專(zhuān)利名稱(chēng)：新蛋白質(zhì)以及編碼該蛋白質(zhì)的新基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到多個(gè)新蛋白質(zhì)、編碼這些蛋白質(zhì)的新基因、分別含有上述各新基因的質(zhì)粒、分別含有上述各個(gè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體、針對(duì)上述新的各個(gè)蛋白質(zhì)的抗體或其片段、細(xì)菌感染癥的檢測(cè)方法以及新的多肽。本發(fā)明的新蛋白質(zhì)是活化的人巨噬細(xì)胞特異的蛋白質(zhì)。
人染色體中大約存在10萬(wàn)個(gè)基因，但現(xiàn)在只分離和鑒定了其中的1/10～1/5，大部分依然沒(méi)有被分離和解析。可以認(rèn)為被LPS刺激特異誘導(dǎo)表達(dá)的基因組中的大部分是未鑒定的新基因。
而敗血病(septicemia)是在身體的某個(gè)地方存在化膿病灶，大量細(xì)菌從該病灶處斷續(xù)地或連續(xù)地流入到血液中的全身性疾病。敗血病的診斷可以通過(guò)培養(yǎng)血液、證明有細(xì)菌存在來(lái)確認(rèn)。然而在該方法中不僅存在著花費(fèi)時(shí)間，而且存在著在進(jìn)行采血操作時(shí)通常存在于皮膚的細(xì)菌(例如，皮膚表面的葡萄球菌)混入、污染血液的缺點(diǎn)。
因此，本發(fā)明人將可在診斷炎癥、變態(tài)反應(yīng)、或癌癥等疾病(特別是細(xì)菌感染癥)的新型診斷和/或治療藥物的開(kāi)發(fā)中應(yīng)用作為目的，對(duì)通過(guò)LPS刺激在巨噬細(xì)胞中可特異誘導(dǎo)表達(dá)的基因進(jìn)行了深入探索，探索結(jié)果可以對(duì)新的3種新基因進(jìn)行分離和鑒定。另外本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)任一個(gè)新基因是在健康人中都不能表達(dá)，但在細(xì)菌感染癥患者中可進(jìn)行表達(dá)的基因。本發(fā)明正是基于這樣見(jiàn)解的發(fā)明。
另外本發(fā)明還涉及到(1)編碼上述「本發(fā)明第1種新蛋白質(zhì)」的基因(以下統(tǒng)稱(chēng)為「本發(fā)明第1種新基因」)、(2)編碼上述「本發(fā)明第2種新蛋白質(zhì)」的基因(以下統(tǒng)稱(chēng)為「本發(fā)明第2種新基因」)、(3)編碼上述「本發(fā)明第3種新蛋白質(zhì)」的基因(以下統(tǒng)稱(chēng)為「本發(fā)明第3種新基因」)。
另外本發(fā)明還涉及到分別含有上述各個(gè)基因的質(zhì)粒。
本發(fā)明還涉及到分別含有上述各個(gè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明還涉及到抗體或其片段，其特征是它們可以分別與上述各種蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體進(jìn)行特異反應(yīng)。
本發(fā)明還涉及到細(xì)菌感染癥的檢測(cè)方法，其特征是分析被檢測(cè)樣品中的上述各種蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)改變體或它們的mRNA。
另外本發(fā)明還涉及到(1)能夠與由序列表中序列號(hào)1表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交的多核苷酸(以下稱(chēng)為「本發(fā)明第1種探針」)、(2)能夠與由序列表中序列號(hào)3表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交的多核苷酸(以下稱(chēng)為「本發(fā)明第2種探針」)、(3)能夠與由序列表中序列號(hào)5表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交的多核苷酸(以下稱(chēng)為「本發(fā)明第3種探針」)。
在本說(shuō)明書(shū)中所謂「功能等價(jià)的改變體」指的是含有在原來(lái)蛋白質(zhì)的氨基酸序列中缺失、置換和/或附加1個(gè)或1個(gè)以上(最好是1個(gè)或數(shù)個(gè))氨基酸的氨基酸序列，而且具有與原有的上述蛋白質(zhì)同樣活性的蛋白質(zhì)。另外在本說(shuō)明書(shū)的用語(yǔ)「附加」中包括在氨基酸序列的N末端和/或C末端附加1個(gè)或1個(gè)以上(最好是1個(gè)或數(shù)個(gè))氨基酸和在氨基酸序列內(nèi)部插入1個(gè)或1個(gè)以上(最好是1個(gè)或數(shù)個(gè))氨基酸兩方面意思。
在本說(shuō)明書(shū)中所謂「同源蛋白質(zhì)」指的是含有與原有蛋白質(zhì)的氨基酸序列的同源性在90％以上(在95％以上比較理想，在98％以上更理想，在99％以上最理想)的氨基酸序列，而且具有與原有的上述蛋白質(zhì)同樣活性的蛋白質(zhì)。另外本說(shuō)明書(shū)中上述「同源性」指的是從BLAST[Basic local alingment search tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215，403-410，(1990)]得到的值。
另外本說(shuō)明書(shū)中用語(yǔ)「基因」和用語(yǔ)「多核苷酸」中任一個(gè)用語(yǔ)都包括DNA和RNA。
圖2是表示通過(guò)RNA印跡法檢測(cè)本發(fā)明的3種新基因組織特異表達(dá)的電泳結(jié)果照片。
圖3是表示使本發(fā)明基因NLG-1-1在COS-1細(xì)胞中表達(dá)的顯微鏡照片。
圖4是表示使本發(fā)明基因NLG-2在COS-1細(xì)胞中表達(dá)的顯微鏡照片。
圖5是表示本發(fā)明基因NLG-1-1的FISH解析結(jié)果的顯微鏡照片。
圖6是表示通過(guò)RNA印跡法檢測(cè)本發(fā)明的新的3種基因在健康人和敗血病患者中表達(dá)的電泳結(jié)果照片。
實(shí)施發(fā)明的最好方式以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明第1種新蛋白質(zhì)最好是含有(1)序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、(2)與上述(1)蛋白質(zhì)功能等價(jià)的改變體以及(3)與上述(1)蛋白質(zhì)同源的蛋白質(zhì)、以及(4)它們[即上述(1)蛋白質(zhì)、上述(2)的功能等價(jià)的改變體、或上述(3)同源蛋白質(zhì)]的片段、由序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)或與其功能等價(jià)改變體或同源的蛋白質(zhì)。
由序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)是由481個(gè)氨基酸組成的。由序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)，由于與小鼠IRG-1(Immune-responsive protein-1)[Immunogenetics，41，263-270，(1995)]在氨基酸序列上表現(xiàn)出大約82％的高同源性，所以被認(rèn)為是人IRG-1。
在序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列中已知可被蛋白激酶C磷酸化的部位有8處，可被酪蛋白激酶(II)磷酸化的部位有10處、由此可以認(rèn)為由序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)在傳遞LPS刺激的信息的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞系統(tǒng)中起著重要的作用。
由于在N末端不存在信號(hào)肽序列，所以認(rèn)為由序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中表現(xiàn)其生物活性。
而作為含有序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)諸如由序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)和與融合用配偶體融合的融合蛋白質(zhì)。在上述融合蛋白質(zhì)中可以使融合用配偶體結(jié)合在由序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列構(gòu)成的上述蛋白質(zhì)N末端和/C末端。
作為融合用配偶體可以使用諸如純化用蛋白質(zhì)[例如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的全部或一部分]、檢測(cè)用蛋白質(zhì)[例如β-半乳糖苷酶α肽(LacZ α)]的全部或一部分、或表達(dá)用蛋白質(zhì)(例如信號(hào)序列)。
在上述融合蛋白質(zhì)中，在由序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列組成的上述蛋白質(zhì)與上述融合用配偶體之間也可以適當(dāng)?shù)貙?dǎo)入可被限定分解的蛋白質(zhì)分解酶(例如，凝血酶或因子X(jué)a)切斷的氨基酸序列。
含有由序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或與其在功能上等價(jià)的改變體或同源蛋白質(zhì)的片段只要是可以用作制備本發(fā)明的第1抗體或其片段的免疫原即可，并沒(méi)有特別限定，但由13個(gè)以上氨基酸殘基構(gòu)成的比較理想，由20個(gè)以上氨基酸殘基構(gòu)成的更好，由50個(gè)以上氨基酸殘基構(gòu)成的最理想。
這些本發(fā)明的第1種新蛋白質(zhì)可以通過(guò)眾所周知的方法獲得，例如，使用本發(fā)明的第1種新基因按照眾所周知的基因工程手法可以制備。
本發(fā)明的第1種新基因只要是編碼本發(fā)明的第1種新蛋白質(zhì)即可，并沒(méi)有特別限定，例如，由序列表中序列號(hào)1表示的堿基序列中的第37位～第1479位堿基組成的堿基序列構(gòu)成的基因。
由序列表中序列號(hào)1表示的堿基序列中的第37位～第1479位堿基組成的堿基序列構(gòu)成的上述基因編碼由序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。另外。由序列表中序列號(hào)1表示的堿基序列中的第37位～第1479位堿基組成的堿基序列構(gòu)成的上述基因是在健康人中不表達(dá)，但在細(xì)菌感染癥患者中表達(dá)的基因。
本發(fā)明的第1種探針只要是可與由序列表中序列號(hào)1表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交的即可，并沒(méi)有特別限定，例如，由與由序列表中序列號(hào)1表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列或其部分堿基序列構(gòu)成的單鏈或雙鏈多核苷酸。本發(fā)明的第1種探針的堿基數(shù)的下限雖然沒(méi)有特別限定，但本發(fā)明的第1種探針的堿基數(shù)在18個(gè)以上比較理想，26個(gè)以上更好，41個(gè)以上最理想。另外其上限也沒(méi)有限定，但本發(fā)明的第1種探針的堿基數(shù)最好在2180個(gè)以下。而本說(shuō)明書(shū)中所謂的「可與由序列表中序列號(hào)1表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交」指的是在后述的實(shí)施例1(4)中記載的條件下[即、含有0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)的2×SSC(standard sodium citrate)]于室溫洗2次，每次20分鐘，再于65℃下用含有0.1％SDS的0.2×SSC洗2次，每次20分鐘，與來(lái)自健康人的mRNA不雜交，但與由序列表中序列號(hào)1表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交。
本發(fā)明第2種新蛋白質(zhì)最好是含有(1)序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、(2)在功能上與上述(1)蛋白質(zhì)功能等價(jià)的改變體以及(3)與上述(1)蛋白質(zhì)同源的蛋白質(zhì)、以及(4)它們[即上述(1)蛋白質(zhì)、上述(2)的功能上等價(jià)的改變體、或上述(3)同源蛋白質(zhì)]的片段、由序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)或與其功能等價(jià)的改變體或同源的蛋白質(zhì)。
由序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)是由390個(gè)氨基酸殘基組成的。由序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)由于與小鼠IRG-1(Immune-responsive protein-1)[Immnogenetics，41，263-270，(1995)]在氨基酸序列上表現(xiàn)出大約82％的高同源性，所以被認(rèn)為人IRG-1。
在序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列中已知可被蛋白激酶磷酸化的部位有6處，可被酪蛋白激酶II磷酸化的部位有8處、由此可以認(rèn)為由序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)在傳遞LPS刺激的信息的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞系統(tǒng)中起著重要的作用。
由于在N末端不存在信號(hào)肽序列，所以認(rèn)為由序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中表現(xiàn)其生物活性。
而作為含有序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)諸如由序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)和與融合用配偶體融合的融合蛋白質(zhì)。在上述融合蛋白質(zhì)中可以使融合用配偶體結(jié)合在由序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列構(gòu)成的上述蛋白質(zhì)N末端和/或C末端。
