專利名稱：Igf－1的結(jié)晶的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)的結(jié)晶形式，更具體的涉及人類IGF-1晶體，一種關(guān)于其結(jié)晶的方法和用x射線衍射所得到的結(jié)構(gòu)。此外，本發(fā)明還涉及基于生理和生化數(shù)據(jù)的識(shí)別新IGF-1拮抗劑分子的方法，該方法表明與已知對(duì)IGF-1結(jié)合蛋白(IGFBP)相互作用重要的殘基接觸的單去污劑分子與IGF-1特異性結(jié)合，并阻止IGFBP-1和IGFBP-3的結(jié)合。
相關(guān)公開(kāi)的描述有大量文獻(xiàn)報(bào)道了IGFs(IGF-1，IGF-2和IGF變體)的活性和反應(yīng)。人類IGF-1是一種有70個(gè)氨基酸的血清蛋白且分子量為7649D，等電點(diǎn)pI是8.4(Rinderknecht和Humbel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，732365(1976)；Rinderknecht和Humbel，J.Biol.Chem.，2532769(1978))并屬于具有胰島素樣和促有絲分裂生物活性的，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素(GH)作用的促生長(zhǎng)因子家族。(Van Wyk等，RecentProg.Horm.Res.，30259(1974)；Binoux，Ann.Endocrinol.，41157(1980)；Clemmons和Van Wyk，Handbook Exp.Pharmacol.，57161(1981)；Baxter，Adv.Clin.Chem.，2549(1986)；美國(guó)專利號(hào)4,988,675；WO 91/03253；WO 93/23071)。IGFs與胰島素有高度序列相似性，大約有49％的相似性。然而，與作為含有被稱作c-肽的33個(gè)氨基酸片段的前體蛋白合成的胰島素不同(它被切除后產(chǎn)生一個(gè)由剩下的A鏈和B鏈共價(jià)連接形成二聚體)，IGFs是單鏈多肽(見(jiàn)

圖1)。
在正在發(fā)育的胚胎中，IGF-1的缺失將導(dǎo)致嚴(yán)重的生長(zhǎng)推遲并延續(xù)到出后以后(Baker等，Cell，7573-82(1993)；Powell-Braxton等，Genes&Development，72609-2617(1993)；Liu等，Cell，7559-72(1993)；Liu等，Molecular Endocrinol.，121452-1462(1998))。然而大部分的血清IGF-1(超過(guò)75％)是由肝臟應(yīng)答生長(zhǎng)激素而產(chǎn)生的，現(xiàn)已證明由肝臟產(chǎn)生的IGF-1對(duì)于老鼠出生后的生長(zhǎng)不是必需的(Sjogren等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，967088-7092(1999))。然而，局部產(chǎn)生的以旁分泌和自分泌的方式發(fā)揮作用的非肚IGF-1似乎承擔(dān)了出生后大部分的IGF-1促進(jìn)生長(zhǎng)的作用(Schlechter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837932-7934(1986)；Isaksson等，Science，2161237-1239(1982))。與它的生長(zhǎng)促進(jìn)作用相一致，IGF-1是一個(gè)很強(qiáng)的有絲分裂原，它調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能如細(xì)胞周期進(jìn)程，凋亡和細(xì)胞分化(LeRoith，Endocrinology，1411287-1288(2000))。
IGFs涉及各種不同的細(xì)胞功能和疾病進(jìn)程，包括細(xì)胞周期進(jìn)程，增殖，細(xì)胞分化和在胰島素抗性糖尿病中有類似胰島素的作用。因此，建議IGF在各種疾病和損傷中IGF用作一種治療工具(關(guān)于綜述，見(jiàn)Lowe，Scientific American(3月/4月1996)，p.62)。由于有這些活性范圍，已經(jīng)在哺乳動(dòng)物中檢測(cè)了IGF-1廣泛的完全不同的用途，腎紊亂治療，糖尿病治療，全身異常代謝狀態(tài)的恢復(fù)如與艾滋病有關(guān)的身體消耗，心臟病治療如心肌缺血，以及神經(jīng)紊亂的治療(Guler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，854889-4893(1998)；Schalch等，J.Clin.Metab.，771563-1568(1993)；Froesch等，Horm.Res.，4266-71(1994)；Vlachopapadopoulou等，J.Clin.Endo.Metab.，123715-3723(1995)；Saad等，Diabetologia，37Abstract 40(1994)；Schoenle等，Diahetologia，34675-679(1991)；Morrow等，Diabetes，42(Suppl.)269(1993)(摘要)；Kuzuya等，Diabetes，42696-705(1993)；Schalch等，“重組人胰島素樣生長(zhǎng)因子(rhIGF-I)在II型糖尿病中的短期代謝作用“Short-term metabolic effects of recombinant human insulin-like growthfactor I(rhIGF-I)in type II diabetes mellitus”，inSpencer EM編，胰島素樣生長(zhǎng)因子的現(xiàn)代概念(New YorkElsevier1991)pp.705-715；Zenobi等，J.Clin.Invest.，902234-2241(1993)；Elahi等，“人體中對(duì)人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)的血液動(dòng)力學(xué)的和代謝反應(yīng)”inModern Concepts of Insulin-Like GrowthFactors，Spencer，EM編(ElsevierNew York，1991)，pp.219-224；Quinn等，NewEngl.J.Med.，3231425-1426(1990)；Schalch等，“Short-term metabolic effectsof recombinanat human insulin-like growth factorl(rhIGF-I)in type IIdiabetes mellitus”inSpencer EM，所編的Modern Concepts of Insulin-likegrowth factors(New YorkElsevier1991)pp.705-714；Schoenle等，Diabetologia，34675-679(1991)；Usala等，N.Eng.J.Med.，327853-857(1992)；Lieberman等，J.Clin.Endo.Metab.，7530-36(1992)；Zenobi等，J.Clin.Invest.，902234-2241(1992)；Zenobi等，J.Clin.Invest.，891908-1913(1992)；Kerr等，J.Clin.Invest.，91141-147(1993)；Jabri等，Diabetes，43369-374(1994)；Duerr等，J.Clin.Invest.，95619-627(1995)；Bondy，Ann Intern.Med.，120593-601(1994)；Hammerman和Miller，Am.J.Physiol.，265F1-F14(1993)；Hammerman和Miller，J.Am.Soc.Nephrol.，51-11(1994)；和Barinaga等，Science，264772-774(1994))。
也有大量的專利文獻(xiàn)公開(kāi)了IGF-1或能增加IGF-1活性濃度的化合物的各種不同用途以治療哺乳動(dòng)物，具體是人類患者，例如，美國(guó)專利號(hào)5,714,460；5,273,961；5,466,670；5,126,324；5,187,151；5,202,119；5,374,620；5,106,832；4,988,675；5,106,832；5,068,224；5,093,317；5,569,648和4,876,242；WO 92/11865；WO 96/01124；WO 91/03253；WO 93/25219；WO 93/08826和WO 94/16722。
IGF系統(tǒng)還包括IGF-1，IGF-2和胰島素的膜結(jié)合受體。I型IGF受體(IGF-1R)與胰島素受體在結(jié)構(gòu)上緊密相關(guān)且共享一些信號(hào)通路(Jones和Clemmons，Endocr.Rev.，163-34(1995))。IGF-2受體是一種似乎不能轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的清除受體(Jones和Clemmons，同上)。因?yàn)镮GF-1和IGF-2與IGF-1R以比胰島素受體更高的親和性結(jié)合，因此很有可能IGF-1和IGF-2的大部分效用是通過(guò)IGF-1R介導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)的(Humbel，Eur.J Biochem.190445-462(1990)；Ballad等，“是否IGF-1曾經(jīng)通過(guò)胰島素受體起作用”，in Baxter等(編)，胰島素樣生長(zhǎng)因子和它們的調(diào)節(jié)蛋白，The Insul in-Like Growth Factors and Their Regulatory Proteins，(AmsterdamElsevier，1994)，pp.131-138)。
IGF-1R是一種由二硫鍵連接α和β亞基的α2β2的異源四聚體。αβ二聚體本身是由二硫鍵連接在細(xì)胞表面已形成共價(jià)異源四聚體。在胰島素/胰島素受體復(fù)合物中，IGF-1與IGF-1R以化學(xué)計(jì)量比1∶2結(jié)合(De Meyts，Diabetologia，37S135-S148(1994))，并有一個(gè)高親和性位點(diǎn)(Kd大約是0.4nM)和一個(gè)低親和性位點(diǎn)(Kd大約是0.6nM)(Tollefsen和Thompson，J.Biol.Chem.，26316267-16273(1998))。測(cè)定了IGF-1R的最初三個(gè)結(jié)構(gòu)域的x射線晶體結(jié)構(gòu)(Garrett等，Nature，394，395-399(1998))。它包括三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域(L1，半胱氨酸富集區(qū)，L2)。影響IGF-1結(jié)合的突變將改變受體表面的結(jié)合凹槽。
突變影響IGF-1對(duì)受體凹面的結(jié)合圖譜。
IGF-1R在正常細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育中是個(gè)關(guān)鍵因子(Isaksson等，EndocrineReviews，8426-438(1987)；Daughaday和Rotwein，Endocrine Rev.，1068-91(1989))。然而，有越來(lái)越多的證據(jù)表明IGF-1R的信號(hào)也在癌細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成中起關(guān)鍵作用(Baserga，Cancer Res.，55249-252(1995))。關(guān)鍵的例子包括通過(guò)用IGF-1R的反義RNA治療的鼠癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的損失表型(Long等，Cancer Res.，551006-1009(1995))和體外人類黑素瘤細(xì)胞移動(dòng)性受到抑制(Stracke等，J Biol.Chem.，26421554-21559(1989))以及通過(guò)添加IGF-1R抗體使人類乳房癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制(Rohlik等，Biochem.Biochem.Biophys.Res.Commun.，149276-281(1987))。
基于IGF-1能在體外促進(jìn)乳房癌細(xì)胞增殖的觀察得出IGFs是潛在的乳房癌細(xì)胞有絲分裂素(Cullen等，Cancer Res.，5048-53(1990))。乳房癌表達(dá)IGF-2和IGF-1R，并能給所有必需的效應(yīng)物提供一種自分泌環(huán)基礎(chǔ)的增殖的范例(Quinn等，JBiol.Chem.，27111477-11483(1996)；Steller等，Cancer Res.，561761-1765(1996))。因?yàn)槿榉堪┦且环N常見(jiàn)的惡性腫瘤影響了大約八分之一的女性并且是北美女性癌癥患者中首要的致死因素(LeRoith等，Ann.Int.Med.，12254-59(1995))，新的合理治療手段需要介入治療。IGF-1能抑制凋亡，并因此使缺乏IGF-1Rs或含有IGF-1R信號(hào)通路的細(xì)胞可能引起腫瘤細(xì)胞選擇性的通過(guò)凋亡而死去(Long等，Cancer Res.，551006-1009(1995))。而且，最近有證據(jù)表明在其他疾病的情況下，如糖尿病中的IGF信號(hào)的改變可能是使視網(wǎng)膜疾病(Smith等，Science，2761706-1709(1997))和腎病(Horney等，Am.J Phvsiol.274F1045-F1053(1998))并發(fā)癥加劇的主要原因。
體內(nèi)的IGF-1通常是可以在混有一個(gè)至少有六種血清蛋白，認(rèn)為是能調(diào)節(jié)IGFs進(jìn)入到IGF-1R中的IGFBPs家族的復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)的(Jones和Clemmons，同上；Bach和Rechler，DiabetesReviews，338-61(1995))。它們還在循環(huán)中和組織IGF-1R水平上調(diào)節(jié)IGF-1和IGF-2的濃度(Clemmons等，Anal.NY Acad.Sci.USA，69210-21(1993))。IGFBPs以變化的親和力和特異性與IGF-1和IGF-2結(jié)合(Jones和Clemmons，同上；Bach和Rechler，同上)。例如，IGFBP-3用相似的親和性與IGF-1和IGF-2結(jié)合，然而IGFBP-2和IGFBP-6則用比它們結(jié)合IGF-1更高的親和力與IGF-2結(jié)合(Bach和Rechler，同上；Oh等，Endocrinology，132，1337-1344(1993))。主要的載體蛋白是IGFBP-3?，F(xiàn)在還不知道在這些IGF-I及其IGFBP的和物中結(jié)合的化學(xué)劑量，這是因?yàn)橛捎谔腔鴮?dǎo)致復(fù)合物的不均一的大小。
IGF-1是在人體液中自然產(chǎn)生的，例如，在血和人腦脊液中。盡管IGF-1可以在許多組織中產(chǎn)生，據(jù)信，最具流動(dòng)性的IGF-1是在肝臟中合成的。據(jù)信，IGFBPs用認(rèn)為作為糖代謝過(guò)程中主要的結(jié)合蛋白的IGFBP-I調(diào)節(jié)IGF-1的生物學(xué)活性(Jones和Clemmons，同上)，(Baxter，“IGF結(jié)合蛋白的生理角色”，“Physiologicalroles of IGF binding proteins”，in Spencer所編的，胰島素樣生長(zhǎng)因子的現(xiàn)代概念(Modern Concepts of Insulin-like Growth Factors(Elsevier，New York，1991))，pp.371-380)。由肝臟產(chǎn)生的IGFBP-1受到營(yíng)養(yǎng)狀況的調(diào)節(jié)，而胰島素直接抑制它的產(chǎn)量(Suikkari等，J.Clin.Endocrinol.Metab.，66266-272(1998))。
體內(nèi)IGFBP-1的功能則有很少的了解。給老鼠服用已純化的人類IGFBP-1證明會(huì)導(dǎo)致急性、但很小的血糖升高(Lewitt等，Endocrinology，1292254-2256(1991))。對(duì)IGFBP-1的調(diào)節(jié)多少有更好的理解。有人提出當(dāng)血糖升高并且胰島素開(kāi)始分泌時(shí)，則IGFBP-1受到抑制，如果允許“游離”IGF-1水平緩慢升高，則有助于胰島素作用于葡萄糖運(yùn)輸。這個(gè)提議認(rèn)為IGFBP-1的作用是直接調(diào)節(jié)血糖。
在大部分情況下，添加外源IGFBP會(huì)降低IGF-1的作用。例如，雌二醇對(duì)MCF-7人乳房癌細(xì)胞的生長(zhǎng)刺激效果是與IGFBP-3mRNA以及蛋白的積累的減少有關(guān)，然而雌激素的拮抗劑ICI 182780則導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制和IGFBP-3mRNA以及蛋白水平的上升(Huynh等，J Biol.Chem.，2711016-1021(1996)；Oh等，Prog.Growth FactorRes.，6503-512(1995))。有報(bào)道用視黃酸抑制體外乳房癌細(xì)胞的增殖可能包括改變腫瘤細(xì)胞IGFBP的分泌或減少體內(nèi)IGF-1的循環(huán)水平(LeRoith等，Ann.Int.Med.，12254-59(1995)；Oh等，(1995)，同上)。與此發(fā)現(xiàn)相反的是，用抗雌激素三苯氧胺處理MCF-7細(xì)胞會(huì)減少IGF-1R的信號(hào)通路但這種行為又與IGFBP的產(chǎn)量減少無(wú)關(guān)(Lee等，J Endocrinol.，15239(1997))。其它支持IGFBP的通常的抗細(xì)胞增殖作用是人們驚奇的發(fā)現(xiàn)IGFBP-3是一種腫瘤抑制因子p53的靶基因(Buckbinder等，Nature，377646-649(1995))。這表明p53的抑制活性部分地通過(guò)IGFBP-3的生產(chǎn)和隨后IGF作用的阻抑介導(dǎo)。(Buckbinder等，同上)。這些結(jié)果表明IGFBPs通過(guò)調(diào)節(jié)由IGF-1/IGF-2調(diào)控的旁分泌/自分泌過(guò)程而阻抑細(xì)胞增殖。這些觀察的必然結(jié)果是發(fā)現(xiàn)前列腺特定抗原(PSA)是一個(gè)IGFBP-3蛋白酶，它一旦激活，則會(huì)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)由于蛋白酶解使IGFBP-3失活的IGF-1/IGF-2反應(yīng)的敏感程度(Cohen等，J.Endocr.，142407-415(1994))。IGFBP與IGF-1/IGF-2復(fù)合并干擾IGF-1/IGF-2進(jìn)入IGF-1Rs(Clemmons等，Anal.NY Acad.Sci.USA，69210-21(1993))。IGFBP-1，-2和3在體外依次加入細(xì)胞中以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。(Lee等，JEndocrinol.，15239(1997)；Feyen等，JBiol.Chem.，26619469-19474(1991))。進(jìn)而，都已證明了IGFBP-1(McGuire等，J Natl.Cancer Inst.，841335-1341(1992)；Figueroa等，J Cell Physiol.，157229-236(1993))，IGFBP-3(Oh等(1995)，同上；Pratt和Pollak，Biophys.Res.Commun.，198292-297(1994))和IGFBP-2有抑制IGF-1或體外在納摩爾濃度水平上由雌激素誘導(dǎo)的乳房癌細(xì)胞增殖。這些發(fā)現(xiàn)支持一種意見(jiàn)即IGFBPs是潛在的IGF反應(yīng)的拮抗劑。還有證據(jù)表明獨(dú)立于與IGF的相互作用，IGFBP-3通過(guò)其自身的細(xì)胞體面受體對(duì)細(xì)胞的直接作用(Oh等，JBiol.Chem.，26814964-14971(1993)；Valentinis等，Mol.Endocrinol.，9361-367(1995))。綜合考慮，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了IGF和IGF-1R用于治療用途的靶蛋白的重要性。
IGFs對(duì)于正常的和已轉(zhuǎn)化的前列腺上皮細(xì)胞有促有絲分裂和抗凋亡的作用(Hsing等，Cancer Research，565146(1996)；Culig等，Cancer Research，545474(1994)；Cohen等，Hormone and Metabolic Research，2681(1994)；Iwamura等，Prostate，22243(1993)；Cohen等，J.Clin.Endocrin.&Metabol.，73401(1991)；Rajah等，J.Biol.Chem.，27212181(1997))。大部分循環(huán)中的IGF-1起源于肝臟，但是IGF在組織中的生物活性不僅涉及循環(huán)中的IGF-1和IGFBPs的水平，還涉及IGFs，IGFBPs和IGFBP蛋白酶的局部產(chǎn)量(Jones和Clemmons，EndocrineReviews，163(1995))。循環(huán)中的IGF-1和IGFBP-3(主要的循環(huán)中的IGFBPs(Jones和Clemmons，同上))的水平人與人之間的差異是巨大的(Juul等，J.Clin.Endocrinol&Metabol.，78744(1994)；Juul等，J.Clin.Endocrinol.&Metabol.，802534(1995))，并且血清中IGF-1水平的不均一性似乎反映了組織中IGF生物活性的不均一性。與IGF-軸組分有關(guān)的標(biāo)記可作為前列腺癌的危險(xiǎn)指標(biāo)，正如PSA有相似的用途(WO 99/38011)。
與大部分其它生長(zhǎng)因子不同，IGFs在循環(huán)中是有很高濃度的，但是僅有很小一部分的IGFs不與蛋白結(jié)合。例如，通常知道在人類和老鼠中，血液中不足1％的IGF是游離的或未結(jié)合的形式存在的(Juul等，Clin.Endocrinol.，44515-523(1996)；Hizuka等，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，151-55(1991)；Hasegawa等，J.Clin.Endocrinol.Metab.，803284-3286(1995))。血液中占?jí)旱苟鄶?shù)的IGF作為非共價(jià)結(jié)合的三元復(fù)合物的部分循環(huán)，該三元復(fù)合物由IGF-1或IGF-2，IGFBP-3和稱為酸-不穩(wěn)定亞基(ALS)的大蛋白組成。IGF，IGFBP-3和ALS的三元復(fù)合物的分子量大約是150,000d，并暗示此復(fù)合物在循環(huán)中的功能可能是作為IGF-1和IGF-2的一個(gè)蓄水池和緩沖液，以避免在游離的IGF-1或IGF-2中發(fā)生快速變化。
已經(jīng)有很多工作鑒定IGF-1和IGF-2中與IGFBPs結(jié)合的區(qū)域(Bayne等，J.Biol.Chem.，26515648-15652(1990)；Dubaquie和Lowman，Biochemistry，386386-6396(1999)；和美國(guó)專利號(hào)5,077,276；5,164,370；5,470,828)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IGF-1和IGF-2的N端區(qū)域?qū)τ诮Y(jié)合IGFBPs是至關(guān)重要的(美國(guó)專利號(hào)5,077,276；5,164,370和5,470,828)。因此，被稱作des(1-3)IGF-1，自然的IGF-1的能難與IGFBPs結(jié)合。
相似的大量的研究致力于鑒定結(jié)合IGF-1R的IGF-1和IGF-2區(qū)域(Bayne等，同上；Oh等，Endocrinology(1993)，同上)。還發(fā)現(xiàn)IGF-1中的在24，31和60位的酪氨酸殘基對(duì)于IGF-1結(jié)合IGF-1R是至關(guān)重要的(Bayne等，同上)。其中一個(gè)或多個(gè)這些氣酪氨酸殘基被置換的突變體IGF-1分子顯示與IGF-1R的結(jié)合逐漸減少。Bayne等，同上，還研究了IGF-1的這些突變體是否還能與IGF-1R和IGFBPs結(jié)合。他們發(fā)現(xiàn)用于結(jié)合到IGFBP的IGF-1和IGF-2上的殘基與那些用于結(jié)合到IGF-1R的殘基很不相同。因此有可能產(chǎn)生與IGFBPs的結(jié)合減少的IGF變體，但是，因?yàn)樗麄兡芎芎玫嘏cIGF-1R結(jié)合，通過(guò)體外的活性分析表明他們?nèi)跃S持活性。
還報(bào)道了與IGFBPs結(jié)合但是不與IGF受體結(jié)合的IGF變體并因此在體外的活性分析中表明其活性下降(Bar等，Endocrinology，1273243-3245(1990))。在這個(gè)被稱作(1-27，gly4，38-70)-hIGF-1的變體中，人IGF-1的C區(qū)中殘基28-37由四-殘基甘氨酸橋所替代。
公開(kāi)了其他的已截短的IGF變體。例如，在專利文獻(xiàn)WO 96/33216中描述了含有真正的IGF-1的殘基1-69的已截短的IGF變體。EP 742,228公開(kāi)了雙鏈IGF-1超拮抗劑，它們是天然發(fā)生的含有縮短C區(qū)的單鏈IGF-1的衍生物。IGF-1類似物的通用式BCn，A，此處B是IGF-1的B區(qū)或是其功能類似物，C是IGF-1的c-區(qū)或是其功能上的類似物，n是在C區(qū)中的氨基酸數(shù)目，大約是6到12，A是IGF-1的A區(qū)或是其功能類似物。
此外，Cascieri等，Biochemistry，273229-3233(1998)中公開(kāi)了IGF-1的四個(gè)突變體，其中的三個(gè)具有對(duì)IGF-1R降低的的親和力。這些突變體是(Phe23，Phe24，Tyr25)IGF-1(它和人IGF-1對(duì)1和2型IGF和胰島素受體的親和力是相等的)，(Leu24)IGF-1和(Ser24)IGF-1(它們與人胎盤IGF-1R，胎盤胰島素受體和大鼠以及小鼠細(xì)胞的IGF-1R的親和性比IGF-1低)和desoctapeptide(Leu24)IGF-1(其中在24位上芳香性的損失與hIGF-1的羧基未端D-區(qū)缺失結(jié)合，對(duì)于IGF-1R它具有比(Leu24)IGF-1低的親和性，但對(duì)于胰島素類受體它具有較高的親和性。這四種突變體對(duì)人類血清結(jié)合蛋白有正常的親和性。
Bayne等，J.Biol.Chem.，2636233-6239(1988)公開(kāi)了種人IGF-1的4種結(jié)構(gòu)同等物一種B-鏈突變體，其中IGF-1的最初16個(gè)氨基酸為胰島素B-鏈的最初17個(gè)氨基酸所取代，(Gln3，Ala4)IGF-1，(Tyr15、Len16)IGF-1和(Gln3，Ala4，Tyr15Len16)IGF-1。這些研究鑒別了負(fù)責(zé)保持與血清結(jié)合蛋白和I型IGF受體結(jié)合的高親和性的一些IGF-1的區(qū)域。
在另一次研究中，Bayne等，J.Biol.Chem.，26411004-11008(1988)公開(kāi)了IGF-1的三種結(jié)構(gòu)同等物(1-62)IGF-1，它缺少IGF-1的羧基末端8個(gè)氨基酸的D-區(qū)；(1-27，Gly4，38-70)IGF-1，其中IGF-1的C-區(qū)的殘基28-37由一個(gè)四殘基的甘氨酸橋所替代；(1-27，Gly4，38-62)IGF-1，具有一個(gè)C區(qū)的甘氨酸取代和一個(gè)D-區(qū)缺失。Peterkofsky等，Endocrinology，1281769-1779(1991)公開(kāi)了使用Bayne等，同上(vol.264)的Gly4突變體的數(shù)據(jù)。
Cascieri等，J.Biol.Chem.，2642199-2202(1989)公開(kāi)了三個(gè)IGF-1類似物，其中IGF-1的A區(qū)中特異性殘基由胰島素A鏈的相應(yīng)殘基替代。該(Ile41，Glu45，Gln46，Thr49，Ser50，Ile51，Ser53，Tyr55，Gln56)IGF-1，A鏈突變體，adw第41位殘基由蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼岵⑶褹區(qū)的第42-56位的殘基也被替代；(Thr49，Ser50，Ile51)IGF-1；和(Tyr55，Gln56)IGF-1.
