專(zhuān)利名稱(chēng)：齲齒危險(xiǎn)的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種齲齒危險(xiǎn)的檢測(cè)方法，以具有特定氨基酸序列的合成肽為抗原，利用免疫學(xué)方法測(cè)定針對(duì)該抗原的人體唾液中所含的分泌型免疫球蛋白A(sIg A)的抗體效價(jià)。
背景技術(shù)：
眾所周知，人的口腔內(nèi)的變異鏈球菌(Streptococcus mutans)的存在和齲齒的發(fā)生之間具有密切關(guān)系，人們對(duì)此進(jìn)行了很多研究(例如，參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。存在于人體唾液中的該變異鏈球菌，在細(xì)菌中是變異鏈球菌及表兄鏈球菌(Streptococcus sobrinus) (下面分別稱(chēng)為[S.mutans]及[S.sobrinus])的通稱(chēng)。
存在于人體唾液中的變異鏈球菌的數(shù)越多，將來(lái)發(fā)生新齲齒的可能性越大(例如，非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)，所以進(jìn)行了試驗(yàn)來(lái)簡(jiǎn)單定量人體唾液中的變異鏈球菌。例如，利用與S.mutans產(chǎn)生特異反應(yīng)的單克隆抗體進(jìn)行試驗(yàn)(例如，參照專(zhuān)利文獻(xiàn)1、2)，通過(guò)肉眼觀察對(duì)簡(jiǎn)單培養(yǎng)試劑盒中增殖的菌體進(jìn)行定量(例如，參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)等。但是，通過(guò)測(cè)定人體唾液中的變異鏈球菌的數(shù)量而檢測(cè)齲齒危險(xiǎn)的方法存在如下問(wèn)題。首先，人體唾液中的變異鏈球菌的量并不總是固定的。例如，在檢測(cè)唾液中的變異鏈球菌的數(shù)量之前，如果被實(shí)驗(yàn)者仔細(xì)刷牙，變異鏈球菌的量就會(huì)臨時(shí)性下降，所以可能被判斷為齲齒的危險(xiǎn)低。
另外，變異鏈球菌量的增加方式因人而異，如果可以預(yù)先檢測(cè)該增加方式之差異，就可以在不受變異鏈球菌實(shí)際的增加或數(shù)量影響的情況下判斷齲齒的危險(xiǎn)。因此，作為無(wú)需直接測(cè)定變異鏈球菌量而檢測(cè)齲齒危險(xiǎn)的方法，為了判定是否患有特定的感染癥，檢測(cè)在人體內(nèi)是否含有由特定的感染源產(chǎn)生的抗體的方法受到了關(guān)注。即，由于抗體是針對(duì)特定的感染源而產(chǎn)生的，例如，人體唾液中如果含有很多針對(duì)變異鏈球菌的抗體，則變異鏈球菌的數(shù)量多的假設(shè)就會(huì)成立。現(xiàn)在，已經(jīng)確定人如果被變異鏈球菌感染，在唾液中會(huì)分泌針對(duì)變異鏈球菌的抗體，將S.mutans作為滅活菌體口服給藥時(shí)，唾液中針對(duì)S.mutans的免疫球蛋白的抗體效價(jià)會(huì)明顯上升(例如，非專(zhuān)利文獻(xiàn)3、4)。
但是，將唾液中所含的針對(duì)變異鏈球菌的抗體效價(jià)的多少用于齲齒的危險(xiǎn)判定的研究，未發(fā)現(xiàn)得到的抗體效價(jià)和齲齒患病狀態(tài)或唾液中變異鏈球菌的量之間有顯著的關(guān)系，因此該研究在齲齒危險(xiǎn)檢測(cè)的應(yīng)用上沒(méi)有獲得成功。
