專利名稱：控制水稻小孢子發(fā)育的cDNA片段及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的一種cDNA片段及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用，特別是涉及控制水稻小孢子發(fā)育的cDNA及其編碼蛋白與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高等生物的繁殖需要經(jīng)過(guò)一個(gè)減數(shù)分裂的過(guò)程以形成配子。雜交系在作物優(yōu)良品種的選育上尤為重要，作為控制雜交系的手段之一，人們把注意力集中到小孢子上。如果能夠人為地控制小孢子的育性，就能夠?yàn)殡s交育種提供一個(gè)強(qiáng)有力的手段。
在植物中，調(diào)控小孢子育性的基因和調(diào)控元件很多，其中，在酵母和人類中發(fā)現(xiàn)的SKP1基因能夠和細(xì)胞周期蛋白A-cdk2復(fù)合體共同作用，控制細(xì)胞由有絲分裂向減數(shù)分裂的過(guò)渡[Hoyt，M.A.1997，Cell，91，149-151]。由于減數(shù)分裂是一個(gè)非常保守的過(guò)程，因而人們?cè)噲D在植物中也找到類似的基因，并在1999年證實(shí)雙子葉植物擬南芥中的ASK基因家族在對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控中起到了同樣的作用[Yang，M.1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，11416-11421]。但在單子葉植物中還沒(méi)有類似的報(bào)道。
控制生物體內(nèi)基因表達(dá)的方式很多，如基因突變、超表達(dá)、反義RNA技術(shù)、基因敲除技術(shù)等等。最近幾年來(lái)，科學(xué)家們?cè)诰€蟲(chóng)中首先發(fā)現(xiàn)一些小RNA能夠?qū)δ愁惢虻谋磉_(dá)起到強(qiáng)烈的抑制作用，并進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了一些雙鏈RNA能夠特異地誘導(dǎo)產(chǎn)生一種能夠識(shí)別并降解這樣的RNA序列的RNase，從而在轉(zhuǎn)錄后的水平上強(qiáng)烈地抑制該類基因的表達(dá)，由此而派生出了RNA干擾(RNA interference，即RNAi)技術(shù)。
當(dāng)已知某個(gè)或某類基因的cDNA序列時(shí)，人為地將該cDNA片段與一段能夠被預(yù)期的宿主細(xì)胞識(shí)別并切除的內(nèi)含子序列構(gòu)建成“cDNA-內(nèi)含子-cDNA”的結(jié)構(gòu)，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞內(nèi)的核酸酶就會(huì)將轉(zhuǎn)錄出的RNAi結(jié)構(gòu)中的由內(nèi)含子片段的轉(zhuǎn)錄部分切除，形成一段由cDNA轉(zhuǎn)錄出的雙鏈RNA的結(jié)構(gòu)，而該雙鏈結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)宿主合成RNase[Hutvagner，2001，science，293，834-838]，特異地識(shí)別并降解宿主細(xì)胞內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄的目的基因的mRNA，從而抑制了該基因的表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)控制水稻小孢子發(fā)育的基因的cDNA片段及其編碼的多肽。
將此cDNA的基因命名為OSK1，它控制水稻小孢子發(fā)育，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2多肽序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性。
序列表中序列1的DNA序列由466個(gè)堿基組成，自5’端第1位堿基到第207位堿基編碼69個(gè)氨基酸的多肽，208位以后的259個(gè)堿基為3’非翻譯區(qū)。
控制水稻小孢子發(fā)育的蛋白OSK1，是包含序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2氨基酸殘基序列是由69個(gè)氨基酸殘基組成多肽，該多肽存在于OSK1蛋白質(zhì)中。
含有上述cDNA的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于RNAi技術(shù)的新質(zhì)粒。
一種用于RNAi技術(shù)的質(zhì)粒，是將控制水稻小孢子發(fā)育的OSK的cDNA片段以不同的方向分別連到水稻泛素基因內(nèi)含子的兩側(cè)，得到一重組片段，并將該重組片段連接到水稻Ubi啟動(dòng)子下游得到的質(zhì)粒。
為使轉(zhuǎn)化體便于篩選，所述質(zhì)粒上含有抗生素篩選標(biāo)記和/或報(bào)告基因。
借助農(nóng)桿菌侵染及其它常規(guī)基因轉(zhuǎn)化方法，可以將Ubi啟動(dòng)子及其下游片段整合在植物染色體上。由于RNA干擾作用使得轉(zhuǎn)化體水稻表現(xiàn)了部分不育甚至完全不育的現(xiàn)象。細(xì)胞學(xué)觀察顯示轉(zhuǎn)化體水稻的小孢子發(fā)育發(fā)生了變異，形成大量不正常的小孢子，甚至不能形成小孢子。本發(fā)明將在作物育種，特別是水稻育種中得到廣泛應(yīng)用。


