì)胞、部分細(xì)胞、細(xì)胞器官，檢測(cè)或分離前進(jìn)一步的操作是必須的，例如破壞生物材料，如酶的細(xì)胞溶菌作用的傳統(tǒng)方法。
本發(fā)明也涉及特異識(shí)別和結(jié)合上述抗體的單克隆或多克隆抗體。
本發(fā)明也涉及從包含寡肽的混合物中檢測(cè)和/或分離本發(fā)明的寡肽的免疫測(cè)定加入本發(fā)明的抗體到混合物中，寡肽被檢測(cè)和/或分離。相反的，免疫測(cè)定可以通過(guò)利用本發(fā)明的寡肽作為探針檢測(cè)本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明的寡肽在體外作為獨(dú)特的分析TPO生物作用的工具，包括評(píng)估涉及TPO制備和受體結(jié)合過(guò)程的許多因素。本發(fā)明的寡肽也對(duì)開(kāi)發(fā)其他結(jié)合和激活TPO-R的化合物有作用，因?yàn)樵摴央奶峁┝撕芏嘟Y(jié)構(gòu)與激活關(guān)系的重要的信息。
本發(fā)明的寡肽也在篩選進(jìn)一步的TPO受體激動(dòng)劑的測(cè)定中作為競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物。本發(fā)明的寡肽可不經(jīng)改變而使用，或者可以經(jīng)修飾共價(jià)或非共價(jià)地與直接或間接提供可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記部分連接。直接標(biāo)記標(biāo)記基團(tuán)包括如放射性標(biāo)記、酶如過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酯酶以及能夠檢測(cè)熒光強(qiáng)度、波長(zhǎng)變化或熒光極化的熒光標(biāo)記。間接標(biāo)記包括使一個(gè)組件與生物素連接，然后與偶合了上述標(biāo)記基團(tuán)的抗生物素蛋白結(jié)合。在化合物和固體支持物結(jié)合的情況下，這些化合物還包括間隔物。
基于它們結(jié)合TPO受體的能力，本發(fā)明的寡肽可以用于檢測(cè)在膜上、細(xì)胞組織上、代謝區(qū)上、活細(xì)胞上、固定細(xì)胞上、生物流體中、組織勻漿中、純化的天然生物物質(zhì)中、原始抽提物中等的TPO受體的試劑。例如，通過(guò)標(biāo)記該寡肽，可以確定表面是否有TPO-R。進(jìn)一步，基于它們結(jié)合TPO-R的能力，本發(fā)明的寡肽可以用于原位染色法、FACS(熒光-激活細(xì)胞分類(lèi))、Western blotting，ELISA等。另外，基于它們結(jié)合TPO-R的能力，本發(fā)明的寡肽可用于分離和純化TPO-R的方法，或分離和純化在細(xì)胞表面上或被滲透的細(xì)胞里表達(dá)TPO-R的細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及了本發(fā)明的寡肽用傳統(tǒng)方法被固定后(如在固體支持物上)，用于篩選和分離過(guò)程。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，特別是本發(fā)明的篩選測(cè)定，寡肽不擴(kuò)散地與一個(gè)含有被分離樣品接收區(qū)域的不溶性支持物(如微量滴定盤(pán))結(jié)合。該不溶性支持物可以用任何能夠結(jié)合寡肽或受體，能夠與可溶性物質(zhì)分開(kāi)，而且與篩選方法相容的合成物制造。這些支持物的表面是固體的或多孔的，以及任何可行的形狀。合適的不溶性支持物包括微量滴定盤(pán)、膜和珠。典型的由玻璃、塑料制成，如聚苯乙烯、多聚糖、尼龍或硝酸纖維素。
當(dāng)然，本發(fā)明也涉及上述分離和篩選方法用寡肽和/或抗體進(jìn)行高通量抗體篩選和/或分離方法，例如在沒(méi)有用固定試劑的溶液中。
本發(fā)明的寡肽也可以作為商業(yè)化的試劑用于各種藥物研究和診斷。這樣的應(yīng)用包括但不僅限于(1)在許多功能測(cè)定中，作為T(mén)PO或潛在的TPO激動(dòng)劑的活性定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；(2)用于維持TPO依賴(lài)細(xì)胞系的增生和生長(zhǎng)；(3)通過(guò)共結(jié)晶方法用于TPO-受體的結(jié)構(gòu)分析；(4)用于研究TPO信號(hào)傳導(dǎo)/受體激活的機(jī)制；以及(5)其它研究和診斷應(yīng)用，在這些應(yīng)用中，TPO-受體很好的被活化，或者通過(guò)TPO或其激動(dòng)劑已知的量這樣的活化容易被測(cè)定。
本發(fā)明的寡肽可用于體外巨核細(xì)胞和它們祖先的增大，與細(xì)胞因子(如TPO)共同作用或單獨(dú)使用?；熀头暖熗ㄟ^(guò)殺死快速分裂的，較成熟的巨核細(xì)胞群導(dǎo)致了血小板減少癥。但是，這些治療方法也可以降低不成熟的、有絲分裂活性較低的巨核細(xì)胞前體細(xì)胞。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明寡肽能夠使血小板減少癥得到改善通過(guò)經(jīng)過(guò)化療或放療的患者和患者自身的細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)獲得的巨核細(xì)胞和未成熟的前體細(xì)胞進(jìn)行比較被證明。
本發(fā)明的寡肽和/或野生型的TPO-Rp和/或與其特異結(jié)合的抗體也可以作用于動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，如嚙齒動(dòng)物和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，包括人，以調(diào)節(jié)，特別是在體內(nèi)激活TPO-R和/或增加或維持現(xiàn)存的血小板數(shù)量。這樣，本發(fā)明包含TPO相關(guān)疾病的治療方法，包括給予足夠量的本發(fā)明的寡肽，以調(diào)節(jié)體內(nèi)TPO-R的作用。例如，給予本發(fā)明的寡肽和合成物可以治療各種血液疾病，包括但不僅限于血小板紊亂和血小板減少癥，特別是當(dāng)與骨髓移植、放療和化療相關(guān)的情況下。這樣的給藥也包括TPO的應(yīng)用。
因此，本發(fā)明也涉及調(diào)節(jié)特別是增加或減少TPO-R活性的方法，這里無(wú)論TPO的存在與否，本發(fā)明的寡肽或與其特異結(jié)合的抗體都可應(yīng)用于TPO-R。這樣的方法可以是體內(nèi)或體外的方法。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的寡肽和合成物預(yù)防地在化療、放療或骨髓移植之前或同時(shí)，或在這樣的輻照(exposure)之后給藥。
因此，本發(fā)明也提供制藥合成物，包括作為一種活性成分，至少有一個(gè)本發(fā)明的寡肽和/或TPO-Rp野生型寡肽，與一個(gè)制藥載體或稀釋液相連。本發(fā)明的合成物可以系統(tǒng)地或局部地給藥，特別是通過(guò)血管內(nèi)口的、肺部的、注射的，如肌肉的、腹膜內(nèi)的、靜脈內(nèi)的(IV)或皮下的注射或吸入，如通過(guò)一個(gè)提煉的粉末形式，通過(guò)皮膚的、鼻的、陰道的、直腸的，或給藥的舌下途徑，也可以用適合每個(gè)給藥途徑的服用藥形式。本發(fā)明的寡肽和/或TPO-Rp野生型寡肽可用于制藥可接受的鹽、酸添加鹽、酯、氨基化合物和/或自由堿基的形式的合成物，優(yōu)先為制藥有效的劑量。
