專利名稱：中試規(guī)模木霉高產(chǎn)厚垣孢子液體發(fā)酵制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種中試規(guī)模木霉高產(chǎn)厚垣孢子液體發(fā)酵制備方法。
背景技術(shù)：
木霉菌(Trichoderma spp.)是國際上公認的對環(huán)境友好的植物病害生物防治微生物。目前國際上已有50余種木霉菌菌劑注冊、生產(chǎn)和使用。但是目前商品化的木霉菌制劑主要是以木霉菌分生孢子為主要成分，制劑貨架期較短(僅有三個月)，限制了制劑在生產(chǎn)中應(yīng)用的有效期限。已有研究表明木霉菌在特定的培養(yǎng)條件下可以產(chǎn)生厚垣孢子，厚垣孢子具有耐干燥、耐高溫、對土壤抑菌作用不敏感及存活期長等優(yōu)點，可使孢子易于加工和貯存，有利于在土壤中存活。因此，如何生產(chǎn)出高含量厚垣孢子是提高木霉菌劑貯藏時間和應(yīng)用時效性的關(guān)鍵技術(shù)。然而迄今為止，國內(nèi)外關(guān)于木霉菌產(chǎn)厚垣孢子發(fā)酵條件的報導(dǎo)或?qū)＠饕抢闷咸烟?、燕麥粉做為碳源在三角產(chǎn)瓶-搖床培養(yǎng)條件下建立的，例如鄒勇等U006)通過正交設(shè)計研究表明黃綠木霉菌(Trichoderma aureoviride) T-33菌株發(fā)酵生產(chǎn)厚垣孢子的優(yōu)化條件為燕麥粉培養(yǎng)液、30°C、pH 4. 0U40r/min振蕩培養(yǎng)，產(chǎn)生厚垣孢子數(shù)量為3. 37 X IO7個/mL。但這一研究主要是在三角瓶和搖床條件下和特定菌株下完成的，生產(chǎn)成本較高，并且缺少普遍適用性，不適合后續(xù)的工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。此外，利用馬鈴薯、葡萄糖、蔗糖做為碳源制備木霉菌T-23菌株厚垣孢子(莊敬華等，2005)，同樣存在生產(chǎn)成本過高和缺少普適性的難題。因此有必要篩選更為低廉的營養(yǎng)基質(zhì)制備木霉菌厚垣孢子制劑。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，顧金剛等在《中國生物防治》2008年第M卷第3 期報告中表明“哈茨木霉ACC30371以玉米稈粉培養(yǎng)基為營養(yǎng)基質(zhì)，在^°C、初始pH 6.0、 250r/min、裝瓶量75mL/250mL的條件下培養(yǎng)，10天后厚垣孢子數(shù)量達5. 13 X IO8個/mL。說明利用低成本原材料生產(chǎn)厚垣孢子是可行的，但本研究發(fā)酵時間過長，需要10天，而且也只是在三角瓶水平上利用特定木霉菌株完成的，很難反映該方法對各種木霉菌生產(chǎn)厚垣孢子的普適性、以及在工業(yè)化水平上發(fā)酵生產(chǎn)厚垣孢子所需條件。此外，玉米的秸稈粉碎過程也增加了操作的繁鎖程度，間接增加了生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種中試規(guī)模木霉高產(chǎn)厚垣孢子液體發(fā)酵制備方法，解決了傳統(tǒng)木霉菌厚垣孢子制備成本高、發(fā)酵規(guī)模小和發(fā)酵時間長等問題， 實現(xiàn)了中試發(fā)酵水平上，低成本制備木霉菌厚垣孢子產(chǎn)品的目標。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明由以下步驟組成步驟一，取木霉菌(Trichoderma spp.)的三種菌株 Τ· koningiopisis、 Τ. atroviride, Τ. harzianum,分別接種于種子菌培養(yǎng)基PDA上進行常溫培養(yǎng)，之后分別接種于種子液中進行發(fā)酵培養(yǎng)，得種子菌發(fā)酵液；
所述的PDA培養(yǎng)基，其組分及含量為馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂粉25g/L 余量為水，該PDA培養(yǎng)基通過以下方式制備得到將馬鈴薯去皮后切成塊加水并煮沸，然后用紗布過濾并向濾液中加葡萄糖和瓊脂粉，最后補水定容。所述的種子液培養(yǎng)基的組分及含量為馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L，余量為水， 該種子液培養(yǎng)基通過以下方式制備得到將馬鈴薯去皮后切成塊加水并煮沸，然后用紗布過濾并向濾液中加葡萄糖，最后補水定容。所述的常溫培養(yǎng)是指在環(huán)境下培養(yǎng)3-4天。所述的發(fā)酵培養(yǎng)是指在pH 6 7J8°C，溶氧量20-30%以及130-140r/min的旋轉(zhuǎn)環(huán)境下發(fā)酵7天。步驟二，將種子菌發(fā)酵液接種于中試水平的液體培養(yǎng)基中，經(jīng)二次發(fā)酵得到液體發(fā)酵物；所述的接種是指按每200L液體培養(yǎng)基添加1. 2L種子菌發(fā)酵液的比例進行接種。所述的液體培液基的組分含量為玉米粉40-60g/L，硫酸銨450-550mg/L，余量為無菌水。所述的玉米粉的粒度為40目以下。