近年來(lái)，在一種變異鏈球菌S.mutans的菌體表層物質(zhì)中，分子量約19萬(wàn)、稱(chēng)為PAc(蛋白質(zhì)抗原血清型C(Protein Antigen cerotype C))的蛋白質(zhì)抗原與變異鏈球菌在牙齒表面的初始附著相關(guān)，該事實(shí)在利用將其作為抗原的單克隆抗體的研究中得到了確認(rèn)。根據(jù)這樣的確認(rèn)，出現(xiàn)了如下設(shè)想如果代替變異鏈球菌將其一部分菌體表層物質(zhì)PAc用作抗原來(lái)測(cè)定血漿的抗體效價(jià)，是否可以找出PAc與齲齒危險(xiǎn)之間的相關(guān)性。但是，此時(shí)也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PAc與齲齒患病狀況或唾液中的變異鏈球菌的量之間具有顯著的關(guān)系，所以不能用作危險(xiǎn)判定的指標(biāo)。
使用變異鏈球菌或PAc的抗體效價(jià)與變異鏈球菌的量之間沒(méi)有關(guān)系的理由是，由于不僅在變異鏈球菌的表面，而且在PAc中也存在多樣的抗原結(jié)構(gòu)，所以為了識(shí)別其他抗原而產(chǎn)生的人免疫球蛋白會(huì)意想不到的與變異鏈球菌的某部分結(jié)合。即，不是為了識(shí)別變異鏈球菌或PAc而產(chǎn)生的人免疫球蛋白，與變異鏈球菌或PAc之間發(fā)生了交叉反應(yīng)。
因此，為了避免上述的交叉反應(yīng)，將在PAc中純粹與變異鏈球菌初始附著牙齒表面有關(guān)的特定部分進(jìn)行了具體的研究，其結(jié)果，本發(fā)明人之一的泉福等確認(rèn)了PAc中具有α螺旋結(jié)構(gòu)的A區(qū)域(部分氨基酸序列216-464)，對(duì)于由S.mutans引起的牙齒表面上的聚生(colonization)和附著具有很大影響(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)5、6)，進(jìn)而，解釋了該P(yáng)Ac的A區(qū)域中最重要的序列是怎樣的(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)8)。之后，在PAc的A區(qū)域中作為抗原對(duì)于人的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)烈作用的序列，被確認(rèn)為是Y---L--Y(人的B細(xì)胞表位)及L--V-K--A(與各種人HLA-DR分子反應(yīng)的部分)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)9、10)。從該結(jié) 果 導(dǎo) 出 了 PAc 的 特 定 氨 基 酸 序 列[NAKATYEAALKQYEADLAAVKKANAA{PAc(361-386)}]。但是，對(duì)于該序列PAc(361-386)，在模型老鼠的實(shí)驗(yàn)中，使用該肽可以導(dǎo)出人的抗PAc(361-386)抗體(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)11)，并且從人血漿中的抗體效價(jià)中可證實(shí)與齲齒經(jīng)驗(yàn)之間的關(guān)系(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)12)。但是沒(méi)有得到該P(yáng)Ac與口腔內(nèi)的變異鏈球菌的數(shù)量之間的關(guān)系。從而，使用特定抗原，根據(jù)針對(duì)該抗原的人免疫球蛋白的抗體效價(jià)的差異，可以正確檢測(cè)齲齒危險(xiǎn)，上述這種齲齒危險(xiǎn)的檢測(cè)方法還沒(méi)有確立。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種齲齒危險(xiǎn)的檢測(cè)方法，其利用具有特定氨基酸序列的合成肽作為抗原，根據(jù)針對(duì)該抗原的人免疫球蛋白的不同抗體效價(jià)的差異，可以正確且短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)齲齒危險(xiǎn)。