作為融合用配偶體可以使用諸如純化用蛋白質(zhì)[例如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的全部或一部分]、檢測(cè)用蛋白質(zhì)[例如β-半乳糖苷酶α肽(LacZ α)]的全部或一部分、或表達(dá)用蛋白質(zhì)(例如信號(hào)序列)。
另外在上述融合蛋白質(zhì)中，在由序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列組成的上述蛋白質(zhì)與上述融合用配偶體之間也可以適當(dāng)?shù)貙?dǎo)入可被限定分解的蛋白質(zhì)分解酶(例如，凝血酶或因子X(jué)a)切斷的氨基酸序列。
含有由序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或與其在功能上等價(jià)的改變體或同源蛋白質(zhì)的片段只要是可以用作制備本發(fā)明的第2抗體或其片段的免疫原即可，并沒(méi)有特別限定，但由13個(gè)以上氨基酸殘基構(gòu)成的比較理想，由20個(gè)以上氨基酸殘基構(gòu)成的更好，由50個(gè)以上氨基酸殘基構(gòu)成的最理想。
這些本發(fā)明的第2種新蛋白質(zhì)可以通過(guò)眾所周知的方法獲得，例如，使用本發(fā)明的第2種新基因按照眾所周知的基因工程手法可以制備。
本發(fā)明的第2種新基因只要是編碼本發(fā)明的第2種新蛋白質(zhì)的即可，并沒(méi)有特別限定，例如，由序列表中序列號(hào)3表示的堿基序列中的第126位～第1295位堿基組成的堿基序列構(gòu)成的基因。
由序列表中序列號(hào)3表示的堿基序列中的第126位～第1295位堿基組成的堿基序列構(gòu)成的上述基因編碼由序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。另外。由序列表中序列號(hào)3表示的堿基序列中的第126位～第1295位堿基組成的堿基序列構(gòu)成的上述基因是在健康人中不表達(dá)，但在細(xì)菌感染癥患者中表達(dá)的基因。
本發(fā)明的第2種探針只要是可與由序列表中序列號(hào)3表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交的即可，并沒(méi)有特別限定，例如，由與由序列表中序列號(hào)3表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列或其部分堿基序列構(gòu)成的單鏈或雙鏈多核苷酸。本發(fā)明的第2種探針的堿基數(shù)的下限雖然沒(méi)有特別限定，但本發(fā)明的第2種探針的堿基數(shù)在18個(gè)以上比較理想，26個(gè)以上更好，41個(gè)以上最理想。另外其上限也沒(méi)有限定，但本發(fā)明的第2種探針的堿基數(shù)最好在1970個(gè)以下。而本說(shuō)明書(shū)中所謂的「可與由序列表中序列號(hào)3表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交」指的是在后述的實(shí)施例1(4)中記載的條件下與來(lái)自健康人的mRNA不雜交，但與由序列表中序列號(hào)3表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交。
本發(fā)明第3種新蛋白質(zhì)最好是含有序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、(2)在與上述(1)蛋白質(zhì)功能等價(jià)的改變體以及(3)與上述(1)蛋白質(zhì)同源的蛋白質(zhì)、以及(4)它們[即上述(1)蛋白質(zhì)、上述(2)的功能上等價(jià)的改變體、或上述(3)同源蛋白質(zhì)]的片段、由序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)或與其功能等價(jià)改變體或同源的蛋白質(zhì)。
由序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)是由83個(gè)氨基酸組成的。由序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)與小鼠NADH-泛醌氧化還原酶MLRQ亞基(CI-MLRQ)在氨基酸序列上表現(xiàn)出大約27％的同源性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道小鼠NADH-泛醌氧化還原酶MLRQ亞基存在于構(gòu)成線(xiàn)粒體電子傳遞系統(tǒng)的4種復(fù)合物(I、II、II、IV)的一個(gè)復(fù)合物I(complex I)中，與活性氧的產(chǎn)生有關(guān)[Circulation Res.，85，357-363(1999)；Biochem.Mol.Biol.Int.，43，669-675(1997)]。在序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)就象其氨基酸序列所表明的那樣，由于也沒(méi)有間隙，與小鼠NADH-泛醌氧化還原酶MLRQ亞基的結(jié)構(gòu)也比較類(lèi)似，所以可能具有傳遞電子能力，與炎癥發(fā)生時(shí)活性氧的產(chǎn)生有關(guān)。
由于在N末端不存在信號(hào)肽，所以認(rèn)為由序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中表現(xiàn)其生物活性。
而作為含有序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)諸如由序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)和與融合用配偶體融合的融合蛋白質(zhì)。在上述融合蛋白質(zhì)中可以使融合用配偶體結(jié)合在由序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)N末端和/或C末端。
作為融合用配偶體可以使用諸如純化用蛋白質(zhì)[例如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的全部或一部分]、檢測(cè)用蛋白質(zhì)[例如β-半乳糖苷酶α肽(LacZ α)]的全部或一部分、或表達(dá)用蛋白質(zhì)(例如信號(hào)序列)。
另外在上述融合蛋白質(zhì)中，在由序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列組成的上述蛋白質(zhì)與上述融合用配偶體之間也可以適當(dāng)?shù)貙?dǎo)入可被限制分解的蛋白質(zhì)分解酶(例如，凝血酶或因子X(jué)a)切斷的氨基酸序列。
含有由序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或與其在功能上等價(jià)的改變體或同源蛋白質(zhì)的片段只要是可以用作制備本發(fā)明的第3抗體或其片段的免疫原即可，并沒(méi)有特別限定，但由13個(gè)以上氨基酸殘基構(gòu)成的比較理想，由20個(gè)以上氨基酸殘基構(gòu)成的更好，由50個(gè)以上氨基酸殘基構(gòu)成的最理想。
這些本發(fā)明的第3種新蛋白質(zhì)可以通過(guò)眾所周知的方法獲得，例如，使用本發(fā)明的第3種新基因按照眾所周知的基因工程手法可以制備。
本發(fā)明的第3種新基因只要是編碼本發(fā)明的第3種新蛋白質(zhì)的即可，并沒(méi)有特別限定，例如，由序列表中序列號(hào)5表示的堿基序列中的第56位～第304位堿基組成的堿基序列構(gòu)成的基因。
由序列表中序列號(hào)5表示的堿基序列中的第56位～第1304位堿基組成的堿基序列構(gòu)成的上述基因編碼由序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。另外。由序列表中序列號(hào)5表示的堿基序列中的第56位～第1304位堿基組成的堿基序列構(gòu)成的上述基因是在健康人中不表達(dá)，但在細(xì)菌感染癥患者中表達(dá)的基因。
本發(fā)明的第3種探針只要是可與由序列表中序列號(hào)5表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交的即可，并沒(méi)有特別限定，例如，由與由序列表中序列號(hào)5表示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列或其部分堿基序列構(gòu)成的單鏈或雙鏈多核苷酸。本發(fā)明的第3種探針的堿基數(shù)的下限雖然沒(méi)有特別限定，但本發(fā)明的第3種探針的堿基數(shù)在18個(gè)以上比較理想，26個(gè)以上更好，41個(gè)以上最理想。另外其上限也沒(méi)有限定，但本發(fā)明的第3種探針的堿基數(shù)最好在652個(gè)以下。而本說(shuō)明書(shū)中所謂的「可與由序列表中序列號(hào)5表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交」指的是在后述的實(shí)施例1(4)中記載的條件下與來(lái)自健康人的mRNA不雜交，但與由序列表中序列號(hào)1表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交。
本發(fā)明的質(zhì)粒只要是含有本發(fā)明的上述各個(gè)新基因(即本發(fā)明的第1種新基因、本發(fā)明的第2種新基因、或本發(fā)明的第3種新基因)即可，并沒(méi)有特別限定，例如通過(guò)向按照所用的宿主細(xì)胞適當(dāng)選擇的眾所周知的表達(dá)載體中分別插入本發(fā)明的上述各個(gè)基因得到的各個(gè)質(zhì)粒(即、含有本發(fā)明的第1種新基因的本發(fā)明第1種質(zhì)粒、含有本發(fā)明的第2種新基因的本發(fā)明第2種質(zhì)粒、或含有本發(fā)明的第3種新基因的本發(fā)明第3種質(zhì)粒)。
另外本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體只要是含有本發(fā)明的上述各個(gè)質(zhì)粒(本發(fā)明第1種質(zhì)粒、本發(fā)明第2種質(zhì)粒、或本發(fā)明第3種質(zhì)粒、)即可，也沒(méi)有特別限定，例如使用本發(fā)明的上述各個(gè)質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)化所希望的宿主細(xì)胞得到的各個(gè)轉(zhuǎn)化體(即含有本發(fā)明第1種質(zhì)粒的本發(fā)明第1種轉(zhuǎn)化體、含有本發(fā)明第2種質(zhì)粒的本發(fā)明第2種轉(zhuǎn)化體、本發(fā)明第3種質(zhì)粒的本發(fā)明第3種轉(zhuǎn)化體)。
作為上述宿主細(xì)胞例如通常使用的眾所周知的微生物，如大腸桿菌或酵母(Saccharomyces cerevisiae)、或眾所周知的培養(yǎng)細(xì)胞，如動(dòng)物細(xì)胞(如，CHO細(xì)胞或COS細(xì)胞)或昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如BmN4細(xì)胞)。
而作為眾所周知的上述表達(dá)載體如對(duì)于大腸桿菌使用pUC、pTV、pGEX、pKK或pTrcHis；對(duì)于酵母使用pEMBLY或pYES2；對(duì)于CHO細(xì)胞使用pMAMneo；對(duì)于COS細(xì)胞使用pcDNA3；對(duì)于BmN4細(xì)胞使用含有蠶核型多角體病毒(BmNPV)的多角體蛋白啟動(dòng)子的載體(例如，pBK283)。
本發(fā)明的第1種抗體或其片段分別與本發(fā)明的第1種蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體特異反應(yīng)。而本發(fā)明的第2種抗體或其片段分別與本發(fā)明的第2種蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體特異反應(yīng)。本發(fā)明的第3種抗體或其片段分別與本發(fā)明的第3種蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體特異反應(yīng)。
本發(fā)明的上述各個(gè)抗體中包括單克隆抗體和多克隆抗體。
本發(fā)明的單克隆抗體(即與本發(fā)明的第1種蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體分別進(jìn)行特異反應(yīng)的本發(fā)明的第1種單克隆抗體、與本發(fā)明的第2種蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體特異反應(yīng)的本發(fā)明的第2種單克隆抗體、與本發(fā)明的第3種蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體特異反應(yīng)的本發(fā)明的第3種單克隆抗體)可以通使用本發(fā)明的新的各個(gè)蛋白質(zhì)或與其功能等價(jià)的改變體，或它們的片段作為免疫用抗原和篩選用抗原，以及按照公知的手段獲得。
例如，使用上述免疫用抗原免疫小鼠，將從該小鼠摘取的脾臟細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞按照Nature，256，495(1975)記載的細(xì)胞融合法，或J.Immunol.Method，100，181-189(1987)記載的電細(xì)胞融合法進(jìn)行細(xì)胞融合，通過(guò)使用上述的篩選用抗原進(jìn)行篩選，可以得到產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤。
作為培養(yǎng)上述雜交瘤的培養(yǎng)基只要是適于雜交瘤培養(yǎng)的培養(yǎng)基就可以，最好使用在Dulbecco改進(jìn)的Eeagle的最小必需培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eeagle′minimum essential medium)中含有胎牛血清、L-谷氨酰胺、L-丙酮酸以及抗生素(青霉素G和鏈霉素)的培養(yǎng)基。
上述雜交瘤在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以在5％CO2濃度、37℃條件下大約培養(yǎng)3天。如在小鼠腹腔中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)大約培養(yǎng)14天。