用于口服給藥的固體服用藥形式包括膠囊、lingualettes、片劑、藥丸、粉末、脂質(zhì)體、小塊、時(shí)間延遲的包衣、顆粒。在這樣的固體服用藥形式中，活性化合物和至少一種惰性制藥可接受的載體，如乳糖、蔗糖或淀粉混合。這樣的固體服用藥形式也可以包含除了惰性稀釋劑的其它物質(zhì)，例如潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂。在膠囊、片劑和藥丸的情況下，服用藥形式也包含膨脹劑和/或緩沖劑，以及食用香料。片劑和藥丸可以另外加入腸衣制備。
用于口服給藥的液體服用藥形式包括制藥可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿，和本領(lǐng)域通常使用的包含惰性稀釋劑的萬(wàn)用藥，如水。除了這樣的惰性稀釋劑，合成物也可以包含佐劑，如改變滲透壓的鹽、pH-調(diào)節(jié)化合物、皮膚滲透劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和懸濁劑和甜味劑、食用香料和香味劑。
根據(jù)本發(fā)明，用于注射給藥的制藥合成物包括消過(guò)毒的水或非水溶液、懸浮液或乳液。非水溶液或介質(zhì)包括例如丙二醇、聚乙二醇、植物油，如橄欖油和谷類(lèi)油、膠質(zhì)、和可注射的有機(jī)酯，如乙烷基油酸鹽。這樣的服用藥形式也可能包括佐劑，如防止、濕潤(rùn)、乳化和分散劑。它們可以通過(guò)，例如用阻止細(xì)菌的過(guò)濾器過(guò)濾，將消毒劑與合成物結(jié)合，放射照射合成物、或加入合成物消毒。它們也可以在用之前用無(wú)菌水，或其它一些無(wú)菌的可注射的介質(zhì)制備。
注射的形式包含生理可接受的介質(zhì)，如水、鹽水、PBS、乙醇溶液、己二酸乙二醇溶液和類(lèi)似物?？扇苡谒姆栏瘎⒈徊捎茫▉喠蛩釟溻c、三磷酸鈉、抗壞血酸鹽、殺藻胺、氯丁醇、硫柳汞、苯汞基硼酸鹽、parabens、芐基乙醇和苯基乙醇。這些試劑的含量可以以個(gè)人質(zhì)量的約0.001到約5％，更好的從約0.001到約2％存在。合適的可被采用的可溶于水的緩沖劑是堿或堿土碳酸鹽、磷酸鹽、重碳酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、醋酸鹽、琥珀酸鹽和類(lèi)似物，如鈉磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、醋酸鹽、重碳酸鹽和碳酸鹽。添加劑，如碳甲基纖維素可以作為載體，含量從質(zhì)量的約0.001到約5％。形式的變化依賴(lài)于形式的目的，可以使用特別的形式以調(diào)節(jié)受體活性，實(shí)現(xiàn)計(jì)劃的治療等。
用于直腸或陰道給藥的合成物優(yōu)先為栓劑，除了活性物質(zhì)，還可以包含賦形劑，如可可油或栓劑蠟。用于鼻腔或舌下給藥的合成物也用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)賦形劑制備。
包含本發(fā)明寡肽和/或野生型TPO-Rp的合成物可以用于預(yù)防和/或治療。在用于治療中，對(duì)于治愈或者至少部分減輕病癥和其并發(fā)癥的足夠量，即治療有效劑量的合成物給予已經(jīng)患如以上描述的疾病的患者。
在預(yù)防應(yīng)用中，包含本發(fā)明寡肽和/或野生型TPO-Rp的合成物給予對(duì)于特定疾病易感或有危險(xiǎn)的患者。這樣的劑量定義為“預(yù)防有效劑量”。在這個(gè)應(yīng)用中，精確的劑量依賴(lài)于患者的健康狀況和體重。
本發(fā)明的制藥合成物也可以以沉淀物的形式給藥，如緩釋合成物。這樣的緩釋合成物包含存在于基質(zhì)上例如由膠原質(zhì)制成的微粒。
有效治療所需的本發(fā)明的TPO激動(dòng)劑的量依賴(lài)于許多不同的因素，包括給藥方法、靶位點(diǎn)、患者的生理狀況和其它給予的藥物。
當(dāng)每天給藥的劑量范圍為哺乳動(dòng)物體重的約0.03mg到10mg/kg，特別是約0.03mg到1mg/kg時(shí)，本發(fā)明的寡肽和/或野生型TPO-Rp在治療TPO介導(dǎo)的情況下有效。特異的劑量由特定的治療情況、給藥途徑控制，以及通過(guò)主治醫(yī)師根據(jù)各種因素，如情況的嚴(yán)重程度、年齡、基本狀況等判斷。
本發(fā)明的寡肽和/或野生型TPO-Rp可以單獨(dú)給藥或和TPO一起給藥。由于TPO提高了本寡肽的效率，后者的劑量可能能降低50％或25％(與TPO應(yīng)用的調(diào)節(jié)劑量相反)。
本發(fā)明的合成物，優(yōu)先的水溶性的合成物，可以進(jìn)一步包含一個(gè)可注射入體液的，在本發(fā)明的每一單位劑量濃度下不顯示出實(shí)質(zhì)制藥活性的水溶性蛋白。(以下稱(chēng)為“水溶性蛋白”)。這樣的水溶性蛋白中，優(yōu)先為血清白蛋白、球蛋白、膠原質(zhì)和/或膠質(zhì)。這個(gè)蛋白可以以一個(gè)普遍使用的劑量加入到可注射的制藥合成物中。這樣，例如水溶性蛋白和本發(fā)明的寡肽的比重為約0.0001∶1到100∶1，優(yōu)先為約0.001∶1到10∶1，或更優(yōu)先的約0.01∶1到約1∶1。
繼續(xù)的，本發(fā)明也涉及上述的寡肽本身和包含它們的合成物，特別的，以干燥和/或純化的形式或在水或水/乙醇溶液中存在。由可溶性合成物或本發(fā)明的肽鹽制備的溶液的pH應(yīng)該不對(duì)制藥活性多肽的活性產(chǎn)生任何不利的影響，但是處在一個(gè)通常注射可接受的范圍；進(jìn)一步，這樣的pH不能導(dǎo)致溶液粘度產(chǎn)生很大的改變，也不能形成沉淀或沉淀類(lèi)似物。因此，溶液的pH應(yīng)該優(yōu)選為4-7，更優(yōu)為5-6，特別是5.3-5.5。
當(dāng)本發(fā)明的水溶性合成物轉(zhuǎn)換為用于給藥的水溶液時(shí)，制藥活性寡肽或其鹽在所述溶液中的濃度應(yīng)優(yōu)選為約0.0000001到10％(w/v)，更優(yōu)的約0.000001到5％(w/v)，或最優(yōu)的約0.00001到1％(w/v)。
本發(fā)明的合成物應(yīng)該優(yōu)選的具有一個(gè)包含本發(fā)明制藥活性寡肽的單位劑量形式，并且如果需要，加入其它添加劑，如上述提到的水溶性蛋白。這樣，例如，上述提到的2或3個(gè)成分溶解或懸浮在無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽水中，裝入安瓿劑或管形瓶。在這種情況下，制備方法可以包括混合制藥活性寡肽鹽溶液和進(jìn)一步，如果需要添加劑溶液，或加入粉末狀的添加劑到制藥活性寡肽鹽溶液或任何其它適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合過(guò)程。給藥形式也通過(guò)加入無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽水到含有制藥活性寡肽鹽的凍干或真空的粉末，如果需要添加劑，就共同存在。單位給藥形式可以包含一個(gè)或更多的傳統(tǒng)添加劑，如pH調(diào)節(jié)試劑(如氨基乙酸、鹽酸、氫氧化鈉)、局部麻醉劑(如利多卡因氫氯化物、氯代丁醇)、同中子素化試劑(如氯化鈉、甘露醇、山梨醇)、乳化劑、吸收抑制劑(如Tween60或80)、滑石、淀粉、乳糖和黃芪膠、硬脂酸鎂、甘油、丙烯乙二醇、防腐劑，芐基乙醇、甲基羥基安息香酸鹽和/或發(fā)煙硫酸二十烷醇?xì)?。這個(gè)單位給藥形式可以進(jìn)一步包含制藥可接受的成分，如聚乙烯乙二醇400或右旋糖苷。