Clemmons等，J.Biol.Chem.，26512210-12216(1990)公開(kāi)了運(yùn)用或是與IGF-1R的親和力降低或是與結(jié)合蛋白的親和力降低的IGF-1類似物來(lái)研究IGFBP-1的配體特異性和IGFBP-1在調(diào)節(jié)IGF-1生物活性中的作用。
除了天然IGFBP，WO94/04569公開(kāi)了特異性結(jié)合分子，該分子它能結(jié)合IGF-1并能增強(qiáng)IGF-1的生物活性。
與IGFBP-1結(jié)合的多肽，阻抑IGF-1與此結(jié)合蛋白結(jié)合，并因此從最近描述的IGF-1和IGFBP-1的混合物中釋放出“游離的IGF”活性，(Lowman等，Biochmeistry，378870-8878(1998)；WO 98/454271998年10月15日出版；Lowman等，國(guó)際兒科腎病聯(lián)合會(huì)，第五次關(guān)于患有慢性腎衰竭的兒童的發(fā)育和生長(zhǎng)的討論會(huì)(紐約，1999年3月13日))。還有描述的是天然分子，des(1-3)IGF-1，它顯示選擇性地降低一些對(duì)IGF結(jié)合蛋白的親和性，但仍然維持對(duì)IGF受體的親和性(美國(guó)專利號(hào)5,077,276；5,164,370；5,470,828)。
然而，由于缺乏特異性拮抗劑，使得IGF與IGFBP的相互作用在篩選、預(yù)防或治療疾病中的利用受到限制。迄今，只知只有一篇文獻(xiàn)描述了IGF-1/IGF-2拮抗劑作為癌癥治療中潛在的制療添加劑的應(yīng)用，(Pietrzkowski等，Cancer Res.，526447-6451(1992))。在那篇報(bào)道中，對(duì)應(yīng)于IGF-1的D區(qū)的肽是作為IGF-1/2的拮4抗劑而合成的。此肽展示出可疑的抑制IGF-1的活性。所觀察到的抑制作用的基礎(chǔ)并不清楚，因?yàn)樵谂cIGF-1R結(jié)合的過(guò)程中D區(qū)并不扮演一個(gè)非常重要的角色，而寧可說(shuō)是，在IGF-1結(jié)合胰島素受體的過(guò)程中不起重要作用(Cooke等，Biochem.，305484-5491(1991)；Bayne等，同上(Vol.264)；Yee等，Cell Growthand Different.，573-77(1994))。
WO 00/23469公開(kāi)了解釋IGF-IGFBP結(jié)合的部分IGFBP和IGF肽，如一段分離的IGFBP的IGF結(jié)合區(qū)域或其變體它們結(jié)合IGF的親和性至少與全長(zhǎng)的IGFBP相同。該專利申請(qǐng)還公開(kāi)了減少IGF與其受體結(jié)合和/或與IGFBP的結(jié)合區(qū)域結(jié)合的IGF拮抗劑。
此外，EP 639981公開(kāi)了含有作為IGF-1受體拮抗劑的短肽的藥物組合物。在藥物組合物中使用的這些肽少于25個(gè)氨基酸組成，并至少含有IGF-1的c或D區(qū)中的一部分，并能抑制由IGF-1誘導(dǎo)的IGF-1受體自磷酸化。
包括IGF分子的多肽具有由一級(jí)氨基酸序列和多肽的周圍環(huán)境決定的三維結(jié)構(gòu)。此三維結(jié)構(gòu)建立了多肽的活性、穩(wěn)定性、結(jié)合親和力、結(jié)合特異性和其他生化特征。因此，一個(gè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的知識(shí)能在設(shè)計(jì)以可溶解或膜結(jié)合的形式來(lái)模擬、抑制或改進(jìn)其生物活性的試劑中提供很多指導(dǎo)。
多肽的三維結(jié)構(gòu)可許多方法測(cè)定。許多最精確的方法使用X射線晶體分析法(Van Holde，Physical Biochemistry(Prentice HallN.J.，1971)，pp.221-239)。這項(xiàng)技術(shù)依賴于晶格對(duì)于X射線或其他射線形式衍射的能力。典型地，適合確定大分子三維結(jié)構(gòu)的衍射實(shí)驗(yàn)需要高質(zhì)量的晶體。不幸的是，對(duì)于IGF-1以及許多其它感興趣的蛋白質(zhì)還沒(méi)有得到這種晶體。例如，已描述了用于M-CSF(EP668,914B1)，CD40配體(WO 97/00895)和BC2Fab片段(WO 99/01476)的晶體。
胰島素的結(jié)晶是一項(xiàng)研究透徹的領(lǐng)域，無(wú)論是致力于結(jié)構(gòu)分析(Adams等，Nature，224491(196))還是在藥物應(yīng)用方面。用于治療的胰島素晶體懸浮液的例子包括在中性pH下0.8-25％的鋅存在的條件下(基于胰島素的重量)穩(wěn)定并顯示延遲作用的菱形鋅-胰島素晶體懸浮液，以及以小桿狀的形式用于延遲作用產(chǎn)物的同型胰島素魚(yú)精蛋白晶體。還知道胰島素的一些其它晶體修飾，但是迄今為止，這些只用于X-射線結(jié)構(gòu)分析。因此，在酸性pH條件下已得到?jīng)]有鋅的正交晶體和單斜晶體(Einstein和Low，Acta Crystallogr.，1532-34(1962))。分類于立體空間類群的更小的正交十二面體也在沒(méi)有鋅的情況下已在等電點(diǎn)處獲得。最后，胰島素的單斜體晶體在鋅和酚及酚的衍生物存在的情況下，在高于等電點(diǎn)處得到晶體的。這些晶體在幾天之內(nèi)便長(zhǎng)成很大的體積(可達(dá)3mm)并有鋒利的邊。有趣的是，這些晶體只能在玻璃表面中發(fā)現(xiàn)而不能在溶液的自由表面中發(fā)現(xiàn)。晶體懸浮液和其他胰島素制劑的結(jié)晶形式以及胰島素的類似物，描述于這些有代表性的專利中，如美國(guó)專利號(hào)4,959,351；5,840,680；5,834,422；6,127,334；5,952,297；5,650,486；5,898,028；5,898,067；5,948,751；5,747,642；5,597,893；5,547,930；5,534,488；5,504,188；5,461,031和5,028,587。
制備晶體蛋白和多肽的各種不同方法是本領(lǐng)域已知的(McPherson等，“蛋白晶體的制備與分析”“McPherson(Robert E.Krieger Publishing Company，Malabar，F(xiàn)L，1989)；Weber，蛋白質(zhì)化學(xué)進(jìn)展，411-36(1991)；美國(guó)專利號(hào)4,672,108和4,833,233)。盡管有多種方法能結(jié)晶多肽，但是沒(méi)有單一的一組條件能提供成功的合理預(yù)期，尤其是當(dāng)晶體必須適合X衍射研究時(shí)。為了提供關(guān)于結(jié)構(gòu)的精確的信息，需要付出很大的努力以獲得具有足夠大小和分辨率的晶體。例如，一旦獲得足夠純的蛋白，它必須結(jié)晶成一定大小和透明度的晶體，這樣有用于X衍射分析和隨后的結(jié)構(gòu)分解。進(jìn)而，盡管可能知道目標(biāo)蛋白的氨基酸序列，但是此序列信息并不能精確預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。而且該序列信息也不能有助于更好地理解配體如IGFBP和它的靶蛋白之間的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象和化學(xué)作用。因此，在藥物設(shè)計(jì)和發(fā)明領(lǐng)域中盡管晶體結(jié)構(gòu)能提供大量有價(jià)值的信息，但是那些在本領(lǐng)域中技術(shù)精通的專業(yè)人士不能容易地得到一些生物上相關(guān)的化合物如IGF-1的晶體。IGF-1的高質(zhì)量衍射晶體將有助于確定其三維結(jié)構(gòu)。
特異IGF-1拮抗劑的產(chǎn)生至少部分地受到限制，因?yàn)檠芯縄GF和IGFBP的結(jié)構(gòu)是困難的。由于不能得到適用于衍射研究的IGF-1晶體，例如，基于豬胰島素晶體結(jié)構(gòu)的對(duì)IGF-1結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)是最重要的獲得IGF-1結(jié)構(gòu)圖的方法(Blundell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75180-184(1978))。還可見(jiàn)Blundell等，F(xiàn)ed.Proc.，422592-2597(1983)，它公開(kāi)了IGFs的三級(jí)結(jié)構(gòu)，受體結(jié)合和抗原性?；贗GF-1的化學(xué)修飾和突變的研究，鑒別出IGF-1和胰島素之間有許多共有殘基，是作為部分胰島素受體的連接位點(diǎn)，具體是，在23-25位的芳香性殘基。
通過(guò)使用NMR和抑制分子動(dòng)態(tài)等方法，最近報(bào)道了IGF-1的溶液結(jié)構(gòu)(Cooke等，同上)。證明所得到的最小化的結(jié)構(gòu)更適合對(duì)修飾的IGF-1的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以及從胰島素的結(jié)構(gòu)活性研究所得出的推斷。而且，De Wolf等，Protein Sci.，52193-2202(1996)公開(kāi)了迷你IGF-1的溶液結(jié)構(gòu)。Sato等，Int.J.Pept.ProteinRes.，41433-440(1993)公開(kāi)了由1H-NMR和遠(yuǎn)距離幾何學(xué)所確定的IGF-1三維結(jié)構(gòu)。Laajoki等，J.Biol.Chem.，27510009-10015(2000)公開(kāi)了長(zhǎng)-[Arg(3)]IGF-1的溶液結(jié)構(gòu)和主鏈動(dòng)力學(xué)。還可見(jiàn)Laajoki等，F(xiàn)EBS Lett.，42097-102(1997))。適用于IGF-1的少數(shù)NMR模型沒(méi)有很好的確定下來(lái)，因?yàn)樵诼菪蔚闹麈溤又g有大RMSDs.最好的NMR模型是顯示了三個(gè)α螺旋的IGF-2模型。見(jiàn)Torres等，J.Mol.Biol.，248385-401(1995)，它公開(kāi)了人IGF-2的溶液結(jié)構(gòu)和它與受體的關(guān)系和結(jié)合蛋白的相互作用。在所有的結(jié)構(gòu)中，C-和D-區(qū)是非常難確定的。
除了能提供結(jié)構(gòu)信息外，多肽晶體還具備其他優(yōu)勢(shì)。例如，結(jié)晶過(guò)程本身進(jìn)一步純化多肽并滿足均一化的一種經(jīng)典標(biāo)準(zhǔn)。事實(shí)上，結(jié)晶化經(jīng)常能提供獨(dú)一無(wú)二的純化質(zhì)量，能去除用其它純化方法如HPLC，透析，傳統(tǒng)的柱層析等所不能去除的雜質(zhì)。而且，多肽晶體通常在環(huán)境溫度下是穩(wěn)定的且沒(méi)有蛋白酶污染和其它與溶液儲(chǔ)存有關(guān)的降解。多肽晶體還可用于藥物制備。最后，通常結(jié)晶化技術(shù)很大程度上沒(méi)有諸如與其它穩(wěn)定方法(如凍干法)有關(guān)的變性等問(wèn)題。因此，就很需要以結(jié)晶化形式制備IGF-1組合物并確定它們的三維結(jié)構(gòu)。本發(fā)明滿足了這個(gè)和其他需要。一旦結(jié)晶完成，晶體學(xué)數(shù)據(jù)提供有用的結(jié)構(gòu)信息，這有助于設(shè)計(jì)出作為拮抗劑或拮抗物的肽。此外，晶體結(jié)構(gòu)提供對(duì)于測(cè)定受體結(jié)合區(qū)域，這可以用作為拮抗劑或拮抗物的小的非肽分子模擬。而且，關(guān)于IGFBP與IGF-1結(jié)合的去污劑的抑制作用的發(fā)現(xiàn)可用于鑒定新的IGF-1的拮抗劑。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明正如權(quán)利要求所述。IGF-1已經(jīng)結(jié)晶并通過(guò)使用IGF-1一個(gè)單獨(dú)的溴離子和7個(gè)硫原子中的6個(gè)的反常規(guī)散射，結(jié)晶IGF-1在1.8埃分辨率上使用多波長(zhǎng)異常衍射(MAD)以確定其結(jié)構(gòu)。在晶體結(jié)構(gòu)中有序排列的IGF-1C區(qū)形成II型β轉(zhuǎn)角并介導(dǎo)晶體堆積反應(yīng)越過(guò)晶體二分體。通過(guò)超速離心分析確定IGF-1的溶液特征，結(jié)果表明IGF-1在中性pH的條件下主要以單體形式存在的，只有很少的一部分以毫摩爾濃度趨向于二聚化。去垢劑中的一種分子，N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺(deoxy big CHAPS)，調(diào)節(jié)對(duì)稱相關(guān)的分子之間的晶體堆積接觸。溶液試驗(yàn)確認(rèn)IGF-1N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺復(fù)合物在溶液中形成并且以可測(cè)定的量結(jié)合的去垢劑阻抑IGFBP的結(jié)合。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種通過(guò)衍射X-射線輻射的IGF-1形成的晶體，產(chǎn)生一個(gè)代表IGF-1三維結(jié)構(gòu)的衍射模式。優(yōu)選地，該晶體大致具有下列細(xì)胞常數(shù)a＝31.831，b＝71.055，c＝65.995和一個(gè)C22的空間群。還有優(yōu)選的是，IGF-1包括一個(gè)A-，B-，C-區(qū)并在晶體中形成一個(gè)二聚體，更為優(yōu)選的是，該晶體在二聚體界面處含有一個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)。
本發(fā)明還提供了一個(gè)包括以上晶體的組合物。優(yōu)選的，當(dāng)分解時(shí)，在該組合物中IGF-1是具有生物活性的。本發(fā)明還提供一種治療患有拮抗劑紊亂的哺乳動(dòng)物，較佳的是人患者特別是人主動(dòng)肌紊亂的方法，所述方法包括給所述哺乳動(dòng)物服用有效量的上述已分解的組合物。
本發(fā)明還提供一種IGF-1結(jié)晶化方法，所包括的步驟是(a)混合含有IGF-1的水溶液和含有一種沉淀劑的儲(chǔ)蓄液以形成混合體積；(b)結(jié)晶混合體積。
本發(fā)明還提供由上述方法產(chǎn)生的結(jié)晶的IGF-1。
此外，本發(fā)明提供一種測(cè)定IGF-1三維結(jié)構(gòu)的方法，包括(a)結(jié)晶IGF-1；(b)輻射結(jié)晶的IGF-1以獲得IGF-1的衍射模工特征；
(c)把衍射模式轉(zhuǎn)化成IGF-1的三維結(jié)構(gòu)。
而且，本發(fā)明提供了一個(gè)機(jī)器可讀的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)介質(zhì)，該介質(zhì)包括由機(jī)器可讀的數(shù)據(jù)編碼的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)物質(zhì)，當(dāng)用恰當(dāng)?shù)臋C(jī)器讀數(shù)據(jù)時(shí)，則可顯示含有IGF-1的分子的晶體的三維表現(xiàn)度。
更進(jìn)一方面，本發(fā)明提供一種在附錄1中顯示的具有同步IGF-1晶體。
此外，本發(fā)明提供了一種使用由IGF-1晶體衍生的IGF-1的三維的方法，其中IGF-1的三維結(jié)構(gòu)包括一個(gè)IGF-1受體結(jié)合區(qū)域，本方法包括鑒定含有與IGF-1三維結(jié)構(gòu)的受體結(jié)合區(qū)域相互作用的結(jié)構(gòu)的化合物和作為IGF-1拮抗劑或拮抗物的功能。優(yōu)先的是，在這個(gè)方法中，IGF-1三維結(jié)構(gòu)包括α與在附錄1中描述的結(jié)構(gòu)信息的那些大致相同碳同等物。
另一方面，本發(fā)明提供了一種鑒定IGF-1拮抗劑或拮抗物的方法，包括的步驟是(a)結(jié)晶IGF-1以形成IGF-1晶體，IGF-1晶體包含一組限定IGF-1受體結(jié)合域的氨基酸殘基；(b)輻射從步驟(a)獲得的晶體，以獲得IGF-1晶體的衍射模型；(c)從衍射模型中確定IGF-1的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括IGF-1受體結(jié)合區(qū)域(d)鑒別一種有三維結(jié)構(gòu)的IGF-1拮抗劑或拮抗物，它在功能上復(fù)制必需的IGF受體結(jié)合、溶劑可及的殘基，該殘基顯示出IGF-1受體結(jié)合區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)，與IGF-1相比，所述IGF-1拮抗劑或拮抗物改變了對(duì)IGF-1應(yīng)答細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。
優(yōu)選的是，本方法中溶劑可及的殘基不參加IGF-1界面的形成。
根據(jù)某些其他方面，本發(fā)明包括設(shè)計(jì)一種化合物的方法，如一種模擬肽，它模擬IGF-1的三維表面結(jié)構(gòu)，所包括的步驟(a)測(cè)定IGF-1的三維結(jié)構(gòu)；和(b)設(shè)計(jì)一種模擬IGF-1三維空間表面結(jié)構(gòu)的化合物。
按照另一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明提供一種鑒別能結(jié)合IGF-1并阻止IGFBP或受體與IGF-1結(jié)合的模擬肽，包括的步驟(a)搜尋具有附錄1中提供的結(jié)構(gòu)參數(shù)或結(jié)構(gòu)同等物的分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)；；(b)從數(shù)據(jù)庫(kù)中選出模擬IGF-1的結(jié)構(gòu)參數(shù)或結(jié)構(gòu)同等物的分子；本發(fā)明還提供一種測(cè)定分子復(fù)合物的至少一部分的三維結(jié)構(gòu)的方法，所述復(fù)合物包括IGF-1且所述方法包括的步驟(a)確定IGF-1晶體的結(jié)構(gòu)同等物；(b)計(jì)算結(jié)構(gòu)同等物的相位；
(c)從步驟(b)所得的相位計(jì)算電子密度圖；(d)基于所述的電子密度圖測(cè)定化合物的至少一部分的結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選地，在步驟(a)中所用的結(jié)構(gòu)同等物與附錄1所描述的那些大致相同或所描述的晶體與附錄1所描述的類似物大致相同。
本發(fā)明還提供評(píng)估一種化學(xué)物質(zhì)與IGF-1或其復(fù)合物締合的能力的方法，方法步驟包括(a)采用計(jì)算或?qū)嶒?yàn)手段在化學(xué)物質(zhì)和IGF-1或它的復(fù)合物之間進(jìn)行一次合適的操作，因此獲得與締合相關(guān)的數(shù)據(jù)；(b)分析由步驟(a)所得到的數(shù)據(jù)以確定在化學(xué)物質(zhì)和IGF-1或它的復(fù)合物之間締合的特征。
本發(fā)明還提供一種化學(xué)物質(zhì)，該化學(xué)物質(zhì)是通過(guò)上述干擾IGF-1和其受體之間或IGF-1和至少一個(gè)其結(jié)合蛋白之間體內(nèi)或體外締合，或與IGF-1的結(jié)合位點(diǎn)締合的方法鑒別的。
還提供了GIF-1結(jié)晶形式的重原子衍生物。
本發(fā)明還包括一種用計(jì)算或?qū)嶒?yàn)手段評(píng)估一種化學(xué)物質(zhì)的方法，以通過(guò)使用具有附錄1中描述的結(jié)構(gòu)同等物的IGF-1晶體獲得該化學(xué)物質(zhì)與IGF-1的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)締合的信息。
使用本發(fā)明上述方法鑒定的任何肽類似物和其它化學(xué)物質(zhì)用于本文所描述的治療方法中并作為藥物組合物。
本發(fā)明還提供一種鑒定IGF-1的間接拮抗劑的方法，包括的步驟(a)把N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺抑制IGFBP-1或IGFBP-3結(jié)合到IGF-1的性能與IGF-1的候選間接拮抗劑的抑制性能作比較；(b)確定候選拮抗劑是否至少與N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺一樣抑制這種結(jié)合。
在一個(gè)較佳實(shí)施例中，這種比較是在N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺與參與的間接拮抗劑之間進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性分析而完成的。一個(gè)更佳的實(shí)施例中，結(jié)合的抑制是通過(guò)預(yù)培養(yǎng)N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺或具有在噬菌體顆粒上表達(dá)的IGF-1的候選拮抗劑并在基于平板的ELISA分析中測(cè)定IGF-1與IGFBP-I或IGFBP-3的殘基結(jié)合而測(cè)定。
本發(fā)明還提供一種鑒定IGF-1的間接拮抗劑的方法，包括把IGF-1和IGF-1的候選間接拮抗劑共結(jié)晶以形成共結(jié)晶結(jié)構(gòu)并測(cè)定候選拮抗劑是結(jié)合IGF-1的一個(gè)片段或兩個(gè)片段都結(jié)合，其中一個(gè)片段有氨基酸殘基Glu3、Thr4、Leu5、Asp12、Ala13、Phe16、Val17、Cys47、Ser51、Cys52、Asp53、Leu54和Leu57，第二個(gè)片段有氨基酸殘基Val11、Gln15、Phe23、Phe25，、Asn26、Val44、Phe49和Arg55，其中如果在已給定的一個(gè)片段中所列的每一個(gè)氨基酸殘基與在共結(jié)晶體中小于或等于6的候選拮抗劑之間至少有一個(gè)接點(diǎn)，那么結(jié)合就會(huì)產(chǎn)生。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，候選拮抗劑抑制IGFBP-1或-3與IGF-1結(jié)合的程度至少與N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺的抑制程度一樣。更優(yōu)選的是，本方法中的結(jié)合抑制是通過(guò)在N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺和候選拮抗劑之間的競(jìng)爭(zhēng)性分析而測(cè)得的。最為優(yōu)選的是，本方法中的結(jié)合抑制是通過(guò)預(yù)培養(yǎng)N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺或具有在噬菌體顆粒上表達(dá)的IGF-1的候選拮抗劑，并測(cè)定在以平板為基礎(chǔ)的ELISA分析中測(cè)定IGF-1與IGFBP-1或IGFBP-3的殘基的結(jié)合來(lái)測(cè)定的。
本民明還提供了一種治療哺乳動(dòng)物的IGF-1拮抗劑紊亂癥的方法，該方法包括給哺乳動(dòng)物服用有效量的N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺。
此處還提供了一種IGF-1和N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺的共結(jié)晶復(fù)合物。
附圖簡(jiǎn)述圖1列出了IGF-1(SEQ ID NO1)，IGF-2(SEQ ID NO1)和胰島素(SEQ ID NO3)的序列。胰島素的A-，B-，C-鏈(和IGF-1和IGF-2的相應(yīng)序列)分別用粗體，下劃線和斜體文本表示。這三個(gè)芳香性殘基在文本略述中顯示。標(biāo)有(！)的殘基被證明對(duì)于結(jié)合IGF-1受體是重要的。標(biāo)有“*”的殘基認(rèn)為對(duì)結(jié)合IGFBP-1和IGFBP-3來(lái)說(shuō)是重要的。含有IGF-1和IGF-2的D區(qū)的C端殘基用常規(guī)方式描述。
圖2是顯示IGF-1的支鏈折疊的帶狀圖。在Ramachandran圖中，97.7％是最優(yōu)選的且2.3％是允許的。
圖3是IGF-1(左邊結(jié)構(gòu))和胰島素(右邊結(jié)構(gòu))的帶狀圖。