通過(guò)使用蛋白質(zhì)的分離和純化中一般常用的方法可以從上述得到的培養(yǎng)液或小鼠的腹水中分離和純化上述單克隆抗體。
一般常用的方法如硫銨鹽析、使用離子交換纖維素的離子交換柱層析、使用分子篩的分子篩柱層析、使用蛋白A結(jié)合多糖類(lèi)的親和柱層析、透析、或冷凍干燥等。
本發(fā)明的各多克隆抗體(與本發(fā)明的第1種蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體特異反應(yīng)的本發(fā)明的第1種多克隆抗體、與本發(fā)明的第2種蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體特異反應(yīng)的本發(fā)明的第2種多克隆抗體、與本發(fā)明的第3種蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體特異反應(yīng)的本發(fā)明的第3種多克隆抗體)可以使用本發(fā)明的新的各個(gè)蛋白質(zhì)或與其功能等價(jià)的改變體，或它們的片段作為免疫用抗原和篩選用抗原，以及使用眾所周知的各自方法，例如按照以下給出的方法進(jìn)行制備。
即將含有抗原的生理鹽水與等量的弗氏完全佐劑或不完全佐劑、或其等價(jià)物，例如Hunter’s TiterMaxTM(Cat.No.YT001-00，日本國(guó)東京)乳化混合之后，注射到哺乳動(dòng)物(特別是兔子或羊)的皮下、腹腔內(nèi)、或肌肉內(nèi)等任一處(初次免疫)。以后每隔2～4周進(jìn)行同樣操作，進(jìn)行數(shù)次免疫。在最終免疫1～2周后從哺乳動(dòng)物的頸動(dòng)脈或心臟采血，通過(guò)使用硫酸銨對(duì)血清進(jìn)行鹽析可以制備抗體。
本發(fā)明的各個(gè)抗體片段是本發(fā)明的上述各個(gè)抗體(包括單克隆抗體和多克隆抗體)的部分片段，而只要具有與原有抗體同樣反應(yīng)特異性并沒(méi)有特別限定。作為本發(fā)明的抗體片段如Fab、Fab’、F(ab’)2、或Fv。本發(fā)明的抗體片段例如可以按照常規(guī)方法通過(guò)用蛋白分解酶對(duì)本發(fā)明的多克隆抗體或單克隆抗體進(jìn)行消化，然后再通過(guò)蛋白質(zhì)的分離和純化的常規(guī)方法得到。
根據(jù)本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的蛋白質(zhì)(特別是由序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、由序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或由序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì))以及其mRNA在健康人中不表達(dá)，而在細(xì)菌感染癥(例如敗血病、肺炎、尿路感染癥、骨髓炎、或中耳炎等)患者中表達(dá)，所以本發(fā)明的蛋白質(zhì)及其mRNA可以用作細(xì)菌感染癥的診斷標(biāo)志。即，通過(guò)使用本發(fā)明的體外檢測(cè)方法，在被檢測(cè)對(duì)象采集的被檢測(cè)樣品中如果存在本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或其mRNA，那么可以判定該被檢測(cè)對(duì)象是細(xì)菌感染癥患者，而如果不存在本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或其mRNA，那么可以判定不是細(xì)菌感染癥。
在本發(fā)明方法中可以使用的被檢測(cè)樣品只要含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或其mRNA即可，并沒(méi)有特別限定，生物樣品，例如從動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物、特別是人(尤其是患者)采集的細(xì)胞等組織或其提取物、或血液(例如血清或血漿)、尿、或腦脊髓液等體液。只要是通常臨床檢查等的被檢測(cè)樣品即可，并沒(méi)有特別限定，都可以使用。
以下關(guān)于本發(fā)明方法首先對(duì)通過(guò)分析本發(fā)明的蛋白質(zhì)的mRNA檢測(cè)細(xì)菌感染癥的方法進(jìn)行說(shuō)明，然后通過(guò)分析本發(fā)明的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)明檢測(cè)細(xì)菌感染癥的方法。
本發(fā)明的方法內(nèi)，通過(guò)分析本發(fā)明的蛋白質(zhì)的mRNA檢測(cè)細(xì)菌感染癥的方法并沒(méi)有特別限定，例如包括以下步驟的檢測(cè)方法使被檢測(cè)樣品與含有與本發(fā)明蛋白質(zhì)的mRNA的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸接觸的步驟；以及分析上述多核苷酸與本發(fā)明蛋白質(zhì)的mRNA的結(jié)合物的步驟的方法(以下稱(chēng)之為「本發(fā)明的第1種檢測(cè)方法」)、或包括將被檢測(cè)樣品中的mRNA轉(zhuǎn)換為cDNA的逆轉(zhuǎn)錄步驟；使用上述逆轉(zhuǎn)錄步驟得到的反應(yīng)液和以本發(fā)明蛋白質(zhì)基因作為模板，可以擴(kuò)增基因的引物，實(shí)施基因擴(kuò)增反應(yīng)[特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)]的基因擴(kuò)增步驟；以及對(duì)在上述基因擴(kuò)增步驟擴(kuò)增的基因進(jìn)行分析的步驟的方法(以下稱(chēng)為「本發(fā)明的第2種檢測(cè)方法」)。
在本發(fā)明的第1檢測(cè)方法中使被檢測(cè)樣品與包含與本發(fā)明蛋白質(zhì)的mRNA的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸(例如本發(fā)明的探針)反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)生成的本發(fā)明蛋白質(zhì)的mRNA-多核苷酸結(jié)合物的存在，或測(cè)定其含量分析本發(fā)明蛋白質(zhì)的mRNA。
上述多核苷酸含有與由被選擇的基因(DNA)轉(zhuǎn)錄的mRNA的一部分互補(bǔ)或?qū)嵸|(zhì)上互補(bǔ)的序列，與由靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA之間形成雙鏈。為了與其靶mRNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，具有充分互補(bǔ)性的任一個(gè)多核苷酸都適用。本發(fā)明方法中可以使用的多核苷酸只要是實(shí)質(zhì)上在靶mRNA內(nèi)的哪一區(qū)域范圍互補(bǔ)都可以。多核苷酸分子可以用作檢測(cè)本發(fā)明蛋白質(zhì)基因中特異的mRNA表達(dá)增減的DNA探針。即通過(guò)特異附著在作為目標(biāo)的本發(fā)明蛋白質(zhì)的mRNA，形成分子雜化體可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)本發(fā)明蛋白質(zhì)mRNA表達(dá)的程度。
在本發(fā)明第1種方法中可以使用的多核苷酸可以適當(dāng)選擇與本發(fā)明蛋白質(zhì)的mRNA的特異堿基序列互補(bǔ)的堿基序列，例如使用眾所周知的DNA合成裝置、PCR裝置或基因克隆等進(jìn)行制備。雖然可以使用各種長(zhǎng)度的多核苷酸，但長(zhǎng)度在10個(gè)堿基以上比較理想，最好含有17個(gè)以上堿基的多核苷酸。
上述多核苷酸可以是沒(méi)有修飾的多核苷酸或多核苷酸類(lèi)似物。合適的類(lèi)似物如乙基或甲基膦酸酯類(lèi)似物、硫代磷酸酯修飾的多脫氧核苷酸[Nucleic Acids Res.，14，9081-9093，(1986)；J.Am.Chem.Soc.，106，6077-6079，(1984)]等。另外由于近年來(lái)在多核苷酸類(lèi)似物的制造中的進(jìn)步，例如也可以使用2′-O-甲基核糖核苷酸[Nucleic AcidsRes.，15，6131-6148，(1987)]或復(fù)合RNA-DNA類(lèi)似物嵌合核糖核苷酸[FEBS Lett.，215，327-330，(1987)]等。
被選擇的多核苷酸可以是帶有電荷的，或不帶電荷的任何一種。為了在體外或體內(nèi)進(jìn)行這樣的實(shí)驗(yàn)，可以使用眾所周知的標(biāo)記試劑，例如放射性同位素或熒光物質(zhì)等按照常規(guī)方法對(duì)多核苷酸進(jìn)行標(biāo)記。作為放射性同位素例如有125I、131I、3H、14C、32P、或35S等。其中作為放射性同位素使用隨機(jī)引物法[Anal.Biochem.，132，6-13，(1983)]用32P進(jìn)行標(biāo)記比較適用。而作為可以更容易且危險(xiǎn)性小的操作的標(biāo)記如可以形成衍生物的熒光色素。作為熒光色素可以使用與多核苷酸結(jié)合的所有色素，例如熒光素、若丹明、德克薩斯紅(Texas Red)、4-氟-7-硝基苯并呋咱、香豆素、熒光胺、琥珀酰熒光素、或丹黃酰氯(ダンシル)等比較適用。
例如通過(guò)使用本發(fā)明蛋白質(zhì)的cDNA的RNA印跡解析對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)mRNA量的測(cè)定可以象如下所示那樣進(jìn)行。即，從任意體細(xì)胞或組織提取、分離mRNA，對(duì)分離的mRNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或尼龍膜上，然后通過(guò)與本發(fā)明蛋白質(zhì)的cDNA探針?lè)磻?yīng)，對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)mRNA量進(jìn)行測(cè)定。使用的本發(fā)明蛋白質(zhì)cDNA探針是與本發(fā)明蛋白質(zhì)mRNA互補(bǔ)的DNA，希望其長(zhǎng)度在17個(gè)堿基以上。
本發(fā)明第2種檢測(cè)方法中的逆轉(zhuǎn)錄步驟和基因擴(kuò)增步驟(特別是PCR步驟)的各個(gè)反應(yīng)本身可以通過(guò)通常的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和基因擴(kuò)增反應(yīng)，例如逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法實(shí)施。即使用逆轉(zhuǎn)錄酶和寡(dT)引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，使用耐熱性DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)，實(shí)施初期變性反應(yīng)(例如，于97℃下保溫2～3分鐘)后，反復(fù)進(jìn)行如下擴(kuò)增循環(huán)(例如進(jìn)行15～45次循環(huán))，實(shí)施PCR(1)DNA的變性過(guò)程(于90～94℃溫育30秒)、(2)單鏈DNA和引物的退火過(guò)程(于50～55℃溫育30秒)、以及(3)通過(guò)耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行的DNA合成過(guò)程(于70～75℃溫育1～2分鐘)。
本發(fā)明第2種檢測(cè)方法中的分析步驟也是通過(guò)DNA的通常分析方法、例如進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后用適當(dāng)?shù)腄NA結(jié)合性色素(例如溴乙錠)對(duì)凝膠進(jìn)行染色的方法或DNA印跡法實(shí)施。
另外本發(fā)明的方法內(nèi)通過(guò)分析本發(fā)明的蛋白質(zhì)檢測(cè)細(xì)菌感染癥的方法并沒(méi)有特別限定，例如包括以下步驟的檢測(cè)方法(以下稱(chēng)之為「本發(fā)明的第3種檢測(cè)方法」)使被檢測(cè)樣品與和本發(fā)明蛋白質(zhì)有免疫學(xué)反應(yīng)性的免疫反應(yīng)性物質(zhì)接觸的步驟；以及分析上述免疫反應(yīng)物質(zhì)與本發(fā)明蛋白質(zhì)的結(jié)合物的步驟。
在本發(fā)明的第3種檢測(cè)方法中首先使上述被檢測(cè)樣品與與本發(fā)明蛋白質(zhì)有免疫學(xué)反應(yīng)性的免疫反應(yīng)性物質(zhì)接觸。在使用來(lái)自人的被檢測(cè)樣品時(shí)，最好使與由序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、由序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)、或由序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)有免疫學(xué)反應(yīng)性的免疫反應(yīng)性物質(zhì)與被檢測(cè)樣品接觸。
在使被檢測(cè)樣品與和本發(fā)明蛋白質(zhì)有免疫學(xué)反應(yīng)性的免疫反應(yīng)性物質(zhì)接觸時(shí)，假如在被檢測(cè)物質(zhì)中不存在本發(fā)明蛋白質(zhì)，就不會(huì)發(fā)生與上述免疫反應(yīng)性物質(zhì)的反應(yīng)，如果在被檢測(cè)物質(zhì)中存在本發(fā)明蛋白質(zhì)，本發(fā)明的蛋白質(zhì)與上述免疫反應(yīng)性物質(zhì)結(jié)合，本發(fā)明蛋白質(zhì)與免疫反應(yīng)性物質(zhì)的結(jié)合物根據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)的存在量生成。該結(jié)合物由于可以根據(jù)眾所周知的方法簡(jiǎn)單地進(jìn)行檢測(cè)，所以可以從結(jié)合物的存在或量檢測(cè)上述被檢測(cè)樣品中的本發(fā)明蛋白質(zhì)的存在，可以測(cè)定其存在的量。作為被檢測(cè)樣品可以使用組織切片或細(xì)胞，通過(guò)熒光抗體法或酶抗體法對(duì)組織或細(xì)胞中的本發(fā)明蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定也是有可能的。