本發(fā)明人為了解決前述問(wèn)題進(jìn)行了全身心研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從抗體的性質(zhì)考慮難以從PAc(361-386)和血漿中的抗體效價(jià)獲得口腔內(nèi)的變異鏈球菌的量，而且即使它們有相關(guān)性，由于使用血漿，實(shí)驗(yàn)需要數(shù)小時(shí)至數(shù)天的操作時(shí)間，因此不能作為可以在臨床上使用的齲齒危險(xiǎn)的檢測(cè)方法。然而，針對(duì)粘膜免疫具有與通常的免疫系統(tǒng)不同的作用，以只含S.mutans的PAc(361-386)的氨基酸序列的合成肽為抗原，測(cè)定從具有防止變異鏈球菌附著牙齒表面的功能的口腔粘膜分泌的分泌型免疫球蛋白A(sIg A)的抗體效價(jià)，可以正確且短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行齲齒危險(xiǎn)的檢測(cè)，從而完成了本發(fā)明。


圖1表示利用ELISA測(cè)定5個(gè)被試驗(yàn)者(A、B、C、D、E)的唾液中免疫球蛋白A針對(duì)合成肽的抗體效價(jià)的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及齲齒危險(xiǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于，利用具有下式1所示氨基酸序列的合成肽為抗原，通過(guò)測(cè)定針對(duì)該抗原的人體唾液中的分泌型免疫球蛋白A的抗體效價(jià)，從而進(jìn)行人的齲齒危險(xiǎn)的檢測(cè)。
式1Asn Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala AspLeu Ala Ala Val Lys Lys Ala Asn Ala Ala在本發(fā)明中，為了得到用作抗原的具有前述式所示氨基酸序列的合成肽，只要是可以得到上述氨基酸序列的方法，則沒(méi)有特別的限定，但是一般優(yōu)選使用氨基酸合成儀。在合成肽的合成中，重要的是所述合成肽不要含有除了上述式所示的氨基酸序列以外的多余氨基酸序列。如果存在多余的氨基酸序列，會(huì)同時(shí)測(cè)定本來(lái)與變異鏈球菌無(wú)關(guān)的免疫球蛋白的抗體效價(jià)，從而使檢測(cè)精度下降。
在本發(fā)明中，樣本使用人體唾液，以具有前述式所示氨基酸序列的合成肽為抗原，測(cè)定人體唾液中含有的分泌型免疫球蛋白A的抗體效價(jià)。實(shí)際上，利用生理鹽水或磷酸鹽緩沖液以任意倍率稀釋樣本而將其用于檢測(cè)。即使樣本的稀釋倍率高，但對(duì)于其中發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的人來(lái)說(shuō)，仍然可以判斷齲齒發(fā)病危險(xiǎn)低。
對(duì)于抗原抗體反應(yīng)的定量測(cè)定，使用與人體唾液含有的分泌型免疫球蛋白A反應(yīng)的標(biāo)記抗體。用于標(biāo)記該抗體的標(biāo)記物質(zhì)，從得到和標(biāo)記的容易程度考慮，優(yōu)選使用如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等酶，熒光素異硫氰酸酯等熒光物質(zhì)，膠態(tài)金或膠乳顆粒等。
在本發(fā)明的方法中，即使使用常規(guī)的酶免疫組織化學(xué)法(針對(duì)變異鏈球菌的抗體效價(jià)測(cè)定法之一，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，以下稱(chēng)為[ELISA])，也可以得到充分實(shí)用的靈敏度。但為了提高在抗原抗體反應(yīng)中得到的測(cè)定值的靈敏度，利用一般使用的技術(shù)，例如使唾液中的分泌型免疫球蛋白A和生物素化的抗人體免疫球蛋白A等反應(yīng)，可以增加測(cè)定時(shí)的測(cè)量靈敏度。在抗體效價(jià)的測(cè)定中，可以直接應(yīng)用以一般抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的方法。另外，也可以適當(dāng)使用免疫色譜法、免疫濃縮法、膠乳凝集法等的任一種。