圖4是IGF-1的帶狀圖顯示在儲(chǔ)蓄液中所用的去垢劑，N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺，在B螺旋的底端結(jié)合進(jìn)入一小段親水縫隙中。去垢劑是用比IGF-1結(jié)構(gòu)淺灰色結(jié)構(gòu)所代表。
圖5是作為二聚體的IGF-1帶狀圖，去垢劑用更淺灰色來(lái)表示。
圖6是一個(gè)作為二聚體的IGF-1帶狀圖，顯示了在二聚體界面上對(duì)受體結(jié)合簇重要的殘基(由圖中心部分的環(huán)形結(jié)構(gòu)表示)。去垢劑則在圖的外圍部分用較淺的灰色表示。
圖7A和7B是IGF-1的帶狀圖，和圖4一樣，證明了在儲(chǔ)蓄液中所用的去垢劑(N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺)，以條狀形式顯示，在B螺旋的底端結(jié)合進(jìn)入一小段親水縫隙中。在圖7A中，去垢劑的頭部基團(tuán)通過(guò)殘基Leu5，Phe16，Val17，Leu54和Leu57插入有條紋的裂隙中。各種灰色陰影是按照Dubaquie和Lowman，同上的丙胺掃描誘變結(jié)果而添加的，Phe16，Val17，Leu15的區(qū)域顯示對(duì)IGFBP-1的親和力有5-10倍的下降，Glu3區(qū)域則顯示有10-100倍的下降以及Pro63和Pro63’區(qū)域有大于100倍的下降。在極右端的黑色部分對(duì)應(yīng)形成結(jié)晶二聚體的對(duì)稱相關(guān)的IGF-1分子。在Leu54附近的環(huán)表明是去垢劑的C10原子，這種去垢劑通過(guò)在這一位置上具有一個(gè)羥锘而與另一個(gè)去垢劑(3-((3-膽胺酰丙基(？))二甲銨)-1-丙烷磺酸鹽；或CHAPS)不同。圖7B顯示去垢劑相反表面的示意圖并描述了去垢劑分子與對(duì)稱相關(guān)的IGF-1分子的相互作用。如圖7A中所顯示的，各種灰色陰影是按照Dubaquie和Lowman，同上的丙胺掃描誘變結(jié)果而添加的，在Gln15附近的基團(tuán)表明其結(jié)合IGFBP-1的親和力有5-10倍的下降，極左側(cè)中等灰色分子，Leu10區(qū)域分子和極右側(cè)中等灰色區(qū)域表明有10-100倍的下降，在Phe49和Gly7的黑色區(qū)域表明有大于100倍的下降。去垢劑分子右端的黑色區(qū)域?qū)?yīng)于形成晶體二聚體的對(duì)稱相關(guān)的IGF-1分子。在Gln15附近的環(huán)表明是去垢劑的C10碳原子，正如上述圖7A所指出的。此圖用INSIGHT(MSI，San Diego，CA)所繪制。
圖8顯示從去垢劑/IGFBP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合研究獲得的曲線圖。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺是當(dāng)作IGF-1結(jié)合固定的IGFBP-1(封閉的正方形)或IGFBP-3(開(kāi)放的圓形)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑來(lái)使用的。在正對(duì)照，可溶性IGFBP-1是當(dāng)作IGF-1結(jié)合固定的IGFBP-1(封閉的三角形)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑來(lái)使用的。每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表了兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。
圖9A是一組溶液中IGF-1的沉降平衡數(shù)據(jù)的非線性最小二乘方分析。在轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為30,000rpm(開(kāi)放三角形)和35,000rpm(開(kāi)放正方形)下所收集的數(shù)據(jù)作為一個(gè)理想的單體-二聚體自締合模型是合適的。實(shí)線是這些數(shù)據(jù)的配合。圖9B顯示了在通過(guò)合適的實(shí)驗(yàn)解釋了數(shù)據(jù)后的兩種轉(zhuǎn)速下的氨基酸殘基圖。它們?cè)诹愀浇S即分布，表明該單體-二聚體模型對(duì)于這種相互作用是恰當(dāng)?shù)摹?br> 圖10A顯示了由IGF-1和N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺復(fù)合物的NMR所確定的帶狀圖，以及圖10B顯示了由IGF-1結(jié)合被環(huán)作IGF-F1-1的由噬菌體產(chǎn)生的IGF-1拮抗劑肽的復(fù)合物的NMR所確定的帶狀圖。
優(yōu)選實(shí)施例的描述A.定義在此處所用的，除非另外指出，“IGF-1”涉及人類胰島素樣生長(zhǎng)因子-1包含一個(gè)沒(méi)有N-端甲硫氨酸的人類天然成熟IGF-1序列，例如，如公開(kāi)于1987.8.5的EP230,869；公開(kāi)于1984.12.19的EP 128,733；或公開(kāi)于1988.10.26的EP 288,451所述。
“IGFBP”或“IGF結(jié)合蛋白”涉及通常與IGF-1締合，或結(jié)合或復(fù)合的蛋白或多肽，而不論它是否是環(huán)形的(如，在血清或組織中)。該定義包括IGFBP-1，IGFBP-2，IGFBP-3，IGFBP-4，IGFBP-5，IGFBP-6，Mac25(IGFBP-7)和環(huán)前列腺素刺激因子(PSF)或內(nèi)皮細(xì)胞特異分子(ESM-1)，以及其它與IGFBPs有高度同源性的蛋白。例如，在Swisshelm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，924472-4476(1995)和Oh等，J.Biol.Chem.，27130322-30325(1996)中所描述的Mac 25.PSF在Yamauchi等，BiochemicalJournal，303591-598(1994)中有所描述。ESM-1在Lassalle等，J.Biol.Chem.，27120458-20464(1996)中有所描述。對(duì)于其他已鑒定的IGFBPs，見(jiàn)，如在1990.6.27公開(kāi)的EP 375,438；在1990.5.23公開(kāi)的EP 369,943；美國(guó)專利號(hào)5,258,287；在1989.10.5公開(kāi)的WO 89/09268；Wood等，分子內(nèi)分泌學(xué)Endocrinology，21176-1185(1988)；Brinkman等，The EMBO J.，72417-2423(1988)；Lee等，Mol.Endocrinol.，2404-411(1988)；Brewer等，BBRC，1521289-1297(1988)；公開(kāi)在1988.12.7的EP 294,021；Baxter等，BBRC，147408-415(1987)；Leung等，Nature，330537-543(1987)；Martin等，J.Biol.Chem.，2618754-8760(1986)；Baxter等，Comp.Biochem.Physiol.，91B229-235(1988)；在1989.9.21公開(kāi)的WO89/08667；在1989.10.19公開(kāi)的WO 89/09792；Binkert等，EMBO J.，82497-2502(1989)。IGFBP-1和IGFBP-3分別與IGF-1的不同殘基結(jié)合。
在此處所用的，“人IGF-1受體”或只是“IGF-1受體”涉及在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IGF-1的任一受體而且包括人體中與人IGF-1結(jié)合的1型和2型IGF受體例如胚盤IGF-1R等。
“IGF-1的間接拮抗劑”是一種從IGFBP-3或IGFBP-1原位釋放IGF-1因此釋放的IGF-1的分子，處于活性狀態(tài)并與其受體相互作用。
“肽”是至少有兩個(gè)氨基酸的分子并且包括至少約有60個(gè)氨基酸的多肽。較佳地，肽約有10-60個(gè)氨基酸，更佳地是約有10-25個(gè)氨基酸，最佳地，約有12-25個(gè)氨基酸。此定義包括線性和環(huán)、肽衍生物、它們的鹽類或光學(xué)異構(gòu)體。
在此處所用的，用于治療的“哺乳動(dòng)物”涉及分類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物包括人、家禽和家畜和動(dòng)物園中的動(dòng)物，參加比賽的動(dòng)物或?qū)櫸铮绻?、馬、貓、羊、豬、母牛等。此處優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是人。術(shù)語(yǔ)“未成年”涉及從剛出生的年齡(如低出生體重的嬰兒)到青春期年齡的哺乳動(dòng)物，后者是那些還沒(méi)有達(dá)到完全生長(zhǎng)勢(shì)的哺乳動(dòng)物。
在此處所用的，術(shù)語(yǔ)“處理”涉及治療處理和預(yù)防疾病或預(yù)防手段。那些需要處理的包括那些已經(jīng)有紊亂癥的和那些傾向于患紊亂癥的或診斷為紊亂癥的或那些需要預(yù)防紊亂癥的。
“紊亂”是指在任何能從IGF-1的激動(dòng)(“激動(dòng)紊亂”)或拮抗劑(“阻抗紊亂”)的處理過(guò)程中受益的任何情形。這包括慢性和急性紊亂或包括那些使哺乳動(dòng)物易感染可懷疑的紊亂的病理狀態(tài)。處理的紊亂癥可能是下面所列的兩種或更多的拮抗或阻抗紊亂的混合。
阻抗紊亂的非限制性的例子包括良性和惡性腫瘤，白血病和淋巴瘤，神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、下丘腦和其他腺體、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和囊胚細(xì)胞紊亂，以及發(fā)炎、血管生成和免疫紊亂，糖尿病并發(fā)癥如糖尿病引起的視網(wǎng)膜病或神經(jīng)病，與年齡相關(guān)的斑點(diǎn)惡化，眼科手術(shù)如白內(nèi)障去除、角膜移植、青光眼過(guò)濾手術(shù)和角膜成形術(shù)、屈光度矯正手術(shù)，如角膜切除術(shù)，還有在鞏膜斑點(diǎn)洞及其惡化、視網(wǎng)膜流淚、視網(wǎng)膜玻璃體病、綜合紊亂癥、角膜的白內(nèi)障紊亂如角膜切除術(shù)的后遺癥，干眼病，結(jié)膜病毒感染，結(jié)膜潰爛，損傷如角膜上皮細(xì)胞損傷，Sjogren綜合癥，視網(wǎng)膜紊亂如斑點(diǎn)和視網(wǎng)膜腫脹，視力受限疤，視網(wǎng)膜缺血和增殖性玻璃質(zhì)的視網(wǎng)膜病。
更為優(yōu)選的是，這些拮抗劑紊亂包括由IGF-1加劇的糖尿病并發(fā)癥，缺血損傷和與不良細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病如癌、再狹窄和哮喘。如果紊亂是一種由IGF-1加劇的糖尿病并發(fā)癥，這種并發(fā)癥包括糖尿病引發(fā)的視網(wǎng)膜病或糖尿病引發(fā)的腎病。處理的效果可以通過(guò)臨床表現(xiàn)或癥狀的減輕來(lái)證明，例如，包括增強(qiáng)腎清除能力、改善視力或結(jié)合到IGF-1受體的IGF-1的量的減少。如果紊亂是一種缺血損傷，它可包括中風(fēng)、心肌缺血和腎的缺血損傷。
用于本發(fā)明目的的拮抗劑紊亂的例子包括任何能用IGF-1處理后受益的情形，包括但不僅限于此，例如，肺病、正如下面要闡明的高血糖癥，腎病，如慢性和急性腎機(jī)能不全，晚期慢性腎衰竭、血管球性腎炎、間質(zhì)性腎炎、腎盂腎炎，腎小球硬化癥，如在糖尿病患者中的Kimmelstiel-Wilson癥狀和腎移植后的腎衰竭，肥胖、GH-不足，Turner氏綜合癥、Laron氏綜合癥、短小身材、與年齡有關(guān)的不良癥狀如肥胖和增加的脂肪的質(zhì)量與瘦肉的比，免疫紊亂如免疫缺陷包括CD4指數(shù)的下降和免疫耐受性下降或化療誘發(fā)的組織破壞，骨髓移植，心臟結(jié)構(gòu)或功能疾病或不足如心臟功能障礙和充血性心臟衰竭，神經(jīng)元，神經(jīng)或神經(jīng)肌肉的紊亂，如外周神經(jīng)病、多發(fā)性硬化、肌肉營(yíng)養(yǎng)失調(diào)或肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良和在任何條件下引起的與消費(fèi)有關(guān)的代謝異常，所包括的條件如外傷或創(chuàng)傷，或受到如細(xì)菌或人類病毒如HIV的感染，受傷，皮膚紊亂，需要恢復(fù)的腸的結(jié)構(gòu)和功能等等。此處優(yōu)選的作為處理目標(biāo)的激動(dòng)紊亂是糖尿病和肥胖癥，心臟功能障礙，由艾滋病引起的消瘦，腎紊亂，神經(jīng)紊亂，全身生長(zhǎng)紊亂和免疫紊亂。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“高血糖紊亂”涉及產(chǎn)生自胰島素抵抗力的所有類型的糖尿病及其紊亂，I型和II型糖尿病，以及重度胰島素抵抗力，高胰島素血癥和高脂血癥，如肥胖患者和對(duì)胰島素有抗性的糖尿病，如Mendenhall氏綜合癥，Werner綜合癥，妖精綜合征，脂類營(yíng)養(yǎng)缺乏糖尿病和其他脂類營(yíng)養(yǎng)缺乏癥。較佳的高血糖癥是糖尿病，具體是I型和II型糖尿病。“糖尿病”本身是一種碳水化合物代謝進(jìn)行性疾病包括胰島素產(chǎn)量不足或利用不夠且其特征表現(xiàn)為高血糖和糖尿。
“生物活性”IGF-1涉及顯示出通常與IGF-1拮抗劑或拮抗物相關(guān)的生物特性的IGF-1，例如允許治療一種或多種上文所列紊亂的特性。
術(shù)語(yǔ)“有效量”涉及一定量的IGF-1或模擬肽或其他化合物，包括能有效治療哺乳動(dòng)物的疾病或紊亂的化學(xué)體。例如，在癌癥中，有效量的肽可以減少癌細(xì)胞的數(shù)目；減小腫瘤的體積；抑制(在某種程度上減緩最好是停止)癌細(xì)胞滲透進(jìn)入周圍器官；抑制(至少在某種程度上減緩最好是停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在某種程度上，抑制腫瘤生長(zhǎng)；促進(jìn)凋亡；且/或在某種程度上減輕與疾病相關(guān)的一種或多種癥狀。
“沉淀劑”是一種在儲(chǔ)蓄液中的試劑，當(dāng)它與IGF-1的水溶液混合后，便沉淀IGF-1并達(dá)到飽和以形成IGF-1晶體。例子包括離液劑如硫酸銨、聚乙二醇(其分子量在很大的范圍內(nèi)，例如，在約2000到20000之間)、檸檬酸鈉、甲次砷酸鈉或它們的混合物。
“儲(chǔ)蓄液”是一種沉淀劑和其他IGF-1結(jié)晶所需要的組分溶液，例如，去垢劑如C12E9(九乙烯基乙二醇十二烷基醚，九乙烯基乙二醇十二醇醚，聚氧乙烯9))，C12E8(八乙烯基乙二醇十二烷基醚，八乙烯基乙二醇十二醇醚，聚氧乙烯月桂醚(8))，十二烷基-β-D-麥芽吡喃糖苷、月桂酸蔗糖酯、環(huán)己基-戊基-β-D-麥芽糖、九乙烯基乙二醇八苯酚酯、十六烷基三甲基色氨酸溴化銨、癸基-β-D-麥芽吡喃糖苷、十二烷醇二甲胺的氧化物、環(huán)己基-戊基-β-D-麥芽糖、正-十二烷基磺酸甜菜堿，3-(十二烷基二甲胺)丙烷-1-磺酸鹽、壬基-β-D-葡萄糖苷、辛基-β-D-硫化葡萄糖苷、OSG、N，N-二甲基癸基胺-β-氧化物、甲基-6-O-(N-庚氨甲酰)-α-D-葡萄糖苷、蔗糖辛基酸鹽、庚-β-D-硫化葡萄糖苷、辛基-β-D-葡萄糖苷、環(huán)己基-丙基-β-D-麥芽糖、環(huán)己基丁烷-N-羥基乙烷葡糖胺、正-硫乙酸甜菜堿、3-(乙酸二甲胺)丙烷-1-磺酸鹽、辛基-N-甲基葡糖胺、環(huán)己基-β-D-葡萄糖苷和N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺。優(yōu)選地，去垢劑是N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺。
“重結(jié)晶”涉及在初始結(jié)晶長(zhǎng)成并確定它不是很大或很有研究?jī)r(jià)值后，向晶體添加物質(zhì)的過(guò)程。此物質(zhì)如甲基戊二醇有溶解晶體的效果，但不稀釋晶體混合物中的其他成分。然后在隨后的幾天中，晶體小滴在儲(chǔ)蓄液中再一次達(dá)到平衡，晶體再一次生長(zhǎng)，但此時(shí)會(huì)長(zhǎng)的更大更有序。
術(shù)語(yǔ)“連接”涉及IGF-1和化學(xué)物質(zhì)或它們的一部分之間的接近的條件。這種連接可以是非共價(jià)的，其中并列是用氫鍵范德華力或靜電作用高能地連接，或可以是共價(jià)連接。
術(shù)語(yǔ)“結(jié)合位點(diǎn)”涉及化學(xué)物質(zhì)與IGF-1結(jié)合或連接的任意或所有位點(diǎn)。
術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)同等物”是指從與在晶體形式中由一個(gè)分子的原子(散射中心)的X-射自線的單色光束的衍射獲得的模式相關(guān)的數(shù)學(xué)議程得到的同等物。衍射數(shù)據(jù)可用于計(jì)算晶體重復(fù)單位的電子密度圖。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員將理解獲得的數(shù)據(jù)取決于具體使用的系統(tǒng)，因此，如果這種同等物詳細(xì)說(shuō)明與本文描述的那些基本相同的親緣關(guān)系，那么事實(shí)上不同的同等物可描述相同的晶體。電子密度圖可用于在晶體的單位細(xì)胞中確定單個(gè)原子的位置。
那些在本領(lǐng)域中的技術(shù)精通人員能理解那些用X衍射晶體學(xué)所確定的一組結(jié)構(gòu)同等物并不是不存在標(biāo)準(zhǔn)誤差的。附錄1顯示了IGF-1的原子同等物。本發(fā)明的目的是，當(dāng)用主鏈原子疊加到附錄1的結(jié)構(gòu)同等物時(shí)，任何一組其蛋白骨架原子的均方差小于2的IGF-1結(jié)構(gòu)同等物都認(rèn)為是相同的。優(yōu)選的是，誤差小于1，更優(yōu)選的是，誤差小于0.5。
術(shù)語(yǔ)“重原子衍生化”涉及一種生產(chǎn)結(jié)晶的IGF-1的化學(xué)修飾的形式方法。實(shí)際上，晶體浸泡在含有重金屬離子鹽或有機(jī)金屬化合物的溶液中，例如氯化鉛、硫化蘋果酸金或乙酸雙氧鈾，這些物質(zhì)可通過(guò)晶體擴(kuò)散并結(jié)合于蛋白質(zhì)表面。結(jié)合重金屬原子的位置可以通過(guò)對(duì)已浸沒(méi)的晶體的X衍射分析而確定。此信息可用于產(chǎn)生用于構(gòu)建分子的三維結(jié)構(gòu)的相位信息。
術(shù)語(yǔ)“晶胞”涉及一種基本形狀塊。晶體的整個(gè)體積可以通過(guò)對(duì)這些塊的常規(guī)組裝而獲得。每一個(gè)晶胞包括模式單位的完整描繪，這些其重復(fù)便組成了晶體。
術(shù)語(yǔ)“空間群”涉及一種晶體的對(duì)稱元素的排列。
術(shù)語(yǔ)“分子替代”涉及一種包括產(chǎn)生一種其結(jié)構(gòu)同等物是未知的初始晶體結(jié)構(gòu)模式，通過(guò)定向和定位一個(gè)其結(jié)構(gòu)同等物是已知的分子，如附錄1中的IGF-1類似物，包括在未知晶體單位小室中，以至于能最好地為觀察到的未知晶體的衍射模式做出解釋。然后可以通過(guò)此模型計(jì)算出相位，并與所觀察到的振幅混合以用近似傅里葉方法合成其未知類似物的結(jié)構(gòu)。然后依次通過(guò)幾種形式的改進(jìn)便提供此未知晶體的最后精確結(jié)構(gòu)。(例如參見(jiàn)Lattman，E.，“旋轉(zhuǎn)與翻譯的功能運(yùn)用”(Use of theRotation and Translation Function)Methods in Enzymology，11555-7(1985)；Rossman編，“The Molecular Replacement Method，”Int.Sci.Rev.Ser.No.13(Gordon和BreachNew York，1972))。利用用本發(fā)明所提供的IGF-1的結(jié)構(gòu)同等物，分子替代可用于確定晶體共復(fù)合物、未知配體、突變體或同系物或IGF-1不同結(jié)晶體的結(jié)構(gòu)同等物。此外，如權(quán)利要求所述的晶體和它的類似物可用于確定與IGF-1連接的化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)同等物。
在此處所用的術(shù)語(yǔ)“化學(xué)物質(zhì)”或“化合物”意思是任何分子、分子復(fù)合物、化合物、模擬肽或其不是IGF-1的片段。首選它是一個(gè)高度生物利用率的分子，如有機(jī)化學(xué)分子或多肽。
B.進(jìn)行本發(fā)明的幾種模式下面對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述包含了IGF-1的晶體結(jié)構(gòu)，制備IGF-1的晶體結(jié)構(gòu)的方法，和使用IGF-1晶體和其結(jié)構(gòu)同等物的方法。
a.IGF-1晶體結(jié)構(gòu)本發(fā)明提供IGF-1晶體以及從其確定的IGF-1的結(jié)構(gòu)。特別是，本發(fā)明提供大約具有下列三維構(gòu)象a＝31.831，b＝71.055，c＝65.995，α＝β＝γ＝90.000°的IG-1晶體。它有一個(gè)對(duì)稱或C2221的空間群。在圖2中顯示的是它們的帶狀結(jié)構(gòu)，他們有三個(gè)螺旋，具有對(duì)應(yīng)于殘基3-28的N末端B區(qū)，從殘基29-34的C區(qū)，從殘基35-40的一段無(wú)序排列的殘基，以及從殘基42-62的A區(qū)。D區(qū)(殘基63-70)基本上是無(wú)序排列的。圖4和7顯示結(jié)晶過(guò)程中所使用的去垢劑結(jié)合進(jìn)入結(jié)構(gòu)的B螺旋底部的一個(gè)小疏水縫隙中。IGF-1在晶體中能形成二聚體，如圖5所示，其中兩個(gè)尾巴是在二聚體臨界面位置。內(nèi)表面積是一個(gè)6892/單體，總面積是13782。對(duì)于在二聚體界面上IGF-1R結(jié)合簇重要的殘基，如圖6所示。
如權(quán)利要求所述的IGF-1晶體的特征在此處的實(shí)施例中有進(jìn)一步的描述且它們的結(jié)構(gòu)同等物在附錄1中。
b.制備IGF-1晶體的方法在各種實(shí)施例，如權(quán)利要求所述的本發(fā)明涉及通過(guò)首先提供含有IGF-1的水溶液來(lái)制備IGF-1的結(jié)晶體形式的方法。然后把含有沉淀劑的儲(chǔ)蓄液與一定體積的IGF-1溶液混合并結(jié)晶終混合液。優(yōu)選的步驟是晶體需要再次溶解并再結(jié)晶?？捎糜谠俳Y(jié)晶的試劑如優(yōu)選甲基戊二醇。典型地晶體溶解于少量此試劑中以最小程度的降低其它試劑的稀釋效果然后使之再生長(zhǎng)一段時(shí)間?？蛇x擇的步驟是晶體IGF-1可從混合液中分離出來(lái)。優(yōu)選的是，IGF-1從原核細(xì)胞中獲得，更為優(yōu)選的是從細(xì)菌細(xì)胞中獲得，最為優(yōu)選的是大腸桿菌。優(yōu)選地它分泌進(jìn)入外周胞質(zhì)并如美國(guó)專利號(hào)5,723,310所描述的方法制備。
水溶液中的IGF-1濃度可以有變化，但首選是約1到50mg/ml，更為優(yōu)選的約5到15mg/ml。類似的，本發(fā)明中使用的沉淀劑可以有變化，并可選自本領(lǐng)域中所知的任何一種沉淀劑。優(yōu)選的是，沉淀劑選自檸檬酸鈉、硫酸銨、聚乙二醇、甲次砷酸鈉或它們的混合物。更為優(yōu)選的沉淀劑是用檸檬酸鈉或甲次砷酸鈉緩沖的聚乙二醇。任何濃度的沉淀劑都可用于儲(chǔ)蓄液中；然而，如果是聚乙二醇，則優(yōu)選的濃度約20到25％；如果是檸檬酸鈉、硫酸銨或甲次砷酸鈉，則優(yōu)選的濃度是1到10M。優(yōu)選的是，儲(chǔ)蓄液還可包括一種去垢劑。優(yōu)選的是，去垢劑的量大約從10到50mM。還有優(yōu)選的去垢劑是N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺。儲(chǔ)蓄液的pH值也可以有變化，優(yōu)選的是在約4到10之間，最好的是約6.5。
本領(lǐng)域中的技術(shù)精通人員會(huì)理解并不是由于不恰當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)而引起這些參數(shù)中的每一個(gè)發(fā)生了變化而仍然可以得到合格的晶體。在實(shí)踐中，一旦對(duì)任何已給定的生長(zhǎng)方法確定恰當(dāng)?shù)某恋韯⒕彌_液或其他試驗(yàn)變量，那么這些方法中的任何一種或任何其他方法都能用于結(jié)晶出如權(quán)利要求所述的晶體。本領(lǐng)域中的技術(shù)精通人員可根據(jù)它的特定需要來(lái)確定變量。