作為與本發(fā)明蛋白質(zhì)有免疫反應(yīng)的免疫反應(yīng)物質(zhì)，例如有針對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗血清、針對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)的多克隆抗體、或針對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)的單克隆抗體或這些抗體的片段等。以上這些抗體或片段既可以單獨(dú)使用，也可以組合同時(shí)使用。上述抗體片段中包括如Fab、Fab’、F(ab’)2、或Fv等片段。
在本發(fā)明的第3種檢測(cè)方法中首先使被檢測(cè)樣品與與本發(fā)明蛋白質(zhì)有免疫學(xué)反應(yīng)性的免疫反應(yīng)性物質(zhì)接觸，使本發(fā)明蛋白質(zhì)-免疫反應(yīng)性物質(zhì)結(jié)合物生成。然后通過(guò)免疫化學(xué)測(cè)定法，檢測(cè)與抗體結(jié)合的本發(fā)明蛋白質(zhì)，測(cè)定其生成量，可以知道被檢測(cè)樣品中的本發(fā)明蛋白質(zhì)水平。
作為免疫化學(xué)的測(cè)定方法原則上可以使用所有常用的免疫分析方法，例如EIA法、ELISA法、或RIA法等。這些免疫測(cè)定方法一般可大致分為以下一些方法。
(1)競(jìng)爭(zhēng)法使含有未知量抗原的被檢測(cè)樣品和用標(biāo)記試劑標(biāo)記的一定量的抗原與相對(duì)應(yīng)的一定量抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，測(cè)定與抗體結(jié)合的標(biāo)記抗原或沒(méi)有與抗體結(jié)合的標(biāo)記抗原的活性。
(2)夾心法向含有未知量抗原的被檢測(cè)樣品中加入過(guò)量的搭載在載體上的抗體，使其反應(yīng)(第1個(gè)反應(yīng))，然后加入用標(biāo)記試劑標(biāo)記的過(guò)量的一定量抗體使其反應(yīng)(第2個(gè)反應(yīng))。測(cè)定載體上保持的帶有標(biāo)記抗體或載體上沒(méi)有保持的帶有標(biāo)記抗體的活性。第1個(gè)反應(yīng)和第2個(gè)反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，也可以錯(cuò)開(kāi)時(shí)間進(jìn)行。
當(dāng)標(biāo)記試劑是放射性同位素時(shí)可以用井型計(jì)數(shù)器或液體閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)標(biāo)記試劑是酶時(shí)，可以加入底物后放置，用比色法或熒光法測(cè)定酶活性。標(biāo)記試劑無(wú)論是熒光物質(zhì)還是發(fā)光物質(zhì)可以分別按照眾所周知的方法進(jìn)行測(cè)定。
除了上述方法以外，最近已經(jīng)使用將電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素等膜上，用抗體檢測(cè)目的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡法，無(wú)論哪一種方法都可以用于本發(fā)明蛋白質(zhì)的檢測(cè)。
這些測(cè)定方法中使用的抗體可以通過(guò)眾所周知的抗體標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記，例如預(yù)先用放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、或發(fā)光性物質(zhì)等的適當(dāng)標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。
作為放射性同位素例如可以使用125I、131I、3H、14C、或35S等。
作為酶是穩(wěn)定、比活性高的比較好，例如可以使用糖苷酶(例如，β-半乳糖苷酶、β-糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-果糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-糖苷酶、或α-甘露糖苷酶)、淀粉酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶、異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、或高峰淀粉酶)、纖維素酶、或溶菌酶等碳水化合物酶；脲酶、或天冬酰胺酶等酰胺酶；膽堿酯酶(例如乙酰膽堿酯酶)、磷酸酶(例如堿性磷酸酶)、硫酸酯酶、或脂肪酶等酯酶；脫氧核糖核酸酶、或核糖核酸酶等核酸酶；過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、或細(xì)胞色素氧化酶等鐵卟啉酶；酪氨酸酶、或天冬氨酸氧化酶等銅酶；或乙醇脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、或異檸檬酸脫氫酶等脫氫酶等。
作為熒光物質(zhì)如熒光胺、或異硫氰酸熒光素等，作為發(fā)光性物質(zhì)如氨基苯二酰肼、氨基苯二酰肼衍生物、熒光素、或光澤精等。
來(lái)自上述各種標(biāo)記的信號(hào)檢測(cè)可以通過(guò)眾所周知的方法實(shí)施。
而作為使抗體和標(biāo)記試劑結(jié)合的方法可以使用任何常規(guī)的方法，例如氯胺T法[Nature，194，495-496，(1962)]，過(guò)碘酸法[Journalof Histochemistry and Cytochemistry，22，1084-1091，(1974)]、或馬來(lái)酰亞胺法[Journal of Biochemistry，79，233-236，(1976)]等。
在上述測(cè)定方法中，例如EIA法可以按如下所示那樣進(jìn)行。首先將被檢測(cè)樣品加到已經(jīng)固定于載體(例如分析板)上的第1抗體中，使本發(fā)明蛋白質(zhì)與第1抗體結(jié)合，生成結(jié)合物，向該結(jié)合物中加入結(jié)合酶標(biāo)記試劑(例如過(guò)氧化物酶)的第2抗體，使上述結(jié)合物進(jìn)一步結(jié)合第2抗體，生成「第1抗體-本發(fā)明蛋白質(zhì)-第2抗體」結(jié)合物。向得到的「第1抗體-本發(fā)明蛋白質(zhì)-第2抗體」結(jié)合物中加入上述標(biāo)記酶(過(guò)氧化物酶)的底物，通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)的生成物的吸光度或熒光強(qiáng)度測(cè)定附著于「第1抗體-本發(fā)明蛋白質(zhì)-第2抗體」結(jié)合物上的標(biāo)記酶的酶活性。就含有已知量的本發(fā)明蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液預(yù)先實(shí)施上述的一系列操作，將本發(fā)明蛋白質(zhì)和吸光度或熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系作成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后將含有未知量的本發(fā)明蛋白質(zhì)的被檢測(cè)樣品得到的吸光度或熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)照，可以測(cè)定被檢測(cè)樣品中的本發(fā)明蛋白質(zhì)的量。
按照以下給出的方法也可以進(jìn)行EIA法。即首先通過(guò)使載體(例如分析板)與被檢測(cè)樣品接觸，將被檢測(cè)樣品內(nèi)的本發(fā)明蛋白質(zhì)固定于載體上，然后加入一次抗體，使本發(fā)明蛋白質(zhì)與一次抗體結(jié)合生成結(jié)合物，然后向該結(jié)合物中加入結(jié)合酶標(biāo)記試劑(例如過(guò)氧化物酶)的抗一次抗體抗體(二次抗體)，使二次抗體結(jié)合于上述結(jié)合物上，生成「本發(fā)明蛋白質(zhì)-一次抗體-二次抗體」結(jié)合物。向得到的「本發(fā)明蛋白質(zhì)-一次抗體-二次抗體」結(jié)合物中加入上述標(biāo)記酶(過(guò)氧化物酶)的底物，通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)的生成物的吸光度或熒光強(qiáng)度測(cè)定附著于上述「本發(fā)明蛋白質(zhì)-一次抗體-二次抗體」結(jié)合物上的標(biāo)記酶的酶活性。就含有已知量的本發(fā)明蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液預(yù)先實(shí)施上述的一系列操作，將本發(fā)明蛋白質(zhì)和吸光度或熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系作成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后將含有未知量的本發(fā)明蛋白質(zhì)的被檢測(cè)樣品得到的吸光度或熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)照，可以測(cè)定被檢測(cè)樣品中的本發(fā)明蛋白質(zhì)的量。
而RIA法可以象如下那樣進(jìn)行。首先將被檢測(cè)樣品加到已經(jīng)固定于載體(例如試管)上的第1抗體中，使本發(fā)明蛋白質(zhì)與第1抗體結(jié)合，生成結(jié)合物，向該結(jié)合物中加入用放射性同位素標(biāo)記試劑標(biāo)識(shí)的(例如，125I)的第2抗體，使上述結(jié)合物進(jìn)一步結(jié)合第2抗體，生成「第1抗體-本發(fā)明蛋白質(zhì)-第2抗體」結(jié)合物。測(cè)定得到的「第1抗體-本發(fā)明蛋白質(zhì)-第2抗體」結(jié)合物的放射能活性(例如，γ-放射能活性)。就含有已知量的本發(fā)明蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液預(yù)先實(shí)施上述的一系列操作，將本發(fā)明蛋白質(zhì)和放射能活性之間的關(guān)系作成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后將含有未知量的本發(fā)明蛋白質(zhì)的被檢測(cè)樣品得到的放射能活性與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)照，可以測(cè)定被檢測(cè)樣品中的本發(fā)明蛋白質(zhì)的量。
另外通過(guò)以下給出的方法也可以進(jìn)行RIA法。即首先通過(guò)使載體(例如試管)與被檢測(cè)樣品接觸，將被檢測(cè)樣品內(nèi)的本發(fā)明蛋白質(zhì)固定于載體上，然后加入一次抗體，使本發(fā)明蛋白質(zhì)與一次抗體結(jié)合生成結(jié)合物，然后向該結(jié)合物中加入用放射性同位素標(biāo)記試劑(例如，125I)標(biāo)識(shí)的抗一次抗體抗體(二次抗體)，使二次抗體結(jié)合于上述結(jié)合物上，生成「本發(fā)明蛋白質(zhì)-一次抗體-二次抗體」結(jié)合物。然后測(cè)定得到的「本發(fā)明蛋白質(zhì)-一次抗體-二次抗體」結(jié)合物的放射能活性(例如，γ-放射能活性)。就含有已知量的本發(fā)明蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液預(yù)先實(shí)施上述的一系列操作，將本發(fā)明蛋白質(zhì)和放射能活性之間的關(guān)系作成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后將含有未知量的本發(fā)明蛋白質(zhì)的被檢測(cè)樣品得到的放射能活性與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)照，可以測(cè)定被檢測(cè)樣品中的本發(fā)明蛋白質(zhì)的量。實(shí)施例以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明，但這些實(shí)施例并沒(méi)有限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1活性化人巨噬細(xì)胞特異的新基因的分離和鑒定(1)來(lái)自脂多糖(LPS)刺激巨噬細(xì)胞的mRNA的分離以1L健康人血液作為起始材料，使用市售的外周血單核細(xì)胞制備用試劑[Lymphoprep；Nycomed公司；ノルゥエ-，オスロ]制備外周血單核細(xì)胞。將得到的外周血單核細(xì)胞懸浮于含有10μg/mL-LPS(Difco Laboratories公司；美國(guó)密歇根州底特律)和10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，使細(xì)胞濃度達(dá)到106個(gè)/mL。將細(xì)胞懸浮液加到塑料培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿加20mL，于37℃和5％CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
培養(yǎng)3個(gè)小時(shí)后，棄掉上清，用20mL磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline；PBS)將附著細(xì)胞(即LPS活化的巨噬細(xì)胞)洗3次。加入細(xì)胞溶解用溶液[4mol/L異硫氰酸胍，30mmol/L醋酸鈉(pH4.8)]3mL，用帶有針頭的注射器反復(fù)進(jìn)行3次吸-排操作，鋪到預(yù)先加有5.7mol/L氯化銫緩沖液(pH4.8)1.2mL的超離心5PA管(日立工機(jī)；日本國(guó)勝田市)。經(jīng)18小時(shí)離心(20℃，38000rpm)后，除去離心管中的上清，用200μL滅菌水將離心管中的沉淀溶解，回收RNA。從1L血液中可以得到約1mg總RNA(即來(lái)自L(fǎng)PS刺激巨噬細(xì)胞的總RNA)。