在本發(fā)明的方法中，將唾液作為樣本是非常重要的，使用人體的血漿則不可能測(cè)定變異鏈球菌的量。
本發(fā)明方法中人體唾液中的分泌型免疫球蛋白A的抗體效價(jià)的測(cè)定方法，可以使用免疫學(xué)中以往使用的測(cè)定方法。例如，ELISA、免疫色譜法、免疫濃縮法、膠乳凝集法等的任一種。
在抗體效價(jià)的測(cè)定中，將具有前述式所示氨基酸序列的合成肽在固體表面固相化，并使所述固相合成肽與任意稀釋的樣本和標(biāo)記抗體反應(yīng)，從而可以診斷齲齒危險(xiǎn)。
在固相化時(shí)，為了測(cè)定時(shí)本底的下降和固相物質(zhì)的穩(wěn)定化，可以共存不與特定抗體反應(yīng)的蛋白。這樣的蛋白可以使用常用的牛血清白蛋白或脫脂乳。在許多情形中，脫脂乳比牛血清白蛋白更有效生成較低的本底，因此其更為合適。
實(shí)施例以下，參照實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限定于下述實(shí)施例。除非具體說(shuō)明，操作是在室溫下進(jìn)行的，pH是指在20～25℃的pH。蛋白量，根據(jù)280nm吸光度算出其濃度。
<根據(jù)ELISA測(cè)定唾液分泌抗體>
(1)用作抗原的合成肽的合成通過(guò)階段式固相肽合成法，得到具有前述式所示氨基酸序列的蛋白。合成儀使用Model 350 Multiple Peptide Synthesizer(產(chǎn)品名稱(chēng)Advanced Chemitech，由Louisville公司制造)，通過(guò)使用TSK-凝膠柱(30×1)的反相高效液體色譜法(以10～45％乙腈洗脫柱，梯度為0.1％TFA)，進(jìn)行合成肽的確認(rèn)。最終提純度為95％以上。
(2)唾液分泌抗體的測(cè)定A)抗體的固相化利用50mM碳酸鈉緩沖液(pH9.6)，將前述方法合成的合成肽稀釋至10μg/mL，并將其添加到96孔微量板(Sumitomo Bakelite公司制造)的各孔中，使其達(dá)到100μL。將其在4℃下靜置過(guò)夜，使合成肽與孔結(jié)合。
B)封閉使用微量板沖洗機(jī)(產(chǎn)品名稱(chēng)Model 1575，Bio-Rat公司制造)，將前述方法固相化的微量板用0.1重量％的中性表面活性劑(產(chǎn)品名稱(chēng)TWEEN20，SIGMA公司制造)的PBS(磷酸鹽緩沖液pH7.4)的液體(以下稱(chēng)為PBST)沖洗三次。沖洗之后，在每孔中注入200μL的含有1％脫脂乳的PBS，37℃封閉1小時(shí)。在封閉之后，利用PBST沖洗三次，以沖洗多余的封閉劑。
C)唾液的制備將咀嚼3分鐘固體石蠟時(shí)分泌的刺激唾液作為樣本。唾液樣本在回收之后至開(kāi)始測(cè)定，都在冰中保存。在實(shí)驗(yàn)中，利用含有0.5％脫脂乳的PBST將唾液稀釋2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024倍。在上述微量板中各添加100μL。添加之后，將板37℃靜置1小時(shí)，之后用PBST沖洗。
D)標(biāo)記抗體利用含有0.5重量％脫脂乳的PBST，將堿性磷酸酶標(biāo)記(產(chǎn)品名稱(chēng)Anti-Human-IgA，由Chemicon International公司制造)制成0.3μL/mL。在各孔中添加100μL制備的標(biāo)記，使其在37℃下反應(yīng)1小時(shí)。