結(jié)晶的各種方法可用于如權(quán)利要求所述的本發(fā)明中，包括蒸汽擴(kuò)散、分批結(jié)晶、液橋或透析結(jié)晶法。優(yōu)選蒸汽擴(kuò)散結(jié)晶。見(jiàn)如McPherson等，Preparation andAnalysis of Protein Crystals，Glick編(John Wiley&Co.，1982)，pp.82-159；Jancarik等，J.Appl.Crystallogr.，24409-411(1991)。
在蒸汽擴(kuò)散結(jié)晶法中，少量體積的蛋白溶液(如幾毫升)與含有沉淀劑的溶液混合。此混合體積掛在一個(gè)含有少量沉淀劑(如1ml)的小孔上面。從液滴到小孔的蒸汽擴(kuò)散將導(dǎo)致液滴中的晶體形成。
結(jié)晶的透析法利用半透膜保留蛋白但允許小分子(如緩沖液和沉淀劑)擴(kuò)散進(jìn)出半透膜。在透析時(shí)，并不是通過(guò)蒸發(fā)來(lái)濃縮蛋白和沉淀劑，而且允許沉淀劑通過(guò)膜緩慢擴(kuò)散并減少蛋白的溶解而保護(hù)蛋白質(zhì)濃度固定不變。
分批方法通常包括緩慢添加沉淀劑至蛋白水溶液直至溶液剛剛渾濁；此時(shí)可封閉容器并靜止一段時(shí)間直至結(jié)晶開(kāi)始。
因此，申請(qǐng)者想要如權(quán)利要求所述的本發(fā)明包括任何和所有的結(jié)晶化方法。本領(lǐng)域中的技術(shù)精通人員能選擇這些方法的任何一個(gè)并改變參數(shù)使所選的方法能得到所要的晶體。
最優(yōu)選的結(jié)晶化方法包括這種方法，其特征在于在例如美國(guó)專利號(hào)5,681,814和WO 99/51272中所描述的在醋酸鹽、檸檬酸鹽或琥珀酸鹽中IGF-1從細(xì)胞和配方中分離后，如果需要任選地脫鹽使pH約為4-5，較佳地約4.5，以形成水溶液。然后一滴該水溶液與約24％聚乙二醇混合，該聚乙二醇用或者約0.1M的檸檬酸鈉或者0.1M的甲次砷酸鈉緩沖至pH6.5，并具有約1μl的約1.4mM的作為去垢劑的N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺。然后此溶液用1mL24％的pH6.5的加有0.1M檸檬酸鈉或加有約0.1M的甲次砷酸鈉的聚乙二醇緩沖液通過(guò)蒸汽擴(kuò)散結(jié)晶法達(dá)到平衡直到晶體小滴形成，此過(guò)程通常需要4-5天。然后將2μl的100％甲基戊二醇加入結(jié)晶滴中使其過(guò)夜溶解晶體并因此形成新的晶體，此過(guò)程通常在一星期之內(nèi)。
晶體結(jié)構(gòu)使用如下面實(shí)施例中詳細(xì)描述的結(jié)合內(nèi)在硫和偶然出現(xiàn)的溴離子的不規(guī)則散射而確定。
c.利用IGF-1晶體和其類似物的方法本發(fā)明的結(jié)晶IGF-1可用于各種目的。例如，結(jié)晶化過(guò)程本身還能進(jìn)一步純化IGF-1以達(dá)到均一性。因此，一個(gè)目的是提供高度純化的IGF-1，在論斷分析中，它可用作標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ?，例如作為分子重量?biāo)記或作為ELISA、放射性分析或放射性受體分析的對(duì)照物。而且結(jié)晶IGF-1晶體在室溫下是穩(wěn)定的，可以很容易地凍干并且比低純度的晶體更難降解。
在本發(fā)明的另一個(gè)用處中，允許進(jìn)行X-射線衍射研究的具有一定大小和質(zhì)量的IGF-1的晶體使本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員能夠進(jìn)行涉及IGF-1的結(jié)合特征，以及IGFBPs、IGF-1受體和與IGF-1連接的ALS結(jié)合特征的研究。
而且，從肽晶體結(jié)構(gòu)得到的結(jié)構(gòu)信息可用于鑒定化學(xué)物質(zhì)，例如，有機(jī)小分子、生物有機(jī)小分子如模擬肽和能結(jié)合IGF-1的合成有機(jī)分子，優(yōu)選阻抑或阻止IGF-1介導(dǎo)的或連接的過(guò)程或事件，或是作為IGF-1激動(dòng)劑。一個(gè)達(dá)到基于此結(jié)構(gòu)的化合物設(shè)計(jì)的例子在結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)藥物設(shè)計(jì)，Pandi Veerapandian編(Marcell DekkerNewYork 1997)中有所描述。
例如，已確定的IGF-1的三維結(jié)構(gòu)技術(shù)精通人員的實(shí)施例，構(gòu)建了如圖2和5所描繪的通過(guò)IGF-1的模型。因?yàn)殡暮投嚯闹械拿恳粋€(gè)原子可被描述為具有適當(dāng)?shù)姆兜氯A半徑的球體，所以便可以構(gòu)建折疊的IGF-1具體表面圖。得到的表面被稱作范德華表面。“溶劑可進(jìn)入的表面”是一個(gè)能讓化學(xué)探針、水分子進(jìn)入的表面，并且通過(guò)在保持與范德華表面接觸的肽的外部的滾動(dòng)適當(dāng)半徑的水分子構(gòu)建而成。那些與水分子表面接觸的部分范德華表面部分定義為一個(gè)連續(xù)表面稱之為“溶劑可進(jìn)入的表面”(Creighton，Thomas E.，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特性，第2版(W.H.Freemanand Company，1984)，pp227-229)。
呈遞模擬IGF-1的溶劑可進(jìn)入的表面的溶劑可進(jìn)入的表面的這種化學(xué)物質(zhì)可由本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員構(gòu)建。例如，技術(shù)精通人員能通過(guò)搜索化合物的三維結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫(kù)以鑒定那些在相似的三維結(jié)構(gòu)排列中決定適當(dāng)?shù)墓δ軋F(tuán)的位置的化合物，然后在這些化學(xué)物質(zhì)周圍構(gòu)建組合的化學(xué)文庫(kù)以鑒定出那些有高親和性的化學(xué)物質(zhì)。
本發(fā)明所能達(dá)到的一個(gè)方法是利用IGF-1的結(jié)構(gòu)同等物設(shè)計(jì)出能結(jié)合或連接IGF-1的化學(xué)物質(zhì)并用不同的方式改變化學(xué)物質(zhì)的物理特性。這些特性如溶解度、親和性、特異性、勢(shì)能、開(kāi)關(guān)頻率或其他結(jié)合特性都有可能改變或是最大限度的提高。
可通過(guò)探測(cè)具有不同個(gè)體的文庫(kù)的GIF-1晶體設(shè)計(jì)所需的化學(xué)物質(zhì)，以確定在候選化學(xué)介體和IGF-1間相互作用的理想位點(diǎn)。例如，從飽和溶液晶體所采集的高分辨率的X衍射數(shù)據(jù)可以確定每一種溶劑分子黏附的位置。然后可以設(shè)計(jì)并合成與那些位點(diǎn)緊密結(jié)合的小分子，并測(cè)試所需的活性。一旦獲得所必需的活性，還可以進(jìn)一步使分子的所需特征最大化。
本發(fā)明還試圖用電腦從小分子數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選或設(shè)計(jì)出能完全結(jié)合或部分結(jié)合IGF-1的化學(xué)物質(zhì)。它們還可用于解決的突變體、共復(fù)合物或其他至少能部分地結(jié)合IGF-1的同源分子的結(jié)晶形式的晶體結(jié)構(gòu)。
一種可用于此目的的方法是分子替代。一種未知的晶體結(jié)構(gòu)，它可能是任何未知的結(jié)構(gòu)，如其他IGF-1的結(jié)晶形式、IGF-1的突變體或肽、IGF-1的共復(fù)合物，和任何其它與IGF-1連接的化學(xué)物質(zhì)的未知晶體，可通過(guò)利用以上在附錄1中提到的結(jié)構(gòu)同等物來(lái)確定。IGF-1的共復(fù)合物包括，但不限于IGF-1-IGFBP-3、IGF-1-IGFBP-ALS、IGF-1-受體、IGF-1-肽或IGF-1-小分子。此方法將會(huì)比沒(méi)有用本發(fā)明的方法而要試圖確定未知晶體的精確結(jié)構(gòu)形式要更快更有效。
因此，所獲得的信息可有助于獲得最有效的IGF-1的抑制劑或拮抗劑。抑制或阻抗IGF-1的化學(xué)物質(zhì)的設(shè)計(jì)通常至少要考慮兩個(gè)因素。第一，化學(xué)物質(zhì)必須能在物理上或結(jié)構(gòu)上與IGF-1連接。這種連接可以是物理上的、結(jié)構(gòu)上的或化學(xué)上的連接，如共價(jià)或非共價(jià)連接，或范德華、疏水性或靜電連接。
第二，化學(xué)物質(zhì)必須有與IGF-1連接的構(gòu)象。盡管并非化學(xué)物質(zhì)的所有部分都必須參與連接IGF-1，但是那些非參與部分仍可能影響分子的所有構(gòu)象。這反過(guò)來(lái)對(duì)化學(xué)物質(zhì)的要求產(chǎn)生巨大的影響。這些構(gòu)象要求包括整個(gè)三維結(jié)構(gòu)和與所有或部分結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)的方向。
化學(xué)物質(zhì)對(duì)IGF-1的潛在抑制或結(jié)合效果可以在它真正合成之前進(jìn)行分析并利用電腦模型技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。如果給定化學(xué)物質(zhì)的理論結(jié)構(gòu)認(rèn)為它和IGF-1不能很充分的結(jié)合和相互作用，則不需要再合成和測(cè)試此化學(xué)物質(zhì)。然而，如果電腦模型表明有強(qiáng)烈的相互作用，那么可以合成此分子并測(cè)試它與IGF-1的結(jié)合能力。因此，這樣就可避免無(wú)用化合物的昂貴且費(fèi)時(shí)的合成。
IGF-1的抑制劑或其他結(jié)合化合物可用電腦評(píng)估和用一系列步驟進(jìn)行設(shè)計(jì)，其步驟是篩選化學(xué)物質(zhì)或片段并選擇他們與IGF-1各個(gè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合能力。
因此，本領(lǐng)域中的技術(shù)精通人員可利用這些方法中的一個(gè)篩選化學(xué)物質(zhì)或片斷的結(jié)合IGF-1的能力。此過(guò)程可從利用視覺(jué)檢查基于附錄1中的IGF-1類似物的電腦所篩選的結(jié)合位點(diǎn)開(kāi)始。然后，所選的片段或化學(xué)物質(zhì)可在IGF-1的各個(gè)結(jié)合口袋中不同方向或“船塢”中定位。停泊可利用如按照Quanta和Sybyl軟件，隨后是能量最小化和具有標(biāo)準(zhǔn)分子動(dòng)力場(chǎng)的分子動(dòng)力學(xué)，例如CHARMM和AMBER來(lái)完成。
特殊計(jì)算機(jī)程序可用于選擇出感興趣的片段或化學(xué)物質(zhì)。這些程序包括，如GRID，可從英國(guó)牛津的牛津大學(xué)獲得；MCSS或CATALYST，可從MolecularSimulations，Burlington，MA獲得；AUTODOCK，可從Scripps Research Institute，LaJolla，CA獲得；DOCK，可從加州大學(xué)，舊金山，CA獲得和XSITE，可從UniversityCollege of London，UK中獲得。
一旦選擇了合適的化學(xué)物質(zhì)或片段，則他們可組裝成抑制劑或拮抗劑。組裝可通過(guò)觀察在電腦上所顯示的每一個(gè)片段的三維結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系和與在此所公開(kāi)的結(jié)構(gòu)同等物的關(guān)系來(lái)完成。
另一方面，在實(shí)驗(yàn)上可以利用或者是空結(jié)合位點(diǎn)或者是一個(gè)包括了分子中有必須活性的部分的隨意位點(diǎn)來(lái)從頭設(shè)計(jì)所需的化學(xué)物質(zhì)。因此，例如可利用固相篩選技術(shù)把待評(píng)估的IGF-1或它的片段或候選化學(xué)物質(zhì)黏附到固相中，因而能為以后的研究鑒定出潛在的結(jié)合物。
基本上，可根據(jù)本發(fā)明使用任何分子模型技術(shù)；這些技術(shù)為本領(lǐng)域中的技術(shù)精通人士所知且很容易掌握?？梢岳斫獗景l(fā)明公開(kāi)的方法和組合物不僅能用于鑒定、設(shè)計(jì)或表征與IGF-1結(jié)合的化學(xué)物質(zhì)，另一方面還可鑒定、設(shè)計(jì)或表征IGF-1的類似物與受體結(jié)合，因而破壞IGF-1-受體的相互作用的化學(xué)物質(zhì)。如權(quán)利要求所述的本發(fā)明特意廣泛地包括這些方法和組合物。
一旦用上述方法設(shè)計(jì)出或選擇了某種化合物，那么化合物與IGF-1的結(jié)合效率可利用電腦或?qū)嶒?yàn)評(píng)估的手段測(cè)定并修改以獲得最大程度的所需的特征。各種不同的參數(shù)可依賴所需的結(jié)果而達(dá)到最大值。這些包括，但不僅限于特異性、親和性、開(kāi)閉頻率、疏水性、溶解度和其它為熟練的技術(shù)人員容易鑒定的特征。
此外，本發(fā)明有利于生產(chǎn)小分子藥物候補(bǔ)物質(zhì)。因此，如權(quán)利要求所述的晶體結(jié)構(gòu)還可用于得到IGF-1和小分子抑制劑的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的信息。例如，如果小分子抑制劑與IGF-1共結(jié)晶，則復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)通過(guò)使用用于相位計(jì)算的已知的IGF-1類似物進(jìn)行分子替代而得到解答。這些信息是有用的，例如，可以確定IGF-1和小分子抑制劑相互作用的特性并因此可提出能增強(qiáng)結(jié)合特征如親和性、特異性和動(dòng)力學(xué)的修改建議。
d.其他方法此處本發(fā)明還有助于提供一種鑒定基于與IGFBPs有關(guān)的N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺的抑制特性的IGF-1間接拮抗劑的方法。此方法包括比較N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺和候選的IGF-1間接拮抗劑抑制IGFBP-1或-3與IGF-1結(jié)合的能力；并確定候選的IGF-1間接拮抗劑是否至少不低于N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺的抑制結(jié)合能力。
優(yōu)選的比較是通過(guò)利用IC50檢測(cè)抑制IGFBP結(jié)合能力而在N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺和候選的IGF-1間接拮抗劑之間作競(jìng)爭(zhēng)性分析來(lái)完成的。在更優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，抑制結(jié)合的能力是通過(guò)把N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺或候選間接拮抗劑和在噬菌體顆粒上表達(dá)的IGF-1一起預(yù)先培養(yǎng)而測(cè)定的并檢測(cè)在基于平板分析如ELISA的基礎(chǔ)上IGF-1與IGFBP-1或IGFBP-3的所結(jié)合殘基。
本發(fā)明還提供一種鑒定包含有共結(jié)晶的候選拮抗劑與IGF-1以形成共結(jié)晶結(jié)構(gòu)的IGF-1間接拮抗劑的方法并確定候選間接拮抗劑分子是結(jié)合IGF-1中的一段還是兩段都結(jié)合。第一段包括的氨基酸殘基有Glu3、Thr4、Leu5、Asp12、Ala13、Phe16、Val17、Cys47、Ser51、Cys52、Len54和Len57，第二段包括氨基酸殘基Val11、Ghn15、Phe23、Phe25、Asp53、Asn26、Val44、Phe49和Arg55.此處的目的是，結(jié)合意味著至少有一個(gè)連接是在給定的一組中所列的每一個(gè)氨基酸殘基與共結(jié)晶結(jié)構(gòu)中小于或等于6的候選間接拮抗劑之間。這樣一種候選拮抗劑分子將有抑制IGF-1結(jié)合到IGFBP-1或IGFBP-3的特性。優(yōu)選的這種候選拮抗劑分子的抑制IGF-1更為優(yōu)選的方法是結(jié)合抑制是使用N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-胱氧阻胺與候選拮抗劑分子的競(jìng)爭(zhēng)分析測(cè)定的。最為優(yōu)選的方法是抑制結(jié)合的能力是通過(guò)把N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺或候選間接拮抗劑和在噬菌體顆粒上表達(dá)的IGF-1一起預(yù)培養(yǎng)而測(cè)定的并能檢測(cè)在基于平板分析如ELISA的基礎(chǔ)上IGF-1與IGFBP-1或IGFBP-3的所結(jié)合殘基。
此處N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺去垢劑可當(dāng)作模板以設(shè)計(jì)出與去垢劑有同樣效果的小分子藥物(與IGF-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IGFBP并隨后破壞IGF-1與IGFBP的相互作用使在原位上釋放出自由的IGF-1，使IGF-1成為有活性的并和它的受體結(jié)合)。與在下面實(shí)施例中所檢測(cè)的其他去垢劑相比，N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺缺少在C10位的氧原子.去垢劑的此區(qū)域與IGF-1的殘基Leu5，Leu54和Leu57的側(cè)鏈原子有緊密聯(lián)系。有相同類型構(gòu)象的分子將作為IGF-1的間接拮抗劑。
這樣鑒定的間接拮抗劑可用于一種治療拮抗劑紊亂的手段，其特征在于給患有這種病的哺乳動(dòng)物服用有效量的IGF-1間接拮抗劑。因此，這種拮抗劑可在治療上用于藥物的制備，例如用于此處所定義的拮抗劑紊亂進(jìn)行臨床試驗(yàn)或商業(yè)化。因此，此處間接拮抗劑的處方可用于治療可從IGF-1治療中受益的任何情況可在任何用IGF-1治療中受益的條件下治療，包括例如糖尿病、慢性和急性腎病，如慢性腎機(jī)能不全、壞疽等、肥胖癥、高胰島素血癥、GH-不足、唐納氏綜合癥、身材矮小、與衰老有關(guān)的不良癥狀如瘦肉-脂肪比增加、免疫缺陷癥包括CD4指數(shù)的增加和免疫耐受性的增加，與消耗有關(guān)的分解代謝異常，如Laron矮小綜合征，胰島素阻抗等等。
為了治療上的使用，此處間接拮抗劑組合物可通過(guò)任何合適的技術(shù)包括口服、腸道外注射、鼻腔滴入或肺部吸入等給哺乳動(dòng)物直接服用并可局部地或全身性地給與。特異性服用方法將依賴于如患者的醫(yī)療史，包括任何服用IGF-1后可感知的或可預(yù)期的副作用或效用的下降以及所要治療的病癥。腸道外注射的例子包括皮下注射、肌肉注射、靜脈注射、動(dòng)脈給予和腹膜內(nèi)注射。最為優(yōu)選的是，服用可持續(xù)注入(利用微型真空泵如滲透泵)，或通過(guò)注射(利用皮下注射或靜脈注射手段)。還可以單個(gè)大丸藥或緩釋儲(chǔ)存劑型用藥。最為優(yōu)選的是，直接拮抗劑口服給與或以一定頻率，優(yōu)選地一天二分之一次、一次、兩次或三次，最好是每天輸注或注射。
用于治療的拮抗劑組合物要以與好的醫(yī)療實(shí)踐相一致的方式配制和給與，考慮到患者個(gè)人的臨床條件(特別是用拮抗劑治療的副作用)，拮抗劑組合物的傳送位點(diǎn)，服用的方法，服用的時(shí)間表和其它臨床醫(yī)師所知的因素。因而用于本發(fā)明目的的拮抗劑的“有效量”是通過(guò)這些考慮而確定的且必須是治療被懷疑疾病的一定量。
作為總的建議，腸胃外給予的每劑拮抗劑總藥物有效量的范圍約從1μg/kg/天到100mg/kg/天，優(yōu)選的是10μg/kg/天到10mg/kg/天。如果是持續(xù)服用，則通常拮抗劑的服用劑量從1μg/kg/小時(shí)到100μg/kg/小時(shí)，或者是每天注射1-4次或通過(guò)持續(xù)的皮下輸入例如用微型真空泵或便攜式輸液泵。還可以使用靜脈袋溶液。選擇恰當(dāng)劑量的關(guān)鍵因素是使用醫(yī)師們認(rèn)為恰當(dāng)?shù)牟僮鳂?biāo)準(zhǔn)測(cè)量所獲得的結(jié)果。如果拮抗劑與胰島素混合使用，那么后者比單獨(dú)使用時(shí)的量要少，下降至其本身對(duì)于血糖幾乎沒(méi)有什么影響的量，如其量在0.1IU/kg/24小時(shí)到0.5IU/kg/24小時(shí)之間。
在一項(xiàng)具體實(shí)施方案中，為了腸胃外給予，通常拮抗劑是通過(guò)在一定所需純度的情況下，以單位劑量可注射的形式(溶液、懸浮液或乳狀液)，與藥物可接受的載體混和配制的，該藥物可接受的載體，即在使用的劑量和濃度下是不會(huì)對(duì)患者產(chǎn)生毒性的并和配方的其它組分相容。例如，優(yōu)選的配方不能包括氧化劑和其它已知的對(duì)多肽是有害的化合物。
通常，配方是通過(guò)使拮抗劑均一地和密切地與液體載體或精細(xì)劃分的固體載體或其二者接觸制備的。優(yōu)選的載體是一種非腸道載體，更為優(yōu)選的是與患者的血液等滲的溶液。這些載體裝置的例子包括水、鹽水、Ringer氏溶液和葡萄糖溶液。非水溶液載體如固定油和乙基油酸在此處也都是有用的，以及脂質(zhì)體。
合適的載體含有少量添加劑如那些能促進(jìn)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。這些物質(zhì)在所用的劑量和濃度內(nèi)對(duì)患者是沒(méi)有毒性的并包括緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、醋酸鹽和其他有機(jī)酸或它們的鹽類；抗氧化劑如抗壞血酸維生素C；低分子量多肽(少于10個(gè)殘基)，如多聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性多聚物如多聚乙烯吡咯烷酮；甘氨酸；氨基酸如谷氨酸，天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物包括纖維素或它的衍生物，葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；平衡離子如鈉；非離子表面活性劑如聚山梨醇酯、poloxamer或PEG，和中性鹽如NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2等。
拮抗劑典型是在這種賦表劑中以濃度為0.1mg/ml到100mg/ml，優(yōu)選的是1-10mg/ml，pH是從4.5-8中單獨(dú)形成的。最后的成品，如果是液體，最好能在2-8℃下儲(chǔ)藏4個(gè)星期。另一方面，該制劑可以凍干并以粉末的形式與水重新合成用于注射，并如上面所描述的液體制劑的儲(chǔ)存方式儲(chǔ)存。
用于治療給予的拮抗劑必須是無(wú)菌的。可用無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾便可很容易地獲得無(wú)菌的拮抗劑(0.2μm的膜)。醫(yī)療上的拮抗劑組合物通常放入一個(gè)具有無(wú)菌入口的容器中，例如靜脈內(nèi)溶液袋或具有可由皮下注射的針頭刺透的塞子的小瓶。
拮抗劑通常是存儲(chǔ)在單位或多劑量容器中，例如，以水溶液或重組的凍干劑型儲(chǔ)存在密封的安瓿或小瓶中。
通過(guò)參考下列實(shí)例將會(huì)對(duì)本發(fā)明有一個(gè)更好的理解。然而，他們不應(yīng)該限制本發(fā)明的范圍。所公開(kāi)的所有文獻(xiàn)和專利在此全文引入，以供參考。
實(shí)施例1