本發(fā)明的合成物根據(jù)傳統(tǒng)方法混合這些成分制成?；旌媳景l(fā)明合成物的目的應(yīng)該是維持制藥活性寡肽的活性，而且氣泡反應(yīng)在過(guò)程中應(yīng)最小化。同時(shí)或以任何順序，將各種成分放在一個(gè)容器里(如瓶子或圓桶里)。容器里的空氣可以是，例如，無(wú)菌潔凈的空氣或無(wú)菌的氮?dú)狻：铣傻娜芤嚎梢员晦D(zhuǎn)移到小瓶或安瓿中，可以進(jìn)一步凍干。
本發(fā)明的合成物的液體形式或凍干粉末形式可以溶解或分散到生物可降解的聚合體溶劑中，如聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、聚(羥基丁酸)、聚(羥基丁酸-乙醇酸)共聚物或它們的混合，然后可能被定型到，如，薄膜、微膠囊(微球體)、或毫微膠囊(毫微球體)中，特別是以軟或硬的膠囊形式。
另外，裝入脂質(zhì)體膠囊，包括磷脂、膽固醇或它們的衍生物的本發(fā)明的合成物可以進(jìn)一步分散到生理鹽水或溶于生理鹽水的透明質(zhì)酸溶液中。
軟膠囊可以用本發(fā)明的合成物的液體形式填充。硬膠囊可以用本發(fā)明的合成物的凍干粉末填充，或者本發(fā)明的合成物的凍干粉末可以包含在片劑里，分別用于直腸給藥或口服。
當(dāng)然，本發(fā)明的合成物可以以預(yù)先填充注射器的形式提供自我給藥。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明寡肽和野生型TPO-Rp，編碼這些寡肽的核酸序列，本發(fā)明的載體，本發(fā)明的宿主細(xì)胞和/或本發(fā)明的抗體用于制備診斷或者治療血液病，特別是血小板減少癥的藥物。
最后，本發(fā)明涉及用于診斷血液病，特別是血小板減少癥的診斷合成物。包括本發(fā)明的寡肽和野生型TPO-Rp，編碼這些寡肽的核酸序列，本發(fā)明的載體，本發(fā)明的宿主細(xì)胞和/或本發(fā)明的抗體，選擇性的和可接受的載體連接。在本發(fā)明一個(gè)特優(yōu)實(shí)施例中，用以上的方法標(biāo)記可以用于本發(fā)明診斷合成物的上述提到的試劑。因此，本發(fā)明標(biāo)記的寡肽，標(biāo)記的核酸序列，標(biāo)記的細(xì)胞和/或標(biāo)記的抗體可用于特異檢測(cè)TPO-R相關(guān)的情況，特別是疾病。相似的，就如上面解釋的，標(biāo)記的試劑可用于鑒定和分離潛在的更多的藥物。
盡管以上只特別描述了本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例，在不背離本發(fā)明的精神和可能的范圍的情況下，修改和改變本發(fā)明是可以的，本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施例列舉在權(quán)利要求中。
SEQ ID No.1到7代表本發(fā)明的寡肽的氨基酸序列。
根據(jù)在全長(zhǎng)(也被稱(chēng)為野生型)TPO-Rp中的位置，肽的長(zhǎng)度用第一個(gè)和最后一個(gè)氨基酸數(shù)字確定。WO99/42127中公開(kāi)了關(guān)于TPO-Rp野生型的氨基酸序列和它的制備，完全和目前的知識(shí)一致。單個(gè)氨基酸的替換用傳統(tǒng)的命名法命名，如“R9A”——描述了TPO-Rp野生型中的原始第9位的精氨酸殘基被替換成丙胺酸。


圖1本發(fā)明的寡肽對(duì)用卡鉑處理(180mg/kg)的小鼠的作用，圖2本發(fā)明的寡肽對(duì)用卡鉑處理(200mg/kg)的小鼠的作用，圖3到6根據(jù)HPLC圖譜進(jìn)行穩(wěn)定性研究的結(jié)果，(圖3第0天，30nmole干粉重新制成1mM溶液中，圖4A第2天，樣品以1mM溶液貯存，圖4B第2天，樣品以干粉貯存，圖5A第9天，樣品以1mM溶液貯存，
圖5B第9天，樣品以干粉貯存，圖6A第14天，樣品以1mM溶液貯存，圖6B第14天，樣品以干粉貯存。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1TPO-Rp(野生型和本發(fā)明的寡肽)在治療卡鉑誘導(dǎo)的血小板減少癥中的作用I方法體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的模型早前已經(jīng)被報(bào)導(dǎo)(Akahori等(1996)干細(xì)胞14678-689，Akahori等(1996)Br.J.Haematol.94722-728，Shibuya等(1998)血液9137-45，Andrews等(1996)干細(xì)胞14661-677)。下面簡(jiǎn)要說(shuō)明了引入的改進(jìn)和修改。
定量給藥時(shí)間表每個(gè)測(cè)試組(PBS、TPO或TPO-Rp)用腹腔內(nèi)注射的方式以單日劑量給藥。日劑量開(kāi)始于第0日，持續(xù)整個(gè)試驗(yàn)期(第10日)。在第0日和第4日兩次腹腔內(nèi)注射卡鉑，每次90mg/kg(組11為PBS)。
血液取樣第0日(基礎(chǔ)的)、第8、11、14、18日的血液進(jìn)行采集。血液通過(guò)從小鼠(8周大的雄鼠C57BL/6Y)尾部取樣獲得，然后燒灼。每個(gè)小鼠80μl的血液采樣到肝素化的血液收集管中。80μl的血液然后與160μl包含足夠EDTA(0.225％)的鹽水混合，以防止凝血。
通過(guò)小鼠的卡鉑誘導(dǎo)的血小板減少癥，檢測(cè)體內(nèi)SEQ ID No.2(TPO-Rp，1-18，R9A，R11A)和No.4(TPO-Rp，4-18，R9A，R11A)的TPO-Rp的效果和野生型肽(TPO-Rp野生型，氨基酸序列ARGGTLELRPRSRYRLQLRARLN)的效果。卡鉑用于誘導(dǎo)血小板減少癥。為了能夠用與臨床情況盡可能相似的模型實(shí)驗(yàn)，一個(gè)先前報(bào)道過(guò)的卡鉑模型被認(rèn)真研究并進(jìn)行了修改。(Akahori等(1996)干細(xì)胞14678-689，Akahori等(1996)Br.J.Haematol.94722-728，Shibuya等(1998)血液9137-45，Andrews等(1996)干細(xì)胞14661-677)。另外，為了用對(duì)給予的藥物顯示最高反應(yīng)，而同時(shí)最小壓力的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)上述方法)，使動(dòng)物出血的方法也被認(rèn)真研究。卡鉑的劑量被增加到了180mg/kg，分兩次腹腔內(nèi)注射，分別在第0天(一半劑量)和第4天(另一半劑量)。在第8天，卡鉑誘導(dǎo)了嚴(yán)重的血小板減少癥。
使用的動(dòng)物組顯示在表I.