所述的二次發(fā)酵是指在pH 3 4J8.0°C 48.8°C，溶解氧 20-30%，i;35-140r/ min的旋轉(zhuǎn)環(huán)境下發(fā)酵5-8天。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下創(chuàng)新點1.本發(fā)明所用基本培養(yǎng)基組分為玉米粉，價格低于傳統(tǒng)的燕麥粉培養(yǎng)基。其他輔助成分的數(shù)量及用量也低于傳統(tǒng)的產(chǎn)厚垣孢子培養(yǎng)基。2.本發(fā)明厚垣孢子制備方法實現(xiàn)了在300L中試水平上低成本發(fā)酵生產(chǎn)厚垣孢子的目標，不再僅限于通過三角瓶-搖床實驗產(chǎn)生厚垣孢子。3.本發(fā)酵條件不僅適用于單一種屬木霉菌產(chǎn)厚垣孢子的液體發(fā)酵，對于其他種木霉菌株液體發(fā)酵產(chǎn)厚垣孢子也具有普遍適應(yīng)性。4.本發(fā)明解決了利用傳統(tǒng)培養(yǎng)基發(fā)酵制備厚垣孢子時間過長、操作復(fù)雜、產(chǎn)量低等問題。本發(fā)明涉及的木霉菌是按照Christian P. Kubicek和Gary E.Harman主編的 ((Trichoderma and Gliocladium》第一卷(Taylor 和 Francis Ltd, 1998)中介紹的土壤稀釋法進行分離，并利用木霉菌選擇性培養(yǎng)基[Josie Williams, John Μ. Clarkson, Peter R. Mills, and Richard M. Cooper A Selective Medium for Quantitative Reisolation of Trichoderma harzianum from Agaricus bisporus Compost, Appl Environ Microbiol. 2003July ；69 (7) :4190 4191)]培養(yǎng)得到。本發(fā)明涉及擬康寧木霉(T. koningiopsis)已經(jīng)在《李廣記陳捷劉銅劉力行*，木霉屬中國新記錄種T. koningiopisis記述，微生物學(xué)通報pl663_1665》公開。本發(fā)明涉及深綠木霉(T.atroviride)已經(jīng)在《Jun Tang, Lixing Liu, Xiuli Huang, Yingying Li, Yunpeng Chen, and Jie Chen. Proteomic analysis of Trichoderma atro viride mycelia stressed by organophosphate pesticide dichlorvos. Can. J. Microbiol. pl21_127》公開。本發(fā)明涉及哈茨木霉(Τ. harz ianum)已經(jīng)在《唐俊孫文良伍柯瑾劉力行陳捷女，木霉菌發(fā)酵液蛋白對玉米彎孢菌葉斑病的誘導(dǎo)抗性作用，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，P8564-8566》公開。上述三株木霉菌株均由上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院植物病理學(xué)實驗室保存。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1步驟一隨意選取10株木霉菌株，分別接種于PDA(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g， IOOOmL水)平板上培養(yǎng)3天；在平板上菌落周邊打取菌餅，接入種子液培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，1000m L水)發(fā)酵3天后，轉(zhuǎn)接至200L液體培養(yǎng)基(組分馬鈴薯 200g，葡萄糖 20g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, FeSO4 · 7H20 0. 0075g, MnSO4O. 0025g, ZnSO4O. 002g, KH2P043. 83g，NaNO3L 42g，(NH4)2SO4L lg，CaCl2Ig,水 1000m L)中，于 300L 液體發(fā)酵罐 (FUS30L發(fā)酵系統(tǒng)，上海國強生化工程裝備有限公司)發(fā)酵7天；發(fā)酵參數(shù)pH6-7、溶氧量 20-30%。步驟二用IM HCL溶液將200L液體發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉10kg，硫酸銨IOOg)酸度調(diào)整到 PH4-5之后加入300L(裝罐量200L)發(fā)酵罐(FUS300L發(fā)酵系統(tǒng)，上海國強生化工程裝備有限公司)中。將1. 2L的種子菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，設(shè)定發(fā)酵參數(shù)溶解氧量20-30%。 從發(fā)酵后第3天開始取樣顯微鏡(40倍物鏡)檢查厚垣孢子的產(chǎn)量變化。本實施例的效果1、實驗設(shè)計分別取2個發(fā)酵條件下不同木霉菌株的發(fā)酵液，利用血球計數(shù)板對厚垣孢子數(shù)量進行統(tǒng)計。結(jié)果表明利用方法二(步驟二)發(fā)酵所得的厚垣孢子數(shù)量普遍高于利用方法一 (步驟一)發(fā)酵所得的厚垣孢子數(shù)量。在供試的10株木霉菌中，有9株菌在利用方法一時所得厚垣孢子數(shù)量大于利用方法二時。表1不同方法厚垣孢子產(chǎn)生數(shù)量(個/mL)不同菌株 1 權(quán)利要求