IGF-1晶體的結(jié)晶及其特征IGF-1的結(jié)晶和數(shù)據(jù)采集重組人類IGF-1(rhIGF-1)可如美國(guó)專利號(hào)5,723,310的實(shí)施例中所描述的利用用于相位一形成種類的聚合物/鹽組合而得到，并如美國(guó)專利號(hào)5,681,814的實(shí)施例中所描述的配制(乙酸、氯化鈉、聚山梨醇酯20和芐基醇)，放入含有7ml的濃度為10mg/ml的rhIGF-1的小瓶中。它被除去鹽分形成0.15M NaCl，20mM NaOAc，pH4.5，并稀釋到最終濃度為10mg/ml。一滴4μl的IGF-1溶液與5μl的儲(chǔ)蓄液(24％聚乙二醇3350用0.1M甲次砷酸鈉緩沖到pH6.5)和1μl的濃度為14mM的N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺混和，它是從用于結(jié)晶篩選的CRYSTAL SCREENTM試劑盒中獲得的并可從Hampton Research，Laguna Nigel，CA中得到。此溶液與1mL的儲(chǔ)蓄液通過(guò)蒸汽擴(kuò)散(Jancarik等，同上)而達(dá)到平衡。因此，一滴混合液懸浮在儲(chǔ)蓄液上方的塑料蓋上下。一個(gè)細(xì)細(xì)的，平板狀的小晶體便在4-5天之內(nèi)出現(xiàn)了。此時(shí)，向結(jié)晶液滴中加入2μl的100％甲基戊二醇(MPD)(終濃度為20％)，并使晶體溶解過(guò)夜。在1星期之內(nèi)，晶體再次出現(xiàn)且最終長(zhǎng)成有明顯鋒利邊緣的0.2mm×0.1mm×0.05mm形狀。這些晶體可用于所有的后續(xù)分析。
本領(lǐng)域中那些精通技術(shù)的人員將會(huì)認(rèn)為上述的結(jié)晶條件可以發(fā)生變化。通過(guò)改變結(jié)晶條件，可以獲得其它IGF-1的結(jié)晶形式。這些變化可單獨(dú)使用也可混合使用，例如，包括改變最終蛋白質(zhì)濃度在約5到35mg/ml之間；改變IGF-1與沉淀劑的比率，改變沉淀劑聚乙二醇的濃度在20-30％之間，改變pH范圍在5.5-7.5之間，改變?nèi)ス竸┑念愋突驖舛龋淖儨囟仍诩s-5℃-30℃之間并利用上述的條件及其變化通過(guò)分批、液橋或透析方法結(jié)晶IGF-1。見(jiàn)McPherson等(1982)，同上。
IGF-1晶體的表征從母液中把一單晶轉(zhuǎn)移至含有25％(w/v)聚乙二醇3350，30％MPD，0.2MpH6.5的甲次砷酸鈉，2.8mM的N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺和1M的溴化鈉的冰冷的防護(hù)劑溶液中。衍射波長(zhǎng)是1.8。放入此溶液后30秒，晶體通過(guò)把溶液放入液氮中而快速冷卻。冷凍晶體的技術(shù)對(duì)于永久的保存是必需的并能得到一組高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。所有的后續(xù)操作和X衍射數(shù)據(jù)采集都是在100K的溫度下進(jìn)行的。
一個(gè)4波長(zhǎng)MAD數(shù)據(jù)組在Stanford Synchrotron Radiation Laboratory中以光線為9-2下收集，數(shù)據(jù)組的順序如下溴峰值(λ1)，低能量偏移(λ2)，溴變形(λ3)和高能量偏移(λ4)。溴峰值和回折點(diǎn)是對(duì)晶體熒光掃描的評(píng)估結(jié)果，且低能量偏移選擇1.54，當(dāng)吸收效果最小時(shí)，則在此波長(zhǎng)下使硫反常小信號(hào)最大化。沒(méi)有使用過(guò)倒轉(zhuǎn)光線幾何學(xué)。運(yùn)用Denzo和Scalepack(Otwinoski和Minor，Methods inEnzymology，276307-326(1997))進(jìn)行數(shù)據(jù)縮減。為了有可能確定最精確的尺度和B-因子，所有的四種波長(zhǎng)數(shù)據(jù)起初是在一起測(cè)量的，并認(rèn)為沒(méi)有反常信號(hào)。然后，通過(guò)此測(cè)量方法所確定的尺度和B-因子應(yīng)用于四組數(shù)據(jù)中的每一組。
屬于空間組C2221的晶體其晶胞常數(shù)為a＝31.83，b＝71.06，c＝66.00，α＝β＝γ＝90.000°。含有IGF-1單位的晶體的不對(duì)稱單位和單一去垢劑分子結(jié)合，得到一種Matthew氏系數(shù)為2.43/Da或48.1％溶劑。晶體的溶劑含量為55％。
結(jié)構(gòu)測(cè)定最初利用或者可獲得的IGF-1的NMR模型或利用胰島素的晶體結(jié)構(gòu)通過(guò)分子替代來(lái)確定IGF-1的結(jié)構(gòu)的嘗試沒(méi)有成功。由于此，通過(guò)溴多波長(zhǎng)異常色散(MAD)(Dauter等，Acta Crystallogr.，D56232-237(2000))的方法來(lái)從頭確定結(jié)構(gòu)。
單鍵溴化物類似物是通過(guò)異常和離散差異Patterson圖的手工檢驗(yàn)而確定的。手工操作的分歧可通過(guò)利用程序SHARP(De La Fortelle and Bricogne，酶學(xué)方法，276472-494(1997))購(gòu)自from Global Phasing Limited，43Newton Road，Cambridge CB22AL，ENGLAND的而對(duì)相位作精細(xì)修改而得到解決，隨后是利用λ2Bijvoet差異計(jì)算的異常差異傅立葉圖的檢測(cè)。一組溴類似物的一方面中的6個(gè)峰值與胰島素的二硫結(jié)構(gòu)相一致(PDB編碼1ZNI)。這六個(gè)峰值相應(yīng)于IGF-1的六個(gè)半胱氨酸γ硫原子；第7個(gè)硫原子(甲硫氨酸59δ原子)在反常差異傅立葉圖中沒(méi)有檢測(cè)到，推斷的原因是因?yàn)樗懈叩臏囟纫蜃?36.72)。在此處，六個(gè)半胱氨酸γ硫原子的位置包括在項(xiàng)位精修中，并有一組λ1數(shù)據(jù)作為參考。貫穿整個(gè)相位精修，溴f”是對(duì)λ1數(shù)據(jù)組的改進(jìn)，f’和f”是對(duì)λ3的改進(jìn)，二者相對(duì)于數(shù)據(jù)組λ2和λ4都保持固定；對(duì)于每一個(gè)波長(zhǎng)硫的f”和f’的值在理論值保持固定不變。硫原子的反常小信號(hào)對(duì)于相統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)有很小的作用，但是最終的電子密度圖顯示了改進(jìn)的連接性，特別是在IGF-1的比較無(wú)序的區(qū)域中。
密度修改(溶劑平均化和柱狀圖譜)是使用DM進(jìn)行的(CollaborativeComputational Project Number 4，Acta Crystallogr.，D50760-763(1994)；Cowtan，Joint CCP4和ESF-EACBMNewsletter on Protein Crystallography，3134-38(1994))且終電子密度圖譜是高質(zhì)量的。對(duì)應(yīng)于IGF-1的三個(gè)螺旋區(qū)域的大約50％的結(jié)構(gòu)獲得的利用程序O(Jones等，Acta Crystallogr.，A47110-119(1991))和QUANTA(97.0版，MSI，San Diego，CA)在實(shí)驗(yàn)上直接建立了電子密度圖譜。利用Sigma(Collaborative Computational Project Number 4，同上；Read，Acta Crystallogr.，A42140-149(1986))幾輪的相位混合在一起以允許剩余分子建立模型。原子位置和受限制的B-因子的改進(jìn)利用了CNX的最大可能目標(biāo)功能(Brunger等，ActaCrystallogr.，D54905-921(1998)and MSI，San Diego，CA)，并與“面具”型的大量溶劑校正和重折光的全B-因子定標(biāo)相偶聯(lián)。
最終的模型包括IGF-1的3-34和41-64殘基，一個(gè)N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺分子，一個(gè)溴原子和50個(gè)水分子。此模型對(duì)λ3數(shù)據(jù)組進(jìn)行了改進(jìn)，因?yàn)閿?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示此數(shù)據(jù)組比其它數(shù)據(jù)組有更高質(zhì)量。從20-到1.8-分辨率的所有數(shù)據(jù)都包括在此改進(jìn)中而不需要應(yīng)用σ截止。二級(jí)結(jié)構(gòu)排布是用程序PROMOTIF(Hutchinson和Thornton，Protein Science，5212-220(1996))制成的。
當(dāng)利用兩組相位得出IGF-1的有序位置是必需相同的，分子中比較靈活的區(qū)域顯示相位中硫原子的連接程度得到顯著改進(jìn)。顯示緊接著第一螺旋的IGF-1轉(zhuǎn)角區(qū)域(殘基19，20和21)實(shí)驗(yàn)電子密度的表明利用混合溴和硫的相位要比單獨(dú)利用溴的相位更能得到更好連接的圖譜。此時(shí)，利用溴+硫的相位，大約50％的分子能直接在實(shí)驗(yàn)圖譜上得到追蹤。
結(jié)構(gòu)描述通過(guò)幾輪的模型構(gòu)建和相位混合，最后的模型，在圖2中顯示，包括IGF-1的殘基3-34和41-64，一個(gè)單一結(jié)合的去垢劑分子和46個(gè)水分子。到達(dá)1.8的R因子是23.7％，而自由R因子是26.9％，且有很好的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。N端的B區(qū)對(duì)應(yīng)的殘基從3-28，C區(qū)從29-34，一組無(wú)序的殘基從35-40且A區(qū)是從42-62。D區(qū)(63-70)基本是無(wú)序的。
IGF-1的結(jié)構(gòu)與胰島素相似(見(jiàn)圖3)，具有在兩個(gè)分子之間保守的主鏈原子上3的均方根差(RMSD)。大部分這些偏差發(fā)生在靈活的區(qū)域，并當(dāng)只考慮到螺旋區(qū)域時(shí)，在α碳原子的RMSD值約0.47。其主要區(qū)別在于遠(yuǎn)離分子主體的C區(qū)的延伸程度，且對(duì)于它在成熟胰島素中沒(méi)有配對(duì)物。此環(huán)包含許多殘基，已知這些殘基對(duì)于受體結(jié)合來(lái)說(shuō)是重要的。
一個(gè)對(duì)IGF-1的丙氨酸-掃描誘變的廣泛研究顯示了那些殘基對(duì)于結(jié)合IGFBP-1和IGFBP-3是重要的。(Dubaquie和Lowman，同上)。這些結(jié)合IGFBP-3的殘基與那些結(jié)合IGFBP-1的相似，盡管IGFBP-3被認(rèn)為是更依賴于主鏈之間的相互作用且受丙氨酸突變的影響更小。沒(méi)有一個(gè)鮮明的點(diǎn)在那里對(duì)于IGFBP-1和IGBP-3結(jié)合重要的殘基聚集成簇，以及使破壞結(jié)合的突變分散在整個(gè)分子中。似乎在N端有一小簇的點(diǎn)聚集，這些點(diǎn)中的大部分具有內(nèi)在的疏水性。
如圖4和7所示，去垢劑分子結(jié)合在B-螺旋底部的一小疏水縫隙中。幾個(gè)直接的副鏈與去垢劑的5，7和10殘基接觸。盡管去垢劑的結(jié)合位點(diǎn)與部分IGFBP-1/IGFBP-3的結(jié)合表位有重疊，但初始的結(jié)果表明，不限于任何一種理論，去垢劑并不能抑制這些蛋白與IGF-1結(jié)合。去垢劑相反面與IGF-1的反面有一個(gè)對(duì)稱的結(jié)合。
如圖5所示，只有一個(gè)大晶體包連接在對(duì)稱相關(guān)的兩個(gè)IGF-1分子之間，產(chǎn)生對(duì)稱的同型二聚體。包埋面的面積是13782，它是在兩個(gè)生理上相關(guān)的蛋白分界面范圍之內(nèi)的。
圖6顯示了在二聚體表面已知對(duì)于受體結(jié)合簇重要的殘基。所顯示的是Tyr24，Thr29，Tyr31和Tyr60。這些殘基的突變導(dǎo)致對(duì)于個(gè)體突變的受體親和性大概6-20倍的損失，或?qū)τ陔p重突變親和性240-200倍的損失。還顯示的是Phe23和Phe25，它們與胰島素的Phe24和Tyr26相互交換，但親和性沒(méi)有降低。
結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步描述IGF-1主要由分別對(duì)應(yīng)胰島素的B-螺旋(IGF-1殘基7-18)和兩個(gè)A-螺旋(IGF-1殘基43-47和54-58)三個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)片段的所組成。疏水核心必須和IGF-1的NMR結(jié)構(gòu)所描述的相同，包括在Cys6和Cys48之間，在Cys18和Cys61之間的三個(gè)二硫鍵，在Cys47和Cys52之間，如上面參考文獻(xiàn)所提及的。殘基3到6并不形成常規(guī)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，因而在此處所描述的結(jié)構(gòu)歸類為最類似于T形胰島素(Derewenda等，Nature，338594-596(1989))；實(shí)際上，當(dāng)IGF-1和T形胰島素重疊在各自的螺旋片段(IGF-1殘基8-19，42-49和54-61；胰島素殘基B9-B20，A1-A8和A13-A20，其RMSD只有0.93)的Cα位置之上。當(dāng)在胰島素中，在B螺旋末端的殘基18-21形成類型II’β轉(zhuǎn)角，再指導(dǎo)主鏈從B螺旋進(jìn)入一個(gè)延伸的區(qū)域。殘基24-27形成類型VIIIβ轉(zhuǎn)角以適應(yīng)C區(qū)，它能延伸出IGF-1的核心區(qū)域并與對(duì)稱相關(guān)的分子相互作用。殘基30-33形成一個(gè)已很好定義過(guò)的類型IIβ轉(zhuǎn)角，在i+1位置顯著地表現(xiàn)為Tyr31。殘基35-40并沒(méi)有建立模型，因?yàn)榇藚^(qū)域的電子密度很微弱且不是相關(guān)聯(lián)的。D區(qū)中只有頭兩個(gè)殘基(63和64)在結(jié)構(gòu)中是有序的。
IGF-1的C區(qū)介導(dǎo)跨越晶胞的α軸的雙重對(duì)徇晶體的相互作用。此相互作用從IGF-1的各個(gè)分子包埋了6892的溶劑可進(jìn)入的面積或者是整個(gè)13782，并且是晶體中的最大界面。全部28個(gè)分子間的在3.6或更少距離的連接是通過(guò)此臨界面而形成的，而隨后的最廣泛的晶體包之間的相互作用只形成九個(gè)連接。臨界面的核心是由每一個(gè)單體的Tyr24和Pro28所控制的，它分別包埋了面積為392和572的溶劑可進(jìn)入的表面。在IGF-1核心的最深處的環(huán)的頂端處的Tyr31的芳香環(huán)包圍對(duì)稱分子的Phe23和Phe25的酚環(huán)。除了這些疏水性相互作用外，兩條主鏈的氫鍵(Tyr31 N-Phe23 0；Ser 34 N-Asp 20 0)也存在于二聚體的臨界面中。D區(qū)的殘基(62-64)還部分地被二聚體結(jié)構(gòu)所隱藏。因?yàn)橛羞@些相互作用，晶體中C區(qū)的大部分是非常有序的，便可提供有重要生物活性的環(huán)的構(gòu)造的第一高分辨率圖。
盡管72種去垢劑化合物，包括類似3-((3-丙基膽胺)二甲胺)-1-丙烷磺酸鹽(CHAPS)和3-((3-丙基膽胺)二甲胺)-2-羥基丙烷磺酸(CHAPS)去垢劑，都是在結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中篩選出來(lái)的，但只有N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺能產(chǎn)生晶體。單分子的N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺與殘基相互作用，在IGF-1的一個(gè)表面上(Leu5，Phe16，Val17，Leu54和Leu57)(圖7A)形成一小的疏水性縫隙。N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺的優(yōu)選性已經(jīng)通過(guò)在去垢劑分子中C10位置的氧原子缺少而得到解釋，但它不限于任何一種理論。去垢劑的此區(qū)域與IGF-1殘基Leu5、Leu54和Leu57的側(cè)鏈原子有緊密聯(lián)系。去垢劑的反面介導(dǎo)與對(duì)稱相關(guān)的IGF-1分子的殘基Val11、Leu14和Gln15的對(duì)稱接觸。令人感興趣的是，N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺的這一面還與二聚體臨界面邊緣有聯(lián)系，且與同一個(gè)IGF-1分子中的Phe23和Phe25以及二聚體配偶體Tyr31和Gly32有緊密聯(lián)系(圖7B)。一個(gè)更為細(xì)致地分析表明去垢劑與IGF-1的兩組結(jié)合口袋結(jié)合。一組有殘基Glu3、Thr4、Leu5、Asp12、Ala13、Phe16、Val17、Cys47、Ser51、Cys52、Asp53、Leu54和Leu57，第二組氨基酸殘基是Val11、Gln15、Phe23、Phe25、Asn26、Val44、Phe49和Arg55。結(jié)合是通過(guò)在所列各氨基酸殘基和候選拮抗劑之間具有至少一個(gè)連接，并該連接小于或等于6來(lái)定義的。
討論IGF-1晶體結(jié)構(gòu)的C區(qū)延伸至分子核心外，且殘基30-33形成一個(gè)規(guī)則的II類型的β轉(zhuǎn)角，且剩余的C區(qū)形成一個(gè)對(duì)稱相關(guān)分子的結(jié)晶二聚體。有暗示表明Tyr31是作為IGF-1R結(jié)合的關(guān)鍵決定性因素，并且它在此范圍的頂端位置使之處于一個(gè)與受體分子相互作用的理想位置。當(dāng)IGF-1的這個(gè)區(qū)域沒(méi)有被NMR數(shù)據(jù)所確定時(shí)，晶體中C區(qū)的構(gòu)象很可能反映出溶液的構(gòu)象。有證據(jù)表明存在環(huán)的頂端反轉(zhuǎn)和在IGF-2的環(huán)末端有一個(gè)鉸鏈彎曲(Torres等，同上)。因此，當(dāng)晶體堆積力會(huì)毫無(wú)疑問(wèn)的幫助穩(wěn)定此環(huán)的方向時(shí)，它的構(gòu)象與IGF-2緊密相關(guān)的溶液結(jié)構(gòu)相一致。
由結(jié)晶二聚體形成的臨界面的大小是很好地在已知的有生物活性的復(fù)合物中被包埋的表面區(qū)域的范圍之內(nèi)(Janin和Chothia，J.Biol.Chem.，26416027-16030(1990))。此外，此相互作用部分地排除了溶劑中一些已知對(duì)于結(jié)合IGF-1R重要的殘基，包括Phe23(包埋度69％)、Tyr24(64％)、Phe25(29％)和Tyr31(38％)。其他研究小組還報(bào)道了IGF-1與IGF-2的同型二聚體相互作用。Laajoki等，(2000)，同上，報(bào)道了在濃度為1mM，IGF-1的人工形式(Long-[Arg3]IGF-1)劃分為20％的二聚體/80％的單體，此比率是與評(píng)估的3.6mM Kd能很好的一致。在他們的IGF-2的NMR研究中，Torres等，見(jiàn)上文，報(bào)道了C-區(qū)中殘基的酰胺質(zhì)子緩慢地與溶劑交換，暗示了IGF-2在溶液中形成同源二聚體。然而，盡管大量表面區(qū)域埋在在晶體中的二聚體內(nèi)，但是IGF-1本身的親和力是非常弱的。此外，已知的與每個(gè)受體二聚體結(jié)合的一個(gè)IGF-1分子化學(xué)計(jì)算法(De Meyts，同上)使其很難合理地進(jìn)行有重要生物活性的IGF-1二聚化。結(jié)論是，在此晶體形式中的IGF-1二聚體是由在結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中高濃度的IGF-1所制得的且不能代表生理上相關(guān)的分子構(gòu)型。
在接近中性pH的條件下所獲得的IGF-1非常低質(zhì)量NMR光鏡數(shù)據(jù)是因?yàn)樽跃喓虾蛯?dǎo)致共振譜線寬度很大變化的內(nèi)部移動(dòng)的結(jié)合(Cooke等，同上)。結(jié)果是，從IGF-1中獲得的NOESY光譜包括許多寬大的，重疊的頂點(diǎn)和幾乎不鋒利的很好分辨的關(guān)聯(lián)。在過(guò)量的N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺存在的情況下為IGF-1采取集的NOESY光譜有一個(gè)相似的表形。因此，去垢劑的結(jié)合并不足以消除IGF-1的聚集或一貫的靈活性且不能促進(jìn)蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象的表征。這與所觀察到的結(jié)晶狀態(tài)形成對(duì)比，添加去垢劑導(dǎo)致形成一個(gè)很有序的晶體二聚體其衍射分辨率達(dá)到很高。Jansson等，J.Biol.Chem.，27324701-24707(1998)指出在緊挨著Cys6周圍的區(qū)域中缺少NMR的排布，它包括Leu5和Gly7，指出Cys6-Cys48的二硫化物在順式和反式構(gòu)象之間相互轉(zhuǎn)換。去垢劑結(jié)合B-螺旋中的一面正對(duì)著二硫化物這個(gè)事實(shí)暗示了，不限于任何一個(gè)理論，它可能通過(guò)對(duì)疏水縫隙更完整的包裝以穩(wěn)定分子的此區(qū)域。事實(shí)上，在此處的晶體結(jié)構(gòu)中，Cys6-Cys48明顯地處于反式構(gòu)象中且沒(méi)有證據(jù)表明存在多種構(gòu)象。
結(jié)論IGF-1的晶體結(jié)構(gòu)通過(guò)對(duì)內(nèi)在硫原子和結(jié)合在不規(guī)則的鹵化物結(jié)合位點(diǎn)上的溴離子的的異常散射確定。此結(jié)構(gòu)與胰島素非常相似，其唯一的主要區(qū)別是C區(qū)，它在蛋白體中突出并介導(dǎo)同源二聚體的相互作用。所埋入的表面區(qū)域量與在中性pH下IGF-1以依賴濃度的方式進(jìn)行自締合的事實(shí)一致。此外，在該二聚體表面發(fā)現(xiàn)幾個(gè)對(duì)于受體結(jié)合重要的殘基，意味著，不限于任何一個(gè)理論，這些殘基的突變對(duì)于與受體結(jié)合的影響可能是由于二聚體的破壞，而不是直接與受體表面相互作用。
實(shí)施例2基于擴(kuò)散的對(duì)去垢劑結(jié)合能力的測(cè)量由NMR所得到的擴(kuò)散方法適用于評(píng)估在IGF-1和N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺之間的Kd值。樣品的制備是在50mM的D20的磷酸緩沖液中，pH6.5(未校正反表讀數(shù))并包括1.0mM N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺+0.5mM IGF-1；0.5mM N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺+0.25mM IGF-1；0.25mMN，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺+0.125mM IGF-1；或僅N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺(1.0，0.5或0.25mM)。所有的光譜是在40℃下用配備有一個(gè)5mm的三聯(lián)梯度，三聯(lián)共振探針Bruker AVANCE 500TM的分光光度計(jì)(BrukerAnalytik GmbH)測(cè)量的。擴(kuò)散測(cè)量是用二極脈沖對(duì)方法在δ＝5ms，τ＝2ms，Δ＝25或40ms分別對(duì)應(yīng)于單獨(dú)使用N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺或N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺+IGF-1的條件下測(cè)量(Wu等，J.Magn.Reson.，Ser.A 115260-264(1995))。當(dāng)Z-梯度的強(qiáng)度在18次等量增加中從0.009Tm-1增至0.45Tm-1時(shí)，光譜在128到1024瞬間中采集；每種樣品至少測(cè)量?jī)纱?。FELIX(v98.0，MSI，San Diego)處理光譜和獲取峰高。擴(kuò)散常數(shù)、去垢劑結(jié)合比率和Kd的結(jié)果值由Fejzo等，Chemistry&Biology，6755-769(1999)中所描述的方法獲得。光譜也可在含有1.0mM 3-((3-丙基膽胺)二甲胺)-1-丙烷磺酸鹽，一種用于膜溶解的兩性離子去垢劑和1.0mM 3-((3-丙基膽胺)二甲胺)-1-丙烷磺酸鹽+0.5mM IGF-1的樣品中采集到。二維NOESY光譜(Jeener等，J.Chem.Phys.，714546-4553(1979))是在0.5mM的混有或缺少1.0mM N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺且其混合時(shí)間為100ms的IGF-1樣品中采集到的。