然后使用市售的mRNA制備試劑盒[Poly(A)Quik mRNA Isolationkit；Stratagene公司；美國(guó)加利福尼亞州La Jolla]，從500μg總RNA中制備出15μg mRNA(即來(lái)自L(fǎng)PS刺激巨噬細(xì)胞的總RNA)。(2)噬菌體cDNA文庫(kù)的制作從得到的來(lái)自L(fǎng)PS刺激巨噬細(xì)胞的15μg mRNA取出5μg制作噬菌體cDNA文庫(kù)。在cDNA文庫(kù)的制作中使用市售的試劑盒(ZAP ExpresscDNA Synthesis Kit和ZAP Express cDNA Gigapack III Gold CloningKit；Stratagene公司)。(3)cDNA的部分堿基序列的解析為了解析來(lái)自L(fǎng)PS刺激的巨噬細(xì)胞的cDNA的堿基序列，按照常規(guī)方法隨機(jī)挑選大約1000個(gè)噬斑，作為噬菌?；厥誧DNA。就回收的大約1000個(gè)來(lái)自L(fǎng)PS刺激的巨噬細(xì)胞的cDNA使用市售的堿基序列確定用試劑盒(Dye Terminator Cycle Sequencing kit；Perkin Elmer Japan公司；浦安市)分別解析cDNA的5′末端一側(cè)以及3′末端一側(cè)的400～500個(gè)堿基。就得到的各個(gè)序列通過(guò)NCBI(National Center for Biotechnology Information；http//inhouse.ncbi.nlm.nih.gov)的BLAST(basic local alignmenttool)進(jìn)行DNA同源性檢索時(shí)，發(fā)現(xiàn)了63個(gè)未知的新基因。(4)通過(guò)RNA印跡法進(jìn)行解析按照上述實(shí)施例(1)記載的來(lái)自L(fǎng)PS刺激的巨噬細(xì)胞的總RNA制備過(guò)程制備來(lái)自L(fǎng)PS刺激的巨噬細(xì)胞的總RNA。另外除了用含有10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基代替含有10μg/mL-LPS和10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基以外，按照上述實(shí)施例(1)記載的來(lái)自L(fǎng)PS刺激的巨噬細(xì)胞的總RNA制備過(guò)程制備來(lái)自未受LPS刺激的巨噬細(xì)胞的總RNA。按照常規(guī)方法對(duì)上述來(lái)自L(fǎng)PS(10μg/mL)刺激的巨噬細(xì)胞的總RNA和來(lái)自未受LPS刺激的巨噬細(xì)胞的總RNA進(jìn)行甲醛/瓊脂糖凝膠電泳后，將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。
將轉(zhuǎn)移了RNA的上述膜于80℃和減壓下熱處理2小時(shí)后，浸入到市售的預(yù)雜交用溶液(Hybrisoll；Oncor公司；美國(guó)馬里蘭州Gaithersurg)，于42℃下進(jìn)行3小時(shí)預(yù)雜交。然后使用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(Boehringer Mannheim公司；德國(guó))，分別加入用同位素32P標(biāo)記的上述實(shí)施例1(3)中得到的各個(gè)新基因，于42℃雜交過(guò)夜。第二天用含有0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)的2×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉)]于室溫下洗2次，每次20分鐘，再于65℃下用含有0.1％SDS的0.2×SSC洗2次，每次20分鐘。將洗凈的膜包起來(lái)于-80℃下進(jìn)行一個(gè)晚上的自動(dòng)放射自顯影。
顯影結(jié)果表明在上述實(shí)施例1(3)得到的63個(gè)新基因內(nèi)由于LPS刺激其表達(dá)被誘導(dǎo)的基因有3個(gè)。3個(gè)新基因(NLG-1-1、NLG-1-2和NLG-2)的RNA印跡法的結(jié)果如

圖1所示。在圖1中記號(hào)「+」指的是「LPS刺激」，而記號(hào)「-」指的是「LPS未刺激」，「Origin」指的是「泳動(dòng)起始點(diǎn)」。3個(gè)新基因(NLG-1-1、NLG-1-2和NLG-2)的mRNA的長(zhǎng)度大約分別是2.3kb、2.3kb、和0.7kb。
另外對(duì)組織特異性研究的結(jié)果就象圖2所示那樣，基因NLG-1-1和基因NLG-1-2在研究的所有組織[即脾臟(帶1)、胸腺(帶2)、前列腺(帶3)、精巢(帶4)、卵巢(帶5)、小腸(帶6)、大腸(帶7)和外周血淋巴細(xì)胞(帶8)]中雖然弱但都表達(dá)，與此相反基因NLG-2只在精巢(帶4)和大腸(帶7)中明顯表達(dá)，而在其它組織看不到表達(dá)。(5)全堿基序列的確定3個(gè)新基因(NLG-1-1、NLG-1-2和NLG-2)全堿基序列根據(jù)常規(guī)方法確定。
基因NLG-1-1和基因NLG-1-2分別由2180bp和1970bp組成，其具體的堿基序列分別為序列表中序列號(hào)1和序列號(hào)3表示的堿基序列?；騈LG-1-1和基因NLG-1-2同源性的檢索結(jié)果表明基因NLG-1-1的第193位～第2139位的堿基序列與基因NLG-1-2的第9位～第1955位的堿基序列完全相同。這可以想象為通過(guò)有選擇地剪接(alternative splicing)，2種mRNA是從一個(gè)染色體基因轉(zhuǎn)錄的。基因NLG-1-1編碼由含有序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列的481個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。而基因NLG-1-2編碼由含有序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列的390個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
而基因NLG-2由652bp構(gòu)成，其具體的堿基序列是序列表中序列號(hào)5表示的堿基序列。另外基因NLG-2編碼由含有序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列的83個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。實(shí)施例2基因NLG-1-1和基因NLG-2在動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)在本實(shí)施例中作為動(dòng)物細(xì)胞使用COS-1(大日本制藥；日本國(guó)大阪府吹田市)，作為載體使用pQB125-fN3rsGFP載體(Quantumbiotechnologies；加拿大魁北克州蒙特利爾市)，按照以下給出的過(guò)程使基因NLG-1-1和基因NLG-2表達(dá)。如果使用上述載體，由于可以作為與綠色熒光蛋白(GFP)融合的融合蛋白質(zhì)表達(dá)目的基因，所以通過(guò)對(duì)綠色熒光進(jìn)行跟蹤可以觀察目的基因的分布。
基因NLG-1-1和基因NLG-2的各個(gè)cDNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)按照以下給出的過(guò)程進(jìn)行制備。即從LPS刺激3小時(shí)的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)制備mRNA，將使用市售的cDNA合成試劑盒(SMARTPCR cDNA syhthesis kit；Clontech公司；美國(guó)加利福尼亞州帕泊阿爾托)從該mRNA合成的cDNA作為模板使用。
作為引物使用由序列5’-C A C G G A T C C A T T C T T C G C T G A A G T C A T C A T G A GC-3’(序列號(hào)7)構(gòu)成的NLG-2正向引物、由序列5’-G T G G A A T T C T T T G G T C A C C C T T T G G A C A T T T T GC-3’(序列號(hào)8)NLG-2反向引物、由序列5’-C A C G G A T C C T T C T T T A C A A C G A A A T G A T G C T C AAG-3’(序列號(hào)9)構(gòu)成的NLG-1-1正向引物以及、由序列5’-G T G G A A T T C G G A G A G A T T T G T G A T A G A A T T A T TA C A T G C-3’(序列號(hào)10)構(gòu)成的NLG-1-1反向引物。
PCR使用市售的PCR用試劑(Advantage cDNA polymerase Mix；Clontech公司)，每一循環(huán)由變性步驟(94℃，30秒)、退火過(guò)程和延伸過(guò)程(68℃，2分鐘)構(gòu)成，反復(fù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。
得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制酶BamHI(寶酒造；日本國(guó)東京都中央?yún)^(qū))和限制酶EcoRI(寶酒造)消化后，使用市售的試劑盒(DNA ligationkit Ver.2；寶酒造)與pQBI 25-fN3rsGFP載體連接進(jìn)行克隆，用于以下實(shí)驗(yàn)。
在基因?qū)氲那耙惶欤瑢OS-1細(xì)胞加到6孔板中(1×106細(xì)胞/孔)。這時(shí)將預(yù)先經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌的蓋玻片放置在上述6孔板的各個(gè)孔中，于上述蓋玻片的上面進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。第二天使用市售的轉(zhuǎn)移用試劑(LipofectAMINE reagent；GibcoBRL；美國(guó)馬里蘭Rockville)將先前得到的載體導(dǎo)入COS-1細(xì)胞。導(dǎo)入3日后用含有4％(v/v)甲醛的PBS將蓋玻片上的細(xì)胞固定30分鐘，用含有20％(v/v)屈立通X-100的PBS處理30分鐘，再用含有20％(v/v)正常山羊血清(Vector Laboratories；美國(guó)加利福尼亞州Burlingame)的PBS處理30分鐘。
在線(xiàn)粒體的染色中使用抗細(xì)胞色素c抗體(Santa CruzBiotechnology；美國(guó)加利福尼亞州Santa Cruz)和德克薩斯紅(TexasRed)標(biāo)記抗兔IgG抗體(Vector Laboratories)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色中使用抗(肌)鈣網(wǎng)蛋白抗體(Upstate Biotechnology；美國(guó)紐約州Lake Placid)和德克薩斯紅(Texas Red)標(biāo)記抗兔IgG抗體(VectorLaboratories)，在高爾基體的染色中使用抗高爾基體58K蛋白質(zhì)抗體(Sigma；美國(guó)密蘇里州圣路易斯)和德克薩斯紅(Texas Red)標(biāo)記抗鼠IgG抗體(Kirkegaard & Perry Laboratories；美國(guó)馬里蘭州Gaithersburg)，分別進(jìn)行免疫染色。
在核的染色中使用碘化丙錠(propidiumiodide；和光純藥工業(yè)；日本國(guó)大阪府大阪市)，在細(xì)胞質(zhì)的染色中使用hydroethidine(Polysciences；美國(guó)賓夕法尼亞州Warrington)。
將蓋玻片安裝到載玻片上后，用共聚焦激光掃描顯微鏡FV500(Olinmpus；日本國(guó)東京都千代田區(qū))進(jìn)行觀察。圖3給出了使基因NLG-1-1表達(dá)的COS-1細(xì)胞的狀態(tài)，圖4給出了使基因NLG-2表達(dá)的COS-1細(xì)胞的狀態(tài)。在圖3和圖4中A是表示基因NLG-1-1或基因NLG-2編碼的蛋白質(zhì)和GFP的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)狀態(tài)的綠色熒光圖像，而B(niǎo)是對(duì)線(xiàn)粒體進(jìn)行染色的紅色熒光圖像，C是將上述A熒光圖像和上述B的熒光圖像重合在一起的圖像，D是微分干涉圖像。
就象圖3A表示的那樣，在核的周?chē)捎^察到基因NLG-1-1的表達(dá)。而圖3A中的綠色熒光圖像和圖3B的紅色熒光圖像(對(duì)線(xiàn)粒體就象染色的熒光圖像)非常一致，熒光圖像一致時(shí)在圖3C中觀察到黃色。另外對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行染色的熒光圖像、對(duì)高爾基體進(jìn)行染色的熒光圖像、核的染色圖像，或細(xì)胞質(zhì)的染色圖像中的無(wú)論哪一個(gè)圖像都與圖3A中的綠色熒光圖像不一致。因此可以判明基因NLG-1-1編碼的蛋白質(zhì)分布于線(xiàn)粒體。
另外就象圖4所表明的那樣，可以判明基因NLG-2編碼的蛋白質(zhì)也和基因NLG-1-1編碼的蛋白質(zhì)一樣分布于線(xiàn)粒體。實(shí)施例3基因NLG-1-1的染色體座位的確定通過(guò)FISH(熒光in situ雜交)解析[Chromosoma.，102，325-332(1993)]確定基因NLG-1-1的染色體座位時(shí)發(fā)現(xiàn)它存在于13號(hào)染色體的長(zhǎng)臂22(13q22)。結(jié)果如圖5所示。在圖5中，A是DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)染色的結(jié)果，B是FISH信號(hào)的結(jié)果。圖5A中的箭頭表示基因NLG-1-1的染色體部位，圖5B中的數(shù)字「13」表示第13號(hào)染色體。實(shí)施例4在敗血病患者中基因NLG-1-1、NLG-1-2和NLG-2表達(dá)的確認(rèn)將從4名健康人和4名敗血病患者分別采集20mL血作為起始材料，按照上述實(shí)施例1(1)記載的順序制備外周血單核細(xì)胞，再?gòu)纳鲜鐾庵苎獑魏思?xì)胞分別制備約20μg的總RNA。
使用各個(gè)RNA 10μg按照上述實(shí)施例1(4)記載的順序?qū)嵤㏑NA印跡。結(jié)果如圖6所示。在圖6中，(A)表示使用基因NLG-1-1作為探針時(shí)的結(jié)果，以下同樣，(B)表示使用基因NLG-1-2作為探針，而(C)表示使用NLG-2作為探針時(shí)的結(jié)果。而在圖6中，帶1～4表示來(lái)自健康人的RNA的結(jié)果，帶5～8表示來(lái)自敗血病患者的RNA的結(jié)果。