表I“體內(nèi)”研究的實(shí)驗(yàn)組組 總劑量 動(dòng)物1 卡鉑a+TPO-Rp野生型0.03mg/kg/day 82 卡鉑a+TPO-Rp野生型0.30mg/kg/day 83 卡鉑a+TPO-Rp野生型0.90mg/kg/day 84 卡鉑a+TPO-Rp SEQ ID No.20.03mg/kg/day 85 卡鉑a+TPO-Rp SEQ ID No.20.30mg/kg/day 86 卡鉑a+TPO-Rp SEQ ID No.20.90mg/kg/day 87 卡鉑a+TPO-Rp SEQ ID No.40.03mg/kg/day 88 卡鉑a+TPO-Rp SEQ ID No.40.30mg/kg/day 89 卡鉑a+TPO-Rp SEQ ID No.40.90mg/kg/day 810 卡鉑a+TPO2.4μg/kg/day811 無(wú)卡鉑 812 卡鉑a單獨(dú) 12a第0日和第4日兩次注射卡鉑，每次90mg/kg。
圖1顯示了在卡鉑處理的小鼠中血小板數(shù)量的劇烈下降，并且概述了上述提到的不同實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果用個(gè)體動(dòng)物基礎(chǔ)值的百分?jǐn)?shù)變化表達(dá)。圖1顯示，劑量為300μg/kg/天和30μg/kg/天的野生型肽TPO-Rp顯著提高了血小板數(shù)量。需要指出，在這樣很高的卡鉑劑量時(shí)，先前使用有效的濃度的TPO(2.4μg/kg/天)不能防止血小板的降低。圖1也顯示縮短的TPO-Rp肽(SEQ ID No.2)，即1-18殘基和R9A，R11A，在劑量為300μg/kg/天和30μg/kg/天時(shí)，對(duì)卡鉑誘導(dǎo)的血小板減少有很強(qiáng)的保護(hù)作用。這兩個(gè)劑量的保護(hù)作用同樣顯著；但是基于存活率(見(jiàn)下)，最低劑量30μg/kg/天有特別的意義，而劑量300μg/kg/天和TPO-Rp野生型效果可比。最高的肽劑量0.9mg/kg/天在血小板保護(hù)方面顯示了很低的效果，這可能是由于肽的聚合造成。圖1也顯示了SEQ ID No.4的TPO-Rp肽最短的序列，即4-18殘基和R9A，R11A，在卡鉑處理的小鼠中顯示了對(duì)血小板水平有一定作用。所有的肽，野生型TPO-Rp、TPO-Rp1-18(R9A，R11A)和TPO-Rp4-18(R9A，R11A)對(duì)其它血液成分沒(méi)有明顯作用。進(jìn)一步，治療沒(méi)有對(duì)動(dòng)物的體重有影響。
檢測(cè)被處理的動(dòng)物的存活率是很重要的。通過(guò)CHI-平方分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估，TPO-Rp，1-18(R9A，R11A)肽表現(xiàn)出了最好的效果和因此最高的存活率。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，用野生型處理的小鼠也表現(xiàn)出了顯著的存活率。
上述所有內(nèi)容清楚地指出肽TPO-Rp1-18(R9A，R11A)顯著地使卡鉑誘導(dǎo)的血小板減少癥恢復(fù)，并且顯示出使該化合物在“體內(nèi)”的活性提高了10倍。
實(shí)施例2TPO-Rp(野生型和本發(fā)明的寡肽)在治療卡鉑誘導(dǎo)的血小板減少癥的作用II方法定量給藥時(shí)間表每個(gè)測(cè)試組用腹腔內(nèi)注射的方式以單日劑量給藥。日劑量開(kāi)始于第0日，持續(xù)整個(gè)試驗(yàn)期(第13日)。最小限度的劑量分別在指定時(shí)間給予第0和4；第0、4和8；第0、4、8和12；第8天到第14天。在第0日和第4日兩次腹腔內(nèi)注射卡鉑，每次100mg/kg。
血液取樣第0日(基礎(chǔ)的)、第8、11、14、18日的血液進(jìn)行采集。血液通過(guò)從小鼠(8周大的雄鼠C57BL/6Y)尾部取樣獲得，然后燒灼。每個(gè)小鼠80μl的血液采樣到肝素化的血液收集管中。80μl的血液然后與160μl包含足夠EDTA(0.225％)的鹽水混合，以防止凝血。
卡鉑的劑量被增加到了200mg/kg，作為積累劑量，分兩次腹腔內(nèi)注射，分別在第0天(一半劑量)和第4天(另一半劑量)。在第7天，卡鉑誘導(dǎo)了嚴(yán)重的血小板減少癥。
使用的動(dòng)物組顯示在表II.
表II“體內(nèi)”研究的實(shí)驗(yàn)組組 總劑量給藥日期1 卡鉑a+TPO-Rp SEQ ID No.2，0.3mg/kg/day0到132 卡鉑a+TPO-Rp SEQ ID No.2，0.3mg/kg/day03 卡鉑a+TPO-Rp SEQ ID No.2，0.3mg/kg/day0和44 卡鉑a+TPO-Rp SEQ ID No.2，0.3mg/kg/day0，4和85 卡鉑a+TPO-Rp SEQ ID No.2，0.3mg/kg/day0，4，8和126 卡鉑a+TPO-Rp SEQ ID No.2，0.3mg/kg/day8和147 卡鉑a+TPO，2.4μg/kg/day 0到138 卡鉑a+TPO，10μg/kg/day 0到139 卡鉑a+TPO，10μg/kg/day 8到1410 無(wú)卡鉑11 卡鉑a單獨(dú) 0和4a第0日和第4日兩次注射卡鉑，每次100mg/kg。
結(jié)果圖2概述了所有卡鉑處理的小鼠實(shí)驗(yàn)組(RCH-01303代表SEQ ID No.2的寡肽)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果用個(gè)體動(dòng)物基礎(chǔ)值的百分?jǐn)?shù)變化表達(dá)。
圖2顯示，劑量為300μg/kg/天的肽增加了血小板數(shù)量。需要指出，為了檢測(cè)在血小板減少癥時(shí)化合物的能力，而這是非常普遍的臨床情況，相比實(shí)施例1增加了卡鉑的劑量。使用濃度為2.4μg/kg/天的TPO激素——同實(shí)施例1，在卡鉑劑量為180mg/kg時(shí)，也不能防止血小板的下降。在更高的劑量10μg/kg/天時(shí)，TPO顯示了一定的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的效果。但是，在這個(gè)特定的卡鉑模型下，由SEQ ID No.2的寡肽引起的效果要比由TPO引起的強(qiáng)。
圖2概述了測(cè)定降低寡肽劑量可能性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。濃度為0.3mg/kg/天的寡肽只在第0天、第0和4天、第0、4和8天、第0、4、8和12天給藥。值得注意的，對(duì)于卡鉑處理的小鼠，似乎只要肽在第0和4天給藥就足夠顯示保護(hù)作用。第11和14天顯示了具有統(tǒng)計(jì)意義的保護(hù)作用水平。有趣的是那些最小劑量處理的組表現(xiàn)出很大的不同的應(yīng)答。這種情況并不少見(jiàn)，正如已知的個(gè)體對(duì)于相同治療的反應(yīng)是不同的。無(wú)論如何，只要在第0和4天給藥，由SEQ ID No.2的寡肽引起的效果就具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義了。同樣的，在第0、4和8天或第0、4、8和12天對(duì)血小板減少癥顯示了顯著的效果。最小劑量的效果可以與連續(xù)給予本寡肽(從第0天到第13天)相比。這樣的降低劑量但是有同樣治療效果的可能性，可以明顯的成為一個(gè)臨床上的優(yōu)勢(shì)。
對(duì)野生型TPO-Rp和本發(fā)明的寡肽的研究指出，這里肽反應(yīng)機(jī)制和自然存在的激素反應(yīng)機(jī)制不同。有顯示，對(duì)于第一次接受化療，并且?guī)滋旌笥肨PO處理的患者，TPO沒(méi)有效果，因此，提出了下面的實(shí)驗(yàn)。
