新白蛋白結(jié)合組合物、方法及應(yīng)用
【專利說(shuō)明】新白蛋白結(jié)合組合物、方法及應(yīng)用
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?200880101168. 4"，申請(qǐng)日為"2008年7月17日"，原發(fā)明名稱 為"新組合物、方法及應(yīng)用"（2010年7月21日提交主動(dòng)修改時(shí)將其修改為"新白蛋白結(jié)合 組合物、方法及應(yīng)用"）的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一類具有白蛋白結(jié)合親和性的工程化多肽。還涉及新的方法及應(yīng)用， 其采用這些及其它化合物與白蛋白在不同環(huán)境下的結(jié)合，其中一些具有治療哺乳動(dòng)物包括 人類的疾病的意義。
[0003]背景
[0004] 血清白蛋白
[0005] 血清白蛋白是哺乳動(dòng)物血清中最豐富的蛋白質(zhì)（40g/l;大約0. 7mM于人類中）， 其功能之一是結(jié)合諸如脂質(zhì)和膽紅素的分子（PetersT,AdvancesinProteinChemistry 37:161，1985)。血清白蛋白的半衰期與動(dòng)物大小直接成比例，其中例如人血清白蛋白 (HSA)半衰期是19天，兔血清白蛋白半衰期是大約5天（McCurdyTRetal，JLabClin Med143:115,2004)。人血清白蛋白在體內(nèi)廣泛分布，特別是在腸道和血液區(qū)室內(nèi)，其中 其主要參與維持摩爾滲透壓濃度。結(jié)構(gòu)上，白蛋白是單鏈蛋白，包含3個(gè)同源結(jié)構(gòu)域，總 共 584 或 585 個(gè)氨基酸（DugaiczykLetal，ProcNatlAcadSciUSA79:71，1982)。白 蛋白含有17個(gè)二硫橋和一個(gè)反應(yīng)硫醇C34,但是缺少N-連接和0-連接碳水化合物部分 (Peters, 1985,supra;NicholsonJPetal，BrJAnaesth85:599,2000)。缺少糖基化 簡(jiǎn)化了白蛋白的重組表達(dá)。白蛋白的這一性質(zhì)與其三維結(jié)構(gòu)是已知的的事實(shí)（HeXMand CarterDC，Nature358:2091992) -起使其成為有吸引力的候選物而用于重組融合蛋白。這 種融合蛋白通常組合治療蛋白（其在給予該蛋白本身時(shí)會(huì)迅速?gòu)纳眢w內(nèi)清除）和血漿蛋白 (其顯示天然的慢清除）在一個(gè)多肽鏈中（SheffieldWP,CurrDrugTargetsCardiovacs HaematolDisord1:1,2001)。這種融合蛋白可提供臨床益處，注射頻率降低，體內(nèi)治療蛋 白水平更高。
[0006] 與HSA的融合或締合導(dǎo)致增加的蛋白質(zhì)體內(nèi)半衰期
[0007] 血清白蛋白缺少任何酶學(xué)或免疫學(xué)功能，因此當(dāng)與生物活性多肽偶聯(lián)時(shí)應(yīng)該不 顯示不希望的副作用。另外，HSA是天然載體，參與內(nèi)源轉(zhuǎn)運(yùn)和輸送各種天然和治療分子 (SellersEMandKoch-ffeserMD,AlbuminStructure,FunctionandUses,edsRosenoer VMetal，Pergamon,Oxford,pl59, 1977)。已報(bào)道幾種策略以將蛋白質(zhì)直接共價(jià)偶聯(lián)至血 清白蛋白或者偶聯(lián)至允許體內(nèi)締合血清白蛋白的肽或蛋白質(zhì)。后一途徑的例子已在例如 W091/01743，W001/45746 及Dennisetal,JBiolChem277:35035-43(2002)中描述。第 一個(gè)文件描述了衍生自鏈球菌蛋白G(SpG)的白蛋白結(jié)合肽或蛋白質(zhì)的應(yīng)用，用于增加其 它蛋白質(zhì)的半衰期。其中的觀點(diǎn)是將細(xì)菌衍生的白蛋白結(jié)合肽/蛋白質(zhì)與已顯示在血液 中快速清除的治療感興趣肽/蛋白質(zhì)融合。由此產(chǎn)生的融合蛋白結(jié)合體內(nèi)血清白蛋白并 從其更長(zhǎng)的半衰期獲益，其增加了融合的治療感興趣肽/蛋白質(zhì)的凈半衰期。W001/45746 及Dennisetal涉及同一概念，但是作者利用相對(duì)短的肽結(jié)合血清白蛋白。所述肽選自 噬菌體展示的肽文庫(kù)。在Dennisetal中，早期工作被提及，其中發(fā)現(xiàn)了對(duì)鏈球菌蛋白G 的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人補(bǔ)體受體1型的重組融合體的免疫學(xué)應(yīng)答的增強(qiáng)。US專利申請(qǐng) US2004/0001827(Dennis)也披露了使用包含肽配體的構(gòu)建體，其也由肽展示技術(shù)鑒別，其 結(jié)合血清白蛋白及綴合生物化學(xué)化合物用于腫瘤靶向。