IGF-1噬菌體ELISA用在Dubaquie和Lowman，同上中描述的展示人類IGF-1的噬菌體載體pIGF-g3新鮮轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞(XL1-藍(lán)，策略基因)，在5ml的2YT培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Handbook(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989))。針對(duì)IGFBP-1和IGFBP-3滴定顯示IGF-1的噬菌體顆粒以獲得預(yù)培養(yǎng)的稀釋倍數(shù)在500-1000倍之間的去垢劑并且結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)蛋白35分鐘。有MAXISORPTM表面(Nunc，Denmark)的有干凈微孔聚苯乙烯免疫平板鋪用IGFBP-1或IGFBP-3蛋白覆蓋并在4℃下過(guò)夜(3μg/ml的50μl，在50mM的碳酸緩沖液中，pH9.6)，并用0.5％的TWEEN20的聚氧乙烷山梨聚糖單月桂酸(Atlas Chemical Co.)和PBS阻抑，并用PBS和0.05％的TWEEN20的聚氧乙烷山梨聚糖單月桂酸洗八次。然后把樣品加入平板30分鐘。用PBS和0.05％的TWEEN20聚氧乙烷山梨聚糖單月桂酸洗平板八次，并用含有50μl的1∶10,000山葵過(guò)氧化酶/抗-M13抗體結(jié)合劑的PBS(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)和0.5％BSA培養(yǎng)30分鐘，然后用PBS，0.05％的TWEEN20的聚氧乙烷山梨聚糖單月桂酸洗八次，再用PBS洗兩次。用四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯培養(yǎng)基(Kirkegaard和Perry，Gaithersburg，MD)培養(yǎng)平板，用1.0H3PO4停止反應(yīng)，在450nm的波長(zhǎng)下讀取分光光度值。
沉降平衡分析IGF-1的自締合是通過(guò)沉降平衡分析而確定的。實(shí)驗(yàn)是在20℃下OPTIMATMXL-A/XL-I超速離心分析儀(Beckman Coulter，Inc)進(jìn)行的。樣品是在0.1M檸檬酸緩沖液中制備的，其pH6.5，75mM NaCl，其加載濃度是從1mM到0.01mM.濃度梯度的測(cè)量是用掃描吸收光學(xué)系統(tǒng)在280nm或285nm的波長(zhǎng)下轉(zhuǎn)速為25000和30000rpm下進(jìn)行的。平衡狀態(tài)的獲得是在大約16小時(shí)后通過(guò)比較連續(xù)掃描而確認(rèn)的。這個(gè)部分的IGF-1特定體積可以從它的氨基酸組成中計(jì)算。利用非線性最小平方配合程序NONLIN(Johnson等，Biophys.J.，36578-588(1981))裝配數(shù)據(jù)得到單個(gè)理想的種類或理想的二聚體自締合模型。締合常數(shù)是由此模型的最佳值所確定的，并通過(guò)非線性最小平方回歸而回歸。
結(jié)果N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺在溶液中結(jié)合IGF-1利用溶液NMR方法可確認(rèn)N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺和3-((3-丙基膽胺)二甲胺)-1-丙烷磺酸鹽與IGF-1的親和力。在把N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺滴入0.5mM的IGF-1溶液中使所觀察到的化學(xué)位移變化暗示了親和性是亞毫摩爾且從這些數(shù)據(jù)中不能很容易地得出測(cè)量結(jié)果。相反，對(duì)這些樣品在不同的IGF-1濃度且含有2摩爾的去垢劑平衡液中使用擴(kuò)散測(cè)量方法而且也對(duì)一些只含有去垢劑(去垢劑的濃度總是比1.4mM的N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺和14mM的3-((3-丙基膽胺)二甲胺)-1-丙烷磺酸鹽的臨界微團(tuán)的濃度要低)的樣品使用擴(kuò)散測(cè)量方法。蛋白質(zhì)存在時(shí)去垢劑的擴(kuò)散常數(shù)的降低可用于評(píng)估去垢劑結(jié)合蛋白質(zhì)的比例(Fejzo等，同上)。因?yàn)槿ス竸┖偷鞍踪|(zhì)的總濃度是已知的，則可確定解離常數(shù)的值。在所研究的三種蛋白濃度(0.5mM，0.25mM，0.125mM)中，可分別獲得Kd值220，440，430μM。此技術(shù)常規(guī)地應(yīng)用在小分子(幾百道爾頓分子量或更少)與大蛋白的結(jié)合上。在此特殊應(yīng)用中，配體相對(duì)大一些(862Da)而蛋白質(zhì)則相對(duì)小一些(7648Da)；因此，結(jié)合的擴(kuò)散常數(shù)的差別減少是微小的。這種不確定性的增加可以測(cè)量解離常數(shù)。基于此，上面所描述的數(shù)據(jù)表明了N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺和IGF-1之間相互作用的Kd值是300±150μM。3-((3-丙基膽胺)二甲胺)-1-丙烷磺酸鹽的擴(kuò)散數(shù)據(jù)的相似分析表明在這種情況下的Kd值大于3mM.
N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺阻抑IGFBP-1和IGFBP-3的結(jié)合為了檢測(cè)N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺結(jié)合IGF-1的抗原決定基，去垢劑用在噬菌體顆粒上表達(dá)的IGF-1預(yù)培養(yǎng)，結(jié)合IGFBP-1和IGFBP-3的殘基水平用基于平板分析(ELISA)技術(shù)來(lái)測(cè)量。作為對(duì)照，3-((3-丙基膽胺)二甲胺)-1-丙烷磺酸鹽也同樣這樣測(cè)量。如圖8所示，N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺完全抑制噬菌體上的IGF-1結(jié)合到其IC50值分別是740±260μM和231±29μM的IGFBP-1和IGFBP-3上。然而，這些數(shù)值可以做保守的解釋，因?yàn)镹，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺的臨界微團(tuán)濃度(1.4mM)代表了圖8曲線的上限。與N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺的效果相比，緊密相關(guān)的3-((3-丙基膽胺)二甲胺)-1-丙烷磺酸鹽在濃度一直達(dá)到1mM中并沒(méi)有表現(xiàn)出任何的結(jié)合抑制。盡管受到試驗(yàn)的限制，所得到的N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺IC50值與上面所估計(jì)的N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺-IGF-1相互作用的Kd值有很好的一致性。
IGF-1的自締合沉降平衡數(shù)據(jù)表明IGF-1在溶液中發(fā)生自締合。平均分子量隨著蛋白質(zhì)濃度從0.01mM增加到1mM而增加。在最高濃度研究的硬度的平均分子量約比單體分子量高37％(1mM是10.4KD相對(duì)于7.6KD的單體分子量)。在低于0.05mM的濃度中，沒(méi)有觀察到自締合，并且IGF-1在中性pH的溶液中只以單體形式存在。如果認(rèn)為高分子量的物質(zhì)就是IGF-1的二聚物，則沉降數(shù)據(jù)可以適合Kd值是3.6+1.0mM(圖9)的單體-二聚體模型。
一些研究鑒定出對(duì)于結(jié)合IGFBP是重要的IGF-1殘基(Clemmons等，Endocrinology，131890-895(1992)；Dubaquie和Lewman，同上；Jansson等，同上；Oh等，(1993)同上；Lowman等(1998)同上，和Dubaquie等，Endocrinology，142165-173(2001))。Dubaquie和Lowman，同上，鑒定了與IGFBP-1和IGFBP-3相互作用的IGF-1中不同的兩組。組I包括Glu7、Leu10、Val11、Leu14、Phe25、Ile43和Val44，而組II包括Glu3、Thr4、Leu5、Phe16、Val17和Leu54。在IGF-1的晶體結(jié)構(gòu)中，這兩組都涉及由去垢劑介導(dǎo)的晶體包裝接觸。(具體的是，IGF-1的晶體結(jié)構(gòu)中的組I包括的氨基酸殘基有Glu3、Thr4、Leu5、Asp12、Ala13、Phe16、Val17、Cys47、Ser51、Cys52、Asp53、Leu54和Leu57，IGF-1的晶體結(jié)構(gòu)中的組2包括的氨基酸殘基有Val11、Gln15、Phe23、Phe25、Asn26、Val44、Phe49和Arg55，其中如果在每一個(gè)所列的氨基酸殘基和候選拮抗劑分子之間存在至少一個(gè)小于或等于6的接觸那么結(jié)合就會(huì)發(fā)生)。
去垢劑的結(jié)合位點(diǎn)與IGFBP相互作用表面的重疊完全與在此處所觀察到的N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺阻抑IGFBP-1和IGFBP-3的結(jié)合相一致。與此相反，N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺并不抑制在細(xì)胞基礎(chǔ)的受體活化分析中IGF-1R介導(dǎo)的信號(hào)通路。這些結(jié)果與最初證明IGF-1上對(duì)于受體和IGFBP相互作用的不同結(jié)合表位的研究是一致的。(Bayne等，同上，(264卷)；Bayne等，同上，(265卷)；Cascieri等，同上)。N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺作為IGFBP相互作用的抑制劑的鑒定使得有能夠開(kāi)發(fā)小分子藥物或能在體內(nèi)破壞IGF-1/IGFBP復(fù)合物的模擬肽，因此從系統(tǒng)的非活性的庫(kù)中釋放受體激活的IGF-1。這些藥物包括用于對(duì)代謝疾病如糖尿病的口服療法。
最近，Zeslawski等，EMBO J.，203638-3644(2001)發(fā)表了與IGFBP-5的N末端區(qū)域的復(fù)合的IGF-1的晶體結(jié)構(gòu)。復(fù)合物的結(jié)構(gòu)完全與此處所表述的去垢劑抑制IGFBP結(jié)合的模型相一致，也在Vajdos等，Biochemistry，4011022-11029(2001)有所公開(kāi)。與噬菌體得到的IGF-1拮抗肽IGF-F1-1(RNCFESVAALRRCMYG(SEQ IDNO4))結(jié)合的IGF-1復(fù)合物NMR測(cè)定結(jié)果與其它IGF-1晶體結(jié)構(gòu)相比表明，不限于任何一種理論，A鏈(螺旋III)的一部分在溶液中是移動(dòng)的并當(dāng)結(jié)合不同的配體(去垢劑，肽，結(jié)合蛋白)時(shí)采用有輕微差別的構(gòu)象。
肽IGF-F1-1和IGF-1間的復(fù)合物是由在600和800MHZ下采集的NMR光譜數(shù)據(jù)測(cè)定的。用13C和15N統(tǒng)一標(biāo)記的IGF-1利用Reilly和Fairbrother，J.Biomol.NMR，4459-462(1994)中所述的方案制備的，并按照Vajodos等，同上的操作步驟進(jìn)行純化。少量摩爾的過(guò)量未標(biāo)記的IGF-F1-1與1.5mM的13C/15N IGF-1溶液混合而且從二重和三重共振NMR實(shí)驗(yàn)中賦值1H，13C和15N NMR共振，如Cavanagh等，蛋白質(zhì)NMR光譜學(xué)，理論與實(shí)踐(Academic PressNew York，1996)中所描述的。IGF-1中的距離限制從13C編輯的NOESY HSQC光譜和15N編輯的NOESY HSQC光譜鑒定(Cavanagh等，同上)。
在IGF-1和肽之間的分子間限制是從ω1-過(guò)濾，ω2-編輯的13C HSQC-NOESY光譜(Lee等，F(xiàn)EBS Lett.，35087-90(1994))中獲得。內(nèi)肽的距離限制是從2-D13C-過(guò)濾NOESY光譜中獲得。此外，Φ兩面角限制是從HNHA光譜(Cavanagh等，同上)中獲得并且χ1限制是從HNHB和短混合時(shí)間TOCSY光譜(Clore等，J.Biomolec.NMR，113-22(1991))中獲得。此外，Φ，ψ限制是運(yùn)用TALOS程序?qū)α、N、Cα、Cβ和C0化學(xué)位移的分析而得出的(Cornilescu等，J.Biomol.NMR，13289-302(1999))。
總體上，899個(gè)距離限制(799個(gè)IGF-1內(nèi)部；33個(gè)肽內(nèi)部；87個(gè)分子之間)，16個(gè)螺旋I中的氫鍵限制和138個(gè)二面角限制(71φ；44ψ；23χ1)用于通過(guò)計(jì)算機(jī)程序CNX(Accelrys Inc.，San Diego)使用扭轉(zhuǎn)角動(dòng)力以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)的總和。對(duì)于B區(qū)域(2-25殘基)和A區(qū)域(41-63殘基)IGF-1的結(jié)構(gòu)是很好地界定的，并具有從0.32±0.06骨架重原子的平均結(jié)構(gòu)中得到一個(gè)平均的RMSD值。C區(qū)域(26-40)和D區(qū)域(62-70)則不能從獲得的數(shù)據(jù)很好地定義。最低限制侵害能量的20種結(jié)構(gòu)有好的骨架立體化學(xué)構(gòu)象(80％的殘基位于φ/ψ空間的最優(yōu)選的區(qū)域，沒(méi)有一個(gè)位于不被允許的區(qū)域)并且?guī)缀醪话瑢?shí)驗(yàn)上的波動(dòng)限制(平均最大距離限制的破壞是0.09+0.02)。IGF-F1-1采用了與溶液中肽本身所確定的構(gòu)象非常相似的構(gòu)象。IGF-1構(gòu)象包括三個(gè)螺旋(殘基7-18，43-49和54-60)并且它和在前面的NMR研究未復(fù)合的IGF-1中低分率條件下見(jiàn)到的IGF-1相似(見(jiàn)Cooke等，同上；Sato等，同上；和Laajoki等，同上)。
圖10顯示了去垢劑與噬菌體肽復(fù)合物的比較。具體的，圖10A顯示了IGF-1與N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺復(fù)合物的帶狀圖，圖10B顯示了IGF-1與噬菌體產(chǎn)生的肽IGF-F1-1的結(jié)合復(fù)合物。B區(qū)域(螺旋I)采用了在兩個(gè)復(fù)合物都非常相似的構(gòu)象。C環(huán)在去垢劑復(fù)合物中只有部分有序，且在多肽復(fù)合物中不能很好地確定。由配體誘導(dǎo)的差異可在IGF-1的A區(qū)(螺旋III)中，在主鏈(殘基52-60)和側(cè)鏈(亮氨酸54和57)的水平上可觀察到。不限于任何一種理論，A區(qū)域的可塑性相信可以使IGF-1與那么多的蛋白結(jié)合(6個(gè)IGFBP和三個(gè)受體)。
本發(fā)明有必要在此處通過(guò)參與一些特異性方法和材料進(jìn)行討論?？梢岳斫膺@些特定方法和材料的討論決不限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍，本發(fā)明可延伸至任何或所有可供選擇的適用于完成本發(fā)明目的的材料和方法。
附錄1注釋3使用MAD溶解的IGF-1晶體結(jié)構(gòu)注釋3精煉注釋3程序X-PLOR(online)98.1注釋3作者BRUNGER注釋3注釋3精煉中使用的數(shù)據(jù)注釋3分辨率上限()1.80注釋3分辨率下限()20.00注釋3數(shù)據(jù)截止(SIGMA(F))0.2注釋3數(shù)據(jù)截止上限(ABS(F))10000000.00注釋3數(shù)據(jù)截止下限(ABS(F))0.001000注釋3完全性(工作+測(cè)試)(％)94.8注釋3反射數(shù)字6870注釋3注釋3適用于精煉的數(shù)據(jù)注釋3互相證實(shí)方法自始至終注釋3游離R值試驗(yàn)組選擇隨機(jī)注釋3R值(工作組)0.237注釋3游離R值0.269注釋3游離R值試驗(yàn)組大小(％)5.6注釋3游離R值試驗(yàn)組計(jì)數(shù)382注釋3游離R值的估計(jì)誤差0.014注釋3注釋3最高分辨率儲(chǔ)存器中的配合注釋3所用儲(chǔ)存器的總數(shù)6注釋3儲(chǔ)存器分辨率范圍的上限(A)1.80注釋3儲(chǔ)存器分辨率范圍的下限(A)1.91注釋3儲(chǔ)存器完全性(工作+試驗(yàn))(％)74.4注釋3儲(chǔ)存器中的反射(工作組)826注釋3儲(chǔ)存器R值(工作組)0.343注釋3儲(chǔ)存器游離R值0.439注釋3儲(chǔ)存器游離R值試驗(yàn)組大小(％)5.5注釋3儲(chǔ)存器游離R值試驗(yàn)組計(jì)數(shù)48注釋3儲(chǔ)存器游離R值的估計(jì)誤差0.063注釋3注釋3精煉中使用的非氫原子數(shù)目注釋3蛋白質(zhì)微粒475注釋3核酸微粒0注釋3異基因62
注釋3溶劑原子102注釋3注釋3B值注釋3來(lái)自WILSON PLOT(A**2)25.1注釋3平均B值(所有，A**2)33.8注釋3總的各向異性B值注釋3B11(A**2)0.00注釋3B22(A**2)0.00注釋3B33(A**2)0.00注釋3B12(A**2)0.00注釋3B13(A**2)0.00注釋3B23(A**2)0.00注釋3注釋3估計(jì)同等誤差注釋3來(lái)自LUZZATI PLOT的ESD(A)0.23注釋3來(lái)自SIGMAA的ESD(A)0.16注釋3低分辨率截止(A)20.00注釋3注釋3互相證實(shí)的估計(jì)同等誤差注釋3來(lái)自C-V LUZZATI PLOT的ESD(A)0.28注釋3來(lái)自C-V SIGMAA的ESD(A)0.18注釋3注釋3理想值的RMS偏差注釋3結(jié)合長(zhǎng)度(A)0.020注釋3結(jié)合角(度)2.0注釋3二面角(度)23.2注釋3不適當(dāng)?shù)慕?度)1.09注釋3注釋3各向同性熱模型限制的注釋3注釋3各向同性熱因子抑制.RMS SIGMA注釋3主鏈鍵(A**2)4.33；4.00注釋3主鏈角(A**2)6.46；4.00注釋3側(cè)鏈鍵(A**2)5.41；8.50注釋3側(cè)鏈角(A**2)8.14；9.00注釋3注釋3NCS模型無(wú)注釋3注釋3NCS抑制RMS SIGMA/重注釋3組1的位置(A)NULL；NULL注釋3組1的B因子(A**2)NULL；NULL
注釋3注釋3參數(shù)文件1MSI_XPLOR_TOPPAR/protein_rep.param注釋3參數(shù)文件2../perameter.element注釋3參數(shù)文件3../cyc.par注釋3參數(shù)文件4../../../g2mz/param19.sol注釋3拓?fù)湮募?/usr/prop/msi/980/data/xplor/toppar/tophscdx.pro注釋3拓?fù)湮募?../topology.element注釋3拓?fù)湮募?../cyc.top注釋3拓?fù)湮募?../../../g2mz/param19.sol注釋3注釋3其它精煉注釋使用的大量溶劑模型SEQRES 1A 100 GLU THR LEU CYS GLY ALA GLU LEU VAL ASP ALA LEU GLNSEQRES 2A 100 PHE VAL CYS GLY ASP ARG GLY PHE TYR PHE ASN LYS PROSEQRES 3A 100 THR GLY TYR GLY SER SER THR GLY ILE VAL ASP GLU CYSSEQRES 4A 100 CYS PHE ARG SER CYS ASP LEU ARG ARG LEU GLU MET TYRSEQRES 5A 100 CYS ALA PRO LEU HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH EOH HOHSEQRES 6A 100 HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOHSEQRES 7A 100 HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOHSEQRES 8A 100 HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOH HOHSEQRES 1 B 3 CYC BR HOHSSBOND 1 CYS A 6 CYS A 48SSBOND 2 CYS A 18 CYS A 61SSBOND 3 CYS A 47 CYS A 52CRYST1 31.830 71.074 66.014 90.00 90.00 90.00 C 2221 16ORIGX1 1.000000 0.000000 0.000000 0.00000ORIGX2 0.000000 1.000000 0.000000 0.00000ORIGX3 0.000000 0.000000 1.000000 0.00000SCALE1 0.031417 0.000000 0.000000 0.00000SCALE2 0.000000 0.014070 0.000000 0.00000SCALE3 0.000000 0.000000 0.015148 0.00000注釋文件名＝＂final.pdb＂注釋 r＝0.237371 free_r＝0.26887注釋 DATEJan-30-01 14:51:37 由使用者mhu生成原子 1 CB GLU A 3 20.808 24.058 21.698 1.00 46.92原子 2 CG GLU A 3 19.515 23.283 21.499 1.00 61.66原子 3 CD GLU A 3 18.281 24.029 22.025 1.00 70.74原子 4 OE1 GLU A 3 18.254 24.408 23.221 1.00 74.11原子 5 OE2 GLU A 3 17.332 24.237 21.238 1.00 75.50