一組被卡鉑處理過(guò)的，從第0天開(kāi)始給予化療試劑的動(dòng)物，從第8到14天接受10μg/kg/天劑量的TPO。相似的，另外一組，SEQ ID No.2的寡肽以0.3mg/kg/天從第8到14天給予卡鉑處理過(guò)的，從第0天開(kāi)始給予化療試劑的動(dòng)物。結(jié)果也顯示在圖2中。TPO對(duì)血小板減少癥沒(méi)有顯示出明顯的作用。相反，盡管是在治療開(kāi)始以后給予的，TPO-Rp(SEQ ID No.2)顯示了血小板的恢復(fù)。寡肽處理的動(dòng)物的血小板水平統(tǒng)計(jì)上的顯著增加，顯示保護(hù)作用不僅存在于治療開(kāi)始的時(shí)候給藥。這個(gè)發(fā)現(xiàn)不僅顯示了本發(fā)明的寡肽在治療開(kāi)始后有防止卡鉑破壞作用的能力，也表明該寡肽和TPO有不同的作用機(jī)制。這樣，兩個(gè)效果——(i)最小劑量給藥時(shí)間表和(ii)不同的作用機(jī)制——提供了大量的優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例3體外寡肽的藥物代謝動(dòng)力學(xué)方法用人血清(包含200個(gè)患者的血清組)和鼠血漿(包含50個(gè)動(dòng)物的血漿組)研究野生型TPO-Rp，TPO-Rp1-18(R9A，R11A，SEQ ID No.2)和TPO-Rp4-18(R9A，R11A，SEQ ID No.4)的降解特征。為了檢測(cè)降解，使用了125I標(biāo)記的肽(標(biāo)記在Y14上)。只有完整的肽和標(biāo)記的降解產(chǎn)物能通過(guò)HPLC分析檢測(cè)。因此，在不同點(diǎn)進(jìn)行這樣的分析清楚地檢測(cè)了指定肽的降解時(shí)間。設(shè)定37℃保溫。本實(shí)驗(yàn)里，標(biāo)記肽的濃度約為1μM。
結(jié)果鼠血漿組的肽降解結(jié)果顯示在表III。在鼠血漿中，TPO-Rp的半衰期看上去為約12分鐘。SEQ ID No.2的TPO-Rp1-18顯示出較短的半衰期，為約1.1分鐘，而SEQ ID No.4的寡肽顯示了很短的半衰期，約0.5分鐘。
表III體外肽在37℃時(shí)的穩(wěn)定性肽 鼠血漿組 人血清組野生型TPO-Rp 12.1 1.9TPO-Rp(1-18；R9A，R11A)1.1 9.6TPO-Rp(4-18；R9A，R11A)0.5 4.9人血清組的肽降解結(jié)果也顯示在表III。與鼠血漿相反，在人血清中，TPO-Rp的半衰期約為1.9分鐘。TPO-Rp4-18(R9A，R11A)被證明有穩(wěn)定性，半衰期約為4.9分鐘。寡肽1-18(R9A，R11A)有相當(dāng)長(zhǎng)的半衰期，約9.6分鐘，穩(wěn)定性是野生型寡肽的5倍。這體現(xiàn)了一個(gè)顯著的改進(jìn)，而大多數(shù)肽具有相對(duì)短的2-3分鐘的半衰期。應(yīng)該注意，相比野生型TPO-Rp，TPO-Rp1-18R9A，R11A在體內(nèi)顯示了活性的提高，盡管鼠血漿中它的半衰期比較短。
對(duì)小鼠中TPO-Rp1-18R9A，R11A(3mg/kg)體內(nèi)降解的研究顯示，經(jīng)過(guò)給予靜脈內(nèi)的大丸劑，血液中的半衰期計(jì)算為7.3分鐘。
實(shí)施例4肽的穩(wěn)定性方法基于UV檢測(cè)從反相柱系統(tǒng)C8 MICROSORB MV柱(Rainin儀器公司)中被洗脫時(shí)的樣品，HPLC方法被運(yùn)用。兩個(gè)緩沖體系開(kāi)始為9.5％5mM TFA(緩沖液A)和5％ACN(緩沖液B)，樣品注入后，B的百分比快速上升到10％，然后在10分鐘里漸漸增加到35％。樣品洗脫過(guò)程后，緩沖液B增加到90％簡(jiǎn)單清洗柱。
結(jié)果將野生型TPO-Rp，TPO-Rp1-18(R9A，R11A，SEQ ID No.2)和TPO-Rp4-18(R9A，R11A，SEQ ID No.4)這三種肽在以下溫度貯存室溫(約20℃)，4℃和-20℃，它們的穩(wěn)定性通過(guò)HPLC分析顯示。肽以1mg干粉或1mM水溶液的形式貯存，沒(méi)有其它賦形劑。在第0天建立了這三個(gè)肽的HPLC洗脫圖譜后，HPLC洗脫圖譜在第2，9，14天重新測(cè)試。
圖3顯示了30nmole野生型TPO-Rp和較短的寡肽在研究開(kāi)始時(shí)的HPLC圖譜，這里1mM肽溶液從干粉制備得到。圖4顯示了肽以1mM溶液形式貯存，研究第2天的HPLC圖譜(圖4A，或圖4B干粉形式)。第9天肽的穩(wěn)定性研究顯示在圖5A和5B中，肽的HPLC圖譜沒(méi)有顯示改變，因此，說(shuō)明了貯存在室溫，4℃和-20℃時(shí)肽都具有高穩(wěn)定性。值得注意的，圖6A和6B中，即第14天肽的穩(wěn)定性研究中，野生型TPO-Rp和本發(fā)明的兩個(gè)寡肽顯示了不變的HPLC圖譜。當(dāng)以1mM溶液或干粉在室溫，4℃和-20℃貯存時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到降解的信號(hào)?？梢缘贸鯰PO-Rp和本發(fā)明的寡肽可以以1mM水溶液或干粉在室溫，4℃和-20℃貯存2周，而沒(méi)有降解的信號(hào)。
進(jìn)一步用HPLC研究表明，野生型寡肽TPO-Rp和SEQ ID No.2肽用1mM水、鹽水或鹽水加0.1％人白蛋白溶液制備，在室溫，4℃和-20℃中保存1，3和4周，沒(méi)有顯示降解的信號(hào)。
實(shí)施例5TPO-Rp1-18R9A，R11A的形成和制備過(guò)程5A)媒介溶液成分％w/vmg/ml4L批醋酸鈉，三水合物，USP， 5.444g0.1361.36110mM(F.W.136.08) m注射水，USP q.s. 100 1mL4升pH*5.3±0.2*(如果需要，用10N HCL和隨后的1N HCL或1N NaOH溶液調(diào)節(jié)pH)甘露醇，USP 5.0 50 200gm制備過(guò)程1.將90％(3.6升)注射水(WFI)加入合適的玻璃容器。
2.將5.444gm醋酸鈉，三水合物加入#1。
3.如果需要，#2的pH用10N HCL(近似于600ul)和另外的1N HCL或1N NaOH溶液調(diào)節(jié)到pH5.3±0.2。
4.加入200gm甘露醇，溶解到#3。溫和攪拌混合直到完全溶解。
5.加入足夠的量WFI到#4，到終體積為4升。溫和攪拌直到均勻。
6.在無(wú)菌情況下，用0.2微米膜過(guò)濾溶液#5到無(wú)菌的容器中。
7.溶液(100mL/小瓶)在無(wú)菌情況下注入7個(gè)根據(jù)無(wú)菌過(guò)程準(zhǔn)備的I型小瓶。在另外兩個(gè)相似的無(wú)菌小瓶(10mL/小瓶)中注入開(kāi)始和保留的樣品。然后封上特氟綸灰色丁基塞子和鋁箔。
5B)可注射的溶液(1mg/mL)成分％w/vmg/ml600mL批TPO-Rp1-18R9A，R11A(無(wú)水自由基)0.1 10.66gm*粉末*媒介見(jiàn)5A100 1mL 600mL注意(對(duì)5B，5C，5D)TPO-Rp1-18R9A，R11A以無(wú)水醋酸鹽的形式提供。量的計(jì)算如下肽粉末的量(無(wú)水醋酸鹽)＝ *基于肽的90.7％的含量制備過(guò)程1.加入精確量的媒介溶液(600mL)到合適的玻璃容器。
2.加入精確量的寡肽粉末(0.66gm粉末)，并溶解到#1，混合均勻。
3.如果需要，測(cè)量#2溶液的pH并調(diào)節(jié)到pH5.3±0.2。
4.在無(wú)菌情況下，通過(guò)0.2微米膜過(guò)濾#3溶液(Milipore Durapore膜或等價(jià)物)。
5.溶液(75mL/小瓶)在無(wú)菌情況下注入7個(gè)根據(jù)無(wú)菌過(guò)程準(zhǔn)備的I型小瓶。在另外兩個(gè)相似的無(wú)菌小瓶(10mL/小瓶)注入開(kāi)始和保留的樣品。然后封上特氟綸灰色丁基塞子和鋁箔。
5C)可注射的溶液(5mg/mL)成分％w/vmg/ml600mL批TPO-Rp1-18R9A，R11A(無(wú)水自由基)0.5 53.3gm*粉末*媒介見(jiàn)5A 100 1mL 600mL制備過(guò)程見(jiàn)5B，根據(jù)上表修改相應(yīng)的量。
5D)可注射的溶液(9mg/mL)成分％w/vmg/ml650mL批TPO-Rp1-18R9A，R11A(無(wú)水自由0.9 96.45gm*基)粉末*媒介見(jiàn)5A 100 1mL 650mL制備過(guò)程見(jiàn)5B，根據(jù)上表修改相應(yīng)的量。
實(shí)施例6方法“體外”信號(hào)研究細(xì)胞處理在RPMI1640培養(yǎng)液(1x青霉素/鏈霉素、2mM谷氨酸鹽、10％胎牛血清(Hyclone)和1ng/mlGM-CSF，離心并重懸浮到含有3％血清且不含有GM-CSF的培養(yǎng)液中)中，使TF-1生長(zhǎng)到細(xì)胞密度為1*106細(xì)胞/ml。細(xì)胞在37℃饑餓14-18小時(shí)，離心并重懸浮到不含血清和GM-CSF的培養(yǎng)液上，使密度為1*106細(xì)胞/ml。2ml的細(xì)胞懸液在37℃用TPO的寡肽處理(如每個(gè)實(shí)驗(yàn)所指導(dǎo)的)30分鐘(5％CO2).每Falcon管加入10ml冰預(yù)冷的細(xì)胞洗滌緩沖液，在4℃以3000rpm快速離心。培養(yǎng)液被仔細(xì)吸出，用PBS重復(fù)洗滌2次。