[0008] 與HSA締合導(dǎo)致降低的免疫原性
[0009] 除了對(duì)生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期的作用之外，還提示生物學(xué)活性蛋白質(zhì)和 白蛋白結(jié)合蛋白之間的融合體的與白蛋白的非共價(jià)締合降低對(duì)生物學(xué)活性蛋白的免疫應(yīng) 答。因此，在W02005/097202中，描述了用這一原理降低或消除對(duì)生物學(xué)活性蛋白的免疫應(yīng) 答。
[0010] 細(xì)菌受體蛋白質(zhì)的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域
[0011] 鏈球菌蛋白G(SpG)是存在于一些鏈球菌菌株的表面上的雙功能受體，能結(jié)合IgG 和血清白蛋白（Bj6rcketal，MoIImmunol24:1113,1987)。所述結(jié)構(gòu)高度重復(fù)，具有幾 個(gè)結(jié)構(gòu)和功能不同的結(jié)構(gòu)域（Gussetal，EMB0J5:1567，1986)，更精確3個(gè)以結(jié)合基序 和3個(gè)血清白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Olssonetal，EurJBiochem168:319,1987)。3個(gè)血清 白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一的結(jié)構(gòu)已確定，顯示三螺旋束結(jié)構(gòu)域（Kraulisetal，F(xiàn)EBSLett 378:190,1996)。這一基序命名為ABD(白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域），大小為46個(gè)氨基酸殘基。在 文獻(xiàn)中，其也被稱為G148-GA3。
[0012] 除了來(lái)自鏈球菌的蛋白G之外的其它細(xì)菌白蛋白結(jié)合蛋白也已經(jīng)鑒別，其含有 類似于蛋白G的白蛋白結(jié)合三螺旋結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域。這種蛋白的例子是PAB，PPL，MAG和 ZAG蛋白。這種白蛋白結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研宄已經(jīng)進(jìn)行和報(bào)道，例如Johansson和同 事（Johanssonetal，JMolBiol266:859-865, 1997;Johanssonetal，JBiolChem 277:8114-8120, 2002)，其引入了命名"GA模塊"（蛋白G相關(guān)白蛋白結(jié)合模塊），針對(duì)負(fù)責(zé)白 蛋白結(jié)合的三螺旋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。另外，Rozaketal報(bào)道了產(chǎn)生GA模塊的人工變體，其被 選擇和研宄不同物種特異性和穩(wěn)定性（Rozaketal,Biochemistry45:3263-3271,2006)。 在本說(shuō)明書中，使用Johanssonetal和Rozaketal文章中建立的對(duì)來(lái)自不同細(xì)菌物種 的GA模塊的術(shù)語(yǔ)。
[0013] 除了上述含有三螺旋的蛋白質(zhì)之外，存在結(jié)合白蛋白的其它細(xì)菌蛋白 質(zhì)。例如，命名為"M蛋白"的鏈球菌蛋白質(zhì)家族包含結(jié)合白蛋白的成員（參見(jiàn) Navarre&Schneewind,MMBR63:174-229, 1999 中的表 2)。非限制性例子是蛋白質(zhì)Ml/ Emml,M3/Emm3,M12/Emml2,EmmL55/Emm55,Emm49/EmmL49 和H〇
[0014] 新生Fc受體（FcRn)介導(dǎo)的HSA的胞轉(zhuǎn)
[0015]MHC1類新生Fc受體（FcRn)介導(dǎo)白蛋白和IgG的細(xì)胞運(yùn)輸和再循環(huán)（Brambell etal,Nature203:1352, 1964;Chaudhuryetal，JExpMedl97:315, 2003)。FcRn也稱為Brambell受體，在低內(nèi)體pH特異結(jié)合白蛋白和IgG，因此通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面并在中性pH 釋放而保護(hù)胞飲蛋白免于溶酶體降解。FcRn在pH5-6對(duì)白蛋白和IgG有良好親和性，而在 中性pH顯示差的至無(wú)親和性。以此方式，白蛋白和IgG的濃度和半衰期被調(diào)節(jié)。另外，F(xiàn)cRn 負(fù)責(zé)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)白蛋白和IgG穿過(guò)細(xì)胞屏障，例如氣道的表皮和覆蓋腸道和胎盤的內(nèi)皮。 [0016] 如從背景描述不同段落證明的，提供選擇具有對(duì)白蛋白的高親和性的多肽是開(kāi)發(fā) 各種生物醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)和其它應(yīng)用的關(guān)鍵因素，因此現(xiàn)有技術(shù)需要額外的這種多肽分子。 [0017] 發(fā)明公開(kāi)