原子 6 C GLU A 3 22.417 22.169 21.324 1.00 36.23原子 7 O GLU A 3 21.616 21.223 21.375 1.00 38.90原子 8 N GLU A 3 21.623 23.389 19.405 1.00 38.88原子 9 CA GUU A 3 21.994 23.550 20.854 1.00 40.66原子 10 N THR A 4 23.696 22.040 21.647 1.00 31.38原子 11 CA THR A 4 24.213 20.754 22.059 1.00 24.88原子 12 CB THR A 4 25.301 20.217 21.051 1.00 23.86原子 13 OG1 THR A 4 26.426 21.106 21.070 1.00 30.08原子 14 CG2 THR A 4 24.786 20.115 19.645 1.00 25.92原子 15 C THR A 4 24.825 20.983 23.441 1.00 20.71原子 16 O THR A 4 24.715 22.065 24.036 1.00 19.97原子 17 N LEU A 5 25.435 19.949 23.986 1.00 19.32原子 18 CA LEU A 5 25.976 20.054 25.319 1.00 15.87原子 19 CB LEU A 5 25.300 19.036 26.254 1.00 22.19原子 20 CG LEU A 5 23.859 19.367 26.714 1.00 28.27原子 21 CD1 LEU A 5 23.229 18.123 27.479 1.00 23.45原子 22 CD2 LEU A 5 23.916 20.612 27.594 1.00 25.44原子 23 C LEU A 5 27.472 19.662 25.252 1.00 19.16原子 24 O LEU A 5 27.742 18.527 24.980 1.00 20.58原子 25 N CYS A 6 28.352 20.591 25.572 1.00 19.74原子 26 CA CYS A 6 29.809 20.320 25.520 1.00 21.84原子 27 C CYS A 6 30.485 20.754 26.790 1.00 16.04原子 28 O CYS A 6 29.990 21.602 27.535 1.00 18.05原子 29 CB CYS A 6 30.448 21.077 24.361 1.00 22.37原子 30 SG CYS A 6 29.753 20.589 22.733 1.00 32.91原子 31 N GLY A 7 31.685 20.185 27.039 1.00 19.09原子 32 CA GLY A 7 32.397 20.613 28.217 1.00 17.15原子 33 C GLY A 7 31.698 20.668 29.536 1.00 18.61原子 34 O GLY A 7 31.069 19.683 29.965 1.00 15.50原子 35 N ALA A 8 31.835 21.779 30.240 1.00 13.90原子 36 CA ALA A 8 31.276 21.897 31.553 1.00 15.72原子 37 CB ALA A 8 31.630 23.239 32.150 1.00 21.73原子 38 C ALA A 8 29.715 21.774 31.498 1.00 14.12原子 39 O ALA A 8 29.116 21.316 32.469 1.00 14.45原子 40 N GLU A 9 29.145 22.263 30.412 1.00 15.00原子 41 CA GLU A 9 27.653 22.198 30.355 1.00 21.86原子 42 CB GLU A 9 27.118 22.975 29.140 1.00 23.00原子 43 CG GLU A 9 27.116 24.481 29.346 1.00 33.94原子 44 CD GLU A 9 26.424 25.279 28.204 1.00 53.09原子 45 OE1 GLU A 9 25.790 24.700 27.260 1.00 50.65
原子 46 OE2 GLU A 9 26.521 26.528 28.270 1.00 63.42原子 47 C GLU A 9 27.200 20.732 30.278 1.00 19.13原子 48 O GLU A 9 26.180 20.376 30.831 1.00 15.61原子 49 N LEU A 10 27.974 19.902 29.589 1.00 16.50原子 50 CA LEU A 10 27.688 18.488 29.435 1.00 19.32原子 51 CB LEU A 10 28.637 17.845 28.384 1.00 16.05原子 52 CG LEU A 10 28.552 16.296 28.272 1.00 18.02原子 53 CD1 LEU A 10 27.080 15.875 27.864 1.00 17.22原子 54 CD2 LEU A 10 29.459 15.858 27.153 1.00 17.33原子 55 C LEU A 10 27.850 17.812 30.788 1.00 20.39原子 56 O LEU A 10 27.030 16.968 31.173 1.00 13.49原子 57 N VAL A 11 28.924 18.126 31.531 1.00 16.73原子 58 CA VAL A 11 29.089 17.550 32.838 1.00 13.49原子 59 CB VAL A 11 30.518 17.917 33.453 1.00 16.29原子 60 CG1 VAL A 11 30.636 17.370 34.882 1.00 19.22原子 61 CG2 VAL A 11 31.603 17.350 32.528 1.00 17.93原子 62 C VAL A 11 28.006 18.025 33.824 1.00 13.78原子 63 O VAL A 11 27.532 17.272 34.668 1.00 11.61原子 64 N ASP A 12 27.599 19.280 33.717 1.00 14.34原子 65 CA ASP A 12 26.573 19.795 34.651 1.00 15.14原子 66 CB ASP A 12 26.166 21.243 34.290 1.00 14.66原子 67 CG ASP A 12 26.960 22.337 34.970 1.00 27.52原子 68 OD1 ASP A 12 27.448 22.152 36.103 1.00 29.53原子 69 OD2 ASP A 12 27.031 23.422 34.314 1.00 31.00原子 70 C ASP A 12 25.275 18.941 34.366 1.00 11.41原子 71 O ASP A 12 24.564 18.555 35.313 1.00 14.02原子 72 N ALA A 13 25.006 18.744 33.115 1.00 16.37原子 73 CA ALA A 13 23.761 18.002 32.720 1.00 18.28原子 74 CB ALA A 13 23.558 18.014 31.189 1.00 15.65原子 75 C ALA A 13 23.803 16.590 33.235 1.00 17.95原子 76 O ALA A 13 22.833 16.073 33.788 1.00 15.70原子 77 N LEU A 14 24.954 15.920 33.065 1.00 11.92原子 78 CA LEU A 14 25.077 14.560 33.611 1.00 15.01原子 79 CB LEU A 14 26.443 13.965 33.164 1.00 13.58原子 80 CG LEU A 14 26.457 13.638 31.695 1.00 15.59原子 81 CD1 LEU A 14 27.939 13.345 31.250 1.00 17.99原子 82 CD2 LEU A 14 25.601 12.370 31.414 1.00 22.05原子 83 C LEU A 14 24.944 14.495 35.098 1.00 15.56原子 84 O LEU A 14 24.341 13.550 35.626 1.00 18.96原子 85 N GLN A 15 25.591 15.431 35.831 1.00 12.18
原子 86 CA GLN A 15 25.494 15.426 37.273 1.00 14.03原子 87 CB GLN A 15 26.379 16.526 37.916 1.00 17.47原子 88 CG GLN A 15 27.917 16.185 37.673 1.00 23.70原子 89 CD GLN A 15 28.863 16.851 38.656 1.00 32.76原子 90 OE1 GLN A 15 29.187 18.020 38.510 1.00 28.85原子 91 NE2 GLN A 15 29.314 16.095 39.658 1.00 29.69原子 92 C GLN A 15 24.061 15.631 37.745 1.00 18.29原子 93 O GLN A 15 23.684 15.090 38.729 1.00 18.76原子 94 N PHE A 16 23.297 16.400 37.012 1.00 18.23原子 95 CA PHE A 16 21.916 16.692 37.438 1.00 17.04原子 96 CB PHE A 16 21.438 17.935 36.706 1.00 18.66原子 97 CG PHE A 16 20.060 18.334 37.110 1.00 18.49原子 98 CD1 PHE A 16 19.874 18.960 38.310 1.00 23.45原子 99 CD2 PHE A 16 18.959 17.947 36.339 1.00 21.34原子 100 CE1 PHE A 16 18.558 19.216 38.788 1.00 27.25原子 101 CE2 PHE A 16 17.646 18.190 36.789 1.00 21.50原子 102 CZ PHE A 16 17.457 18.829 38.020 1.00 24.95原子 103 C PHE A 16 21.018 15.479 37.110 1.00 15.52原子 104 O PHE A 16 20.248 15.013 37.971 1.00 20.37原子 105 N VAL A 17 21.160 14.923 35.916 1.00 16.12原子 106 CA VAL A 17 20.338 13.761 35.490 1.00 17.94原子 107 CB VAL A 17 20.392 13.598 33.932 1.00 21.28原子 108 CG1 VAL A 17 19.831 12.219 33.456 1.00 25.51原子 109 CG2 VAL A 17 19.619 14.737 33.295 1.00 22.15原子 110 C VAL A 17 20.720 12.454 36.182 1.00 21.98原子 111 O VAL A 17 19.843 11.655 36.556 1.00 24.05原子 112 N CYS A 18 22.015 12.222 36.411 1.00 17.42原子 113 CA CYS A 18 22.430 10.964 37.039 1.00 20.54原子 114 C CYS A 18 22.420 10.998 38.579 1.00 26.67原子 115 O CYS A 18 22.386 9.967 39.239 1.00 24.96原子 116 CB CYS A 18 23.841 10.565 36.505 1.00 16.00原子 117 SG CYS A 18 23.947 10.463 34.717 1.00 29.49原子 118 N GLY A 19 22.462 12.198 39.147 1.00 32.94原子 119 CA GLY A 19 22.464 12.366 40.595 1.00 31.76原子 120 C GLY A 19 23.563 11.580 41.263 1.00 37.69原子 121 O GLY A 19 24.730 11.631 40.869 1.00 40.61原子 122 N ASP A 20 23.186 10.815 42.276 1.00 39.20原子 123 CA ASP A 20 24.150 10.009 42.989 1.00 47.44原子 124 CB ASP A 20 23.471 9.355 44.187 1.00 60.22原子 125 CG ASP A 20 23.633 10.169 45.437 1.00 73.16
原子 126 OD1 ASP A 20 24.132 11.311 45.326 1.00 79.05原子 127 OD2 ASP A 20 23.275 9.675 46.524 1.00 78.87原子 128 C ASP A 20 24.843 8.946 42.149 1.00 37.42原子 129 O ASP A 20 25.954 8.521 42.472 1.00 38.02原子 130 N ARG A 21 24.213 8.484 41.084 1.00 26.27原子 131 CA ARG A 21 24.883 7.495 40.267 1.00 33.90原子 132 CB ARG A 21 23.930 6.931 39.223 1.00 36.79原子 133 CG ARG A 21 22.513 7.382 39.490 1.00 50.60原子 134 CD ARG A 21 21.547 6.260 39.495 1.00 46.09原子 135 NE ARG A 21 21.068 5.971 38.157 1.00 44.95原子 136 CZ ARG A 21 20.533 6.865 37.329 1.00 42.44原子 137 NH1 ARG A 21 20.397 8.132 37.692 1.00 49.97原子 138 NH2 ARG A 21 20.103 6.474 36.138 1.00 34.61原子 139 C ARG A 21 25.951 8.301 39.565 1.00 36.17原子 140 O ARG A 21 25.786 9.474 39.374 1.00 37.51原子 141 N GLY A 22 27.056 7.707 39.184 1.00 35.48原子 142 CA GLY A 22 27.983 8.551 38.437 1.00 28.95原子 143 C GLY A 22 27.566 8.445 36.983 1.00 24.58原子 144 O GLY A 22 26.409 8.046 36.674 1.00 22.09原子 145 N PHE A 23 28.465 8.786 36.065 1.00 15.51原子 146 CA PHE A 23 28.157 8.704 34.664 1.00 15.18原子 147 CB PHE A 23 27.665 10.080 34.127 1.00 20.92原子 148 CG PHE A 23 28.539 11.242 34.571 1.00 20.47原子 149 CD1 PHE A 23 28.271 11.908 35.762 1.00 24.30原子 150 CD2 PHE A 23 29.644 11.596 33.815 1.00 20.21原子 151 CE1 PHE A 23 29.126 12.965 36.237 1.00 25.52原子 152 CE2 PHE A 23 30.520 12.636 34.261 1.00 20.52原子 153 CZ PHE A 23 30.259 13.307 35.458 1.00 22.56原子 154 C PHE A 23 29.397 8.332 33.920 1.00 20.77原子 155 O PHE A 23 30.484 8.463 34.494 1.00 24.08原子 156 N TYR A 24 29.242 7.891 32.673 1.00 20.54原子 157 CA TYR A 24 30.396 7.562 31.821 1.00 25.88原子 158 CB TYR A 24 30.393 6.126 31.295 1.00 33.47原子 159 CG TYR A 24 29.706 5.125 32.115 1.00 31.26原子 160 CD1 TYR A 24 30.356 4.551 33.204 1.00 43.74原子 161 CE1 TYR A 24 29.763 3.573 33.939 1.00 47.84原子 162 CD2 TYR A 24 28.422 4.680 31.785 1.00 41.08原子 163 CE2 TYR A 24 27.818 3.692 32.524 1.00 39.08原子 164 CZ TYR A 24 28.492 3.151 33.589 1.00 44.15原子 165 OH TYR A 24 27.949 2.164 34.357 1.00 56.07
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原子 206 OG1 THR A 29 32.938 -4.249 25.9471.00 52.79原子 207 CG2 THR A 29 32.313 -2.071 25.0861.00 55.75原子 208 CTHR A 29 30.897 -4.498 27.6351.00 35.36原子 209 OTHR A 29 30.068 -5.322 27.2381.00 34.58原子 210 NGLY A 30 31.721 -4.720 28.6431.00 33.36原子 211 CA GLY A 30 31.659 -5.997 29.3231.00 33.97原子 212 CGLY A 30 32.109 -7.243 28.5361.00 31.86原子 213 OGLY A 30 32.227 -7.275 27.3051.00 34.94原子 214 NTYR A 31 32.265 -8.325 29.2751.00 23.05原子 215 CA TYR A 31 32.723 -9.576 28.6901.00 25.72原子 216 CB TYR A 31 33.144 -10.505 29.8131.00 21.15原子 217 CG TYR A 31 34274 -9.992 30.6331.00 24.03原子 218 CD1 TYR A 31 34.066 -9.497 31.8921.00 17.01原子 219 CE1 TYR A 31 35.106 -8.997 32.6441.00 26.09原子 220 CD2 TYR A 31 35.579 -9.983 30.1211.00 29.13原子 221 CE2 TYR A 31 36.616 -9.502 30.8701.00 25.81原子 222 CZ TYR A 31 36.383 -9.009 32.1151.00 25.77原子 223 OH TYR A 31 37.419 -8.560 32.8751.00 34.26原子 224 CTRR A 31 31.678 -10.274 27.8401.00 29.45原子 225 OTYR A 31 30.468 -10.172 28.1121.00 30.08原子 226 NGLY A 32 32.141 -10.990 26.8081.00 29.62原子 227 CA GLY A 32 31.228 -11.746 25.9721.00 33.28原子 228 CGLY A 32 30.235 -10.912 25.1981.00 36.13原子 229 OGLY A 32 29.161 -11.380 24.8321.00 32.23原子 230 NSER A 33 30.606 -9.668 24.9371.00 41.08原子 231 CA SER A 33 29.722 -8.787 24.2171.00 47.10原子 232 CB SER A 33 30.130 -7.331 24.3861.00 46.73原子 233 OG SER A 33 29.397 -6.557 23.4631.00 52.64原子 234 CSER A 33 29.816 -9.142 22.7641.00 57.93原子 235 OSER A 33 30.807 -9.735 22.3171.00 57.01原子 236 NSER A 34 28.772 -8.755 22.0391.00 65.04原子 237 CA SER A 34 28.657 -8.989 20.6131.00 70.41原子 238 CB SER A 34 28.414 -7.659 19.8991.00 72.65原子 239 OG SER A 34 27.049 -7.299 19.9951.00 72.85原子 240 CSER A 34 29.885 -9.671 20.0281.00 71.58原子 241 OSER A 34 30.642 -9.053 19.2891.00 69.77原子 242 CB THR A 41 30.810 6.81219.0431.00 59.11原子 243 OG1 THR A 41 29.666 5.95218.9751.00 64.04原子 244 CG2 THR A 41 31.511 6.89217.7001.00 59.18原子 245 CTHR A 41 31.044 6.41621.4491.00 51.54
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原子 406 N CYS A 61 24.290 7.385 32.352 1.00 18.42原子 407 CA CYS A 61 24.402 7.303 33.809 1.00 15.63原子 408 C CYS A 61 24.808 5.872 34.207 1.00 19.70原子 409 O CYS A 61 24.394 4.908 33.563 1.00 25.04原子 410 CB CYS A 61 23.065 7.562 34.511 1.00 22.45原子 411 SG CYS A 61 22.415 9.181 34.212 1.00 24.27原子 412 N ALA A 62 25.543 5.738 35.298 1.00 24.74原子 413 CA ALA A 62 26.004 4.424 35.756 1.00 31.14原子 414 CB ALA A 62 27.273 4.588 36.641 1.00 24.85原子 415 C ALA A 62 24.902 3.747 36.563 1.00 36.05原子 416 O ALA A 62 23.920 4.394 36.962 1.00 33.02原子 417 N PRO A 63 25.014 2.427 36.780 1.00 44.06原子 418 CD PRO A 63 26.021 1.447 36.310 1.00 47.05原子 419 CA PRO A 63 23.942 1.803 37.576 1.00 46.88原子 420 CB PRO A 63 24.182 0.296 37.393 1.00 47.68原子 421 CG PRO A 63 25.651 0.166 37.068 1.00 49.88原子 422 C PRO A 63 24.111 2.253 39.027 1.00 48.13原子 423 O PRO A 63 23.135 2.412 39.773 1.00 54.36原子 424 N LEU A 64 25.379 2.467 39.379 1.00 51.56原子 425 CA LEU A 64 25.835 2.896 40.693 1.00 61.37原子 426 CB LEU A 64 26.997 1.994 41.170 1.00 63.79原子 427 CG LEU A 64 26.761 0.984 42.312 1.00 60.23原子 428 CD1 LEU A 64 26.872 -0.435 41.767 1.00 61.06原子 429 CD2 LEU A 64 27.781 1.210 43.447 1.00 58.43原子 430 C LEU A 64 26.327 4.343 40.607 1.00 67.33原子 431 O LEU A 64 27.441 4.612 40.132 1.00 71.54原子 432 C1 CYC B 1 19.808 21.082 25.297 1.00 29.47原子 433 C6 CYC B 1 19.974 19.730 24.564 1.00 31.45原子 434 O21 CYC B 1 21.316 19.561 24.000 1.00 30.05原子 435 C5 CYC B 1 19.707 18.570 25.545 1.00 24.70原子 436 C4 CYC B 1 18.349 18.647 26.185 1.00 28.97原子 437 C11 CYC B 1 18.069 17.503 27.203 1.00 25.55原子 438 C10 CYC B 1 18.915 17.625 28.449 1.00 26.59原子 439 C9 CYC B 1 18.774 19.062 29.167 1.00 22.28原子 440 C15 CYC B 1 19.668 19.202 30.407 1.00 18.50原子 441 C18 CYC B 1 19.488 18.173 31.529 1.00 17.96原子 442 C17 CYC B 1 20.033 18.861 32.738 1.00 20.63原子 443 C16 CYC B 1 20.478 20.370 32.210 1.00 19.19原子 444 C43 CYC B 1 20.408 21.271 33.357 1.00 17.91原子 445 C55 CYC B 1 21.476 20.723 34.438 1.00 26.47