E)顯色在PBST沖洗之后，將100μL含0.1重量％的對(duì)硝基苯酚磷酸二鈉六水合物作為堿性磷酸酶顯色底物的二乙醇胺緩沖液添加在各孔中，并在37℃靜置30分鐘。以波長(zhǎng)為405nm的吸光度進(jìn)行測(cè)定。其中，二乙醇胺緩沖液的制備成分如下二乙醇胺48.5mLMgCl26H2O50.0mgNaN3100mgH2O400ml最終pH 9.8利用ELISA檢測(cè)5個(gè)被實(shí)驗(yàn)者(A、B、C、D、E)的唾液中免疫球蛋白A針對(duì)合成肽的抗體效價(jià)，結(jié)果如圖1所示。其結(jié)果，可以確認(rèn)本發(fā)明試驗(yàn)條件是適合評(píng)價(jià)抗體效價(jià)的條件。即，通過(guò)設(shè)定這樣的試驗(yàn)條件，分為抗體效價(jià)高的組(A、C、E)和低的組(B、D)兩個(gè)組，從而有可能使其他被試驗(yàn)者根據(jù)分組評(píng)價(jià)高低，或可以通過(guò)抗體效價(jià)的實(shí)際數(shù)值檢測(cè)齲齒危險(xiǎn)。這次在口腔內(nèi)的實(shí)際變異鏈球菌量和抗體效價(jià)高低不同的組之間確認(rèn)了齲齒危險(xiǎn)檢測(cè)方法的精確度。
<變異鏈球菌的測(cè)定>
A)唾液的制備將咀嚼3分鐘固體石蠟時(shí)分泌的刺激唾液作為樣本。在唾液樣本在回收之后，立即用于以下的培養(yǎng)，剩余部分冰上保存。
B)測(cè)定利用MSB(Mitis Salivarius Bacitracin培養(yǎng)基)，測(cè)定唾液中的變異鏈球菌。方法為，在無(wú)菌條件下利用PBS稀釋唾液，在培養(yǎng)基上涂布50μL。將涂抹的培養(yǎng)基在厭氧條件下37℃培養(yǎng)3天。根據(jù)檢測(cè)的菌落數(shù)計(jì)算出唾液中變異鏈球菌的量(cfu/ml)。
將由本發(fā)明方法測(cè)定的抗體效價(jià)與由表1所示的通過(guò)菌落測(cè)定的變異鏈球菌數(shù)進(jìn)行比較。
表1

根據(jù)上述結(jié)果可以確認(rèn)，人體唾液中的分泌型免疫球蛋白A針對(duì)合成肽的抗體效價(jià)和變異鏈球菌的量之間存在關(guān)系，可以進(jìn)行齲齒危險(xiǎn)的檢測(cè)。
<利用免疫色譜法測(cè)定抗體效價(jià)的方法>
A)涂布有捕捉抗體的多孔膜的制備硝酸纖維素膜(產(chǎn)品名稱(chēng)SXHF，由日本Millipore公司制造)用作多孔膜。將該膜切出5mm×40mm的長(zhǎng)方形，在帶狀的膜中央部分涂布用PBS制備至500μg/mL的合成肽1μL。將涂布的膜在37℃下干燥2小時(shí)，在干燥器中保管至使用之前。
B)唾液的制備將被試驗(yàn)者咀嚼3分鐘固體石蠟而得到的刺激唾液回收至塑料容器中，并將其立即利用PBST稀釋4倍后用作樣本。
C)測(cè)定在96孔微量板的孔中，添加利用PBS稀釋5倍的金標(biāo)記的抗人體IgA(產(chǎn)品名稱(chēng)BA.GAHA40，由British Biocell International公司制造)50μL，進(jìn)而添加稀釋唾液樣本100μL至所述孔中進(jìn)行混合。在涂布有事先制備的捕捉抗體的多孔膜的一端，利用夾子將40mm×40mm濾紙四折而固定，將沒(méi)有固定濾紙的另一端5mm×40mm浸漬在孔中使試驗(yàn)液滲入并觀察有無(wú)抗體反應(yīng)。
D)變異鏈球菌數(shù)量的測(cè)定利用在實(shí)施例1中記載的方法測(cè)定變異鏈球菌的數(shù)量。
結(jié)果如表2所示。在涂布捕捉抗體的多孔膜上的合成肽涂布部分染成紅色，則認(rèn)定“有反應(yīng)”。
表2

與“有反應(yīng)”(n＝25)的組相比，“沒(méi)有反應(yīng)”(n＝42)的組其變異鏈球菌量的平均數(shù)量顯著(p＝0.05)偏高。在該試驗(yàn)中確定“沒(méi)有反應(yīng)”的被試驗(yàn)者可以判定齲齒危險(xiǎn)高。
代替合成肽，將培養(yǎng)的S.mutans固相化，通過(guò)與實(shí)施例1所示ELISA的相同方法檢測(cè)唾液的抗體效價(jià)。結(jié)果，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)變異鏈球菌的量和抗體效價(jià)之間存在關(guān)系。
