一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌o157：h7的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌O157：H7的方法，它是用CdTe量子點(diǎn)與大腸桿菌O157:H7多克隆抗體的偶聯(lián)，大腸桿菌O157:H7單克隆抗體包被光纖，光纖探針插入含有待測(cè)菌的溶液中，使抗原與捕獲抗體發(fā)生的特異反應(yīng)從而將抗原固定于光纖上，然后再將該光纖探針插入發(fā)含有檢測(cè)抗體的溶液中，使檢測(cè)抗體上的納米量子點(diǎn)也結(jié)合到光纖表面，再利用光纖倏逝波生物傳感器對(duì)大腸桿菌O157:H7進(jìn)行檢測(cè)，該對(duì)提高食品中病原微生物的檢出率具有重要應(yīng)用價(jià)值，對(duì)于促進(jìn)人類(lèi)健康和我國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫技術(shù)及衛(wèi)生檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌0157:H7是腸出血性大腸埃希氏菌的主要血清型，是重要的人類(lèi)致病菌，可引起出血性腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合癥(HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)及死亡等。由于腸出血性大腸埃希菌(enterohemorrhagic E.coli, EHEC)0157:H7對(duì)人的致病力強(qiáng)，近年來(lái)世界范圍內(nèi)由該菌引起的不同規(guī)模、不同區(qū)域的爆發(fā)流行不斷發(fā)生，發(fā)病呈明顯上升趨勢(shì)。該菌主要通過(guò)食物、水以及直接接觸感染,動(dòng)物是其主要的宿主，因此加強(qiáng)對(duì)進(jìn)口冷凍肉類(lèi)、禽類(lèi)及其制品的檢驗(yàn)力度是預(yù)防該菌污染食品的重要手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種安全、快速、靈敏的檢測(cè)食品中大腸桿菌0157:H7的方法，一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的方法。
[0004]—種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的方法,它包括:
DCdTe量子點(diǎn)與大腸桿菌0157:H7多克隆抗體的偶聯(lián)
取水溶性CdTe量子點(diǎn)與PBS緩沖液混合，大腸桿菌0157:H7多克隆抗體加入到上述混合液中，然后將加入新制備的EDC溶液，將混合樣品在37°C培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)2個(gè)小時(shí)，然后4°C過(guò)夜，將反應(yīng)混合液離心，上清液用超濾膜反復(fù)進(jìn)行超濾，去除小分子物質(zhì)和未反應(yīng)的CdTe量子點(diǎn)，收集超濾膜截留的CdTe-多克隆抗體偶聯(lián)物；
2)捕獲抗體光纖探針的制備
將聚苯乙烯光纖表面，先用鹽酸和乙醇混合液清洗，再用硫酸清洗，接下來(lái)在超純水中煮沸，使光纖表面具有親水的極化層；然后將處理好的光纖放入I大腸桿菌0157單抗的溶液中浸泡，取出用去離子水洗凈，即得到包被有捕獲抗體光纖探針；
3)大腸桿菌0157:H7的檢測(cè)
將CdTe-多克隆抗體偶聯(lián)物制成水溶液，將捕獲抗體光纖探針插入待測(cè)溶液中，然后再將捕獲抗體光纖探針?lè)湃隒dTe-多克隆抗體偶聯(lián)物制成水溶液中，用光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)；
步驟I)所述的混合樣品，包含1.0mL量子點(diǎn)，1.0mL PBS，400uL抗體，IOOuL EDC。
[0005]步驟2)所述的光纖為聚苯乙烯光纖；
步驟2)所述的大腸桿菌0157:H7單抗溶液為10 μ g/ml ；
步驟3) CdTe-多克隆抗體偶聯(lián)物制成水溶液為100 μ g/ml。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:將捕獲抗體(大腸桿菌0157:H7單克隆抗體)與探針共價(jià)偶聯(lián)形成光纖探針；所用檢測(cè)抗體為用納米量子點(diǎn)(CdFe)進(jìn)行了標(biāo)記的大腸桿菌0157:H7多克隆抗體；其中捕獲抗體和檢測(cè)抗體均能特異與大腸桿菌0157:H7結(jié)合；當(dāng)將光纖探針插入含有待測(cè)菌的溶液中，使抗原與捕獲抗體發(fā)生的特異反應(yīng)從而將抗原固定于光纖上，然后再將該光纖探針插入發(fā)含有檢測(cè)抗體的溶液中，使檢測(cè)抗體上的納米量子點(diǎn)也結(jié)合到光纖表面，再通過(guò)向光纖傳感器中輸入激發(fā)光使其形成的倏逝波場(chǎng)效應(yīng)，從而激發(fā)光纖傳感器表面的檢測(cè)抗體上的納米量子點(diǎn)標(biāo)記物產(chǎn)生熒光信號(hào)，根據(jù)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度變化可判斷免疫反應(yīng)是否發(fā)生以此來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌0157:H7的特異檢測(cè)。