就象圖6所表示的那樣，本發(fā)明的3種新基因(NLG-1-1、NLG-1-2和NLG-2)的表達(dá)在4名健康人中都看不到，但在4名敗血病患者中卻表現(xiàn)非常明顯。通過(guò)對(duì)本發(fā)明的這些基因的表達(dá)進(jìn)行分析，從這些結(jié)果可以確認(rèn)這些基因可以用于細(xì)菌感染癥的診斷、或治療后病況的判定。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性已知由LPS刺激引起的生命現(xiàn)象與發(fā)炎時(shí)的現(xiàn)象同樣。事實(shí)上在發(fā)炎時(shí)起主要作用的巨噬細(xì)胞中LPS刺激特異誘導(dǎo)表達(dá)的基因群中包括炎性細(xì)胞因子(TNF，IL-1、IL-6、IL-18)、趨化因子(IL-8、MCP)、作為炎性疾病的慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)的發(fā)炎部位引起產(chǎn)生異常的膠原等分泌性蛋白質(zhì)、作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)引起炎癥的產(chǎn)生NO(一氧化氮)的NO合成酶、產(chǎn)生前列腺素的環(huán)加氧酶(COXII)，而且包括與炎性蛋白質(zhì)基因的表達(dá)有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄因子NF-kB等幾乎所有的炎性疾病起因蛋白質(zhì)基因。
有關(guān)針對(duì)這些蛋白質(zhì)的抑制劑作為抗炎藥物的臨床開(kāi)發(fā)正在深入進(jìn)行，很多處于臨床實(shí)驗(yàn)中。例如抗TNF抗體或NO合成酶抑制劑已經(jīng)作為炎性疾病的治療藥使用了。另外膠原酶抑制劑作為癌轉(zhuǎn)移抑制劑，COXII抑制劑作為治療癌癥藥都分別處于臨床開(kāi)發(fā)中。從這些結(jié)果中可以認(rèn)為通過(guò)LPS誘導(dǎo)表達(dá)的本發(fā)明的新基因及其蛋白質(zhì)也都極有可能與炎性疾病、變態(tài)反應(yīng)或癌的發(fā)生和/或進(jìn)展有關(guān)系。
本發(fā)明的第1和第2種新蛋白質(zhì)有可能與LPS的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞系統(tǒng)有關(guān)。而本發(fā)明的第3種新蛋白質(zhì)有可能與細(xì)胞內(nèi)電子傳遞和/或自由基產(chǎn)生有關(guān)。因此這些蛋白質(zhì)與以往的消炎藥開(kāi)發(fā)的目標(biāo)不同，上述蛋白質(zhì)的抑制劑有可能成為新型消炎藥。利用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法、RNA印跡法、點(diǎn)漬法、或DNA微點(diǎn)陣(microarray)，通過(guò)對(duì)來(lái)自人的臨床樣品中的上述蛋白質(zhì)基因的表達(dá)的研究，也許可以用于炎癥、變態(tài)反應(yīng)、或癌的診斷中?；蛘呤褂蒙鲜龅鞍踪|(zhì)的抗體也許可以進(jìn)行炎癥、變態(tài)反應(yīng)、或癌的診斷。另外上述蛋白質(zhì)基因的反義DNA也有可能用于炎癥、變態(tài)反應(yīng)、或癌的治療(包括基因治療)。
通過(guò)本發(fā)明的探針或本發(fā)明的抗體可以進(jìn)行細(xì)菌感染癥(例如敗血病、肺炎、尿路感染癥、骨髓炎、或中耳炎)的診斷。本發(fā)明蛋白質(zhì)在制備本發(fā)明抗體時(shí)是有用的，本發(fā)明的新基因、本發(fā)明的質(zhì)粒、以及本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體在制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)中是有用的。
以上按照特定模式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員都清楚的變形和改良都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
序列表<110>吳羽化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社<120>新蛋白質(zhì)以及編碼該蛋白的基因<130>KRH-647<150>JP 2000-042933<151>2000-02-21<160>10<210>1<211>2180<212>DNA<213>人類(lèi)<220><221>CDS<222>(37)..(1482)<400>1ggcacgagct gaactgaacc tcttctttac aacgaa atg atg ctc aag tct atc 54Met Met Leu Lys Ser Ile1 5aca gaa agc ttt gcc aca gca atc cat ggc ttg aaa gtg gga cac ctg 102Thr Glu Ser Phe Ala Thr Ala Ile His Gly Leu Lys Val Gly His Leu10 15 20aca gat cgt gtt att cag agg agc aag agg atg att cta gac act ctg 150Thr Asp Arg Val Ile Gln Arg Ser Lys Arg Met Ile Leu Asp Thr Leu25 30 35ggt gct ggg ttc ctg gga acc act acg gaa gtg ttt cac ata gcc agc 198Gly Ala Gly Phe Leu Gly Thr Thr Thr Glu Val Phe His Ile Ala Ser40 45 50caa tat agc aag atc tac agt tcc aac ata tcc agc act gta tgg ggt 246Gln Tyr Ser Lys Ile Tyr Ser Ser Asn Ile Ser Ser Thr Val Trp Gly55 60 65 70cag cca gac atc agg ctc ccg ccc aca tat gct gct ttt gtg aac ggt 294Gln Pro Asp Ile Arg Leu Pro Pro Thr Tyr Ala Ala Phe Val Asn Gly75 80 85gtg gct att cac tcc atg gat ttt gat gac acg tgg cac cct gcc acc 342Val Ala Ile His Ser Met Asp Phe Asp Asp Thr Trp His Pro Ala Thr90 95 100cac cct tct ggg gct gtc ctt cct gtc ctc aca gct tta gca gaa gcc 390His Pro Ser Gly Ala Val Leu Pro Val Leu Thr Ala Leu Ala Glu Ala105 110 115ctg cca agg agt cca aag ttt tct ggc ctt gac ctg ctg ctg gct ttc 438Leu Pro Arg Ser Pro Lys Phe Ser Gly Leu Asp Leu Leu Leu Ala Phe120 125 130aat gtt ggt att gaa gtg caa ggc cga tta ctg cat ttc gcc aag gag 486Ash Val Gly Ile Glu Val Gln Gly Arg Leu Leu His Phe Ala Lys Glu135 140 145 150gcc aat gac atg cca aag aga ttc cat ccc cct tcc gtg gta gga acg 534Ala Asn Asp Met Pro Lys Arg Phe His Pro Pro Ser Val Val Gly Thr155 160 165ttg ggt agt gct gct gct gca tcc aag ttt tta gga ctt agc tcg aca 582Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ser Lys Phe Leu Gly Leu Ser Ser Thr170 175 180aag tgc cga gaa gct ctg gcc att gct gtt tcc cat gct ggg gca ccc 630Lys Cys Arg Glu Ala Leu Ala Ile Ala Val Ser His Ala Gly Ala Pro185 190 195atg gcc aat gct gcc acc cag acc aag ccc ctc cac att ggc aat gct 678Met Ala Asn Ala Ala Thr Gln Thr Lys Pro Leu His Ile Gly Asn Ala200 205 210gcc aag cat ggg ata gaa gct gca ttt ttg gca atg ttg ggt ctc caa 726Ala Lys His Gly Ile Glu Ala Ala Phe Leu Ala Met Leu Gly Leu Gln215 220 225 230gga aac aag cag gtc ttg gac ttg gag gca gga ttt ggg gcc ttt tat 774Gly Asn Lys Gln Val Leu Asp Leu Glu Ala Gly Phe Gly Ala Phe Tyr235 240 245gcc aac tat tcc cca aaa gtc ctt cca agc ata gct tcc tac agt tgg 822Ala Asn Tyr Ser Pro Lys Val Leu Pro Ser Ile Ala Ser Tyr Ser Trp250 255 260ctg ctg gac cag cag gac gtg gcc ttt aag cgt ttt cct gca cat tta 870Leu Leu Asp Gln Gln Asp Val Ala Phe Lys Arg Phe Pro Ala His Leu265 270 275tct acc cac tgg gtg gca gac gca gct gca tct gtg aga aag cac ctt 918Ser Thr His Trp Val Ala Asp Ala Ala Ala Ser Val Arg Lys His Leu280 285 290gta gca gag aga gcc ctg ctt cca act gac tac att aag aga att gtg 966Val Ala Glu Arg Ala Leu Leu Pro Thr Asp Tyr Ile Lys Arg Ile Val295 300 305 310ctc agg ata cca aat gtc cag tat gta aac agg ccc ttt cca gtt tcg 1014Leu Arg Ile Pro Asn Val Gln Tyr Val Asn Arg Pro Phe Pro Val Ser315 320 325gag cat gaa gcc cgt cat tca ttc cag tat gtg gcc tgt gcc atg ctg 1062Glu His Glu Ala Arg His Ser Phe Gln Tyr Val Ala Cys Ala Met Leu330 335 340ctt gat ggt ggc atc act gtc ccc tca ttc cat gaa tgc cag atc aac 1110Leu Asp Gly Gly Ile Thr Val Pro Ser Phe His Glu Cys Gln Ile Asn345 350 355agg cca cag gtg aga gag ctg ctc agt aag gtg gag ctg gag tac cct 1158Arg Pro Gln Val Arg Glu Leu Leu Ser Lys Val Glu Leu Glu Tyr Pro360 365 370ccg gac aac ttg cca agc ttc aac ata ctg tac tgt gaa ata agt gtc 1206Pro Asp Asn Leu Pro Ser Phe Asn Ile Leu Tyr Cys Glu Ile Ser Val375 380 385 390acc ctc aag gat gga gcc acc ttc aca gat cgc tct gat acc ttc tat 1254Thr Leu Lys Asp Gly Ala Thr Phe Thr Asp Arg Ser Asp Thr Phe Tyr395 400 405ggg cac tgg aga aaa cca ctg agc cag gag gac cta gag gaa aag ttc 1302Gly His Trp Arg Lys Pro Leu Ser Gln Glu Asp Leu Glu Glu Lys Phe410 415 420aga gcc aat gcc tcc aag atg ctg tcc tgg gac aca gtg gaa agc ctt 1350Arg Ala Asn Ala Ser Lys Met Leu Ser Trp Asp Thr Val Glu Ser Leu425 430 435ata aag ata gtc aaa aat cta gaa gac cta gaa gac tgt tct gtg tta 1398Ile Lys Ile Val Lys Asn Leu Glu Asp Leu Glu Asp Cys Ser Val Leu440 445 450act aca ctt ctc aaa gga ccc tct cca cca gag gta gct tca aac tct 1446Thr Thr Leu Leu Lys Gly Pro Ser Pro Pro Glu Val Ala Ser Ash Ser455 460465 470cca gca tgt aat aat tct atc aca aat ctc tcc tgaggcttac caacatctaa 1499Pro Ala Cys Asn Asn Ser Ile Thr Asn Leu Ser475 480atgactttgc atttggggag attcaatgat ttggtttgta aagcaagggt ctgctgcttg 1559gttttcccag gaaaaatgaa caaagatgga gagagtccag aaacagaact acatatatct 1619ggaaggagcc ttctcctgaa aattttgcag gacagttcca cttacctaaa tcaagatgaa 1679acacacacac aaaaatgagt ttgtaagcat tcacaagggt gaaattcaac tcacctgtga 1739tttacttata aaattaatct cttcatagga attatgtgtg gacttcatga gcctcaaggt 1799tttagaggga tgtgaacctg catgtatatt ttctgacagt ggagagggct ctggtgcatt 1859gtgtcaccaa cagatctcct agaccatggc ttattaccaa gccctccaca