以后的步驟在冰上操作。吸出培養(yǎng)液，每管再加入0.6ml的2x溶菌緩沖液。吸管吹打，然后轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，置于冰上約30分鐘，14000xg離心10分鐘。上清(溶菌液)用于免疫沉淀反應(yīng)。
免疫沉淀反應(yīng)每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)使用20-40μL的GammaBind G瓊脂糖漿。在Fppendorf管中用0.5x溶菌緩沖液洗滌蛋白G珠數(shù)次，每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)加入1-4μg的PY-99抗體(Santa Cruz-Biotechnology)。室溫下，端到端轉(zhuǎn)動(dòng)管子保溫2小時(shí)。加入溶菌液，然后4℃下轉(zhuǎn)動(dòng)管子保溫過(guò)夜。用1x溶菌緩沖液洗滌3次，然后立刻加入pH6.5的0.5M的Tris。加入50μL SDS-樣品緩沖液，將樣品加到膠前，先煮沸3分鐘。
Western blot分析約10μL/樣品在8％聚丙烯酰胺小膠上跑，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)，在固定緩沖液中固定1小時(shí)，1∶1000稀釋?zhuān)挺罶TAT5抗體一起在4℃下保溫過(guò)夜。洗滌膜，1∶2000稀釋?zhuān)c合適的堿性磷酸酯酶連接的第二抗體一起室溫保溫2小時(shí)。PVDF膜用Blotto沖洗，并用NBT/BCIP(Cappel)開(kāi)發(fā)。
結(jié)果實(shí)驗(yàn)評(píng)估了經(jīng)過(guò)HPLC分析沒(méi)有顯示明顯降解的寡肽(見(jiàn)實(shí)施例4)是否仍保持生物活性。
用體外信號(hào)測(cè)定檢測(cè)了本發(fā)明的寡肽和野生型TPO-Rp的活性。運(yùn)用以上確定的標(biāo)準(zhǔn)程序，用經(jīng)過(guò)HPLC分析的肽樣品刺激TF-1細(xì)胞。STAT5(通過(guò)TPO-R信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活的JAK2激酶的底物)的磷酸化和相應(yīng)的活化被測(cè)定。在穩(wěn)定性研究的第18天，濃度3μM的肽被測(cè)定；在穩(wěn)定性研究的第30天，濃度50nM和5μM的肽被測(cè)定。所有的肽在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中被評(píng)估3或4次。收集所有的數(shù)據(jù)，掃描Western blot，對(duì)STAT5的磷酸化強(qiáng)度定量。
所有實(shí)驗(yàn)(mean+/-SEM)的數(shù)據(jù)在表IV到IX中列出(見(jiàn)下)(W水，S血清，H0.1％HSA)。結(jié)果說(shuō)明在不同的貯存條件下，肽的活性有些不同。在“第18天”的穩(wěn)定研究中顯示，室溫貯存時(shí)，TPO-Rp(1-18，R9A，R11A)肽的活性明顯減弱。當(dāng)化合物貯存在4℃和-20℃時(shí)，活性保持。盡管用水或鹽水制備的肽溶液能夠保持活性，加入0.1％HSA使化合物的活性顯著的最好。這個(gè)結(jié)論被第30天穩(wěn)定研究的結(jié)果確認(rèn)。溶解于水的SEQIDNo.2的肽貯存在-20℃時(shí)，保持活性。當(dāng)貯存在鹽水，或加入0.1％HSA的鹽水中時(shí)，溶液在室溫、4℃和-20℃時(shí)，都保持活性。比較第30天的穩(wěn)定研究，當(dāng)以水溶液的形式貯存在-20℃時(shí)，野生型TPO-Rp的活性表現(xiàn)出明顯的降低。
上述穩(wěn)定性研究揭示了TPO-Rp(1-18，R9A，R11A，SEQ ID No.2)是一個(gè)比較穩(wěn)定的分子，在任何溶劑中，當(dāng)貯存在-20℃時(shí)，可以保持一個(gè)月的活性。有趣的是，盡管在任何溶劑或溫度情況下，肽沒(méi)有降解的圖譜，但是活性測(cè)定顯示了一些不同。
實(shí)施例7縮短的TPO-Rp寡肽的生物活性方法SEQ ID No 1-7的寡肽通過(guò)固相合成和后續(xù)的HPLC純化到90-95％的純度。寡肽的確定通過(guò)質(zhì)譜和氨基酸分析檢測(cè)。所顯示的MW是從質(zhì)譜分析得到(M+H+)(SEQ ID No.12141，No.21971，No.31857，No.41687，No.52240，No.62069，No.72736，野生型2755)。
繪制了本發(fā)明的寡肽的劑量-反應(yīng)曲線，并且比較了它們的活性和野生型TPO-Rp的活性。
肽劑量反應(yīng)活性基本的通過(guò)體外信號(hào)測(cè)定評(píng)估。測(cè)定STAT5能因此活化的磷酸化。STAT5是JAK2激酶的一個(gè)底物，通過(guò)TPO-Rp信號(hào)傳導(dǎo)激活。每個(gè)寡肽的活性在一個(gè)很寬的濃度范圍中被檢測(cè)。檢測(cè)濃度為0.3，3，10，30nM的肽和0.1，0.3，3和30μM的TPO-Rp。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，比較通過(guò)測(cè)量STAT5磷酸化獲得的寡肽的活性與得到的10ng/mlTPO的活性，即比較TPO-R活性和信號(hào)最強(qiáng)的激素水平。所有的肽在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中被評(píng)估4-5次。收集所有的數(shù)據(jù)，Westbem blot被掃描，STAT5磷酸化的強(qiáng)度被定性。
結(jié)果
每個(gè)寡肽的活性用他們最高活性的百分比表示。因此，100％活性為在寡肽濃度為30μM時(shí)，得到的STAT5蛋白磷酸化值。
結(jié)果清楚的指出相比野生型TPO-Rp，所有的寡肽有保留的活性。表X(見(jiàn)下)概括了所有被檢測(cè)的寡肽近似的EC50的值。
第一組寡肽(A1-L18，SEQ ID No1和2)顯示不僅活性能夠與野生型TPO-Rp相比，R9A，R11A形式(約EC5010nM)的效能也提高了。值得注意的，當(dāng)進(jìn)行丙胺酸行走和結(jié)構(gòu)分析時(shí)，寡肽的這個(gè)部分被顯示對(duì)TPO-Rp活性是關(guān)鍵的。活性的增加可能是由于寡肽結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或兩者共同的改進(jìn)。
最短的寡肽，15氨基酸長(zhǎng)(G4-L18，SEQ ID No3和4)的兩種形式都保留了與野生型TPO-Rp可比的活性。第三組寡肽(G4-R21，SEQ ID No.5和6)的兩種形式都顯示了和與野生型TPO-Rp相同的活性。
實(shí)施例8對(duì)鼠進(jìn)行SEQ ID No.2的寡肽的28天的靜脈毒性研究。SEQ ID No.2的肽的局部和系統(tǒng)的毒性用CrlCD(SD)IGS BR大鼠通過(guò)這個(gè)28天靜脈研究被定性。通過(guò)后繼的28天的恢復(fù)時(shí)間，評(píng)定從高劑量組的效果中的恢復(fù)情況。通過(guò)在側(cè)面尾部靜脈的大丸藥?kù)o脈注射，肽給予三個(gè)毒理組(組2，3和4)，以及3個(gè)毒動(dòng)力學(xué)組(組2A，3A和4A)。劑量分別是5，15和45mg/kg/天，至少連續(xù)28天。一個(gè)同時(shí)存在的媒介組(組1)基于可比較的服法，接受5％甘露醇溶液，10mM醋酸鈉。媒介和45mg/kg/天的組各包括15個(gè)雄的和15個(gè)雌的，5mg/kg/天和15mg/kg/天組各包括10個(gè)雄的和10個(gè)雌的，3個(gè)毒動(dòng)力學(xué)組各包括9個(gè)雄的和9個(gè)雌的。對(duì)所有組的劑量都是5ml/kg。