圖1為用于RNAi的質(zhì)粒圖譜。
圖2為不同處理的花粉粒。
圖3轉(zhuǎn)化體水稻的Northern雜交結(jié)果圖4轉(zhuǎn)化體水稻葉片總DNA經(jīng)SmaI消化后的Southern雜交結(jié)果具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、OSK1片段的獲得1、水稻減數(shù)分裂期cDNA文庫(kù)的構(gòu)建以中花10號(hào)水稻為材料，取減數(shù)分裂期幼穗(長(zhǎng)4-5cm)為材料，進(jìn)行cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。文庫(kù)構(gòu)建選用CLONTECH公司的SMART cDNA Library Construction Kit(Catalog#k1051-1)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。該試劑盒最終將雙鏈cDNA插入在載體pTriplEx2之上。
包裝反應(yīng)采用Promega公司的Packagene System(Catalog#K315/1-4)。構(gòu)建后文庫(kù)的滴度為0.8-1.4×106pfu/ml。
2、水稻減數(shù)分裂期cDNA文庫(kù)cDNA的PCR擴(kuò)增常規(guī)步驟提取水稻減數(shù)分裂期cDNA文庫(kù)的cDNA，以引物5’引物5’CGG ATC CA(T/C)ATG(A/G)TNG A(A/G)GA(T/C)GA(T/C)TG3’引物5’GTCTAGATC(A/G)AANGCCCA(T/C)TG(G/A)TT(T/C)TC進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為98℃×2min→(94℃×1min→64℃×40sec→72℃×80sec)×32循環(huán)→72℃×10min，得到特異PCR擴(kuò)增片段。
3、水稻減數(shù)分裂期cDNA文庫(kù)的噬菌斑原位雜交篩選取1ul水稻減數(shù)分裂期cDNA文庫(kù)與500ul指示菌XL1-Blue混合，溫育20分鐘后，與適量頂層瓊脂糖(0.65％)混勻，鋪于150mm平板上，37℃培養(yǎng)至噬菌斑直徑約1mm。把平板置4℃2小時(shí)后，移出至室溫，取一圓形尼龍膜平鋪于頂層瓊脂糖表面，使其直接與噬菌斑接觸30-60秒后，小心將尼龍膜取下，DNA的一面向上置于裝有變性液(0.5mol/L NaOH、1.5mol/L NaCl)的盤子中5分鐘，再將尼龍膜置于中和液[1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris-Cl(pH7.4)]中5分鐘，用2×SSC浸泡后，將DNA的一面向上置于紙巾上干燥。每個(gè)平皿重復(fù)上述轉(zhuǎn)膜一次。待尼龍膜晾干后，80℃烤膜1-2小時(shí)后待用。
取一小盤，加入少量2×SSC，將烤好的尼龍膜置其液面上，使液體從下面濕透尼龍膜。浸泡5分鐘。將尼龍膜轉(zhuǎn)移到盛有適量預(yù)雜交液[5×SSC、0.5％SDS、1mmol/LEDTA(pH8)]的容器內(nèi)，65℃溫育2小時(shí)。
以所得PCR片段用32P隨機(jī)標(biāo)記后做為探針。100℃加熱5分鐘變性，迅速冰浴。然后將探針加入到預(yù)雜交液中，65℃溫育12小時(shí)以上。
雜交完成后，棄雜交液，用2×SSC+0.1％SDS或0.2×SSC+0.1％SDS于65℃進(jìn)行適當(dāng)程度的洗膜。
-70℃進(jìn)行X光片曝光。
通過(guò)噬菌斑原位雜交，在水稻減數(shù)分裂期cDNA文庫(kù)中篩選到一個(gè)克隆，該克隆含有與擬南芥ASK1基因同源的由466個(gè)堿基組成的cDNA片段，將此cDNA的基因命名為OSK1，序列為序列表中的序列1，將含有該cDNA片段的質(zhì)粒命名為pTrOSK。
實(shí)施例2、Northern雜交將各種材料的總RNA分別測(cè)定濃度后，取等量的各個(gè)樣品在1.0％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳至溴酚藍(lán)遷移到凝膠的2/3處，將凝膠轉(zhuǎn)移至一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，用滅菌的DEPC水淋洗3-4次，浸泡于數(shù)倍體積的20×SSC中，溫和搖動(dòng)45min；通過(guò)毛吸作用轉(zhuǎn)移24小時(shí)，使RNA帶吸附在尼龍膜上，120℃烤膜30分鐘。
將尼龍膜放入雜交管，經(jīng)65℃預(yù)雜交2-3hr后，加入經(jīng)純化、變性的32P-標(biāo)記的OSK1探針，65℃雜交過(guò)夜(17小時(shí)以上)，倒出雜交液，用2×SSC+0.1％SDS和1×SSC+0.1％SDS，65℃，各洗膜10min；用保鮮膜包裹尼龍膜后，用X-光膠片進(jìn)行放射自顯影；-80℃曝光3-7天后，按常規(guī)洗片，顯示雜交帶的位置。結(jié)果如圖3所示，圖中ss種子苗；ml減數(shù)分裂時(shí)期葉片；pl減數(shù)分裂后葉片；t轉(zhuǎn)化體葉片，由圖3可見(jiàn)，轉(zhuǎn)化體除了和對(duì)照都在約600bp的相同位置出現(xiàn)了相似的雜交條帶外，它還有一條較大的額外雜交條帶。這額外的的信號(hào)可以認(rèn)為是RNAi結(jié)構(gòu)的組成型轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