[0007]本方法建立了一種基于倏逝波場(chǎng)激發(fā)的納米量子點(diǎn)免疫光纖生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的方法?；谫渴挪▓?chǎng)激發(fā)的量子點(diǎn)免疫光纖生物傳感器是熒光生物傳感器的一種。它主要結(jié)合了光在光纖中傳播時(shí)產(chǎn)生倏逝波場(chǎng)以及抗體一抗原免疫反應(yīng)的高特異性和高靈敏度的特點(diǎn)。倏逝波場(chǎng)激發(fā)的原理是:當(dāng)光在光纖內(nèi)以全反射方式傳輸時(shí)，產(chǎn)生一種橫貫光纖的波，通過(guò)纖芯與包層的交界處傳出光纖，這種波隨傳播距離呈指數(shù)衰減，稱(chēng)為倏逝波。由于傳送到待測(cè)微生物溶液中的倏逝波場(chǎng)深度只有波長(zhǎng)量級(jí)，所以光纖倏逝波生物傳感器只能探測(cè)到結(jié)合于倏逝波場(chǎng)范圍內(nèi)的熒光染料發(fā)出的熒光，而溶液中游離的熒光染料對(duì)測(cè)量結(jié)果無(wú)影響。因此與其他生物檢測(cè)手段相比，光纖倏逝波生物傳感器具有如下優(yōu)點(diǎn):1)靈敏度高，生物特異性強(qiáng)；2)操作簡(jiǎn)單，測(cè)量速度快；3)可以對(duì)生物反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；4)可以使儀器小型化。
[0008]而量子點(diǎn)具有激發(fā)光譜寬，且連續(xù)分布，發(fā)射光譜呈對(duì)稱(chēng)分布且寬度窄，顏色隨粒徑大小可調(diào)，不同發(fā)光波長(zhǎng)的量子點(diǎn)可用同一波長(zhǎng)的光激發(fā)，并且光化學(xué)穩(wěn)定性極高，不易分解。量子點(diǎn)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光染料檢測(cè)食品中的病源性微生物，其獲得了更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，更長(zhǎng)的發(fā)光時(shí)間和更靈敏的信號(hào)，從而使得大大的降低了待測(cè)樣品的檢測(cè)限。
本發(fā)明提供了一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的方法，它是用CdTe量子點(diǎn)與大腸桿菌0157:H7多克隆抗體的偶聯(lián)，大腸桿菌0157:H7單克隆抗體包被光纖，光纖探針插入含有待測(cè)菌的溶液中，使抗原與捕獲抗體發(fā)生的特異反應(yīng)從而將抗原固定于光纖上，然后再將該光纖探針插入發(fā)含有檢測(cè)抗體的溶液中，使檢測(cè)抗體上的納米量子點(diǎn)也結(jié)合到光纖表面，再利用光纖倏逝波生物傳感器對(duì)大腸桿菌0157:H7進(jìn)行檢測(cè)，該方法提高了檢測(cè)效率，對(duì)提高食品中病原微生物的檢出率具有重要應(yīng)用價(jià)值，對(duì)于促進(jìn)人類(lèi)健康和我國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1、大腸桿菌0157靈敏度的檢測(cè)結(jié)果；
圖2、大腸桿菌0157特異性檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1大腸桿菌0157:H7抗原菌液的制備和BALB/c小鼠免疫
取本研究實(shí)_80°C保存的標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌0157:H7 (ATCC11229)，經(jīng)肉湯培養(yǎng)后，劃線法于LB上培養(yǎng)，常規(guī)方法增菌培養(yǎng)，6000r/min離心lOmin，收集菌體沉淀，用滅菌生理鹽水重復(fù)離洗三次后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)(2.0X 108CFU/mL)，加入終濃度為0.3%的甲醛4°C過(guò)夜使菌體滅活。次日將洗脫好的菌液在20KHz、150W的冰浴條件下進(jìn)行超聲波使菌體細(xì)胞破碎，每次破碎10s，間隔10s，總用時(shí)20min。采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定菌體蛋白含量，結(jié)果為2.636 mg/mL0