觀察毒理組的所有動(dòng)物在用藥前、剛用藥后、用藥一小時(shí)后和恢復(fù)期一天一次的毒性的臨床征兆。進(jìn)行詳細(xì)的身體檢查，每周記錄個(gè)體的體重和食物量。評(píng)估在用藥前、處理階段的中點(diǎn)、初步尸檢和恢復(fù)尸檢時(shí)的臨床病理學(xué)參數(shù)(血液學(xué)、血清化學(xué)和驗(yàn)?zāi)?。收集試驗(yàn)前和預(yù)定的尸檢時(shí)的骨髓涂片。在初步尸檢時(shí)，收集血清，用于抗體確定。在用藥開(kāi)始前、研究的第3周和恢復(fù)期，研究的第7周進(jìn)行眼科的檢查。對(duì)所有的動(dòng)物進(jìn)行完全的尸檢。在初步尸檢和恢復(fù)尸檢時(shí)，對(duì)選擇的器官進(jìn)行稱(chēng)重。在初步尸檢時(shí)收集的選擇性的組織用顯微鏡檢驗(yàn)。
在第0、6、14、20和27天，收集分配到毒動(dòng)力學(xué)組中的一組分開(kāi)的動(dòng)物的血清樣品，用于檢測(cè)血漿水平。
用肽處理對(duì)于存活率、體重、食物量、臨床病理參數(shù)、器官重量和骨髓細(xì)胞沒(méi)有影響。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)肽相關(guān)的眼科的、肉眼可見(jiàn)的、顯微鏡可見(jiàn)的變化。
當(dāng)被給予了SEQ ID No.2的肽，雄的和雌的大鼠在28天里表現(xiàn)出了很好的耐受?；谛凼蟮那傲邢俚闹亓拷档?，雌鼠的沒(méi)有可觀察出來(lái)的效果的水平(NOEL)為45mg/kg/天。
實(shí)施例9對(duì)猴進(jìn)行SEQ ID No.2的寡肽的28天的靜脈毒性研究。用獼猴進(jìn)行28天的靜脈研究，使對(duì)SEQ ID No.2的肽的局部和系統(tǒng)的毒性定性。在28天的恢復(fù)期中，肽作用的可逆性被評(píng)估。連續(xù)28天，肽通過(guò)隱靜脈的大丸藥?kù)o脈注射給藥，劑量分別是5，15和30mg/kg/天。雌猴按計(jì)劃比雄猴晚一天開(kāi)始給藥。一個(gè)對(duì)照的媒介組基于可比較的服法，接受5％甘露醇溶液，10mM醋酸鈉。媒介對(duì)照組和30mg/kg/天的組各包括5個(gè)雄猴和5個(gè)雌猴。5mg/kg/天和15mg/kg/天組各包括3個(gè)雄猴和3個(gè)雌猴。對(duì)所有組的劑量都是5ml/kg。
用實(shí)施例8描述的方法觀察的所有猴子。
在第0、7、14、21和27天，收集來(lái)自3個(gè)猴/性別/組的血清樣品，以確定SEQ ID No.2的肽的血漿濃度，并計(jì)算毒動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
本研究中沒(méi)有死亡。在肽的靜脈注射后，在大多數(shù)劑量組的大多數(shù)猴子中發(fā)生了一個(gè)臨床征兆的改變。在雄性5mg/kg/天給藥的情況下，沒(méi)有化合物-相關(guān)的臨床征兆。在雄性15mg/kg/天給藥的情況下，發(fā)生了面部潮紅(3/3)和流涎癥(1/3)。在雄性30mg/kg/天給藥的情況下，發(fā)生了面部潮紅(4/5)，身體表面潮紅(3/5)，流涎癥(3/5)，嘔吐(1/5)和肌肉緊張性降低(1/5)。在雌性5mg/kg/天給藥的情況下，發(fā)生了面部潮紅(2/3)。在雌性15mg/kg/天給藥的情況下，發(fā)生了面部潮紅(3/3)，身體表面潮紅(2/3)和流涎癥(1/3)。在雌性30mg/kg/天給藥的情況下，發(fā)生了面部潮紅(5/5)，身體表面潮紅(4/5)，流涎癥(4/5)，嘔吐(2/5)和肌肉緊張性降低(1/5)。所有的臨床征兆降低，在給藥一個(gè)小時(shí)以后消失。在恢復(fù)期中，沒(méi)有這些臨床征兆發(fā)生。
用肽處理，對(duì)于體重、臨床病理參數(shù)(血液學(xué)、血清化學(xué)和驗(yàn)?zāi)?，生理參數(shù)(體溫、心臟頻率、血壓和呼吸頻率)，心電圖評(píng)估和器官重量沒(méi)有影響。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與肽相關(guān)的眼科的、肉眼可見(jiàn)的、顯微鏡可見(jiàn)的變化。與肽相關(guān)的發(fā)現(xiàn)對(duì)于雄猴和雌猴沒(méi)有明顯的不同。
當(dāng)被給予了SEQ ID No.2的肽，28天里，雄猴和雌猴在最大劑量為30mg/kg/天時(shí)，表現(xiàn)出了很好的耐受。基于剛被給藥后面部潮紅，雄猴的沒(méi)有可觀察出來(lái)的效果的水平(NOEL)為5mg/kg/天。雌猴的NOEL沒(méi)有被建立。因?yàn)榕R床征兆和肌肉虛弱(在研究的第1天僅發(fā)現(xiàn)在1/5雄猴和1/5雌猴)是暫時(shí)的，并且沒(méi)有其他測(cè)試效果被發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)性別的可觀察出來(lái)的效果的水平(NOAEL)都建立在30mg/kg/天。
實(shí)施例10SEQ ID No.2的肽對(duì)組胺釋放的作用。
SEQ ID No.2的肽對(duì)組胺釋放的作用在體外的外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)中被測(cè)定。
檢測(cè)從4個(gè)不同的受檢者中得到的PBMC。含有3μM到10mM的不同濃度的SEQ ID No.2的肽的白血球懸浮液被保溫。人的抗IgE抗體以及緩沖液僅分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。組胺的釋放量用ELISA定量(IBL，目錄號(hào)RE59221)。測(cè)定的敏感度為2.4ng/mL。
選擇從3μM到10mM的濃度范圍評(píng)估了在不同的從靜脈注射得到的肽的水平下組胺的釋放。因此，假設(shè)分布量為每kg組織400ml，濃度30mg/kg對(duì)應(yīng)剛注射后的約38μM。在細(xì)胞外液中已知肽自由分布。因此，肽的最高濃度10mM比細(xì)胞外液的最高濃度高約100倍。
在最高濃度10mM時(shí)，肽導(dǎo)致一個(gè)相對(duì)小，但是顯著的15ng/ml的組胺釋放。這個(gè)值比陽(yáng)性對(duì)照(抗-IgE)低了10倍。濃度低于等于3.3mM的肽在人PBMC中，對(duì)組胺釋放沒(méi)有作用。范圍包含了所有治療的體內(nèi)濃度。在體外最高肽濃度10mM時(shí)，觀察到一個(gè)小的，但是顯著的組胺釋放。濃度比任何治療劑量明顯高。
實(shí)施例11分析猴和大鼠的血清樣品，以檢測(cè)在實(shí)施例8和9中已被檢測(cè)的獼猴和大鼠中IgG的存在。在32個(gè)猴血清樣品和80個(gè)大鼠血清樣品中，沒(méi)有能檢測(cè)到抗SEQ ID No.2的肽的抗體。
序列表<110>普利瓦制藥工業(yè)股份有限公司<120>血栓生成素受體肽<130>14267<140><141><160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Ala Arg Gly Gly Thr Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu1 5 10 15Gln Leu<210>2<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Ala Arg Gly Gly Thr Leu Glu Leu Ala Pro Ala Ser Arg Tyr Arg Leu1 5 10 15Gln Leu<210>3<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Gly Thr Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu1 5 10 15<210>4<211>15<212>PRT<213>Homo sapiems<400>4Gly Thr Leu Glu Leu Ala Pro Ala Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu1 510 15<210>5<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Gly Thr Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Arg1 5 10 15Ala Arg<210>6<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Gly Thr Leu Glu Leu Ala Pro Ala Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Arg1 5 10 15Ala Arg<210>7<211>23<212>PRT<213>Homo sapiens<400>7Ala Arg Gly Gly Thr Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Phe Arg Leu1 5 10 15Gln Leu Arg Ala Arg Leu Asn20