實(shí)施例3、基于OSK1 cDNA片段的RNAi結(jié)構(gòu)的構(gòu)建將長(zhǎng)度為618bp的水稻泛素基因內(nèi)含子片段，連接到質(zhì)粒pTrOSK的EcoRI+SmaI切口處得到質(zhì)粒p1。
自p1用RsaI+XhoI切下反向連接的OSK-Ubi內(nèi)含子片段并插入到質(zhì)粒pBluescriptII KS的EcoRV+XhoI處得到p2。
自p2的EcoRI+KpnI處切下反向連接的OSK+Ubi內(nèi)含子片段并連接到pTrOSK的EcoRI+KpnI位點(diǎn)處，得到p3。
用KpnI+SacI自p3切下RNAi結(jié)構(gòu)連接到質(zhì)粒pUN1301的相同酶切位點(diǎn)處，得到RNAi的表達(dá)載體pUNOSK，其結(jié)構(gòu)圖譜如圖1所示。在pUNOSK中，以啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)隨后的RNAi結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄。
實(shí)施例4、pUNOSK對(duì)水稻的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性苗GUS染色把pUNOSK轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105中后，再用來(lái)侵染水稻中花10號(hào)的愈傷組織，經(jīng)共培養(yǎng)感染、抗性培養(yǎng)基篩選及分化培養(yǎng)基上分化得到抗性苗。
取分化出的幼苗切段，于GUS染色液(100mmol/L NaPO4 pH7.0，0.1％Triton X-100，10mmol/LEDTA，0.5mmol/L亞鐵氰化鉀，0.5mmol/L鐵氰化鉀，X-Gluc1mg/mL)中，抽氣幾分鐘，然后置于37℃溫育過(guò)夜，觀察藍(lán)色反應(yīng)。進(jìn)一步確定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。結(jié)果表明，外源基因已整合到了抗性苗的基因組中。
實(shí)施例5、轉(zhuǎn)化體Southern鑒定提取轉(zhuǎn)化體的總DNA，用SmaI酶切、電泳后將凝膠置于數(shù)倍體積的變性液(1.5MNaCl-0.5M NaOH)中浸泡45min，溫和搖動(dòng)，使DNA變性；用去離子水對(duì)凝膠稍事漂洗后，浸泡于數(shù)倍體積的中和液中(1.5M NaCl-1.0MpH7.5 Tris-HCl)，溫和搖動(dòng)；更換中和液，繼續(xù)浸泡15min；通過(guò)毛細(xì)作用使DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜。
轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將尼龍膜用6×SSC漂洗5min；將尼龍膜放在濾紙上晾干，120℃烘烤30min。
將尼龍膜放入雜交管，加入適量預(yù)雜交液(15ml 20×SSC，5ml 50×denhardt，2.5ml 10％SDS，0.5ml 10mg/ml鮭精DNA，27ml ddH2O)，65℃預(yù)雜交2-3hr；預(yù)雜交結(jié)束后，倒出預(yù)雜交液，加入適量雜交液(15ml 20×SSC，2.5ml 10％SDS，0.5ml10mg/ml鮭精DNA，32ml ddH2O)和純化變性好的探針(以隨機(jī)延伸法對(duì)OSK1片段進(jìn)行32P放射性標(biāo)記)，65℃雜交過(guò)夜；倒出雜交液，用2×SSC+0.1％SDS和1×SSC+0.1％SDS，65℃，各洗膜10min。
用保鮮膜包裹尼龍膜后，用X-光膠片進(jìn)行放射自顯影；-80℃曝光3-7天后，按常規(guī)洗片。結(jié)果表明從對(duì)轉(zhuǎn)化體的Southern雜交結(jié)果可以看出，基于OSK1 cDNA片段的RNAi結(jié)構(gòu)插入到了轉(zhuǎn)化體中(SmaI能夠自RNAi結(jié)構(gòu)中切下約700bp的條帶)。而且，強(qiáng)、弱轉(zhuǎn)化體中插入片段的拷貝數(shù)可能相同，結(jié)果如圖4所示，圖中a.MW markers；b.對(duì)照；c.強(qiáng)轉(zhuǎn)化體；d.弱轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例6、轉(zhuǎn)化體小孢子觀察取轉(zhuǎn)化體的成熟花藥放到清潔的載玻片上，加上一滴醋酸洋紅溶液，將花藥輕輕搗碎，用鑷子去除大的碎片后，蓋上蓋玻片再用拇指均勻壓片。顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示，圖中a.正?；ǚ哿?；b.轉(zhuǎn)化體花粉粒；c.轉(zhuǎn)化體花粉粒，示大小差別。從圖中可以明顯看出轉(zhuǎn)化體的小孢子發(fā)育異常。