代替合成肽，將基因重組的S.mutans的培養(yǎng)基上清作為樣品，得到提純PAc。具體的提純方法根據(jù)Okahashi N等，“變異鏈球菌血清型C的表面蛋白抗原基因的克隆(Cloning of Surface protein antigengene from serotype c Streptococcus mutans)”Mol Microbiol，(USA)，Blackwell Scienctific Publications，1993，3，第221-08頁(yè)和Koga T等，“變異鏈球菌血清型C的細(xì)胞表面蛋白抗原突變體的表面疏水性、粘著和聚集(Surface hydrophobicity，adherence，and aggregation of cellsurface protein antigen mutants of Streptococcus mutans serotype c)”，Infect Immun，(USA)，Baltimore Md American Associaton ofImmunologists，1990，58，第289-96頁(yè)進(jìn)行。除了將上述提純PAc用作抗原之外，通過(guò)與實(shí)施例2相同的方法進(jìn)行檢測(cè)。其結(jié)果如表3所示。
表3

“有反應(yīng)”的組和“沒(méi)有反應(yīng)”的組的變異鏈球菌的平均數(shù)量不存在顯著差異(P＝0.05)。因此，不能根據(jù)比較例2判定齲齒危險(xiǎn)的多少。
發(fā)明效果如上所述，本發(fā)明的齲齒危險(xiǎn)的檢測(cè)方法，將具有特異于變異鏈球菌的氨基酸序列的合成肽作為抗原，根據(jù)針對(duì)該抗原的人唾液中分泌型免疫球蛋白A的不同抗體效價(jià)，可以正確且短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)齲齒危險(xiǎn)。因此本發(fā)明方法在齒科醫(yī)療中具有極大的貢獻(xiàn)價(jià)值。
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1.一種檢測(cè)個(gè)體齲齒危險(xiǎn)的方法，其特征在于，以具有下式1所示氨基酸序列的合成肽為抗原，通過(guò)測(cè)定人體唾液中所含的針對(duì)該抗原的的分泌型免疫球蛋白A的抗體效價(jià)，從而檢測(cè)人的齲齒危險(xiǎn)，式1Asn Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala AspLeu Ala Ala Val Lys Lys Ala Asn Ala Ala。
全文摘要
本發(fā)明提供一種齲齒危險(xiǎn)的檢測(cè)方法，將具有特定氨基酸序列的合成肽作為抗原，根據(jù)針對(duì)該抗原的人體免疫球蛋白A(sIgA)的不同抗體效價(jià)，可以正確且短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)齲齒危險(xiǎn)。本發(fā)明以具有下式1所示氨基酸序列的合成肽為抗原，通過(guò)測(cè)定針對(duì)該抗原的人體唾液中的分泌型免疫球蛋白A的抗體效價(jià)，檢測(cè)人的齲齒危險(xiǎn)，式1 Asn Ala Lys Ala Thr TyrGlu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu Ala Ala Val LysLys Ala Asn Ala Ala。
文檔編號(hào)C07K14/195GK1495429SQ0312492
公開(kāi)日2004年5月12日 申請(qǐng)日期2003年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月19日
發(fā)明者泉福英信, 鱒沢諭美子, 岡田淳一, 一, 美子 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Gc