權(quán)利要求
1.一種具有生物活性的TPO(血栓生成素)受體調(diào)節(jié)子的寡肽，其特征在于它包含有15-18個(gè)氨基酸，通式為X1GTLELX2PX3SRYRLQLX4，其中X1為ARG或缺失，X2為R或AX3為R或A和X4為RAR或缺失，或其生物等價(jià)物。
2.如權(quán)利要求1所述的寡肽，其特征在于所述寡肽選自由SEQ IDNo.1-6定義的任何氨基酸序列組成的組，或其生物等價(jià)物。
3.一種寡肽，其特征在于包含由SEQ ID No.7定義的氨基酸序列。
4.一種核酸序列，其特征在于編碼了根據(jù)權(quán)利要求1，2或3的寡肽。
5.一種載體，其特征在于包含權(quán)利要求4的核酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于該載體是細(xì)菌、病毒、哺乳動(dòng)物或酵母載體。
7.如權(quán)利要求5或6所述的載體，其特征在于它進(jìn)一步包含能夠在合適的宿主細(xì)胞中直接表達(dá)核酸序列的5’和/或3’調(diào)控元件。
8.一種宿主細(xì)胞，其特征在于它包含權(quán)利要求5到7中任一項(xiàng)所述的載體，在合適的條件下能夠表達(dá)權(quán)利要求1或2所述的寡肽。
9.如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于它是哺乳動(dòng)物、酵母或細(xì)菌細(xì)胞。
10.一種遺傳改變細(xì)胞的方法，其特征在于該方法通過(guò)轉(zhuǎn)染包含根據(jù)權(quán)利要求5到7中任一項(xiàng)所述的載體的細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于細(xì)胞通過(guò)化學(xué)或電誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染的技術(shù)被轉(zhuǎn)染，特別是電穿孔或細(xì)胞融合，逆轉(zhuǎn)錄病毒或病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因或粒子攻擊法。
12.一種制造能夠制備權(quán)利要求1，2或3所述的寡肽的非人的哺乳動(dòng)物的方法，其特征在于權(quán)利要求4的核酸序列被轉(zhuǎn)入非人的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中。
13.一種非人的哺乳動(dòng)物，其特征在于在其生殖細(xì)胞和/或體細(xì)胞中包含權(quán)利要求4所述的核酸序列，特別是包含權(quán)利要求8或9的宿主細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求13所述的非人的哺乳動(dòng)物，其特征在于是嚙齒動(dòng)物或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。
15.一種制備權(quán)利要求1，2或3所述的寡肽的方法，其特征在于包含用權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在能夠表達(dá)并從細(xì)胞或培養(yǎng)液中回收寡肽的培養(yǎng)液里培養(yǎng)細(xì)胞。
16.一種抗體，其特征在于該抗體與權(quán)利要求1，2或3所述的寡肽特異結(jié)合。
17.如權(quán)利要求16所述的抗體，其特征在于該抗體是單克隆或多克隆抗體，或其片段。
18.一種抗體，其特征在于與權(quán)利要求16或17的抗體特異結(jié)合。
19.一種制藥合成物，其特征在于用于治療血液病，特別是血小板減少癥，包含權(quán)利要求1，2或3所述的寡肽，權(quán)利要求4所述的核酸序列，權(quán)利要求5到7中任一項(xiàng)所述的載體，權(quán)利要求8或9所述的宿主細(xì)胞，或權(quán)利要求16、17或18所述的抗體，有選擇地和制藥可接受的載體連接。
20.一種診斷合成物，其特征在于用于診斷血液病，特別是血小板減少癥，包含權(quán)利要求1，2或3所述的寡肽，權(quán)利要求4所述的核酸序列，權(quán)利要求5到7中任一項(xiàng)所述的載體，權(quán)利要求8或9所述的宿主細(xì)胞，或權(quán)利要求16、17或18所述的抗體，有地?fù)竦暮椭扑幙山邮艿妮d體連接。
21.如權(quán)利要求19或20所述的制藥或診斷合成物，其特征在于進(jìn)一步包含血栓生成素。
22.如權(quán)利要求19到21中任一項(xiàng)所述的制藥或診斷合成物，其特征它為片劑、藥丸、膠囊、顆粒、栓劑、粉末、小塊、脂質(zhì)體、包衣、供注射、注入、口服給藥的溶液、糖漿、懸浮液、乳液、噴霧、吸入劑、氣霧劑、糊劑、軟膏或藥水的形式。
23.權(quán)利要求1，2或3的寡肽，權(quán)利要求4的核酸序列，權(quán)利要求5到7中任一項(xiàng)的載體，權(quán)利要求8或9的宿主細(xì)胞，和/或權(quán)利要求16、17或18的抗體的應(yīng)用，其特征在于用于制備診斷或治療血液病，特別是血小板減少癥所用的藥物。
24.如權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其特征在于該藥物進(jìn)一步包含血栓生成素。
25.一種調(diào)節(jié)TPO-R(血栓生成素一受體)活性的方法，其特征在于權(quán)利要求1，2或3的寡肽或權(quán)利要求16、17或18的抗體在血栓生成素存在或不存在的情況下用于調(diào)節(jié)TPO-R。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于調(diào)節(jié)是活性的增加或降低。
27.一種篩選藥物的方法，其特征在于篩選對(duì)診斷或治療血液病，特別是血小板減少癥有效的藥物，包含篩選潛在的藥物，它們能夠與權(quán)利要求1，2或3所述的寡肽競(jìng)爭(zhēng)以結(jié)合TPO-R或活化細(xì)胞外信號(hào)途徑。
28.一種治療方法，其特征在于治療對(duì)用血栓生成素激動(dòng)劑治療易感的疾病患者，包含給予患者治療有效的劑量的權(quán)利要求1，2或3所述的寡肽和/或野生型TPO-Rp。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于該疾病是由骨髓移植、放療、化療、過(guò)敏反應(yīng)引起的或先天性的血液病或血小板減少癥。
30.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其特征在于進(jìn)一步包含用血栓生成素給藥。
31.一種野生型TPO-Rp，編碼野生型TPO-Rp的核酸序列，包含該核酸序列的載體，包含該載體的宿主細(xì)胞和/或與野生型TPO-Rp特異結(jié)合抗體的應(yīng)用，其特征在于用于制備診斷或治療血液病，特別是血小板減少癥的藥物。
32.一種從包含TPO-R的來(lái)源中檢測(cè)或分離TPO-R的方法，其特征在于包括在TPO-R能與所述寡肽特異結(jié)合，并從包含TPO-R的來(lái)源中分離出來(lái)的情況下，將權(quán)利要求1，2或3的寡肽應(yīng)用于包含TPO-R的來(lái)源。
33.從混合物中檢測(cè)和/或分離權(quán)利要求1到3所述的寡肽的免疫測(cè)定，其特征在于將權(quán)利要求16或17所述的抗體應(yīng)用于該混合物，檢測(cè)和/或分離與抗體結(jié)合的寡肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)新的能夠治療血小板減少癥的診斷和治療合成物。
文檔編號(hào)C07K16/44GK1426467SQ01808567
公開(kāi)日2003年6月25日 申請(qǐng)日期2001年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月25日
發(fā)明者塔特婭娜·納蘭達(dá), 倫納特·奧爾松 申請(qǐng)人:普利瓦制藥工業(yè)股份有限公司