原子 446 C56 CYC B 1 21.498 21.442 35.738 1.00 31.90原子 447 C57 CYC B 1 22.417 22.653 36.015 1.00 39.26原子 448 N59 CYC B 1 22.473 23.332 37.133 1.00 46.97原子 449 C74 CYC B 1 23.443 24.507 37.216 1.00 56.76原子 450 C75 CYC B 1 22.897 25.835 36.400 1.00 62.01原子 451 C76 CYC B 1 23.920 27.038 36.528 1.00 66.74原子 452 N77 CYC B 1 23.715 27.349 37.968 1.00 68.00原子 453 C78 CYC B 1 24.623 27.135 39.017 1.00 72.42原子 454 C80 CYC B 1 24.134 27.596 40.383 1.00 76.46原子 455 O86 CYC B 1 22.731 28.037 40.272 1.00 73.03原子 456 C81 CYC B 1 25.194 28.755 40.862 1.00 85.35原子 457 O87 CYC B 1 25.451 29.858 39.876 1.00 86.03原子 458 C82 CYC B 1 24.767 29.384 42.284 1.00 92.20原子 459 O88 CYC B 1 23.400 29.939 42.115 1.00 92.22原子 460 C83 CYC B 1 25.777 30.529 42.728 1.00 96.59原子 461 O89 CYC B 1 27.124 29.924 42.873 1.00 99.38原子 462 C84 CYC B 1 25.395 31.205 44.130 1.00 97.03原子 463 O85 CYC B 1 26.318 32.274 44.541 1.00 95.57原子 464 O79 CYC B 1 25.765 26.665 38.880 1.00 74.76原子 465 C68 CYC B 1 21.737 23.120 38.324 1.00 39.41原子 466 C69 CYC B 1 20.223 23.496 38.137 1.00 38.89原子 467 C70 CYC B 1 19.523 23.355 39.421 1.00 38.22原子 468 N71 CYC B 1 20.564 22.987 40.353 1.00 50.02原子 469 C72 CYC B 1 20.399 22.763 41.607 1.00 55.62原子 470 C90 CYC B 1 21.157 21.536 42.121 1.00 57.83原子 471 O96 CYC B 1 20.407 20.319 41.993 1.00 56.55原子 472 C91 CYC B 1 21.664 21.940 43.578 1.00 63.18原子 473 O97 CYC B 1 21.600 20.757 44.471 1.00 63.88原子 474 C92 CYC B 1 23.186 22.499 43.622 1.00 66.58原子 475 O98 CYC B 1 23.971 21.462 44.307 1.00 68.12原子 476 C93 CYC B 1 23.135 23.867 44.446 1.00 67.49原子 477 O99 CYC B 1 22.357 24.774 43.597 1.00 66.74原子 478 C94 CYC B 1 24.493 24.656 44.683 1.00 74.63原子 479 O95 CYC B 1 24.178 25.865 45.490 1.00 80.12原子 480 O73 CYC B 1 19.735 23.526 42.349 1.00 63.35原子 481 O58 CYC B 1 23.106 22.977 35.125 1.00 40.42原子 482 C54 CYC B 1 20.742 22.893 32.977 1.00 18.54原子 483 C14 CYC B 1 19.521 20.648 31.087 1.00 23.61原子 484 C19 CYC B 1 17.911 20.963 31.644 1.00 16.19原子 485 C13 CYC B 1 19.810 21.781 30.035 1.00 19.97
原子 486 O20 CYC B 1 21.223 21.655 29.535 1.00 19.41原子 487 C12 CYC B 1 18.975 21.668 28.869 1.00 17.80原子 488 C8 CYC B 1 19.095 20.197 28.184 1.00 20.86原子 489 C3 CYC B 1 18.129 20.072 26.867 1.00 26.70原子 490 C7 CYC B 1 16.492 20.310 27.375 1.00 27.90原子 491 C2 CYC B 1 18.448 21.212 25.824 1.00 28.19原子 492 BR BR C 1 34.062 6.612 30.395 0.50 33.08原子 493 O HOH W 1 19.167 24.790 26.224 1.00 26.47原子 494 O HOH W 2 23.897 21.958 31.132 1.00 22.60原子 495 O HOH W 3 21.553 23.642 27.485 1.00 29.42原子 496 O HOH W 4 24.680 19.970 37.794 1.00 27.43原子 497 O HOH W 5 30.918 19.401 40.676 1.00 23.25原子 498 O HOH W 6 16.708 17.200 40.896 1.00 28.59原子 499 O HOH W 7 16.516 25.080 41.353 1.00 25.88原子 500 O HOH W 8 18.741 11.412 20.841 1.00 29.70原子 501 O HOH W 9 27.307 23.459 25.693 1.00 22.59原子 502 O HOH W 10 29.313 -4.298 41.568 1.00 37.18原子 503 O HOH W 11 24.485 23.989 32.854 1.00 35.58原子 504 O HOH W 12 17.430 11.457 36.970 1.00 26.36原子 505 O HOH W 13 22.518 16.744 15.421 1.00 37.65原子 506 O HOH W 14 22.764 17.648 22.807 1.00 29.54原子 507 O HOH W 15 22.916 12.486 18.554 1.00 30.85原子 508 O HOH W 16 21.127 13.160 16.233 1.00 67.05原子 509 O HOH W 18 33.941 3.332 34.867 1.00 47.13原子 510 O HOH W 19 28.659 24.132 37.361 1.00 34.15原子 511 O HOH W 20 26.049 12.100 38.687 1.00 43.38原子 512 O HOH W 22 22.998 5.484 43.119 1.00 56.07原子 513 O HOH W 23 21.091 10.590 19.804 1.00 37.65原子 514 O HOH W 24 27.553 20.681 37.920 1.00 40.51原子 515 O HOH W 25 21.539 4.646 32.538 1.00 35.17原子 516 O HOH W 35 36.200 4.986 34.099 1.00 55.94原子 517 O HOH W 36 25.301 25.430 41.805 1.00 45.43原子 518 O HOH W 37 28.063 14.145 40.069 1.00 39.11原子 519 O HOH W 38 20.561 25.768 50.428 1.00 38.92原子 520 O HOH W 39 22.841 23.744 25.080 1.00 40.88原子 521 O HOH W 40 16.781 11.726 39.998 1.00 65.62原子 522 O HOH W 41 29.705 23.094 40.234 1.00 40.48原子 523 O HOH W 42 18.375 14.116 41.324 1.00 58.97原子 524 O HOH W 43 15.538 9.778 20.639 1.00 61.25原子 525 O HOH W 44 34.144 2.745 20.168 1.00 48.45
原子 526 O HOH W 45 20.621 8.952 42.429 1.00 33.04原子 527 O HOH W 46 17.087 6.329 28.850 1.00 32.70原子 528 O HOH W 47 25.800 23.668 39.622 1.00 46.80原子 529 O HOH W 48 16.978 27.199 25.066 1.00 44.77原子 530 O HOH W 49 22.764 7.118 24.736 1.00 38.06原子 531 O HOH W 50 24.770 22.332 46.924 1.00 48.70原子 532 O HOH W 51 21.688 25.678 41.327 1.00 52.53原子 533 O HOH W 52 19.396 17.922 42.396 1.00 53.49原子 534 O HOH W 53 21.375 18.431 46.997 1.00 57.91原子 535 O HOH W 54 19.736 20.961 17.193 1.00 46.33原子 536 O HOH W 55 30.374 4.915 45.161 1.00 52.15原子 537 O HOH W 56 18.588 26.408 48.436 1.00 44.58原子 538 O HOH W 57 23.722 24.504 28.990 1.00 38.5權(quán)利要求
1.一種由IGF-1形成的晶體，其特征在于，所述晶體衍射x-射線輻射以產(chǎn)生代表IGF-1三維結(jié)構(gòu)的衍射模式。
2.如權(quán)利要求1所述的晶體，其特征在于，所述晶體大致遵循下列晶胞常數(shù)a＝31.831，b＝71.055，c＝65.995和C2221的空間組。
3.如權(quán)利要求1所述的晶體，其特征在于，所述IGF-1包括A-，B-，C-和D-區(qū)域并在晶體中形成二聚體，其中所述晶體在二聚體的臨界面處有一個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)。
4.一種組合物，其特征在于，所述組合物包括如權(quán)利要求1所述的晶體和載體。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述IGF-1再溶解時(shí)是有生物活性的。
6.一種治療患有拮抗劑紊亂的哺乳動(dòng)物的方法，其特征在于，所述方法包括給所述哺乳動(dòng)物服用有效量的如權(quán)利要求5所述的組合物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是人。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述紊亂癥是糖尿病、肥胖癥、心臟功能紊亂、與艾滋病相關(guān)的消耗、腎紊亂、神經(jīng)紊亂、整個(gè)身體的生長(zhǎng)紊亂或免疫紊亂。
9.一種結(jié)晶IGF-1的方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟(a)把含有IGF-1的水溶液與含有沉淀劑的儲(chǔ)蓄液混合形成一定的混合體積；(b)結(jié)晶所述混合體積。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述IGF-1是從原核細(xì)胞中獲得的。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于步驟(a)中的水溶液含有1-50mg/ml的IGF-1。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于步驟(a)中的水溶液含有5-15mg/ml的IGF-1。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述沉淀劑是聚乙二醇、檸檬酸鈉、硫酸銨、甲次砷酸鈉或它們的混合物。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述沉淀劑是用檸檬酸鈉或甲次砷酸鈉緩沖的聚乙二醇。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述沉淀劑存在于儲(chǔ)蓄液中，如果是聚乙二醇則其量為20-25％，如果是檸檬酸鈉、硫酸銨或甲次砷酸鈉則為1-10M。
16.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述儲(chǔ)蓄液還包括去垢劑。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述去垢劑的量從10到50mM。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述去垢劑是N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺。
19.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述儲(chǔ)蓄液的pH是從4到10。
20.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述pH值為6.5
21.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)通過(guò)蒸氣擴(kuò)散結(jié)晶法、分批結(jié)晶法、液橋結(jié)晶法或透析結(jié)晶法來(lái)進(jìn)行。
22.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)通過(guò)蒸氣擴(kuò)散結(jié)晶法來(lái)進(jìn)行。
23.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在步驟(b)后IGF-1的再結(jié)晶。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述再結(jié)晶利用甲基戊二醇進(jìn)行。
25.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法還包括分離結(jié)晶的IGF-1。
26.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述水溶液是用以0.1M檸檬酸鈉或0.1M甲次砷酸鈉緩沖至pH6.5的24％的聚乙醇和1μl 1.4mM的N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺去垢劑混合而成的，此溶液用1ml以0.1M的檸檬酸鈉或0.1M的甲次砷酸鈉緩沖至pH6.5的1ML的24％的聚乙二醇通過(guò)蒸氣擴(kuò)散結(jié)晶飽和平衡直至形成晶體小滴，并向晶體小滴中加入2μl 100％的甲基戊二醇使晶體溶解過(guò)夜，由此形成新的晶體。
27.用如權(quán)利要求9所述方法制造的結(jié)晶IGF-1。
28.一種鑒定IGF-1間接拮抗劑的方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟(a)比較N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺抑制IGF-1結(jié)合IGFBP-1或-3的能力與候選的IGF-1的間接拮抗劑抑制相同結(jié)合的能力；(b)確定候選間接拮抗劑是否至少有與N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺相同的抑制效果。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述比較是通過(guò)N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺和候選間接拮抗劑之間競(jìng)爭(zhēng)性分析而完成的。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合抑制是通過(guò)預(yù)培養(yǎng)N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺或候選拮抗劑與在噬菌體顆粒上表達(dá)的IGF-1并用基于平板的ELISA分析來(lái)確定IGF-1與IGFBP-1或IGFBP-3結(jié)合的殘基來(lái)測(cè)定的。
31.一種鑒定IGF-1的間接拮抗劑的方法，其特征在于，所述方法包括IGF-1與IGF-1的候選間接拮抗劑共結(jié)晶以形成共結(jié)晶結(jié)構(gòu)并確定候選間接拮抗劑是結(jié)合IGF-1中的一組還是兩組都結(jié)合，其特點(diǎn)是一組包括的氨基酸殘基有Glu3、Thr4、Leu5、Asp12、Ala13、Phe16、Val17、Cys47、Ser51、Cys52、Asp53、Leu54和Leu57；第二組所包括的氨基酸殘基有Val11、Gln15、Phe23、Phe25、Asn26、Val44、Phe49和Arg55，其中如果在共結(jié)晶結(jié)構(gòu)中給定的一組的各個(gè)所列的氨基酸殘基與候選拮抗劑有至少一個(gè)接觸小于或等于6那么結(jié)合就會(huì)產(chǎn)生。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述候選拮抗劑抑制IGF-1與IGFBP-1或-3之間發(fā)生結(jié)合的能力至少和N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺一樣。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合抑制使用N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺與候選拮抗劑之間的競(jìng)爭(zhēng)性分析來(lái)測(cè)定。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合抑制通過(guò)預(yù)培養(yǎng)N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺或候選拮抗劑與在噬菌體顆粒上的表達(dá)IGF-1并用基于平板的ELISA分析來(lái)確定IGF-1與IGFBP-1或IGFBP-3結(jié)合的殘基而測(cè)定的。
35.IGF-1與N，N-雙(3-D-葡糖氨基丙烷)-脫氧膽胺的共結(jié)晶復(fù)合物。
36.一種確定IGF-1三維結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，所述方法包括(a)結(jié)晶IGF-1；(b)照射結(jié)晶的IGF-1以獲得具有結(jié)晶IGF-1的衍射模型的特征(c)把衍射模型轉(zhuǎn)化為IGF-1的三維結(jié)構(gòu)。
37.一種機(jī)器可讀數(shù)據(jù)儲(chǔ)存介質(zhì)，其特征在于，所述介質(zhì)包括用機(jī)器可讀數(shù)據(jù)編碼的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存材料，當(dāng)用適當(dāng)?shù)臋C(jī)器讀取時(shí)，該儲(chǔ)存介質(zhì)顯示含有IGF-1的分子的晶體的三維代表。
38.一種IGF-1晶體，其特征在于，所述晶體具有附錄1中所示的結(jié)構(gòu)同等物。
39.一種利用從IGF-1晶體中得到的IGF-1三維結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，所述IGF-1的三維結(jié)構(gòu)包括IGF-1受體結(jié)合區(qū)域，此方法包括鑒定含有與IGF-1三維結(jié)構(gòu)的受體結(jié)合區(qū)域相互作用的結(jié)構(gòu)和作為IGF-1拮抗劑或拮抗物的行駛功能的化合物。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述IGF-1的三維結(jié)構(gòu)包括與附錄1中所列結(jié)構(gòu)信息大致相同的α碳類似物。
41.一種鑒定IGF-1拮抗劑或拮抗物的方法，其特征在于，所述方法包括的步驟是(a)結(jié)晶IGF-1以形成IGF-1晶體，所述IGF-1晶體包括一組限定IGF-1受體結(jié)合區(qū)域的氨基酸殘基；(b)照射從步驟(a)中獲得的IGF-1晶體以獲得IGF-1晶體的衍射模型；(c)從衍射模型中確定IGF-1三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括IGF-1受體結(jié)合區(qū)域；(d)鑒定具有三維結(jié)構(gòu)的IGF-1拮抗劑或拮抗物，該拮抗劑或拮抗物在功能上復(fù)制必需的IGF受體結(jié)合、溶劑可進(jìn)入的殘基，該殘基代表IGF-1受體結(jié)合區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)，所述IGF-1拮抗劑或拮抗物與IGF-1相比對(duì)IGF-1效應(yīng)細(xì)胞具有改變的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述溶劑可進(jìn)入的殘基并不參與IGF-1臨界面的形成。
43.一種設(shè)計(jì)能模擬IGF-1三維空間表面結(jié)構(gòu)的化合物的方法，其步驟包括(a)確定IGF-1的三維結(jié)構(gòu)；(b)設(shè)計(jì)能模擬IGF-1三維空間表面結(jié)構(gòu)的化合物。
44.一種鑒定結(jié)合IGF-1并阻抑IGFBP或受體與IGF-1結(jié)合的模擬肽的方法，其特征在于，所述方法包括的步驟是(a)用附錄1中所提供的結(jié)構(gòu)參數(shù)或結(jié)構(gòu)同等物尋找分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)；(b)從數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇出能模擬IGF-1的結(jié)構(gòu)參數(shù)或結(jié)構(gòu)同等物的分子。
45.一種確定分子復(fù)合物的至少部分三維結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，所述的復(fù)合物包括IGF-1且所述的方法包括的步驟有(a)確定IGF-1晶體的結(jié)構(gòu)同等物；(b)從結(jié)構(gòu)同等物計(jì)算相位；(c)由步驟(b)所得的相位的計(jì)算電子密度圖譜；(d)基于所述的電子密度圖譜確定至少一部分復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，在步驟(a)所用的結(jié)構(gòu)同等物大致上與附錄1所描述的那些相同或描述與附錄1中的類似物基本相同的晶體。
47.一種評(píng)估化學(xué)物質(zhì)與IGF-1或它的復(fù)合物相連的能力的方法，其特征在于，所述方法包括的步驟如下(a)利用計(jì)算或?qū)嶒?yàn)手段在化學(xué)物質(zhì)和IGF-1或它的復(fù)合物之間進(jìn)行適當(dāng)?shù)牟僮?，因而獲得與連接相關(guān)的數(shù)據(jù)；(b)分析由步驟(a)獲得的數(shù)據(jù)以確定化學(xué)物質(zhì)和IGF-1或它的復(fù)合物之間的連接特征。
48.由權(quán)利要求47所述的方法鑒定的化學(xué)物質(zhì)，其特征在于，所述個(gè)體在體內(nèi)或體外妨礙IGF-1和它的受體或IGF-1和至少一種其結(jié)合蛋白之間的連接，或與IGF-1的結(jié)合位點(diǎn)的連接。
49.一種IGF-1結(jié)晶形式的重原子衍生物。
50.一種計(jì)算或?qū)嶒?yàn)評(píng)估化學(xué)物質(zhì)以獲得它與IGF-1的結(jié)合位點(diǎn)，締合的信息的方法，其特征在于，所述方法使用具有附錄中描述的結(jié)構(gòu)同等物的IGF-1晶體。
全文摘要
通過(guò)一種能得到IGF－1結(jié)晶物的方法而獲得IGF－1晶體。結(jié)晶IGF－1所包括的步驟是把含有IGF－1的水溶液與含有沉淀劑的儲(chǔ)蓄液混合形成混合液；并結(jié)晶混合液，還任選地再結(jié)晶和分離IGF－1晶體。此外，提供了一種鑒定IGF－1的間接拮抗劑的方法，該方法使用一種去污劑作為IGFBP－1和IGFBP－3與IGF－1結(jié)合抑制水平的標(biāo)準(zhǔn)，和/或使用與候選間接拮抗劑結(jié)合的IGF－1結(jié)合結(jié)合口袋的類似物用于以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)。
文檔編號(hào)C07K14/65GK1703425SQ02804707
公開(kāi)日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2002年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月9日
發(fā)明者M·謝夫勒, M·烏爾茨, F·沃伊道斯 申請(qǐng)人:基因技術(shù)股份有限公司