gtgcaagggg 1919tgctactggg gaatgggtgg gtttaaatcc tgcctctgcc attcactaga tgtagccttg 1979agcatgttac cattagccct ctgcctcagt ttccctattt gtcaagccga agtaaaaagc 2039agtctggaaa aatcgcattt tggctctaga acccatggtc ttaagcactg caatatatca 2099cctttcagta taaaaatatt tgaatcagag ttgcaataaa gaatgaaaag gaaaaaagag 2159aagtaaaaaa aaaaaaaaaa a 2180<210>2<211>481<212>PRT<213>人類(lèi)<400>2Met Met Leu Lys Ser Ile Thr Glu Ser Phe Ala Thr Ala Ile His Gly1 5 10 15Leu Lys Val Gly His Leu Thr Asp Arg Val Ile Gln Arg Ser Lys Arg20 25 30Met Ile Leu Asp Thr Leu Gly Ala Gly Phe Leu Gly Thr Thr Thr Glu35 40 45Val Phe His Ile Ala Ser Gln Tyr Ser Lys Ile Tyr Ser Ser Asn Ile50 55 60Ser Ser Thr Val Trp Gly Gln Pro Asp Ile Arg Leu Pro Pro Thr Tyr65 70 75 80Ala Ala Phe Val Asn Gly Val Ala Ile His Ser Met Asp Phe Asp Asp85 90 95Thr Trp His Pro Ala Thr His Pro Ser Gly Ala Val Leu Pro Val Leu100 105 110Thr Ala Leu Ala Glu Ala Leu Pro Arg Ser Pro Lys Phe Ser Gly Leu115 120 125Asp Leu Leu Leu Ala Phe Asn Val Gly Ile Glu Val Gln Gly Arg Leu130 135 140Leu His Phe Ala Lys Glu Ala Asn Asp Met Pro Lys Arg Phe His Pro145 150 155 160Pro Ser Val Val Gly Thr Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ser Lys Phe165 170 175Leu Gly Leu Ser Ser Thr Lys Cys Arg Glu Ala Leu Ala Ile Ala Val180 185 190Ser His Ala Gly Ala Pro Met Ala Asn Ala Ala Thr Gln Thr Lys Pro195 200 205Leu His Ile Gly Asn Ala Ala Lys His Gly Ile Glu Ala Ala Phe Leu210 215220Ala Met Leu Gly Leu Gln Gly Asn Lys Gln Val Leu Asp Leu Glu Ala225 230 235 240Gly Phe Gly Ala Phe Tyr Ala Asn Tyr Ser Pro Lys Val Leu Pro Ser245 250 255Ile Ala Ser Tyr Ser Trp Leu Leu Asp Gln Gln Asp Val Ala Phe Lys260 265 270Arg Phe Pro Ala His Leu Ser Thr His Trp Val Ala Asp Ala Ala Ala275 280 285Ser Val Arg Lys His Leu Val Ala Glu Arg Ala Leu Leu Pro Thr Asp290 295 300Tyr Ile Lys Arg Ile Val Leu Arg Ile Pro Asn Val Gln Tyr Val Asn305 310 315 320Arg Pro Phe Pro Val Ser Glu His Glu Ala Arg His Ser Phe Gln Tyr325 330 335Val Ala Cys Ala Met Leu Leu Asp Gly Gly Ile Thr Val Pro Ser Phe340 345 350His Glu Cys Gln Ile Asn Arg Pro Gln Val Arg Glu Leu Leu Ser Lys355 360 365Val Glu Leu Glu Tyr Pro Pro Asp Asn Leu Pro Ser Phe Asn Ile Leu370 375 380Tyr Cys Glu Ile Ser Val Thr Leu Lys Asp Gly Ala Thr Phe Thr Asp385 390 395 400Arg Ser Asp Thr Phe Tyr Gly His Trp Arg Lys Pro Leu Ser Gln Glu405 410 415Asp Leu Glu Glu Lys Phe Arg Ala Asn Ala Ser Lys Met Leu Ser Trp420 425 430Asp Thr Val Glu Ser Leu Ile Lys Ile Val Lys Asn Leu Glu Asp Leu435 440 445Glu Asp Cys Ser Val Leu Thr Thr Leu Leu Lys Gly Pro Ser Pro Pro450 455 460Glu Val Ala Ser Asn Ser Pro Ala Cys Asn Asn Ser Ile Thr Asn Leu465 470 475 480Ser<210>3<211>1970<212>DNA<213>人類(lèi)<220><221>CDS<222>(126)..(1298)<400>3ggcacgaggc cagccaatat agcaagatct acagttccaa catatccagc actgtttggg 60gtcagccaga catcaggctc ccgcccacat atgctgcttt tgtgaacggt gtggctattc 120actcc atg gat ttt gat gac acg tgg cac cct gcc acc cac cct tct ggg 170Met Asp Phe Asp Asp Thr Trp His Pro Ala Thr His Pro Ser Gly1 5 10 15gct gtc ctt cct gtc ctc aca gct tta gca gaa gcc ctg cca agg agt 218Ala Val Leu Pro Val Leu Thr Ala Leu Ala Glu Ala Leu Pro Arg Ser20 25 30cca aag ttt tct ggc ctt gac ctg ctg ctg gct ttc aat gtt ggt att 266Pro Lys Phe Ser Gly Leu Asp Leu Leu Leu Ala Phe Asn Val Gly Ile35 40 45gaa gtg caa ggc cga tta ctg cat ttc gcc aag gag gcc aat gac atg 314Glu Val Gln Gly Arg Leu Leu His Phe Ala Lys Glu Ala Asn Asp Met50 55 60cca aag aga ttc cat ccc cct tcc gtg gta gga acg ttg ggt agt gct 362Pro Lys Arg Phe His Pro Pro Ser Val Val Gly Thr Leu Gly Ser Ala65 70 75gct gct gca tcc aag ttt tta gga ctt agc tcg aca aag tgc cga gaa 410Ala Ala Ala Ser Lys Phe Leu Gly Leu Ser Ser Thr Lys Cys Arg Glu80 85 90 95gct ctg gcc att gct gtt tcc cat gct ggg gca ccc atg gcc aat gct 458Ala Leu Ala Ile Ala Val Ser His Ala Gly Ala Pro Met Ala Asn Ala100 105 110gcc acc cag acc aag ccc ctc cac att ggc aat gct gcc aag cat ggg 506Ala Thr Gln Thr Lys Pro Leu His Ile Gly Asn Ala Ala Lys His Gly115 120 125ata gaa gct gca ttt ttg gca atg ttg ggt ctc caa gga aac aag cag 554Ile Glu Ala Ala Phe Leu Ala Met Leu Gly Leu Gln Gly Asn Lys Gln130 135 140gtc ttg gac ttg gag gca gga ttt ggg gcc ttt tat gcc aac tat tcc 602Val Leu Asp Leu Glu Ala Gly Phe Gly Ala Phe Tyr Ala Asn Tyr Ser145150 155cca aaa gtc ctt cca agc ata gct tcc tac agt tgg ctg ctg gac cag 650Pro Lys Val Leu Pro Ser Ile Ala Ser Tyr Ser Trp Leu Leu Asp Gln160 165 170 175cag gac gtg gcc ttt aag cgt ttt cct gca cat tta tct acc cac tgg 698Gln Asp Val Ala Phe Lys Arg Phe Pro Ala His Leu Ser Thr His Trp180 185 190gtg gca gac gca gct gca tct gtg aga aag cac ctt gta gca gag aga 746Val Ala Asp Ala Ala Ala Ser Val Arg Lys His Leu Val Ala Glu Arg195 200 205gcc ctg ctt cca act gac tac att aag aga att gtg ctc agg ata cca 794Ala Leu Leu Pro Thr Asp Tyr Ile Lys Arg Ile Val Leu Arg Ile Pro210 215 220aat gtc cag tat gta aac agg ccc ttt cca gtt tcg gag cat gaa gcc 842Asn Val Gln Tyr Val Asn Arg Pro Phe Pro Val Ser Glu His Glu Ala225 230 235cgt cat tca ttc cag tat gtg gcc tgt gcc atg ctg ctt gat ggt ggc 890Arg His Ser Phe Gln Tyr Val Ala Cys Ala Met Leu Leu Asp Gly Gly240 245 250 255atc act gtc ccc tca ttc cat gaa tgc cag atc aac agg cca cag gtg 938Ile Thr Val Pro Ser Phe His Glu Cys Gln Ile Asn Arg Pro Gln Val260 265 270aga gag ctg ctc agt aag gtg gag ctg gag tac cct ccg gac aac ttg 986Arg Glu Leu Leu Ser Lys Val Glu Leu Glu Tyr Pro Pro Asp Asn Leu275 280 285cca agc ttc aac ata ctg tac tgt gaa ata agt gtc acc ctc aag gat 1034Pro Ser Phe Asn Ile Leu Tyr Cys Glu Ile Ser Val Thr Leu Lys Asp290 295 300gga gcc acc ttc aca gat cgc tct gat acc ttc tat ggg cac tgg aga 1082Gly Ala Thr Phe Thr Asp Arg Ser Asp Thr Phe Tyr Gly His Trp Arg305 310 315aaa cca ctg agc cag gag gac cta gag gaa aag ttc aga gcc aat gcc 1130Lys Pro Leu Ser Gln Glu Asp Leu Glu Glu Lys Phe Arg Ala Asn Ala320 325 330 335tcc aag atg ctg tcc tgg gac aca gtg gaa agc ctt ata aag ata gtc 1178Ser Lys Met Leu Ser Trp Asp Thr Val Glu Ser Leu Ile Lys Ile Val340 345 350aaa aat cta gaa gac cta gaa gac tgt tct gtg tta act aca ctt ctc 1226Lys Asn Leu Glu Asp Leu Glu Asp Cys Ser Val Leu Thr Thr Leu Leu355 360 365aaa gga ccc tct cca cca gag gta gct tca aac tct cca gca tgt aat1274Lys Gly Pro Ser Pro Pro Glu Val Ala Ser Asn Ser Pro Ala Cys Asn370 375 380aat tct atc aca aat ctc tcc tgaggcttac caacatctaa atgactttgc 1325Asn Ser Ile Thr Asn Leu Ser385 390atttggggag attcaatgat ttggtttgta aagcaagggt ctgctgcttg gttttcccag 1385gaaaaatgaa caaagatgga gagagtccag aaacagaact acatatatct ggaaggagcc 1445ttctcctgaa aattttgcag gacagttcca cttacctaaa tcaagatgaa acacacacac 1505aaaaatgagt ttgtaagcat tcacaagggt gaaattcaac tcacctgtga tttacttata 1565aaattaatct cttcatagga attatgtgtg gacttcatga gcctcaaggt tttagaggga 1625tgtgaacctg catgtatatt ttctgacagt ggagagggct ctggtgcatt gtgtcaccaa 1685cagatctcct agaccatggc ttattaccaa gccctccaca gtgcaagggg tgctactggg 1745gaatgggtgg gtttaaatcc tgcctctgcc attcactaga tgtagccttg agcatgttac 1805cattagccct ctgcctcagt ttccctattt gtcaagccga agtaaaaagc agtctggaaa 1865aatcgcattt tggctctaga acccatggtc ttaagcactg caatatatca cctttcagta 1925taaaaatatt tgaatcagag ttgcaataaa aaaaaaaaaa aaaaa 1970<210>4<211>390<212>PRT<213>人類(lèi)<400>4Met Asp Phe Asp Asp Thr Trp His Pro Ala Thr His Pro Ser Gly Ala1 5 10 15Val Leu Pro Val Leu Thr Ala Leu Ala Glu Ala Leu Pro Arg Ser Pro