[0018] 本發(fā)明第一方面滿足了對(duì)具有相當(dāng)高的白蛋白親和性的新多肽的需求，其是通過(guò) 提供包含白蛋白結(jié)合基序的白蛋白結(jié)合多肽而滿足，所述基序由如下氨基酸序列組成：
[0019] GVSDX5YKX8X9I XnX12AX14TVEGVX20ALX 23X24X25I
[0020] 其中各自獨(dú)立地，
[0021] X5選自Y和F;
[0022] X8選自N,R和S ;
[0023] X9選自V，I，L，M，F(xiàn)和Y;
[0024] Xn選自N，S，E和D;
[0025] X12選自R,K和N ;
[0026] X14選自K和R;
[0027] X2。選自D, N,Q,E,H,S,R和K;
[0028] X23選自K,I和T ;
[0029] X24選自A, S, T, G,H,L和D;和
[0030] X25選自H,E和D;
[0031] 條件是所述氨基酸序列不是
[0032] GVSDYYKNLI NNAKTVEGVK ALIDEI；
[0033] 所述白蛋白結(jié)合多肽結(jié)合白蛋白，從而相互作用的Kd值最大為lx1(T9M。
[0034] 本發(fā)明的序列相關(guān)的白蛋白結(jié)合多肽種類的上述定義是基于大量如下實(shí)驗(yàn)章節(jié) 詳細(xì)描述的鑒別和鑒定的白蛋白結(jié)合多肽的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。變體選自親代多肽序列或"骨架" 的隨機(jī)變體的大集合，所述選擇基于在例如噬菌體展示或其它選擇實(shí)驗(yàn)中與白蛋白的相互 作用。鑒別的白蛋白結(jié)合基序或"ABM"相應(yīng)于親代骨架的白蛋白結(jié)合區(qū)，所述區(qū)域組成三 螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的2個(gè)a螺旋。盡管親代骨架中的2個(gè)ABM螺旋的原始氨基酸殘基 已經(jīng)組成結(jié)合表面用于與白蛋白相互作用，該結(jié)合表面根據(jù)本發(fā)明通過(guò)取代修飾以提供另 外的白蛋白結(jié)合能力。
[0035] 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到任何多肽的功能，例如本發(fā)明多肽的白蛋白結(jié)合能力， 依賴于多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此可以對(duì)多肽的氨基酸序列進(jìn)行小改變而不影響其功能。因此， 本發(fā)明涵蓋了ABM的修飾變體，它們使得白蛋白結(jié)合特征被保留。例如，可以將屬于某一功 能組的氨基酸殘基（例如疏水性、親水性、極性等）的氨基酸殘基用來(lái)自相同功能組的另一 個(gè)氨基酸交換。
[0036] 在本發(fā)明這一方面的多肽的一個(gè)實(shí)施方案中，\是Y。
[0037] 在本發(fā)明這一方面的多肽的一個(gè)實(shí)施方案中，X8選自N和R，并且可以特別是R。
[0038] 在本發(fā)明這一方面的多肽的一個(gè)實(shí)施方案中，乂9是L。
[0039] 在本發(fā)明這一方面的多肽的一個(gè)實(shí)施方案中，Xn選自N和S，并且可以特別是N。
[0040] 在本發(fā)明這一方面的多肽的一個(gè)實(shí)施方案中，X12選自R和K，例如乂12是1?或乂12是 K〇
[0041] 在本發(fā)明這一方面的多肽的一個(gè)實(shí)施方案中，乂14是K。
[0042] 在本發(fā)明這一方面的多肽的一個(gè)實(shí)施方案中，X2Q選自D，N，Q，E，H，S和R，并且可以 特別是E。
[0043] 在本發(fā)明這一方面的多肽的一個(gè)實(shí)施方案中，X23選自K和I，并且可以特別是K。
[0044] 在本發(fā)明這一方面的多肽的一個(gè)實(shí)施方案中，X24選自A，S，T，G，H和L。
[0045] 在本發(fā)明這一方面的多肽的一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，&4是L。
[0046] 在本發(fā)明這一方面的多肽的一個(gè)甚至更具體的實(shí)施方案中，