[0011]取8周齡雌性BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。首免采用上述滅活菌液(2X 108CFU/mL)與等量弗氏完全佐劑混合后腹腔注射50 μ L，皮下注射50 μ L，以后每隔2周免疫I次，換用弗氏不完全佐劑，劑量同前，共免3次。
[0012]3免后，小鼠斷尾采血，用常規(guī)間接ELISA方法檢測(cè)血清效價(jià)。其中，包被抗原是實(shí)施例I所制備的大腸桿菌0157:Η7菌液，稀釋度為1:50，小鼠血清濃度為200X稀釋度開(kāi)始的梯度濃度，酶標(biāo)二抗為HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(稀釋度為1:15000)。測(cè)定結(jié)果表明，抗體效價(jià)為1:25600。
[0013]實(shí)施例2 CdTe量子點(diǎn)與大腸桿菌0157:Η7多克隆抗體的偶聯(lián)
取ImL的水溶性CdTe量子點(diǎn)與ImL PBS (ρΗ=7.4)緩沖液混合，將400uL的大腸桿菌0157:H7多克隆抗體(lmg/ml)加入到上述混合液中，然后將IOOuL新制備的EDC溶液(4mg/ml)加入到混合液中，樣品在37°C培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)2個(gè)小時(shí)，然后4°C過(guò)夜。將2.5mL反應(yīng)混合液(包含 1.0mL 量子點(diǎn)，1.0mL PBS,400uL 抗體，IOOuL EDC)5000r/min 離心 2min，取上清液，上清用截留分子量為100000的超濾膜反復(fù)進(jìn)行超濾，去除小分子物質(zhì)和未反應(yīng)的CdTe量子點(diǎn)，收集超濾膜截留的CdTe-抗體偶聯(lián)物，然后用PBS (pH7.4)溶解。4°C避光保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例3光纖與捕獲抗體的包被
將聚苯乙烯光纖表面，先用清洗液(36-38%濃HCL:70-90%乙醇溶液體積比為1:1)清洗10分鐘，再用70%濃硫酸清洗10分鐘，接下來(lái)在超純水中煮沸10分鐘，使光纖表面具有親水的極化層。然后將處理好的光纖放入10 μ g/ml大腸桿菌0157:H7單抗(保藏編號(hào)為:CGMCC N0.6251，抗大腸桿菌0157: H7單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，已于2012年06月20日送中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，北京市北辰西路I號(hào)院3號(hào)保藏。)的溶液中浸泡lh，取出用去離子水洗凈，即得到包被有捕獲抗體光纖探針。
[0014]實(shí)施例4應(yīng)用光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的方法
將捕獲抗體光纖探針插入待測(cè)溶液中，如果該溶液中存在與光纖探針上捕獲抗體反應(yīng)的大腸桿菌0157:H7，由于該菌能與捕獲抗體特異性結(jié)合從而形成復(fù)合分子；然后再將光纖探針?lè)湃牒?00 μ g/ml納米量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)抗體溶液中，則該溶液中的檢測(cè)抗體與光纖上與捕獲抗體結(jié)合的大腸桿菌0157:H7通過(guò)免疫反應(yīng)結(jié)合，則該納米量子點(diǎn)被固定在光纖探針上，然后通過(guò)倏逝波生物傳感器(光纖傳感器及光纖均由中科院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械與物理所提供)進(jìn)行檢測(cè)。
[0015]實(shí)施例5檢測(cè)靈敏度的確定
將大腸桿菌0157:H7菌株在LB液體培養(yǎng)基中，42 °C培養(yǎng)18 h?24 h。瓊脂平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。將包被大腸桿菌0157:H7菌的單克隆抗體的光纖探針?lè)謩e插入濃度為5 X 10° CFU/mL '5X101 CFU/mL、5X102 CFU/mL、5X103 CFU/mL、5X104 CFU/mL、5X105 CFU/mL和5X106CFU/mL的大腸桿菌0157:H7菌溶液及空白溶液中孵育10 min，加陰性對(duì)照，PBS清洗三遍后再與量子點(diǎn)標(biāo)記的多抗反應(yīng)lOmin，然后上機(jī)進(jìn)行測(cè)量。測(cè)試結(jié)果如下圖1所示，其中大腸桿菌0157菌液濃度高于5 X IO1 CUF/mL都能夠檢出，說(shuō)明該方法最低能檢測(cè)到50個(gè)CFU/ml的大腸桿菌0157。