20 25 30Lys Phe Ser Gly Leu Asp Leu Leu Leu Ala Phe Asn Val Gly Ile Glu35 40 45Val Gln Gly Arg Leu Leu His Phe Ala Lys Glu Ala Asn Asp Met Pro50 55 60Lys Arg Phe His Pro Pro Ser Val Val Gly Thr Leu Gly Ser Ala Ala65 70 75 80Ala Ala Ser Lys Phe Leu Gly Leu Ser Ser Thr Lys Cys Arg Glu Ala85 90 95Leu Ala Ile Ala Val Ser His Ala Gly Ala Pro Met Ala Asn Ala Ala100 105 110Thr Gln Thr Lys Pro Leu His Ile Gly Asn Ala Ala Lys His Gly Ile115 120 125Glu Ala Ala Phe Leu Ala Met Leu Gly Leu Gln Gly Asn Lys Gln Val130 135 140Leu Asp Leu Glu Ala Gly Phe Gly Ala Phe Tyr Ala Asn Tyr Ser Pro145 150 155 160Lys Val Leu Pro Ser Ile Ala Ser Tyr Ser Trp Leu Leu Asp Gln Gln165 170 175Asp Val Ala Phe Lys Arg Phe Pro Ala His Leu Ser Thr His Trp Val180 185 190Ala Asp Ala Ala Ala Ser Val Arg Lys His Leu Val Ala Glu Arg Ala195 200 205Leu Leu Pro Thr Asp Tyr Ile Lys Arg Ile Val Leu Arg Ile Pro Asn210 215 220Val Gln Tyr Val Asn Arg Pro Phe Pro Val Ser Glu His Glu Ala Arg225 230 235 240His Ser Phe Gln Tyr Val Ala Cys Ala Met Leu Leu Asp Gly Gly Ile245 250 255Thr Val Pro Ser Phe His Glu Cys Gln Ile Asn Arg Pro Gln Val Arg260 265 270Glu Leu Leu Ser Lys Val Glu Leu Glu Tyr Pro Pro Asp Asn Leu Pro275 280 285Ser Phe Asn Ile Leu Tyr Cys Glu Ile Ser Val Thr Leu Lys Asp Gly290 295 300Ala Thr Phe Thr Asp Arg Ser Asp Thr Phe Tyr Gly His Trp Arg Lys305 310 315 320Pro Leu Ser Gln Glu Asp Leu Glu Glu Lys Phe Arg Ala Asn Ala Ser325 330 335Lys Met Leu Ser Trp Asp Thr Val Glu Ser Leu Ile Lys Ile Val Lys340 345 350Asn Leu Glu Asp Leu Glu Asp Cys Ser Val Leu Thr Thr Leu Leu Lys355 360 365Gly Pro Ser Pro Pro Glu Val Ala Ser Asn Ser Pro Ala Cys Asn Asn370 375 380Ser Ile Thr Asn Leu Ser385 390<210>5<211>652<212>DNA<213>人類(lèi)<220><221>CDS<222>(56)..(307)<400>5ggcaccaggc gcaccgcccg gcgtccagat ttggcaattc ttcgctgaag tcatc atg 58Met1agc ttt ttc caa ctc ctg atg aaa agg aag gaa ctc att ccc ttg gtg 106Ser Phe Phe Gln Leu Leu Met Lys Arg Lys Glu Leu Ile Pro Leu Val5 10 15gtg ttc atg act gtg gcg gcg ggt gga gcc tca tct ttc gct gtg tat 154Val Phe Met Thr Val Ala Ala Gly Gly Ala Ser Ser Phe Ala Val Tyr20 25 30tct ctt tgg aaa acc gat gtg atc ctt gat cga aaa aaa aat cca gaa 202Ser Leu Trp Lys Thr Asp Val Ile Leu Asp Arg Lys Lys Asn Pro Glu35 40 45cct tgg gaa act gtg gac cct act gta cct caa aag ctt ata aca atc 250Pro Trp Glu Thr Val Asp Pro Thr Val Pro Gln Lys Leu Ile Thr Ile50 55 60 65aac caa caa tgg aaa ccc att gaa gag ttg caa aat gtc caa agg gtg 298Asn Gln Gln Trp Lys Pro Ile Glu Glu Leu Gln Asn Val Gln Arg Val70 75 80acc aaa tgacgagccc tcgcctcttt cttctgaaga gtactctata aatctagtgg354Thr Lysaaacatttct gcacaaacta gattctggac accagtgtgc ggaaatgctt ctgctacatt 414tttagggttt gtctacattt tttgggctct ggataaggaa ttaaaggagt gcagcaataa 474ctgcactgtc taaaagtttg tgcttatttt cttgtaaatt tgaatattgc atattgaaat 534ttttgtttat gatctatgaa tgtttttctt aaaatttaca aagctttgta aattagattt 594tctttaataa aatgccattt gtgcaagatt tctcaaagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 652<210>6<211>83<212>PRT<213>人類(lèi)<400>6Met Ser Phe Phe Gln Leu Leu Met Lys Arg Lys Glu Leu Ile Pro Leu1 5 10 15Val Val Phe Met Thr Val Ala Ala Gly Gly Ala Ser Ser Phe Ala Val20 25 30Tyr Ser Leu Trp Lys Thr Asp Val Ile Leu Asp Arg Lys Lys Asn Pro35 40 45Glu Pro Trp Glu Thr Val Asp Pro Thr Val Pro Gln Lys Leu Ile Thr50 55 60Ile Asn Gln Gln Trp Lys Pro Ile Glu Glu Leu Gln Asn Val Gln Arg65 70 75 80Val Thr Lys<210>7<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列NLG-2正向引物<400>7cacggatcca ttcttcgctg aagtcatcat gagc 34<210>8<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列NLG-2反向引物<400>8gtggaattct ttggtcaccc tttggacatt ttgc 34<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列NLG-1-1正向引物<400>9cacggatcct tctttacaac gaaatgatgc tcaag 35<210>10<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列NLG-1-1反向引物<400>10gtggaattcg gagagatttg tgatagaatt attacatgc 39
權(quán)利要求
1.含有由序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體或其片段。
2.編碼權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體的基因。
3.權(quán)利要求2記載的基因，其是由序列表中序列號(hào)1表示的堿基序列中的第37位～1479位堿基組成的堿基序列構(gòu)成的。
4.含有權(quán)利要求2或3記載的基因的質(zhì)粒。
5.含有權(quán)利要求4記載的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。
6.抗體或其片段，其特征是可與權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)改變體進(jìn)行特異反應(yīng)。
7.細(xì)菌感染癥的檢測(cè)方法，其特征是分析被檢測(cè)樣品中的含有由序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體或它們的mRNA。
8.權(quán)利要求7記載的檢測(cè)方法，其中細(xì)菌感染癥是敗血病。
9.可以與序列表中序列號(hào)1表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交的多核苷酸。
10.含有由序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體或其片段。
11.編碼權(quán)利要求10記載的蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體的基因。
12.權(quán)利要求11記載的基因，其是由序列表中序列號(hào)3表示的堿基序列中的第126位～1295位堿基組成的堿基序列構(gòu)成的。
13.含有權(quán)利要求11或12記載的基因的質(zhì)粒。
14.含有權(quán)利要求13記載的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。
15.抗體或其片段，其特征是可與權(quán)利要求10記載的蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)改變體進(jìn)行特異反應(yīng)。
16.細(xì)菌感染癥的檢測(cè)方法，其特征是分析被檢測(cè)樣品中的含有由序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體或它們的mRNA。
17.權(quán)利要求16記載的檢測(cè)方法，其中細(xì)菌感染癥是敗血病。
18.可以與序列表中序列號(hào)3表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交的多核苷酸。
19.含有由序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體或其片段。
20.編碼權(quán)利要求19記載的蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體的基因。
21.權(quán)利要求20記載的基因，其是由序列表中序列號(hào)5表示的堿基序列中的第56位～第304位堿基組成的堿基序列構(gòu)成的。
22.含有權(quán)利要求20或21記載的基因的質(zhì)粒。
23.含有權(quán)利要求22記載的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。
24.抗體或其片段，其特征是可與權(quán)利要求19記載的蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)改變體進(jìn)行特異反應(yīng)。
25.細(xì)菌感染癥的檢測(cè)方法，其特征是分析被檢測(cè)樣品中的含有由序列表中序列號(hào)6表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其功能等價(jià)的改變體或它們的mRNA。
26.權(quán)利要求25記載的檢測(cè)方法，其中細(xì)菌感染癥是敗血病。
27.可以與序列表中序列號(hào)5表示的堿基序列構(gòu)成的mRNA特異雜交的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明概述了一組新蛋白質(zhì)、編碼該組蛋白質(zhì)的新基因、分別含有上述新基因的質(zhì)粒組、分別含有上述各個(gè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體、針對(duì)上述新的各個(gè)蛋白質(zhì)的抗體或其片段、細(xì)菌感染癥的檢測(cè)方法以及新的多肽。上述各個(gè)新的蛋白質(zhì)是對(duì)活化的人巨噬細(xì)胞特異的蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1426420SQ01808399
公開(kāi)日2003年6月25日 申請(qǐng)日期2001年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月21日
發(fā)明者廣瀨國(guó)孝, 酒井潤(rùn) 申請(qǐng)人:吳羽化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社