序列表<160>2<210>1<211>466<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>1aaggtcgacc aggccaccct cttcgacctc atcctggccg cgaactacct caacatcaag 60gggttgctgg accttacttg ccagactgtt gctgacatga tcaaggggaa gactcctgag120gagatccgca agaccttcaa catcaagaac gacttcaccc ctgaggagga agaggagacc180cgcagggaga accagtgggc ttttgagtag aaggcatcaa ggcctctgat gtcttggtgc240ttagatcctt actccgtatc tacgtatgct ctgcttttat atgtcgtgct ggttgtaagt300attttggagt ccgatggggg ttcatgtgca cgtttagttg gttaaatggt taagttctat360ccaggaaaaa aagaactgat gtggtcagaa ctactgaacc tgttatctgc attaattaat420actatcaatc tgcagtaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 466<210>2<211>69<212>PRT<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>2Lys Val Asp Gln Ala Thr Leu Phe Asp Leu Ile Leu Ala Ala Asn1 5 10 15Tyr Leu Asn Ile Lys Gly Leu Leu Asp Leu Thr Cys Gln Thr Val20 25 30Ala Asp Met Ile Lys Gly Lys Thr Pro Glu Glu Ile Arg Lys Thr
35 40 45Phe Asn Ile Lys Asn Asp Phe Thr Pro Glu Glu Glu Glu Glu Thr50 55 60Arg Arg Glu Asn Gln Trp Ala Phe Glu65 69
權(quán)利要求
1.控制水稻小孢子發(fā)育的OSK的cDNA片段，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2多肽序列的核苷酸序列；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列的編碼區(qū)具有80％以上同源性的DNA序列。4)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列的非編碼區(qū)具有80％以上同源性的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述控制水稻小孢子發(fā)育的cDNA是序列表中序列1的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于該cDNA的5’端第1位堿基到第207位堿基編碼69個(gè)氨基酸的多肽。
4.控制水稻小孢子發(fā)育的蛋白OSK1，是包含序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于它是包含序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
6.含有權(quán)利要求1所述cDNA的表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于所述載體是將控制水稻小孢子發(fā)育的OSK的cDNA片段以不同的方向分別連到水稻泛素(ubquitin)基因內(nèi)含子的兩側(cè)，得到一重組片段，并將該重組片段連接到Ubi啟動(dòng)子下游得到的質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體，其特征在于所述質(zhì)粒上含有抗生素篩選標(biāo)記和/或報(bào)告基因。
9.含有權(quán)利要求1所述基因的細(xì)胞系。
10.權(quán)利要求1-3所述基因在作物育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)控制水稻小孢子發(fā)育的基因的cDNA及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用。目的是提供一個(gè)控制水稻小孢子發(fā)育的cDNA及其編碼產(chǎn)物及用于RNAi技術(shù)的質(zhì)粒。控制水稻小孢子發(fā)育的基因OSK1的cDNA是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2多肽序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。用于RNAi技術(shù)的質(zhì)粒是將OSK1的cDNA以不同的方向分別連到水稻泛素基因內(nèi)含子的兩側(cè)，得到一重組片段，并將該重組片段連接到Ubi啟動(dòng)子下游得到的質(zhì)粒。細(xì)胞學(xué)觀察顯示轉(zhuǎn)化體水稻的小孢子發(fā)育發(fā)生了變異，形成大量不正常的小孢子，甚至不能形成小孢子。本發(fā)明將在作物育種，特別是水稻育種中得到廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1539972SQ03109789
公開(kāi)日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2003年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月21日
發(fā)明者種康, 梁預(yù), 趙原, 許智宏, 譚克輝, 種 康 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所