[0016]實(shí)施例6特異性試驗(yàn)用建立的光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌0157:H7菌的方法對(duì)已知的產(chǎn)氣莢膜梭菌(ATCC13124)、綿羊李斯特氏菌(ATCC11387)、英諾克李斯特氏菌(ATCC19119)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、腸炎沙門(mén)氏菌(ATCC13076)、傷寒沙門(mén)氏菌(ATCC13311 )、大腸埃希菌(ATCC25922)、蠟樣芽胞桿菌(ATCC11778))、大腸桿菌0157 (ATCC35150)、空腸彎曲桿菌(ATCC33291)等細(xì)菌進(jìn)行特異性交叉試驗(yàn)，同時(shí)空白對(duì)照。如圖2所示，結(jié)果表明該方法特異性較強(qiáng)，只對(duì)大腸桿菌0157:H7具有發(fā)生反應(yīng)，而對(duì)其他菌沒(méi)有交叉反應(yīng)。
[0017]實(shí)施例7人工添加樣品的檢測(cè)
取雞肉25g加入225mL的LB培養(yǎng)基中，分別加入大腸桿菌0157菌懸液，使其初始菌液濃度達(dá)到 5 CFU/mL, 10 CFU/mL, 20 CFU/mL, 50 CFU/mL, 100 CFU/mL，均質(zhì)后，取 2mL 上清，煮沸滅菌，各取ImL用于檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如表1所示，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到50 CFU/mL,即在樣品中若含有50 CFU/mL的在大腸桿菌0157即可被檢出，而對(duì)于20 CFU/mL的濃度的樣品3次檢測(cè)中可能有I~2次結(jié)果為陽(yáng)性。
【權(quán)利要求】
1.一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的方法,它包括: DCdTe量子點(diǎn)與大腸桿菌0157:H7多克隆抗體的偶聯(lián) 取水溶性CdTe量子點(diǎn)與PBS緩沖液混合，大腸桿菌0157:H7多克隆抗體加入到上述混合液中，然后將加入新制備的EDC溶液，將混合樣品在37°C培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)2個(gè)小時(shí)，然后4°C過(guò)夜，將反應(yīng)混合液離心，上清液用超濾膜反復(fù)進(jìn)行超濾，去除小分子物質(zhì)和未反應(yīng)的CdTe量子點(diǎn)，收集超濾膜截留的CdTe-多克隆抗體偶聯(lián)物； 2)捕獲抗體光纖探針的制備 將聚苯乙烯光纖表面，先用鹽酸和乙醇混合液清洗，再用硫酸清洗，接下來(lái)在超純水中煮沸，使光纖表面具有親水的極化層；然后將處理好的光纖放入I大腸桿菌0157單抗的溶液中浸泡，取出用去離子水洗凈，即得到包被有捕獲抗體光纖探針； 3)大腸桿菌0157:H7的檢測(cè) 將CdTe-多克隆抗體偶聯(lián)物制成水溶液，將捕獲抗體光纖探針插入待測(cè)溶液中，然后再將捕獲抗體光纖探針?lè)湃隒dTe-多克隆抗體偶聯(lián)物制成的水溶液中，用光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的方法，其特征在于:步驟I)所述的混合樣品，包含1.0mL量子點(diǎn)，1.0mL PBS，400uL抗體，IOOuL EDC0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的方法，其特征在于:步驟2)所述的光纖為聚苯乙烯光纖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的方法，其特征在于:步驟2)所述的大腸桿菌0157:H7單抗溶液為10 yg/mL.
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的方法，其特征在于:步驟3) CdTe-多克隆抗體偶聯(lián)物制成的水溶液為100 μ g/ml。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103913577SQ201410082184
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】劉金華, 劉韜, 孟日增, 魏春艷, 盧春梅 申請(qǐng)人:吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心