1.一種中試規(guī)模木霉高產(chǎn)厚垣孢子液體發(fā)酵制備方法，其特征在于，由以下步驟組成步驟一，取木霉菌的三種菌株T. koningiopsis、T. atroviride或Τ. harzianum,分別接種于種子菌培養(yǎng)基上進行常溫培養(yǎng)，之后分別接種于種子液中進行發(fā)酵培養(yǎng)，得種子菌發(fā)酵液；步驟二，將種子菌發(fā)酵液接種于中試水平的液體培養(yǎng)基中，經(jīng)二次發(fā)酵得到液體發(fā)酵物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中試規(guī)模木霉高產(chǎn)厚垣孢子液體發(fā)酵制備方法，其特征是， 所述的PDA培養(yǎng)基，其組分及含量為馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂粉25g/L余量為水，該PDA培養(yǎng)基通過以下方式制備得到將馬鈴薯去皮后切成塊加水并煮沸，然后用紗布過濾并向濾液中加葡萄糖和瓊脂粉，最后補水定容。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中試規(guī)模木霉高產(chǎn)厚垣孢子液體發(fā)酵制備方法，其特征是， 所述的種子液培養(yǎng)基的組分及含量為馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L，余量為水，該種子液培養(yǎng)基通過以下方式制備得到將馬鈴薯去皮后切成塊加水并煮沸，然后用紗布過濾并向濾液中加葡萄糖，最后補水定容。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中試規(guī)模木霉高產(chǎn)厚垣孢子液體發(fā)酵制備方法，其特征是， 所述的常溫培養(yǎng)是指在環(huán)境下培養(yǎng)3-4天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中試規(guī)模木霉高產(chǎn)厚垣孢子液體發(fā)酵制備方法，其特征是， 所述的發(fā)酵培養(yǎng)是指在PH 6 7J8°C，溶氧量20-30%以及130-140r/min的旋轉(zhuǎn)環(huán)境下發(fā)酵7天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中試規(guī)模木霉高產(chǎn)厚垣孢子液體發(fā)酵制備方法，其特征是， 所述的接種是指按每200L液體培養(yǎng)基添加1. 2L種子菌發(fā)酵液的比例進行接種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中試規(guī)模木霉高產(chǎn)厚垣孢子液體發(fā)酵制備方法，其特征是， 所述的液體培液基的組分含量為玉米粉40-60g/L，硫酸銨450-550mg/L，余量為無菌水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中試規(guī)模木霉高產(chǎn)厚垣孢子液體發(fā)酵制備方法，其特征是， 所述的玉米粉的粒度為40目以下。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中試規(guī)模木霉高產(chǎn)厚垣孢子液體發(fā)酵制備方法，其特征是， 所述的二次發(fā)酵是指在PH 3-4，28. O0C -28. 8°C，溶解氧20-30%，135-140r/min的旋轉(zhuǎn)環(huán)境下發(fā)酵5-8天。
全文摘要
一種微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域的中試規(guī)模木霉高產(chǎn)厚垣孢子液體發(fā)酵制備方法，通過取木霉菌的三種菌株T.koningiopisis、T.atroviride、T.harzianum，分別接種于種子菌培養(yǎng)基PDA上進行常溫培養(yǎng)，之后分別接種于種子液中進行發(fā)酵培養(yǎng)，得種子菌發(fā)酵液；再將種子菌發(fā)酵液接種于中試水平的液體培養(yǎng)基中，經(jīng)二次發(fā)酵得到液體發(fā)酵物。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)木霉菌厚垣孢子制備成本高、發(fā)酵規(guī)模小和發(fā)酵時間長等問題，實現(xiàn)了中試發(fā)酵水平上，低成本制備木霉菌厚垣孢子產(chǎn)品的目標。
文檔編號C12N1/14GK102154194SQ20111008107
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者張婷, 王秉麗, 陳捷 申請人:上海交通大學(xué)